1

Giri
Tanm Tarihe

Tartmalar: Nanobakteriler cansz proteinmineral kompleksleri mi, yoksa bakteri mi? Nanobakterilerin zellikleri

Morfoloji Boyanma Kltr Biyokimyasal zellikler Epidemiyoloji Patogenez/patoloji Diren ve duyarllk Tan Tedavi

Nanobakteriyel hastalklar ve ksa alma zetleri

lk defa Finlandiyada bulunan Kuopio niversitesinden Olavi Kajander ve Neva iftiolu - 1992 Nasl kefedildi?

3T6 fare fibroblastlar zerinde sitotoksik etki ve hcre lmleri Hcre kltrleri kontaminantlar Kontaminasyon kayna ticari hcre kltr serumu (FBS)

A. Direk FBSden izole edilmi nanobakteriler, DIC (bar = 200 nm). B. 2 aylk kltr sreci ardndan nanobakteriler, biyofilmden grtnt, SEM (bar = 1 m)
Kajander ve iftiolu, PNAS*, 1998 *Proceedings of the National Academy of Sciences

(a) Salkl 3T6 hcreleri. (b) NB enfekte vakuoll 3T6 hcreleri (sitotoksik). (DIC, Bar, 10 m.)
Kajander ve iftiolu, Pathophysiology, 1998
5

3T6 fare fibroblast hcreleri (a) Enfekte olmam kontrol hcreleri. Deneye baladktan (b) 10 dk, (c) 15. dk, (d) 30 dk, (e) 4 sa, (f) 24 sa, (g) 48 sa ve (h) 72 sa sonra elde edilmi grntler. (Bar = 10 m, ndirekt FITC* boyama)
*fluoroscein isothiocyanate

Kajander ve iftiolu Pathophysiology, 1998

6

Nanobacterium sanguineum: Memelilerin kan ve serumlarnda saptanabilen, 80-500 nm boylarnda olan, 0,1 mlik filtrelerden geebilen ve insan ve memelilerde kalsifikasyonlu hastalklara sebep olabilen olduka kk mikroorganizmalardr. Hidroksiapatitten oluan mineral bir kabua (h. duvar) sahip olup proteobakterlerin -2 alt grubunda yer almaktadrlar.

Nanobakteriler (NB), son yllarda baz kesimlerce mikroorganizma olmadklar ve cansz, protein-mineral kompleksleri yapsnda olduklar savunularak kalsifiye edici nanopartikller anlamna gelen Calcifying Nanoparticle(CNP) olarak da isimlendirilebilmektedir. Ancak nanobakterilerin cansz protein-mineral kompleksleri mi, yoksa bakteri mi olduklar sorunu konusunda halen tatmin edici bir alma yaplmam ve bu konuda bir uzlamaya varlamamtr.

Avrupada retilen ve retimleri esnasnda FBS kullanlan;

6 eit hayvan asnn 3nn 3 eit inaktive insan polio asnn 2sinin nanobakteriler ile kontamine olduu saptanmtr. zm: ticari FBSe gama-n uygulamas.

101st General Meeting of the American Society for Microbiology May 20-24, 2001, Orlando, Florida
http://www.vaccinationnews.com/dailynews/July2002/AnotherViralVaxDebate13.htm
9

Kan ve serum

Scak su travertenleri ve jeolojik kayalar

Marstan gelen meteorit

Nanobakteri

Nan(n)obakteri

Nanop

?
10

Ancak canl organizmalar olduklarna dair phe ve itirazlar !

Ar kk boyutlar: 80-500 nm (<140 nm).

Oysa mikoplazmalarn da dk su konsantrasyonlarnda boyutlarnn 75 nmye dek debildii bildirilmektedir.
Volke F, NaturalScience, 1997

11

Mineral-protein komplekslerine morfolojik olarak benzemeleri.

