‫حفظ الصول الوراثية النباتية داخل النابيب وبالنيتروجين السائل‬

‫تمهيد‬
‫يعتبر حفظ الصول الوراثية داخل النابيب طريقة مكملة للساليب التقليدية المتبعة في الحفظ‪،‬‬
‫حيث يتم بهذه الطريقة حفظ المادة النباتية على المدى القصير‪ ،‬المتوسط‪ ،‬والبعيد‪ ،‬هذا بالضافة‬
‫إلى أن الحفظ داخل النابيب يتم في ظروف مسيطر عليها و بمساحات صغيرة إذا ما قورنت‬
‫بالطرق الخرى‪.‬‬

‫مقدمة‬
‫مقارن ًة بالنباتات ذات التكاثر الخضري‪ ،‬فإن النباتات التي تتكاثر بانتاج البذور ليست في خطرإذ‬
‫أنه بالمكان حفظ هذه النباتات على شكل بذور‪ .‬أما النباتات ذات التكاثر الخضري فهي تحفظ في‬
‫الحدائق النباتية (‪ )Botanical Gardens‬عن طريق اكثارالدرنات‪ ،‬الجذور‪ ،‬العقل‪ ،‬أو البصال‬
‫بشكل متواصل‪ .‬إل أن هذه الطريقة لها مساوئها التي تتلخص بأنها مجهدة‪ ،‬وارتفاع نسبة تعرض‬
‫النباتات للفات والظروف والجهادات البيئية القاسية‪ .‬وقد وجد أن زراعة النسجة طريقةٌ فاعلةٌ‬
‫ومفيدة في حفظ النباتات ذات التكاثر الخضري وخصوصًا المحاصيل التجارية مثل البطاطا‪،‬‬
‫النخيل‪ ،‬أشجار الغابات‪ ،‬اشجار الفاكهة‪ ،‬إضاف ًة إلى العديد من النواع الخرى‪.‬‬

‫إن حفظ الصول الوراثية بزراعة النسجة تطلبت جهداً بحثيًا كبيرًا خلل العقود الثلثة‬
‫الماضية‪ )Shoot tips( .‬أو (‪ )meristem derived explants‬المحفوظة والمخزنة بإبطاء‬
‫معدلت نموها لها استخدامات مهمة في وحدات مصادر (‪ )germplasm‬الدولية‪ .‬أيضا‪ ،‬هذه‬
‫الطريقة تجعل (‪ )germplasm‬متوفرًا في أي وقت من أجل الستخدام الدولي‪ .‬هناك أنواع‬
‫عديدة من المواد النباتية التي أستخدمت وما زالت تستخدم لحفظ المحاصيل ذات التكاثر‬
‫الخضري داخل النابيب‪ ،‬ومن أكثر الجزاء النباتية المستخدمة لهذا الغرض الجزاء المشتقة من‬
‫المريستيم مثل (‪ )shoot tips‬والبراعم‪ ،‬وذلك لثباتها الجيني‪.‬‬

‫الحفظ داخل النابيب‬

‫الحفظ داخل النابيب بإبطاء النمو‬
‫إن الهدف الرئيسي لحفظ (‪ )germplasm‬هو تقليل عدد الزرعات الفرعية (‪،)subcultures‬‬
‫اضاف ًة إلى حفظ التباين الوراثي للنواع المختلفة من النباتات في ظروف معقمة دون تشكيل أي‬
‫خطورة عليها‪ .‬أن الحفظ بإبطاء النمو يتم بزراعة الجيرمبلزم في ظروف نمو طبيعية أو في‬
‫ظروف تحد من النمو‪ .‬هذه الظروف يمكن تحقيقها باتباع عدة أساليب مثل الحضانة في درجات‬
‫حرارة منخفضة و‪/‬أو اضاءة منخفضة‪ ،‬التلعب بالعناصر الغذائية في الوسط الغذائي‪ ،‬إضافة‬
‫إلى استخدام العوامل السموزية (‪ )osmotic agents‬ومحددات النمو‪.‬‬

