T.C.

UKUROVA NVERSTES SALIK BLMLER ENSTTS BYOKMYA ANABLM DALI

FERTL VE NFERTL SEMEN RNEKLERNDE ENERJ RETMNDE GREV ALAN BAZI STOZOLK VE MTOKONDRYAL ENZM AKTVTELERNN KARILATIRILMASI

Bil.Uzm. Hlya LEVENTERLER DOKTORA TEZ

DANIMANI Prof. Dr. Nurten DKMEN

ADANA-2005

T.C. UKUROVA NVERSTES SALIK BLMLER ENSTTS BYOKMYA ANABLM DALI

FERTL VE NFERTL SEMEN RNEKLERNDE ENERJ RETMNDE GREV ALAN BAZI STOZOLK VE MTOKONDRYAL ENZM AKTVTELERNN KARILATIRILMASI

Bil.Uzm. Hlya LEVENTERLER DOKTORA TEZ

DANIMANI Prof. Dr. Nurten DKMEN

Bu tez, ukurova niversitesi Aratrma Fonu tarafndan SBE D-23 nolu proje olarak desteklenmitir.

ADANA-2005

KABUL VE ONAY

Biyokimya Doktora Program erevesinde yrtlm olan Fertil ve nfertil Semen rneklerinde Enerji retiminde Grev Alan Baz Sitozolik ve Mitokondriyal Enzim Aktivitelerinin Karlatrlmas adl alma, aadaki jri tarafndan Doktora tezi olarak kabul edilmitir. Tez Savunma Tarihi: 28.6.2005 mza Prof. Dr. Nurten DKMEN .. Tp Fakltesi Jri Bakan mza Prof. Dr. Suna SOLMAZ .. Tp Fakltesi mza Do. Dr. Gzide YCEBLG .. Fen-Edebiyat Fakltesi mza Prof. Dr. Belks AYDINOL Dicle niversitesi Tp Fakl. mza Do. D. Soner KOLTA .. Tp Fakltesi

Yukardaki tez, Ynetim Kurulunun .tarih ve ..sayl karar ile kabul edilmitir. Prof. Dr. Sait POLAT Enstit Mdr

ii

TEEKKR
Doktora eitimim srasnda ilgi, sevgi, sabr ve anlay ile hibir zaman yardmn esirgemeyen, her konuda ok byk desteini grdm sayn hocam Prof. Dr. Nurten Dikmene sonsuz teekkrlerimi sunarm. Tez almalarm srasnda yardm ve katklarndan dolay Prof. Dr. Suna Solmaza ve anabilim dal bakanl sresince destek ve hogrsn esirgemeyen sayn hocam Prof. Dr. Levent Kayrna teekkr ederim. Eitimim srasnda yardmlarndan dolay Biyokimya Anabilim Dal retim yelerine, alanlarna ve beni destekleyen Kadn Hastalklar ve Doum Anabilim Dal retim yeleri ile alanlarna teekkrlerimi sunarm. Tez almam SBE D-23 nolu proje ile destekleyen .. Rektrl Aratrma Fonuna, Salk Bilimleri Enstits bakan Prof. Dr. Sait Polat ve enstit alanlarna teekkr ederim. almalarmda yardmlarndan dolay Do. Dr. Soner Kolta, Do.Dr. Davut Alptekin, retim grevlisi Dr. Glah Seydaolu ve Nkleer Tp Laboratuvar alanlarna teekkr ederim. Ayrca yardm ve katklarndan dolay Safiye Taga ve Ayen Durmaza teekkrlerimi sunarm. almalarm sresince beni destekleyen, her zaman yanmda olan aileme, eime, oluma ve kzma sonsuz teekkrlerimi sunarm.

iii

NDEKLER
Kabul ve Onay TEEKKR NDEKLER EKLLER DZN ZELGELER DZN SMGELER VE KISALTMALAR DZN ZET ABSTRACT 1. GR 2. GENEL BLG 2.1. Tarihe 2.2. nfertilitenin Deerlendirilmesi 2.2.1. Kadnda nfertilite Nedenleri 2.2.2. Erkekte nfertilite Nedenleri 2.3. Semen Analizi 2.3.1. Sperm rneinin Alnmas 2.3.2. Semen rneinin Deerlendirilmesi 2.3.3. Semenin Makroskopik ncelemesi 2.3.4. Semenin Mikroskopik ncelemesi 2.3.5. Spermatogenez 2.3.6. Semen 2.4. Malat Dehidrogenaz (MDH) ve Malik Enzimler (ME) 2.4.1. MDH (EC 1.1.1.37) 2.4.2. MDH1 Geni in Gen Kart 2.4.3. Amino Asit Dizi Benzerlii 2.4.5. Substrat zgnlnn Dzenlenmesi 2.5. Malik Enzim 2.5.1. Malik Enzim 1 (ME1) 2.5.2. Malik Enzim 2 (ME2) 2.5.3. Malik Enzim 3 (ME3) ii iii iv vii ix xi xiii xiv 1 3 3 6 6 7 10 10 10 11 12 16 19 22 23 23 26 26 27 28 28 28

iv

2.5.4. MDH ve MEin Klinik Olarak nemi 2.6. Laktat Dehidrogenaz ve C4 zoenzimi 2.6.1. Ontogen ve Testiste Yerleim 2.6.2. LDH-C4n Kinetii 2.6.3. Substratlar (Metabolik nemi) 2.6.4. nhibitrler 2.6.5. Molekler zellikleri 2.6.7. Testis Hasar ve nfertilitede Bir Marker Olarak LDH-C4 2.7. Reaktif Oksijen Trleri ve Antioksidan Koruma 2.7.1. Reaktif Oksijen Trleri ve Oksidatif Stres 2.7.2. Oksidatif Stres ve Lkositler 2.7.3. Oksidatif Stres ve Sperm Fonksiyonu 2.7.4. Lipit Peroksidasyonu 2.7.5. Antioksidan Korumalar 2.7.6. Glutatyon 2.7.7. Fosfolipit Hidroperoksit Glutatyon Peroksidaz 2.8. Seminal Svda Fruktoz ve Glukoz 2.9. Leptin 2.10. Testosteron 2.10.1 Testosteron Sentezi 2.10.2. Testosteron Etki Mekanizmalar 2.10.3. Testosteron ve nfertilite 2.10.3.Seminal Plazmada Hormonal Steroidler 3.GERE VE YNTEMLER 3.1. Cihazlar 3.2. rneklerin Temini ve Gruplandrmas 3.3. Sperm Homojenizasyonu 3.4. Sperm Ykama (Swim up) 3.5. Analiz Yntemleri 3.5.1. Malat Dehidrogenaz (MDH) Aktivite Tayini 3.5.2. Laktat Dehidrogenaz (LDH) Aktivite Tayini 3.5.3. Redkte Glutatyon (GSH) Tayini

34 35 36 37 37 39 40 41 42 42 42 43 43 44 45 48 50 53 58 58 59 60 61 62 62 63 66 67 68 68 71 73