Cisar ve ark. PNAS, 2000 Martel ve ark. PNAS, 2008 Wu ve ark. Plos One, 2009

Ancak ayn derecede bakteriye de benzedikleri sylenmektedir. Dolaysyla morfolojinin tek bana buna karar vermede yeterli bir kriter deildir.
Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998

12

Nanobakteriler, SEM
Vali ve ark. Geochim Cosmochim Acta. 2001
13

Genom dizilerinin halen tam olarak saptanamam olmamas DNA-spesifik boyalarla boyanabilmeleri
Kajander ve iftiolu. PNAS, 1998 Kumar ve ark. J Investig Med, 2006

DNA ve RNA ekstrakte edilebilmesi

Hudelist ve ark. Histopathology, 2004 Kumar ve ark. J Investig Med, 2006

Elektron mikroskobu ile DNA ve RNA tanmlanmas

Agababov ve ark. J Biosci, 2007
14

Saptanan veya ekstrakte edilen nkleik asitlerin protein-mineral komplekslerine rastgele balandklar ve sk sk PCR kontaminasyonlarna sebep olan mikroorganizmalarn nkleik asitleri olduu (Phyllobacterium myrsinacearum gibi ).
Cisar ve ark. PNAS, 2000

NBlerin demineralize edildikten sonra DNA-spesifik boyalarla boyanabilmeleri, nkleik asitlerin dardan gelmediklerini gstermekte. Buysa nkleik asitlerin protein-mineral komplekslerine basit bir balanmalar eklindeki gr rtmekte.
iftiolu ve ark. Kidney Int. 1999 Khullar ve ark. Urol Res. 2004 Miller ve ark. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004
15

Hidroksiapatitin eitli serum proteinleri ile ilikileri ve belli homeostatik deiimlerin ardndan, fizyolojik serum koullar altnda da NB oluuu iddias.
Raoult ve ark. Plos Pathog. 2008 Martel ve Young, Plos One, 2009

NBler serum proteinlerinin bulunmad, serumsuz ortamlarda da baarl bir ekilde oaltlabilmi, ancak inorganik hidroksiapatit kristallerinin serum ieren ortamlarda oalamadklar gzlenmitir.
Mathew ve ark. Nanomedicine, 2008

16

NBlere zg monoklonal antikorlarn serum proteinleri olan albumin, fetuin-A ile apraz reaktiviteleri
Wu ve ark. Plos One, 2009 Young ve ark. Plos One, 2009

Ancak NB antijenlerinin tm serum rneklerinde gsterilemediler (nk bu serum proteinleri btn insanlarda bulunmaktadr) ve Fin poplasyonu zerinde yaplan baka bir almadaysa Finlilerin yalnzca %5inin serumlarnda NB antijeni saptanabilmitir.
Kajander ve ark. Urol Res. 2003

17

DNAaz ve RNAaz aktivitelerine diren gstermeleri.

Raoult ve ark. Plos Pathog. 2008

Ancak yaplan almada NBlerin demineralize edilmedikleri ve bu nedenle bu durumun mineralize kabuun enzimlere kar koruyucu rolyle aklanabilecei sylenmektedir.
Kutikhin ve ark. Int J Nanomedicine, 2012

18

3 aylk bir kltr sreci ardndan apatit kabuk iersine gmlm NBler. TEM, Bar = 200 nm,
Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998
19

NaHCO3 ve inert gazlarn NB replikasyonu zerine kritik etkisi (pozitif etki). Yani, NBlerin evresindeki hidroksiapatit kristalleri birikiminin bu maddelerden etkilenmeleri.
Martel ve Young, PNAS, 2008

Ancak bu almann NBlerin yalnzca mineral kabuk oluumlarn aklamaktadr. Yaplarndaki nkleik asit varl ve mevcudiyeti ile ilgili deildir.
Kutikhin ve ark. Int J Nanomedicine, 2012

20

NBlerin kltrde remeleri ve pasajlarnn yaplabilmesi, biyofilm oluturma ve bamsz bir ekilde oalabilmesi. ridin, metionin ve aspartik asit ile birleebilmeleri. (nkleik asit ve protein biyosentez metabolizmalar) 16 Slik ribozomal RNA. E.coli karakteristiinde DNA ve RNA oran varl. Endotoksine sahip olmalar Tablo > Kutikhin ve ark. Int J Nanomedicine, 2012
21