‫‪osmoticums‬‬ ‫الحفظ باستخدام‬

‫العوامل السموزية عبارة عن مواد تخفف أو تقلل من ‪ water potential‬للخليا‪ .‬وقد ثبتت‬
‫فاعلية إضافة مثل هذه المواد الى الوسط الغذائي‪ ،‬حيث تعمل على تقليل معدل النمو وزيادة فترة‬
‫التخزين للنسجة المحفوظة داخل النابيب للعديد من النباتات‪ .‬ووفقا للفرضية‪ ،‬فإن إضافة‬
‫العوامل السموزية للوسط الغذائي تعمل على عدم ايجاد ‪ ،critical turgor pressure‬والذي‬
‫يعتبر ضروريا قبل حدوث استطالة الخليا‪ ،‬وإن مثل هذه الحالة ستعمل على تثبيط نمو الكالوس‬
‫و تكون ‪ shoots‬معا‪.‬‬
 ‫من أهم العوامل السموزية التي سجلت كمواد ناجحة في اطالة فترة التخزين للعديد من النسجة‬
‫المحفوظة داخل النابيب‪ :‬المانيتول‪ ،‬السكروز‪ ،‬السوربيتول‪tributyl-2,4 ،‬‬
‫‪,dichlorbenzylphosphonium chloride )Phosphon D(, malic hydrazide‬‬
‫حمض السكسينيك‪ CCC ,2-dinethyl hydrazide )B-995, ( ،‬و أنسايمادول‪.‬‬

‫يعتبر السكروز مكونا أساسيا في معظم الوساط المستخدمة لزراعة النسجة النباتية‪ ،‬فهو يعمل‬
‫كمصدر للطاقة إضافة إلى كونه عامل اسموزيا‪ .‬يمكن استخدام السكروز لتقليل نمو النباتات‬
‫داخل النابيب حيث يعتمد نمو ‪ explant‬على تركيز السكروز في الوسط الغذائي‪ .‬فقد أثبتت‬
‫الدراسات أن زيادة تركيز السكروز في الوسط الغذائي قد أدت إلى تقليل استطالة النباتات في‬
‫البطاطا والجاص البري‪ ،‬و أن استخدام التركيز ‪ ٣٠‬غم‪/‬لتر في وسط زراعة كالوس التبغ أدى‬
‫إلى تقليل القدرة على تكوين ‪ .shoots‬ليس هذا وحسب‪ ،‬بل إن إضافة ‪ ١٥٠‬غم‪/‬لتر من السكروز‬
‫أدت إلى تثبيط تكوين ‪ shoots‬بشكل كامل‪.‬‬

‫ومن العوامل السموزية الخرى المستخدمة‪ ،‬المانيتول‪ .‬وهو عبارة عن كحول سكري ينتج في‬
‫بعض النباتات نتيجة لقيامها بعملية التمثيل الضوئي‪ .‬وقد وجد أن استخدام المانيتول لم يدعم نمو‬
‫النسجة في التبغ‪ ،‬و عمل على تقليل نمو ‪ shoot‬في نبات الغريب (‪)chrysanthemum‬‬
‫واللوز المر‪ .‬ويعتبر السوربيتول عامل اسموزيا آخر يستخدم لتحقيق نفس الغاية‪ ،‬وقد أثبت‬
‫فاعليته عند استخدامه في الوسط المستخدم لزراعة نبات الغريب‪.‬‬

‫الحفظ في درجات الحرارة المنخفضة‬

‫يعتبرالحفظ في درجات الحرارة المنخفضة واحدا من أهم تقنيات حفظ الصول الوراثية النباتية‬
‫باستخدام زراعة النسجة‪ .‬ومن أهم مميزات وحسنات هذه الطريقة أنها تقلل من مشاكل‬
‫المراض‪ ،‬تقلل من التحورات الجينية‪ ،‬إضافة إلى ل تحتاج إلى عمالة أو حيز كبيرين‪ .‬إن الحفظ‬
‫بدرجات حرارة منخفضة يؤدي إلى تراكم الليبيدات غير المشبعة على الغشاء الخلوي‪ ،‬والذي‬
‫بدوره يؤدي إلى تثخن الغشاء الخلوي‪ ،‬ما يمنع انقسام الخلية واستطالتها‪.‬‬

‫يعتمد الحفظ بدرجات الحرارة المنخفضة على البيئة والصل الجغرافي للنباتات‪ .‬عادةً‪ ،‬تحفظ‬
‫النباتا المقاومة للبرودة في درجات حرارة بين صفر و ‪٥‬م‪ ،°‬ويجب الخذ بعين العتبار أن‬
‫النباتات الستوائية وشبه الستوائية أقل قدرةً على مقاومة البرودة‪ .‬فعلى سبيل المثال‪ ،‬تم وبنجاح‬
‫حفظ القهوة على درجة حرارة ‪ ٢٠‬م‪ ،°‬في حين أن جيرمبلزم التفاح حفظ في درجة حرارة بين‬
‫‪١‬م‪ °‬و ‪٤‬م‪.°‬‬