3.5.4. Glukoz Tayini 3.5.5. Fruktoz Tayini 3.5.6. Serbest Testosteron Tayini 3.5.7. Leptin Tayini 4. BULGULAR 5. TARTIMA 5.2. MDH Aktivitesi le lgili Deerlendirme 5.3. LDH Aktivitesi le lgili Deerlendirme 5.4. GSH Dzeyi le lgili Deerlendirme 5.5. Fruktoz ve Glukoz Dzeyi le lgili Deerlendirme 5.6. Hormonlar ve Erkek reme Sistemi 5.6.1. Leptin Dzeyi le lgili Deerlendirme 5.6.2. Testosteron Dzeyi le lgili Deerlendirme

75 77 79 80 81 82 121 127 129 131 134 135 136 138 139 142 151

5.1. rnek Seimi ve Spermiyogram zelliklerine Gre Deerlendirme 120

5.6.3. Seminal Svda NAD-MDH Aktivitesi <20mU/ml Olan rneklerin Deerlendirilmesi 6. SONULAR VE NERLER 7. KAYNAKLAR 8. ZGEM

vi

EKLLER DZN
ekil 1. Antony Van Leeuwenhoek ekil 2. Antony Van Leeuwenhoekun spermatozoa gzlemleriyle ilgili izimleri ekil 3. Antony Van Leeuwenhoekun sperm ekliyle ilgili olarak ilk dnceleri ekil 4. Makler sperm saym kameras ekil 5. Makler sperm saym kamerasnn yakn grnm ekil 6. Makler kamerasnda semen rneinin damlatlarak hazrlanmas ekil 7. Makler kamerasnda spermlerin grnts ekil 8. Normal morfolojiye sahip, olgun sperm rnei ekil 9. Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm grntleri ekil 10. Erkek reme sistemi ekil 11. Testislerin yaps ekil 12. 2. kromozom zerinde MDH1 geninin yerleimi ekil 13. Halofilik bir archaebacteria olan Haloarcula marismortuide MDH yaps ekil 14. nsanda mNADME kompleksi ekil 15. Malik enzimin aktif blgesi ekil 16. Malatn enzim zerinde aktif blgeye balanmas ekil 17. Malik enzimin katalitik mekanizmas ekil 18. LDH moleklnn yaps ekil 19. Sistein ekil 20. Glutatyon sentezi ekil 21. Sertoli hcrelerinde de novo sentez ve glutatyon dng sistemi ekil 22. Polyol yolu ekil 23. Leptin moleklnn 3 boyutlu molekler yaps ekil 24. Leptin reseptr izoformlar ekil 25. Leptinin gonadal organlar zerine etkisi ekil 26. Leptin hipotalamik-hipofiz-testikler aks 25 30 31 32 33 40 46 47 48 50 53 54 54 56 5 12 12 13 13 15 16 17 19 25 4 3

vii

ekil 27. Leptinin spermatojenik hcrelerin farkllamas ve yenilenmesi zerinde etkileri ekil 28. Testosteronun yaps ekil 29. FSH ve LHn hedef dokudaki etkinlikleri ekil 30. Fruktoz standart erisi ekil 31. Homojenizasyon ncesinde spermlerin morfolojik grnm ekil 32. Homojenizasyondan sonra spermlerin morfolojik grnm ekil 33. Spermiyogram deerlendirmesine gre gruplarn karlatrlmas ekil 34. Seminal svda NAD-MDH ve NADP-MDH aktiviteleri ekil 35. Seminal svda LDH aktivitesi ekil 36. Seminal svda GSH dzeyi ekil 37. Seminal svda glukoz dzeyi ekil 38. Seminal svda fruktoz dzeyi ekil 39. Seminal svda serbest testosteron dzeyi ekil 40. Seminal svda leptin dzeyi ekil 41. Sperm homojenatlarnda NAD ve NADP bal MDH aktiviteleri ekil 42. Sperm homojenatlarnda LDH aktivitesi 57 58 61 78 81 82 114 115 116 116 117 117 118 118 119 119

viii

ZELGELER DZN
izelge 1. Sperm retimi iin ihtiya duyulan hormonlar ve etkileri izelge 2. nsanda seminal plazmada bulunan eitli maddelerin konsantrasyonlar izelge 3. nsan semeninde bulunan steroidler izelge 4. Grup A- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri izelge 5. Grup B- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri izelge 6. Grup C- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri izelge 7. Grup D- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri izelge 8. Grup E- Olgu ya, semen hacmi izelge 9.Grup A- Seminal sv rneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri izelge 10.Grup B- Seminal sv rneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri izelge 11. Grup C-Seminal sv rneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri izelge 12. Grup D- Seminal sv rneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri izelge 13.Grup E-Seminal sv rneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri izelge 14.Grup A- Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri izelge 15.Grup B- Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri izelge 16.Grup C- Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri izelge 17.Grup D- Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri izelge 18.Grup E- Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri 96 95 94 93 92 91 91 90 89 88 21 61 84 85 86 87 87 9

ix

izelge 19.Grup A- Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri izelge 20-Grup B- Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri izelge 21-Grup C- Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri izelge 22-Grup D- Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri izelge 23-Grup D- Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri izelge 24. Ya, semen hacmi ve spermiyogram zelliklerinin gruplardaki ortalama deerleri izelge 25. Seminal svda NAD/NADP-MDH ve LDH aktivitelerinin ortalamalar izelge 26. Seminal svda GSH, glukoz ve fruktoz deerlerinin ortalamalar izelge 27. Seminal svda serbest testosteron ve leptin dzeylerinin ortalamalar izelge 28. A Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri izelge 29. B Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri izelge 30. C Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri izelge 31. D Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri izelge 32. Sperm rneklerinde MDH ve LDH aktivitelerinin ortalamalar izelge 33. Gruplardaki deikenlerin A (kontrol) grubu ile karlatrlmalar sonucunda bulunan p deerleri izelge 34. Gruplarn birbirleriyle karlatrlmalar sonucunda bulunan p deerleri izelge 35. A Grubundaki deikenlerin kendi iinde korelasyonu izelge 36. B Grubundaki deikenlerin kendi iinde korelasyonu izelge 37. C Grubundaki deikenlerin kendi iinde korelasyonu izelge 38. D Grubundaki deikenlerin kendi iinde korelasyonu izelge 39. E Grubundaki deikenlerin kendi iinde korelasyonu 110 111 111 112 112 113 109 104 105 106 107 108 108 103 102 101 100 100 99 98 97

SMGELER VE KISALTMALAR
ADP ATP cDNA Da DHEAS DNA dl FSH GOD GnRH GR GSH GPX GSSG LH H2O2 IVF ICSI JAK kDa LDH L MAPK MDH ME mg M g l Alfa Adenozin Difosfat Adenozin Trifosfat Komplementer Deoksi Ribonkleik Asit Dalton Dehidroepiandrosteron Deoksi Ribonkleik Asit Desi Litre Folikl Uyarc Hormon Glukoz Oksidaz Gonadotropin Serbestletirici Hormon Glutatyon Redktaz Redkte Glutatyon Glutatyon Peroksidaz Okside Glutatyon Luteinletirici Hormon Hidrojen Peroksit n Vitro Fertilizasyon Intra Cytoplasmic Sperm Injection Janus Kinaz Kilo Dalton Laktat Dehidrogenaz Litre Mitojen Aktive Protein Kinaz Malat Dehidrogenaz Malik Enzim Mili Gram Molarite Mikro Gram Mikro Litre

xi

ml mM mol mU mRNA NAD

+

Mili Litre Mili Molar Mikro Mol Mili Unite Haberci Ribonkleik Asit Nikotinamid Adenin Dinkleotid (okside) Nikotinamid Adenin Dinkleotid (indirgenmi) Nikotinamid Adenin Dinkleotid Fosfat Nikotinamid Adenin Dinkleotid Fosfat (indirgenmi) Nano Gram Nano Metre Nitrik Oksit Leptin Reseptr Optik Dansite Speroksit Anyonu Hidroksil Radikali Peroksinitrit Anyonu (ONOO-) Kromozomun Ksa Kolu Piko Gram Kromozomun Uzun Kolu
-