Antimetabolik aktiviteye sahip ancak elatlama aktivitesi olmayan birok kemoteraptie (rnek: antimisin A, trimetropim vs.) duyarl olmalar.
Fotobiyostimlasyonun ardndan replikasyonun (oalma) artmas. Demineralizasyon sonras bakteriyel proteinler saptanmas (EF-Tu, EF-G, GroEL, poliribonkleotid asetil transferaz vs.). -merkaptoetanol ile replikasyonun stimle olmas. Anaerobik koullarda kesinlikle reyememe. Demineralize halde patojenik ativite sergilemeleri ve farkl patojenik aktivitelere sahip olmalar. Tablo > Kutikhin ve ark. Int J Nanomedicine, 2012

22

o o o o o o o

80-500 nm (100 nmlik filtrelerden geebilirler). Kok, kokkobasil ve basil. Hidroksiapatit (Ca ve Pden ierir)den mineralize hcre duvar Membran benzeri bir yap. Oyuk (merkezi kavite). kiye blnerek (binary fission), tomurcuklanarak ya da paralanarak oalabilirler. Scakla direnli biyofilm oluturabilirler.

23

kiye blnmekte olan bir nanobakteri hcresi (SEM) Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998
24

(A) DIC mikroskopisi, 1600X (solda), (B) SEM (sada)(bar = 5 m)

(A) Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998 (B) Cisar ve ark. PNAS, 2000

25

Gram negatif DNA-spesifik boyalar (Hoechst 33258, PicoGreen [optimum demineralizasyonun ardndan]) %2lik uranil asestat (hidroksi apatit zerindeki mukusa spesifik) Alizarin krmz S (mineralize halde) Fosfotungstik asit

26

Agar ieren geleneksel mikrobiyolojik besiyerlerinde retilemez, hcre kltr besiyerlerinde retilebilirler (serumlu veya serumsuz). kilenme sreleri 3 gn, serumsuz ortamdaysa 6 gndr. Serumsuz ortamda DMEM ve RPMI-1640da kltr ve pasajlar yaplabilir. Kltr besiyerinde serum konsantrasyonu %5in altndaysa kalsifikasyon (mineralizasyon) yaparlar. >1 mm mikroskobik koloniler.

27

Hcre kltr koullarnda 1 ay inkbe edilmi NB kltr (DMEM). Kltr iesi dibinde biyofilm eklinde reme (Sada). Soldaki iede reme yok (kontrol).
Cisar ve ark. PNAS, 2000
28

Modifiye Loeffler besiyerindeki 6 haftalk nanobakteri ta kolonileri. A. 10 cmlik bir petri kabndaki koloniler. Koloniler besiyerinde tal/kat kntlar oluturarak yaylyorlar. Ok, grimsi kahverengi renkte tipik bir koloniyi gsteriyor. B. (A)da ok iaretiyle gsterilen koloninin 40Xlik bytlm hali. C. kntdaki neter-benzeri kristal birikintilerin (depozit, yn) TEMden elde edilmi grnts. (Bar = 200 nm)
Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998
29

%5 CO2 ve %95 hava ihtiva eden ortamda en iyi ekilde rerler. Anaerobik bymeyi stimule eden -merkaptoetanole hassastrlar, ancak anaerobik koullarda tam olarak kltre edilemezler. Fibroblast ve lenfositler zerinde sitotoksik etki yaparlar.

30

Metabolizmalar E. coliden 1000 kat daha yavatr. ridin, metionin ve aspartik asit ile birleebilirler. pH 7.4n altnda kalsifikasyon (mineralizasyon kirelenme) yaparlar. reaz negatiftirler.

veya

31

Fin toplumunun genel olarak %5inde* ve Trkiyede yaplan bir aratrmada hemodiyalize giren hastalarn %80de** nanobakterilere rastlanmtr.

*Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 78467847, July 1998 **Kajander ve ifiolu, yaynlanmam veri, 2003

32

Nanobakteriler hcre duvarlar etrafnda kalsiyum ve fosfat mineralleri kelterek bir ekirdeklenme blgesi (nidus) vazifesi grmekte ve bylelikle hcre-ii, hcre-d ve dokusal kalsifikasyona (biyomineralizasyon veya kirelenme) sebep olmakta ve ta oluumlarna sebebiyet verebilmektedir.
Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998*

*Nanobacteria: An alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation
33

A. Demineralizasyon sonras bir bbrek tanda NB hcresi (TEM, bar = 50 nm). B. 3T6 hcre kltrnde hcre ii ve d kalsifikasyon, von Kossa boyama (k mikroskobu, 270X)
Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998
34

35

36

Kutikhin ve ark. Int J Nanomedicine, 2012

37

90 Cye 1 saat dayanabilirler. 30 kGraylk gama-radyasyona direnlidirler. %5lik NaCl solsyonuna direnlidirler. Mineralize halde lizozime, proteinaz Kya ve belli dier proteinazlara, lipazlara, amilazlara, alkalilere, ultrasona, Xnna, deterjanlara ve zgenlere direnlidir. 37 Cnin altnda oalmalar basklanr ve biyofilm oluumlar engellenir.

38

Geni spektrumlu antimikrobiyal terepatiklere: aminoglikozitler, kloramfenikol, linkozamidler, sefalosporinler, makrolidler, fluorokinolonlar, glikopeptidler, polimiksinler, anti-tuberkuloz ajanlar, aminocyclitol ve spektinomisinlere direnlidir. Tetrasiklin, amfisilin, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoksazol, nitrofurantoin, 5-florurasil, sitozin arabinosid, antimisin A, sodyum azid, potasyum siyanid, bifosfonatlar (etidronat, klodronat) ve 6-aminokaproik asite hassastrlar; n vitro bymeleri EDTA, EGTA ve sitrat ile inhibe edilebilir.

39

Geleneksek bakteri boyama yntemleriyle boyanamazlar. Hoechst 33258, propidyum iyodr ve PicoGreen ile DNA-spesifik boyanma SEM ve TEM von Kossa boyama (kalsiyum bileenlerine spesifik) %2lik uranil asetat (mukusa spesifik, kurun sitrat ile birlikte kullanlarak) Alizarin krmzs S (mineralize halde) Uzun dnem kltivasyon sreci ardndan gene von Kossa boyama.

40

A. Ik mikroskobu grnts. B. Hoechst ile DNA-spesifik boyama. C. Apatit kabuk ierisindeki NBler (DIC). D. Kabuk katman ksmen demineralize olmu (sklm) nanobakteri grubu (A-D. 860X). E ve F. Kltr iesinden ayrlm (sklm) NBlerin SEM grntleri (Bar = 1 m) .
Kajander ve iftiolu, PNAS, 1998
41

DMEM ve RPMI-1640da kltivasyon (100-220 nmlik filtrelemenin ardndan, 37 C). oalmalar 650 nmde spektrofotometrik yntemle belirlenebilir. NB antijenleri, anti-NB monoklonal antikorlar* veya nanobakteriyel monoklonal fare antikorlar** ile serolojik, immnohistokimyasal, immnofloresan, immnoblotting ve Ouchterlony/immndifzyon yntemler.

*8/0 (porine) 5/2 (peptidoglikana) 8D10 (porine) **A4002

42

Genomik yntemler de (PCR) bulunmaktadr, ancak NB nkleik asitleri temelindeki mevcut primerlerin eldesinde ve bunlarn kontaminant bakterilerin nkleik asitleri olmad konusunda kukular bulunmaktadr. Proteomik yntemler (poliakrilamid jel elektroforezi, ak sitometresi, immnoblotting ).