‫خلل الحفظ والتخزين‪ ،‬تختلف الحاجة إلى الضوء باختلف أنواع النباتات‪ .‬معظم البروتوكولت‬
‫المتبعة في الحفظ في درجات الحرارة المنخفضة إما في شدة ضوء منخفضة أو في الظلمة‪ ،‬إل‬
‫أن هناك العديد من النواع حفظت بهذه الطريقة بوجود الضوء‪ .‬ففي حين أنه قد تم وبنجاح حفظ‬
‫زرعات القهوة‪ ،‬الحمضيات والبطاطا بوجود الضوء‪ ،‬ال أنه قد تم أيضًا حفظ ‪ rootstock‬التفاح‬
‫و ‪ shoot tips‬المشمش في الظلمة‪.‬‬

‫أما المادة النباتية المستخدمة للحفظ في درجات الحرارة المنخفضة‪ ،‬فإن هناك العديد منها مثل ‪.‬‬
‫‪ shoot tips, nodal segments, and rooted shoots‬وقد وجد أن ‪ shoot tips‬هي الكثر‬
‫نجاحاً‪ ،‬وأن ذلك عائد إلى ارتفاع نسبة البقاء والنمو بعد الحفظ‪ ،‬إضاف ًة ألى ارتفاع نسبة الثبات‬
 ‫الجيني‪ .‬وقد وجد أيضاً أنه بالمكان استخدام الكالوس‪ ،‬الجنة و ‪ cell suspension‬لحفظ‬
‫النباتات بالحرارة المنخفضة‪.‬‬

‫الحفظ بالنيتروجين السائل‬

‫يتم بهذه الطريقة حفظ المادة الحيوية في النيتروجين السائل بدرجة حرارة ‪°١٩٦‬س‪ ،‬حيث أن‬
‫النقسام الخلوي والعمليات اليضية والكيموحيوية في درجة الحرارة هذه تتوقف‪ ،‬وبالتالي فإن‬
‫خصائصها ل تتغير ولفترة غير محدودة‪ .‬علوةً على ذلك‪ ،‬فإن الحفظ بالنيتروجين السائل يضمن‬
‫الحفاظ على الصفات الشكلية والجينية للجيرمبلزم المحفوظ إلى أقصى درجة‪.‬‬

‫إن التطور في حفظ الخليا والعضاء النباتية بالنيتروجين السائل كان مواكباً للتطورات الحاصلة‬
‫في حفظ النواع الثديية‪ .‬وقد كان أول تقرير سجل على بقاء النسجة النباتية حية بعد تعرضها‬
‫لدرجات حرارة منخفضة جداً في عام ‪ .١٩٥٦‬حيث لحظ أن أغصان(‪ )twigs‬التوت القاسية (‬
‫‪ )mulberry‬كانت قادرة على تحمل التجميد (‪ .)extra-organ freezing‬وفي السنوات‬
‫الخيرة‪ ،‬تم تطوير العديد من طرق وتقنيات الحفظ بالنيتروجين السائل‪ ،‬والذي بدوره أدى إلى‬
‫إستخدام هذه الطريقة لحفظ العديد من النسجة والعضاء بمختلف الحجام والشكال‪.‬‬

‫تستخدم (‪ )shoot tips‬وبطول ‪٣ -١‬ملم للحفظ بهذه الطريقة بسبب ثبات صفاتها الجينية وارتفاع‬
‫نسبة البقاء واعادة النمو‪ .‬تمتاز القمم النامية بأن خلياها صغيرة وكثيفة وتنقسم بنشاط وسرعة‪،‬‬
‫علوةً على أن معدلت التضاعف(‪ )multiplication‬تكون عالية بعد اخراجها من النيتروجين‬
‫السائل واذابتها‪ .‬سبب آخر قوي ووجيه لختيار (‪ )shoot tips‬للحفظ بالنيتروجين السائل هو‬
‫محتوى الماء المنخفض فيها‪ .‬وقد وجد أن معلقات الخليا الجنينية قد حفظت بنجاح بطريقة‬
‫الكبسلة‪ -‬التجفيف و ‪ regenerated‬إلى نباتات كاملة‪.‬‬