NADH NADP NAD(P)H ng nm NO Ob-R OD O2 OHONOOp pg q ROO ROT SOD UV WHO

Peroksil Radikali Reaktif Oksijen Trleri Superoksid Dismutaz Ultraviole World Health Organization (Dnya Salk Tekilat)

xii

ZET
Fertil ve nfertil Semen rneklerinde Enerji retiminde Grev Alan Baz Sitozolik ve Mitokondriyal Enzim Aktivitelerinin Karlatrlmas nfertilitenin yaklak % 50 orannda erkek faktrne bal olduu bildirilmitir. Spermiyogram, erkek fertilizasyon potansiyelini deerlendirmede ok nemlidir. Bu amala sperm; konsantrasyon, motilite ve morfoloji zellikleri ynnden deerlendirilir. almada fertil ve infertil semen gruplarnda, spermde enerji metabolizmasn incelemek iin Malat ve Laktat Dehidrogenaz (MDHNAD/NADP ve LDH) aktiviteleri; glukoz, fruktoz ve redkte glutatyon (GSH) dzeyleri incelendi. Lokal hormon etkinliini aratrmak iin de serbest testosteron ve leptin dzeylerini karlatrdk. nfertil grup say, motilite ve morfolojiye gre drt alt gruba ayrld. Enzim aktiviteleri kinetik yntemlerle, GSH, fruktoz ve glukoz spektrofotometrik olarak hormon dzeyleri RIA yntemiyle lld. Seminal sv almalarnda enerji metabolizmasnn kilit bir enzimi olan NAD-MDH ve LDH aktivitesi ile GSH dzeyi fertil grupta infertil gruplardan anlaml dzeyde (p<0.05) yksek bulundu. Bu deikenlerin sperm fonksiyonlarn deerlendirmede nemli katklar olabileceine inanmaktayz. Seminal svda leptin ve serbest testosteron dzeyleri oligoteratospermik grupta kontrol grubundan anlaml oranda (p<0.05) dk bulundu. Azospermik grupta ise serbest testosteron dzeyi kontrol grubundan anlaml olarak yksekti. Oligoteratospermik grupta testosteron dzeyi ile seminal sv NAD-MDH aktivitesi arasnda pozitif korelasyon saptanmas, testosteronun bu enzimin aktivitesini dzenleyen bir faktr olabileceini dndrmtr. Sperm tarafndan fruktozun yan sra glukozun da aktif bir ekilde kullanld, tketimleri arasnda yksek oranda benzerlik bulunduu, fertil grupta bu metabolitlerin tketiminin infertil gruptan daha fazla olduu dikkatimizi ekti. Bu bulgular, spermde enerji ihtiyacnn karlanmasnda fruktozun yan sra glukozun da etken olduunu gsterdi. Genel olarak MDHn NAD formunun NADP formuna oranla hem seminal sv hem de spermde daha aktif olarak altn tesbit ettik. Sperm homojenatlarnda, btn gruplarda LDH aktivitesi kontrol grubuna oranla anlaml dzeyde (p<0,05) dk bulundu. Anahtar szckler: Laktat Dehidrogenaz, semen, testosteron, Dehidrogenaz, leptin, Malat

xiii

ABSTRACT
Comparison of Some of the Cytosolic and Mitochondrial Enzyme Activities which Play Role in Fertile and Infertile Semen Samples

It is reported that infertility is due to male factor approximately at 50%. Spermiogram too important in the evaluation of male fertilization potential. So sperm can be evaluated according to concentration, motility and morphology. In this study, in fertile and infertile semen groups, Malate dehydrogenase (MDH) and Lactate Dehydrogenase (LDH) activities (to study energy metabolism of sperm) and levels of glucose, fructose and reduced glutathione (GSH) were investigated. Free testosterone and leptin levels were compared to explore the efficiency of local hormones. Infertile group was classified in to four subgroups according to concentration, motility and morphology. Enzyme activities were measured with kinetic method, GSH, fructose and glucose levels were evaluated spectrophotometrically and hormone levels were measured with RIA method. NAD-MDH (the key enzyme of energy metabolism) and LDH activities and GSH levels were found significantly (p<0.05) higher in seminal plasma of fertil group. We believe that these variables may have an important contribution in the evaluation of sperm functions. In seminal plasma of oligoteratospermic group, levels of free testosterone and leptin were found significantly lower (p<0.05) than control group. A positive correlation was found between testosterone level and seminal plasma NAD-MDH, so it is thought that testosterone may be a factor that regulates activity of this enzyme. It is reported that in addition to fructose sperm also use glucose, and consumption of these sugars similar to each other. Fertile group use more fructose and glucose than infertile group. It is showed that glucose is important for energy requirement of sperm. We reported that NAD-MDH works better than NADP form, both in seminal plasma and sperm. It is found that LDH activities of all groups were significantly (p<0.05) lower than control group. Keywords: Lactate Dehydrogenase, leptin, Malate Dehydrogenase, semen, testosterone.

xiv

1. GR
reme kapasitesinin istek dnda azalmas infertilite adn alr. Bir baka ifade ile, kontraseptif bir yntem uygulamadan, dzenli bir cinsel yaama ramen (ortalama haftada iki kez beraberlik dzenli cinsel yaam olarak kabul edilir) bir yl sreyle gebelik olumamas infertilite olarak tanmlanr. Yaplan aratrmalarda, toplumlarda infertilite orannn % 10-15 dolaynda olduu bildirilmitir 1,2,3. Kliniklere infertilite problemi ile bavuran iftlerin % 48inde erkee bal faktrn olmas erkek fertilizasyon potansiyelinin aratrlmasn bir n koul olarak beraberinde getirmektedir. Reprodktif yataki erkeklerin % 6snda infertilite problemi ortaya kmaktadr. Bu olgularn yaklak % 90nda da bozulmu spermatogenez Erkeklerde anatomik, endokrin, immnolojik bir bozukluk veya infeksiyon infertilite nedeni olabilir. nfertilitede erkek faktrnn kesinlik kazanabilmesi iin; yk, genel fizik muayene, semen analizi ve hormonal tetkikler srasyla yaplmal ve gereinde testis biyopsisi; biyokimyasal ve fonksiyonel testlerle desteklenmelidir. Bu nedenle erkek faktrn ortaya koyan en basit test spermiyogramdr. Dikkatli bir ekilde yaplan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesi ile aksesuvar bezlerin almas hakknda salkl bilgi sahibi olunmasn salayacaktr 1,2,3. Semen analizi makroskopik, biyokimyasal ve mikroskopik aratrmalar kapsar ve zellikle u noktalar zerinde durulur. ejaklat hacmi ve semenin likefikasyonu semenin biyokimyasal zellikleri semendeki spermatozoa konsantrasyonu hareketli spermatozoa yzdesi spermatozoann morfolojisi dier hcrelerin tanmlanmas 4. vardr 1,2,3.