43

NBlere kar gelitirilmi kullanlan mevcut bir tedavi yntemi yok, ancak gelitirilme aamasnda olan birka yntem var, bir rnek: Tip III kronik prostatit/kronik pelvik ac sendromunda gelitirilme aamasnda olan bir tedavi almas:

comET-terapi (tetrasiklin, nutrient karmlar ve EDTA). tetrasiklin ve nutrient karmlar (oral yolla), EDTA (rektal fitil) 3 ay sren comET tedavisinde, daha nceki mevcut tedavi yntemlerinin etkisiz olduu bu hastalkta,

hastalarn %80inde en az %25lik bir dzelme, hastalarn %53unde bu parametre %50nin stnde,
prostattaki ta boyutlarnda transrektal ultrason testine gore hastalarn %50sinde en az iki kat azalma Shoskes ve ark. J Urol, 2005
44

Rastgele olarak toplanan 72 bbrek tann 70inde (%97.3) serolojik, bakteriyoskopik ve bakteriyolojik metotlarla NB varl saptanm ve bbrek talarnn 67inden (%93.1) NBler izole edilerek kltrleri yaplabilmitir.

iftiolu, Bjrklund ve ark. Kidney Int, 1999

45

MoAblar ile kalsifiye kalp kapakklarnn saptanmas. A. Kalsiyum fosfat varln gsteren von Kossa ile pozitif boyama (siyah ve kahverengi blgeler). B. Sr kaynakl NBlere spesifik MoAblar ile pozitif immnohistokimyal boyama. (Bar = 100 m). almalarnda 29 kalsifiye kardiyak kapaknn 26s pozitif sonu verirken, kalsifiye olmayan kapakklarn tamam negatif sonu vermitir.
Hu ve ark. Cardiovasc. Pathol. 2009
46

Multi-dedektrl bilgisayarl tomografi kullanlarak koroner arter kirelenmesi tespit edilen 103 hastann ve 94 adet kontrol grubunun kullanld almada, deneklerin serumlarnda ELISA yntemi ile NB antikorlar aratrlm ve yksek skorlu koroner arter kirelenmesi olan hastalarn serum antikor titrelerinin tomografide saptanan deerlerle tutarl ekilde yksek olduu grlmtr.

Tulunay Kaya ve ark. Coron Artery Dis. 2011

47

Spesifik NB antikorlar (MoAb) ile doku kesitinin immnohistokimyasal boyanmas. A. Spesifik MoAblarla pozitif sonu. B. zotip antikorlar ile negatif sonu. Psammoma cisimcikleri ieren 7 adenokarsinom dokusunun 7sinde de pozitif sonu (%100) elde edilirken, Psammoma cisimcikleri iermeyen 10 malign ovaryum tmr dokusunun 10unda negatif sonu (%0) elde edilmitir. (immnohistokimyasal incelemeler) Hudelist ve ark. Histopathology, 2004

48

Sanlara transretral olarak NB enjeksiyonu Deneye baladktan 1-2 hafta sonra prostatik akut iltihabik deiimler 4 hafta sonra bu iltihabik deiimler kronik hle gelmesi 8. haftann sonunda sanlarn %70inin (10da 7si) prostatik beze kovuklarnda mikroskopik ta oluumlar

Shen ve ark. J Urol. 2010

49

Tavanda karotit arterleri hasara uratarak damar-ii enjekte edilen NBlere kar duyarllklarn llmesi Mineralize NBler: tkanma, kirelenme Demineralize NBler: tkanma, kalsifikasyon, hiperplazi
Schwartz ve ark. Int J Nanomedicine, 2008

50

Serum rnekleri: 318 (%8) salkl ve 76 (%31,6) safra ta bulunan hastada NB varl Safra kltrnn immmnohistokimyasal incelenmesi: Safra ta bulunan 46 (%61,3) hastada; safra ta bulunmad tespit edilen 18 (%61,1) hastada nanobakteri varl.

(Ancak safra ta bulunmayan 18 hastann 13nn karacier kanseri ve 2sinin de ampular kanseri hastas olduu).
Wen ve ark. Chin Med J, 2005

51

RPMI-1640da 3-4 haftalk NB kltr ve lam zerinde immnhistokimyasal boyama (200x)

Wen ve ark. Chin Med J, 2005

52

53