Morfolojik olarak kabul edilebilecek bir sperm, ncelikle ba ve kuyruk blmlerinden olumaktadr. Spermin ba ksmnda akrozom, postakrozom ve nkleus bulunmaktadr. Daha sonra ok ince bir tabakadan oluan boyun ksm vardr ki ancak

elektron mikroskobunda grlebilir. Boyun ksmndan sonra orta ksm gelir. Bu blm en nemli blmlerden biridir, nk burada spermlere hareket iin gerekli enerjiyi verecek olan mitokondriler bulunmaktadr 4. almay planlarken, zellikle fertilizasyon yetenei iin nemli olan sperm etkinliini irdeleyebilmek amacyla spermin enerji metabolizmas zerinde durulmu ve bu konuda kilit noktalarda neme sahip enzim aktivitelerinin incelenmesi kararlatrlmtr. Bu dncelere paralel olarak (ncelikle sitoplazmada glikolitik yolun son enzimi olduu iin) Laktat Dehidrogenazn (LDH); sperm ve seminal svda ayr ayr allmas dnlmtr. Hedeflenen ikinci enzim Malat Dehidrogenaz (MDH)dr. MDH trikarboksilik asit dngsnn son enzimidir. Mitokondrial enzim aktivitesinin gsterilebilmesi iin ve sentetik aktiviteler gz nne alnarak bu enzimin NAD ve NADP bal iki formunun sperm ve seminal svda ayr ayr allmas planlanmtr. Enerji metabolizmasna destek olmas amacyla glukoz ve fruktoz dzeylerinin belirlenmesi de dnlmtr. Yaplan aratrmalarda infertil erkeklerin, fertil gruptan daha fazla dzeyde total antioksidan kapasiteyi baskladklar ve daha dk dzeylerde antioksidan ierdikleri bildirilmitir. Reaktif oksijen trlerinin, sperm fonksiyonlarn yoldan etkiledii aklanmtr: Motilitenin azalmas Anormal morfoloji Sperm-yumurta penetrasyonunun azalmas 5. Bu almada antioksidan etkinlii deerlendirmek amacyla seminal svda Redkte Glutatyon (GSH) dzeyinin saptanmas amaland. Ayrca GSH dzeyi ile dier deikenler arasnda olas bir ilikinin aratrlmas dnld. te yandan seminal svda, hormonal profili gzden geirmek amacyla serbest testosteron ve leptin dzeylerinin saptanmas amalanmtr. Buna bal olarak seminal svda bu hormonlar ile dehidrogenaz enzimleri (MDH, LDH) arasnda bir ilgi olup olmad da zerinde durduumuz konular arasnda yer almaktadr. Sz edilen deikenlerin her birinin tek bana ya da btn olarak bir kombinasyon halinde farkl alma gruplarnda (fertil ve infertil semen rneklerinde) deerlendirilmesinin, sperm aktivitesinin hangi ynde etkilenebilecei konusunda bir fikir oluturabilecei dnlmektedir.

2. GENEL BLG
2.1. Tarihe Sra d bir bilim adam olan Antony Van Leeuwenhoek (ekil 1) 17. yzyln balarnda Hollandada yaamtr. Yksek eitim ya da niversite derecesine sahip olmayan Leeuwenhoekun hobisi mikroskop lensleri yapmakt. 1668den nce basit bir mikroskop yapmay baard ve bu gzlemleriyle biyoloji tarihinde nemli bulularn ncs oldu 6.

ekil 1. Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723) 6

Yapt gzlemler ile bakteri, parazitik mikroskopik protistler, sperm hcreleri, kan hcreleri ve mikroskopik nematodlar kefetti. Antony Van Leeuwenhoek semende yapt ilk incelemede globllere benzettii bu yaplar zerinde pek durmamt. drt yl sonra 1677de Hamm ile semende yaptklar incelemede kuyruklar olan kk hayvanlar grdler. Leeuwenhoek bu gzlemlerini (ekil 2) London Royal Societyye yazd mektupta bildirdi. Spermin insan vcudunda gelitiine inanmaktayd ve semenin iindeki spermin fosfat kristallerini ilk kez tanmlad
6,7

. Leeuwenhoek ve

Hamm, spermatozoann insann minyatr yapsn ierdiini dnmlerdir (ekil 3).

Bu fikir ilkoluum teorisi (preformation theory) olarak bilinmektedir. Bu teoriye gre; spermatozoa oosite girmesinden sonra minyatr insann geliimi gerekleecektir4.

ekil 2. Antony Van Leeuwenhoekun spermatozoa gzlemleriyle ilgili izimleri 8

1775de Spallanzani oosit ve spermatozoann yeni bir insan geliimi iin gerekli olduunu ispatlamtr. 1830da Prevost ve Dumas spermatozoann fertilizasyon iin nemli olduunu ve 1841de Von Kolliker, testis seminifer tbllerinde hcre blnmesinin son rnnn spermatozoa olduunu aklamlardr Macomber ve Sanders sperm saym tekniini gelitirdiler 4,9.
4,9

. 1929da

ekil 3. Antony Van Leeuwenhoekun sperm ekliyle ilgili olarak ilk dnceleri (ilkoluum teorisi-preformation theory) 8

1929da Macomber ve Sanders sperm saym tekniini gelitirdiler. MacLeod (1942), Macleod ve Gold (1953), Eliasson (1971) ve Hellinga (1949,1976) konvansiyonel sperm analizinin bilimsel temellerini aklamlardr. Bu metodlar hala referans olarak kullanlmaktadr 4,9,10. Spermin tanmlanp semen analiz tekniklerinin kullanma girmesi zellikle infertilite aratrmalar konusunda nemli bir r amtr. 1970li yllarn sonlarndan itibaren ortaya kan yeni teknolojiler ve bunlarn klinik kullanmlar hem infertiliteye yol aan nedenlerin daha iyi anlalmasn salam hem de milyonlarca iftin ocuk sahibi olabilme ansn artrmtr.1978 ylnda in vitro fertilizasyon (IVF) yntemi ile ilk tp bebein doumu gerekletirilmi ve daha sonra bu yntem erkek infertilitesi, aklanamayan infertilite gibi bir ok endikasyon iin baaryla kullanlmtr. 1992de intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yntemiyle elde edilen ilk gebelikler ile ICSI, gnmzde iddetli erkek infertilite tedavisinde ok nemli bir yer edinmitir.

2.2. nfertilitenin Deerlendirilmesi Bir yl ierisinde korunma yntemi olmadan srdrlen dzenli bir cinsel yaama ramen (ortalama haftada iki kez beraberlik dzenli cinsel yaam olarak kabul edilir) gebelik olumamasna infertilite ad verilir. Hi gebelik olumamas durumu primer infertilite; daha nce mevcut bir gebeliin ardndan gebelik elde edilmemesi ise sekonder infertilite olarak tanmlanr. Gebelik iin hibir ansa sahip olmama sterilite olarak ifade edilir. Yaplan aratrmalarda, toplumlarda infertilite orannn % 10-15 dolaynda olduu bildirilmitir 12,13,14. Erkek infertilitesi, infertil iftlerin %10-30unda tek neden, %15-30unda ise kadndaki probleme ek olarak karmza kmakta, dolays ile vakalarn yaklak %50sinde grlmektedir 12,13 . nfertilite nedenleri Sperm Ovlatr Fallop tpleri Serviks Nedeni bilinmeyen % 30-40 % 15-20 % 25-40 %5 % 5-15
15

2.2.1. Kadnda nfertilite Nedenleri Pelvik inflamatuar hastalk Uterus dnda gebelik Abdominal cerrahi ntrauterin alet komplikasyonlar Fibroidler Kadnda einin spermine kar alerjik reaksiyon olumas Ovlasyon yetersizlii Endometriozis Hipofiz bezi yetersizlii Over yetersizlii Uzun dnem doum kontrol ilac kullanmann etkileri Hipotiroidizm ya da hormonal dengesizlikler

Ya (kadnlarda 35 yandan sonra fertilite kapasitesi azalmaktadr) Anormal uterus ekli Servikal mukus yetersizlii Tekrarlayan dkler Yetersiz beslenme Tiroid fonksiyonunda yetersizlik Diabet Fallop tplerinde blok Konjenital anomaliler Tbal ligasyon 15,16.

2.2.2. Erkekte nfertilite Nedenleri Sperm ile ilgili problemler Dk sperm says Sperm retiminde bozukluk (defektif sperm saysnda art) Oligospermi (sperm saysnn dk olmas) Azospermi (sperm bulunmamas) Seminal kanallarda tkanklk Seminal sv bozukluklar Is sperm potansiyelini azaltabilir Kronik yksek ate Seks ncesi egzersiz Seks ncesi scak banyo Sperm kalitesi ya da saysnda dmeyi genellikle etkileyen nedenler Alkol lalar Esrar Nikotin Baz tbbi uygulamalar Pestisitler Kurun Kronik alkolizm

Belirli hormonal bozukluklar sperm kalitesini etkiler Hipofiz bozukluklar Feminizasyon

Testikler bozukluklar sperm retimini etkiler Testikler vein varikozu Testikler hasar Testikler tmr Varikosel Testikl anomali nmemi testis (ocuklukda baarl ekilde mdahale edilmemise) Testikler burulma Kabakulak Radyasyona maruz kalma

Testikler kanaln bloke olmas (sperm salnmn etkiler) Testikler kanalda kzl (scarring) Cinsel yolla bulaan hastalklar Gonera Klamidya Genital kanal anomalisi

Retrograd

ejaklasyonu

(mesaneye

ters

ejaklasyon-eitli

nedenlerden dolay oluabilir) Prostat cerrahisi Baz tbbi mdahaleler Ejaklasyonun olumamas (eitli nedenlere bal olabilir) ktidarszlk (impotens) Erektil disfonksiyon Diabet Prostat cerrahisi retra cerrahisi Kan basnc ile ilgili uygulamalar Baz kromozom bozukluklar XXY erkekler

Baz tbbi uygulamalar 17,18.

Erkek faktrn ortaya koyan nemli testler: 1. Spermiyogram 2. Postkoidal test 3. Antisperm antikor lm(serum veya seminal plazmada) 4. Spermatozoann fertilizasyon kapasite testleri 5. Serumda: Serbest ve total testosteron Luteinletirici hormon Follikl uyarc hormon Prolaktin dzeyleri de nemlidir 3.

Endokrinolojik inceleme Sperm retimi iin ihtiya duyulan erkek seks hormonlar izelge 1de gsterilmitir.
izelge 1. Sperm retimi iin ihtiya duyulan hormonlar ve etkileri 19

Hormon GnRH FSH LH Prolaktin Testosteron

Etkisi FSH ve LH hormonlarnn salglanmasn salar. Beyinde hipotalamustan salglanr. Testisteki sertoli hcrelerini uyararak sperm retimini salar. Hipofiz bezinden salglanr. Leydig hcrelerinde testosteron sentezlenmesini ve sperm retiminin devamlln salar. Hipofiz bezinden salglanr. LHn Leydig hcreleri zerindeki etkisini arttrr. Hipofiz bezinden salglanr. Sperm retiminin devamlln salar. Testisteki Leydig hcrelerinden salglanr. LH sentezini kontrol eder. Karacier, kas ve ya dokusunda testosteronun metabolize edilmesi ile oluur. %20-25i Leydig hcrelerinden salglanr. FSH salnmn engeller. Sertoli hcrelerinden salglanr. FSH salnmn arttrr. Leydig hcrelerinden salglanr.

Estradiol nhibin Aktivin

2.3. Semen Analizi (Spermiyogram) nfertil iftlerde yarya yakn bir oranda erkekte problem olduu belirlenmitir. Erkeklerde anatomik, endokrin, immnolojik bir bozukluk veya infeksiyon, infertilite nedeni olabilecektir. Bu nedenle erkek faktrn ortaya koyan en basit test spermiyogramdr 2 2.3.1. Sperm rneinin Alnmas Hastalar ile yaplan ilk grmede rnek vermek iin gelecekleri gn 3-5 gnlk bir cinsel perhiz sresine uymalar tavsiye edilir. 2-7 gn arasndaki cinsel perhiz sresi yeterli grlrse de ksa sreli cinsel perhizde semendeki sperm says az, uzun sreli cinsel perhizde de (erkek faktr mevcut ise) sperm says yeterli olsa bile motilitenin dk olduu gzlenmitir. Yaplan aratrmalarda, uzun sreli cinsel perhizin spermlerin akrozin ieriinde de azalmaya neden olduu gsterilmitir. nerilen cinsel perhiz sresine uyulduunda, dikkatli bir ekilde yaplan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin almas hakknda salkl bilgi sahibi olunmasn salayacaktr 2,11. Hastalara steril artlarda, steril kutular verilerek bu amala dzenlenmi sperm verme odasn kullanmalar salanr. Hastalar, mastrbasyonla rnek vermeleri gerektii konusunda bilgilendirilir, kullandklar kutularn zerine isimleri etiketle yaptrlr. rnek verme esnasnda nelere dikkat etmeleri gerektii nceden hazrlanm bir bildiri ile kendilerine aklanmaldr. rnek toplanmas esnasnda krem ya da kayganlatrc bir madde kullanmamas, rnek toplanan kutuya su ya da baka bir madde karmamas sylenir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha nceden yaplan kimyasal ve biyolojik testlerle toksik olmad ispatlanm kutular satn alnmaldr. Hastann rneini aldktan sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili biyologlara teslim etmeleri gerektii izah edilmelidir 2,11. 2.3.2. Semen rneinin Deerlendirilmesi Erkek fertilizasyon potansiyelinin aratrlmasnda ilk basamak semen analizidir. Bu inceleme esnasnda Dnya Salk rgt tarafndan belirtilen kriterler (WHO, 1992) esas alnmaktadr. Semen analizi makroskopik ve mikroskopik incelemeden oluur 10,11.

10

2.3.3. Semenin Makroskopik ncelemesi Makroskopik incelemede semen ierii likefikasyon, grnm, volm ve pH zellikleri ynnden deerlendirilmektedir 4,10,11. 1. Likefikasyon (Semenin znlrl) Ejaklasyon srasnda akc olan semen koagle olur. Prostattan salglanan amilaz ve proteolitik enzimler 10-30 dakika ierisinde semenin likefiye olmasn (znrlk kazanmasn) salar. Laboratuvara ulaan semen rnei 37Cde (etvde) likefiye olana kadar bekletilir, sonra incelemeye alnr. Bu sreyi aan rnekler viskoz olarak kabul edilir 4,10,11. 2. Grnm Normalde semen sar-gri renkte, parlak ve homojendir. Prostat bezinden salglanan sperminin oksidasyonundan kaynaklanan kendine zg bir kokusu vardr. Semende eritrositlerin bulunmas halinde renk krmz-kahverengidir. Uzun sreli cinsel perhizlerde ve pyospermide renk sarya dnr 4,10,11. 3. Volm WHO kriterlerine gre semen hacmi 2 ml veya daha fazla olmaldr. 1 mlden az olmas durumu, hipospermik olarak isimlendirilip toplama srasnda rnein dklm olabilecei, ksa cinsel perhiz sresi, retrograd ejaklasyonu veya ejaklatr kanalda darlk gibi nedenler dnlebilir. Miktar 6 mlden fazla olan semen ierii hiperspermik olarak adlandrlr, bu durumda cinsel perhiz sresi uzun veya seminal sv fazladr 2,10,11. 4. pH Normal pH deeri 7.2 8.0 arasndadr. Akut enfeksiyonlarda pH deeri 8in zerine kabilir. pHnn dk olmas sperm salnmnn yetersizlii ve bu nedenle ejaklatn daha ok asidik prostat svsndan olutuunu gsterebilir 10,11.

11

2.3.4. Semenin Mikroskopik ncelemesi Mikroskopik incelemede semen ierii; sperm konsantrasyonu, hareketlilii (motilite), morfoloji ve yuvarlak hcre says ve bu hcrelerin snflandrlmas ynnden incelenmektedir 10,11. 1. Konsantrasyon Sperm saym iin gnmzde en fazla kullanlan aletlerden biri Makler Sperm Saym Kamerasdr (ekil 4,5). 1978 ylnda Prof. Dr. Amnon Makler tarafndan sperm saym iin zel olarak tasarlanmtr. Semen rneinin incelendii kamerann 10 m derinliinde olmas spermatozoann tek bir dzlemde serbest hareketine olanak salamaktadr. Makler kameras ile spermlerin hareketlilik yzdeleri daha kesin olarak saptanabilmektedir 20,21,22.

ekil 4. Makler sperm saym kameras 21

ekil 5. Makler sperm saym kamerasnn yakn grnm 21,22

12

Gvenilir bir deerlendirme iin ideal olan Makler sperm saym aletindeki 100 karedeki spermleri saymaktr. Saym u ekilde gerekletirilir. Bir damla semen (5 l) kamerann merkezine damlatlp zerine kapak cam kapatlr. Drt adet kuvartz bacak sayesinde spermler, 10 m derinlikte yzeceklerdir (ekil 6). Bu derinlikte ancak bir adet sperm ba sabilir. Bu sebeple bir hat zerinde yaplacak saym 20x bytme altnda 10 karede motil ve non-motil sperm saylr ve 106 ile arplarak mililitredeki (x 106/ml) sperm says belirlenir. Normal sperm konsantrasyonu >20x106/ml ve totalde 40x106dur 20. .

ekil 6. Makler kamerasnda semen rneinin damlatlarak hazrlanmas 21

2. Motilite Motilite deerlendirilirken konsantrasyon saymnda olduu gibi x20 bytme altnda ve 10 karede yaplr (ekil 7). Motil spermlerin, toplam sperm saysna oran yzde olarak motiliteyi verir 10,20,22.

ekil 7. Makler kamerasnda spermlerin grnts 22

13

Dnya Salk rgt hareketlilii 4 snfta deerlendirmektedir: a- hzl dorusal progresif hareket b- yava dorusal ya da dorusal olmayan hzl hareket c- progresif olmayan hareket d- hareketsiz Normal sperm konsantrasyonunun >%50si motil ve bu deerin %25i progresif olmaldr 10,20. 3. Morfoloji Morfolojik deerlendirmede WHO veya Krugerin strict kriterleri kullanlmaktadr. WHO kriterlerine gre normal deer >%30 iken Kruger strict kriterlerine gre %14 olmaldr. Morfolojik deerlendirmede sperm ba, boyun ve kuyruk anomalileri ynnden dikkatle incelenmelidir 20,23. Sperm morfolojisi deerlendirilirken nce lam zerine yayma yaplarak seilen boya ile boyama yaplr (WHO iin Papanicolaou ve Kruger strict kriterleri iin DiffQuick veya Spermac). Deerlendirme immersiyon ya altnda yaplr tercihen 100 veya 200 sperm incelenerek % normal cinsinden sonu verilir 20,24. Kruger Strict Kriterlerine Gre Morfoloji Deerlendirmesinde Diff-Quick Boyama Teknii 5 l likefiye olmu, taze semen rnei lam zerine damlatlarak yayma yaplr. Preparat 3-5 dakika d ortamda kurutulur. 5 dakika ale ierisinde bulunan fiksatif (tesbit) ierisinde bekletilir. Boyama ilemi iin Diff-Quick boya seti u basamaklarla uygulanr I nolu boya iinde 1 dakika bekletilir ve su ile ykanr (I nolu boya: Eozin G-pH 6.6 fosfat tamponu ile) II nolu boya iinde 1 dakika bekletilir ve su ile ykanr (II nolu boya: Eozin GpH 6.6 fosfat tamponu ile) Preparat kurutulur zerine immersion ya damlatlarak (x100) faz kontrast mikroskopta incelenir. Boyama sonrasnda akrozom yeil, nkleus krmz, boyun ve kuyruk yeil boyanr 24.

14

Normal Sperm Morfolojisi Morfolojik deerlendirme Kruger kriterlerine gre yaplmtr. Normal sperm morfolojisi > %14 olmaldr (ekil 8,9). Kruger kriterlerine gre: Ba Dz oval Akrozom, ban % 40-70ini oluturur. Normal ller; uzunluk 5-6 m, genilik 2.5-3.5 m Borderline ba formlar anormal olarak snflanr. Boyun Orta ksm Abaksiyel implantasyon olmamal ve intakt olmal Silindir eklinde 1 m genilikte ve ba uzunluunun 1.5 kat uzunlukta olmal. Ba byklnn den byk sitoplazmik droplet olmamal Kuyruk Orta ksmdan hafife ince, kvrm iermeyen 45 m uzunlukta olmal 20,23.

ekil 8. Normal morfolojiye sahip, olgun sperm rnei 19

15

ekil 9. Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm grntleri 19,25

2.3.5. Spermatogenez Spermatogenez aamada incelenir: 1. Germ hcrelerinin (gametlerin) retimi, 2. Germ hcrelerinin fertilizasyon (ayn zamanda mayoz blnme) iin fonksiyonel olarak hazrlanmas, 3. Onlar aktif olarak motil klan yapsal farkllamalar 4,19.

1. Gametlerin retilmesi Embriyogenezin erken dnemlerinde, primordial germ hcreleri gelimekte olan gonadlara g ederler. Spermatogenez esnasnda bu hcreler testis hcrelerinin seminiferz tbllerinde bulunurlar. mmatr (olgunlamam) germ hcreleri spermatogonia olarak adlandrlrlar ve seminiferz tbllerde bulunan hcrelerden mitoz blnme sonucunda geliirler 4,19. 2. Fonksiyonel Farkllama Baz hcreler blnmeyi durdurarak primer spermatositlere farkllamaktadr. Her primer spermatosit redksiyon blnmesine (ilk mayoz blnme) giderek sekonder spermatosit oluturur. kinci mayoz blnme tamamlandnda drt haploid spermatid retilir 4,19.

16

3. Yapsal Farkllama Spermatidler, morfolojik farkllamaya giderek olgun spermatozoay olutururlar. Bu farkllama olay spermiogenezis olarak adlandrlr; spermatidler uzar ve flagella geliir fakat birbirlerine ve sitoplazmik kprlerle Sertoli hcrelerine baldrlar. Bu olayn avantaj, spermatidlerin ana hcreden kaynaklanan btn rnlerden faydalanabilmesidir 4,19. Spermler erkek cins bezleri (gonadlar) olan testislerde retilirler (ekil 9). Testisler overler gibi ift fonksiyonludur; sperm retiminin yansra endokrin ilevleri de vardr. Testisler yaplar ve grevleri farkl iki majr komponentten olumutur. Leyding ya da interstisiyal hcreler majr endokrin ieriine sahiptirler. Bu hcrelerin primer rn olan testosteron erkekte embriyonik geliim, pubertede sekonder seksel geliim ve cinsel gcn korunmas iin nemlidir. Testislerin byk blmn kaplayan seminiferz tbller spermatozoa retiminden sorumludur 4,19.

ekil 10. Erkek reme sistemi 19

17

Seminiferz tblleri, Sertoli ve germinal hcrelerden olumutur: Sertoli hcreler kendi ilerinde balantlar oluturmutur. Bu balantlar proteinlerin interstisiyal alandan seminiferz tbl alanna geiini engeller ve kan-testis bariyeri oluturmu olur. Sertoli hcreleri gelimekte olan germ hcrelerini sararak germ hcre farkllamas iin uygun ortam hazrlamaktadr. Bu hcreler hasara uram germ hcrelerini fagositoza uratmakta ve germ hcrelerinin spermatozoa oluumunda kullanlmayan sitoplazma paralarn da fagositozla almaktadr. FSH ya da testosterona cevap olarak Sertoli hcreleri yksek affiniteye sahip bir molekl olan androjen-balayan protein sekrete etmektedir 26. Spermlerin ejaklasyonla d ortama verilmesine kadar izledikleri kanallar testis ii (intratestikler) ve testis d (ekstratestikler) olmak zere iki grupta incelenir. ntratestikler kanallar; tubuli rekti, rete testis ve duktuli efferentes olup ekstratestikler kanallar da epididimis ve duktus deferens (vas deferens) dir. Bu kanallarn yapsal zellikleri ve dolaysyla spermlerin matrasyonuna katklar da birbirinden farkldr 26.

ntratestikler Kanallar Tubulu Rekti ve Rete Testis: Seminifer tbller ksa ve dz tbller (tubuli rekti) araclyla rete testise alrlar 26. Duktuli Efferentes: Rete testis ve epididimis arasnda yer alr, ok sral prizmatik epitelle delidir. Epitel hcrelerinin bir grubu sillidir ve sillerin hareketi ile lmendeki sv ve spermlerin epididimise doru ilerlemesi salanr 26 (ekil 11). Ekstratestikler Kanallar Duktus Epididimis: Anatomik olarak blmden meydana gelmitir. Ba (kaput), gvde (korpus) ve kuyruk (kauda). Epididimis spermlerin olgunlaarak

18

ekil 11. Testislerin yaps 19

fonksiyonel zelliklerini kazandklar kanal olarak dier erkek genital boaltma kanallarndan farkldr 26. Duktus (vas) Deferens: Duktus epididimisden balayarak prostatik retrann sonland yere kadar uzanr. Erkek genital boaltma kanallar iinde duvar en gelimi, en iyi organize olandr 26. 2.3.7. Semen Ejaklasyon Sempatik sinir sisteminin uyarlmas, epididimis ve duktus deferens kaslarnn peristaltik kontraksiyonuna neden olmaktadr. Spermatozoa ieren sv epididimis, duktus deferens ve ampllada depolandktan sonra ejaklatr kanal boyunca prostatik retraya geirilmektedir. Seminal keseler de, 2-3 ml kadar alkali bir svy ejaklatr kanal boyunca retraya sekrete etmektedir 4. Prostat kaslarn kaslarnn kasmasyla ejaklat 1-2 ml sulu prostat sekresyonu alr4. gerekletirilir. Prostatik retradan, retraya gei salanr. retra etrafndaki kontraksiyonu retrann dna gndermeye Ejaklasyon srasnda mesane kapatlarak retrograt ejaklasyonu (mesaneye ejaklasyon) nlenmi olur 4.

19

Semen Ejaklat ya da semen (meni) hipotalamo-pititer aks dahilinde testislerin ilevi ve posttestikler boaltma kanallaryla aksesuar bezlerin salglarndan oluan bir son rndr. Normal insan ejaklatnn ortalama hacmi yaklak olarak 3 ml olup 2-6 ml aralnda deiir ve iki komponenti vardr: 1. testisler tarafndan retilen spermatozoa, 2. seminal plazma; 1/3 prostat sekresyonundan, 2/3 seminal kese sekresyonundan oluur 4. Normal semen hacminin % 10unu spermatozoa, % 90n seminal plazma oluturur. Seminal plazmann en nemli grevi (pH = 7.2-7.8) spermatozoa transportu ve tampon grevi grerek vajinann pHsnn ykseltilmesidir. pH 6,2nin altna dtnde spermatozoa yavaca immobilize olacaktr. Hacmin az olmas yeterince tampon kapasitesi oluturamayaca iin spermatozoa immobilizasyonu gerekleecek, hacmin fazla olduu durumda da spermatozoa konsantrasyonu decektir. Bu durum dezavantaj gibi grlmemelidir, nk spermatozoa ejaklatn ilk ksmnda yer almaktadr 4. Seminal plazma, ejaklatn sv blmdr; erkekte eitli salg bezlerinin (epididimis, vas deferens, amplla, seminal vezikl, prostat bezi) sekresyonundan oluan bir karmdr. Ayn kiinin farkl ejaklatlarnda, seminal plazma kompozisyonu mevsimsel farkllk gsterebilmektedir. Ayrca ejaklasyondan sonra seminal plazmadaki enzim ve spermlerin metabolik aktivitesine bal olarak da seminal plazmann kompozisyonu deimektedir 26. nsan ejaklatnn ilk fraksiyonu sperm ve prostatik bir sekresyon olan sitrik asit ynnden zengindir. Fruktoz konsantrasyonu, seminal vezikllerin majr sekretuar rndr ve ejaklatn sonraki sekresyonlarnda ykselmektedir 26. Dier vcut svlarndan farkl olarak seminal plazma yksek konsantrasyonlarda potasyum, inko, sitrik asit, fruktoz, fosforilkolin, spermin, serbest amino asitler, prostaglandinler ile nemli dzeyde asit fosfataz, betaglukronidaz, laktik dehidrogenaz, alfa amilaz ve prostat spesifik antijenler iermektedir 26.

20

izelge 2. nsanda Seminal Plazmada Bulunan eitli Maddelerin Konsantrasyonlar 26

Madde Sodyum Potasyum Kalsiyum Magnezyum Klorr Bikarbonat Fruktoz Glukoz Sorbitol nozitol Laktik asit Pirvik asit Sitrik asit Glutamik asit Askorbik asit Karnitin Asetilkarnitin Gliserofosfokolin Fosfokolin Spermin Spermidin Putresin Kreatin Arjinin Ergotionin rik asit Protein (mg/ml)

Konsantrasyon (mM) 43-112 14-28 5-7 1.2-5 28-56 8 2-33 0.4 0.6 3-3.5 2.2-5.6 3.4 5.2-7.3 6.5 0.6 0.2-1.3 0.06-0.28 2.0-3.3 14-21 3 0.1 0.2 1.5 5.2 eser dzeyde 0.1-0.4 35-50

21

2.4. Malat Dehidrogenaz (MDH) ve Malik Enzimler (ME) MDH ve MEler pek ok metabolik yolun nemli enzimleridir. Bu yollar arasnda: - anaerobik solunum - trikarboksilik asit dngs - glukoneogenez - glioksilat dngs - NADPH eldesi ve ya asit biyosentezi saylabilir27 . MDH (E.C. 1.1.1.37) NAD+ baml olup sitozol ve mitokondriye yerlemitir. Mitokondride sitrik asit siklusunda nemli bir rol oynar; malat, dehidrogenasyon ile ykseltgenip okzaloasetat oluturulurken, NAD+ NADHa indirgenir 28,29,30,31. L-malat + NAD+ okzaloasetat + NADH + H+
28,29,30,31

NADH elektron transport sistemine girerek ATP retimine yardm eder. Okzaloasetat pek ok metabolik yolda nemli rol oynar; trikarboksilik asit siklusu, amino asit sentezi, glukoneogenez, oksidasyon/redksiyon dengesinin korunmas, sitoplazma ve hcre organelleri arasnda metabolit deiiminin hzlanmas bu ilevler arasnda saylabilir 27,31,32. Malat dehidrogenaz ailesi ierisinde yer alan MEler NAD(P) baml olup sitozol ve mitokondride bulunurlar. Bu enzimler, malatn oksidatif dekarboksilasyonunu gerekletirerek pirvat, NAD(P)H ve CO2 olutururlar 32,33. Mg+2 NAD(P)+ + L-malat NAD(P)H + pirvat + CO2 32 NADPH ya asit sentezi iin redkte edici ajan olarak grev alr. Ya asitleri sadece mkemmel bir enerji kayna olmayp fosfolipit tabakasnn yapsal birimlerini olutururlar. Bylece NADP+ baml dehidrogenazlar bir hcrenin metabolik ve yapsal btnlnn korunmas iin nemlidir 27,32.

22

MDH farkl kaynaklardan izole edilmitir; bakteri, algler, mantar, bitkiler, memeliler ve organeller rnein mitokondria, kloroplast, glioksizomlar ve peroksizomlar1. Doada ok yaygn olarak bulunan (ubiquitous) bu enzimler pek ok canlda iyi korunmu durumda bulunan proteinlerdir 28. MDH ile ilgili aratrmalar 1960l yllarda balam, yaps 1968 ylnda allmtr 27. 2.4.1. MDH (EC 1.1.1.37) Alternatif simlendirmeler Malat dehidrogenaz Malik dehidrogenaz L-malat dehidrogenaz NAD-L-malat dehidrogenaz Malik asit dehidrogenaz NAD-baml malik dehidrogenaz NAD-malat dehidrogenaz NAD-malik dehidrogenaz malat (NAD) dehidrogenaz NAD-baml malat dehidrogenaz NAD-zgn malat dehidrogenaz NAD-bal malat dehidrogenaz MDH Keto asit redktaz alfa-1 (KETAR) 34 . 2.4.2. MDH1 Geni in Gen Kart Tanmlama Kromozomal yerleim Proteinler Malat dehidrogenaz, sitoplazmik (EC 1.1.1.37) Kromozom Lokus Bykl Altbirim 2 2p13.3 333 amino asit 36295 Da Homodimer

Katalitik aktivite: (S)-malat + NAD+ okzaloasetat +NADH+ H+

23

Hcresel yerleim: Sitoplazmik Metabolik yollar Sitrat siklusu (TCA siklusu) Pirvat metabolizmas Glioksilat ve dikarboksilat metabolizmas Karbon fiksasyonu Redktif karboksilat siklusu (CO2 fiksasyonu) 35,36 Optimum pH: nhibitrler: 7,4 30 eitli iyodine ajanlar; tiroksin, iyot, siyanit molekler iyot SH gruplarn okside ederek (Varrone 1970) enzimi (Gutman Aktivatrler inaktive ve ederler. 2-Tenoil-trifloroaseton -1974) ve
30

Hartstein

klorotirikin

(Schindler-1975) MDH inhibe eder . Fosfat, arsenat ve inko iyonlar uyarcdr. Merkribenzoatn dk konsantrasyonlarnn aktivatr olduu gsterilmitir 30. MDH1 geni; bbrek, akcier, kalp, iskelet kas, karacier, pankreas, prostat, dalak, timus, beyin ve omurilikde eksprese edilmitir 35. MDHlar e altbirimlerden oluan multimerik enzimlerdir, dimer ya da tetramer olarak organize olmulardr. Her subnit kataliz fonksiyonu ynnden bamsz olarak hareket eder, katalitik blgeler arasnda iliki bildirilmemitir. Genellikle NAD+baml MDHlar metabolik dzenlemeye katlmazlar; mitokondrial enzim istisnadr, bir blgesinde subnit iin allosterik kontrole bamldr 28. Mitokondriyal ve sitoplazmik MDH olarak iki formdaki enzimler farkl genlerle kodlanmaktadr. Birktoft ve ark. (1982) iki enzim arasnda (ayn ekilde LDH ile de) yakn yapsal homoloji bulmular ve ortak bir ata genden geldikleri sonucuna varmlardr. Tanaka ve ark. (1996) insan cDNA ile kodlanan 334 amino asitlik bir protein izole etmiler ve fare/san sitozolik MDH ile %96 benzerlik gsterdiini aklamlardr. Yetikin insan dokularnda Northern blot analizi ile yaplan almada bu genin kalp ve iskelet kasnda yksek dzeyde eksprese edildii bildirilmitir
28

24

Floresan in situ hibridizasyon ile enzimin kromozomal yerleiminin 2p16 olduunu saptamlardr (ekil 12) 35 .

ekil 12. 2. kromozom zerinde MDH1 geninin yerleimi 35

Farede MDHn sitozolik formu Mor2 geni ile mitokondrial formu Mor geni ile sembolize edilmitir (insanda kullanlan mitokondrial ve sitozolik izozimlerin zt numaralandrma sistemi). MOR ifadesi enzimin oksidoredktaz fonksiyonu ile ilgilidir 29. MDHn yaps Haloarcula marismortuide allm ve u ekilde aydnlatlmtr (ekil 13) 27: MDH, alfa ve beta protein oksidoredktazlara aittir. 606 amino asit ve 4690 atom ile homodimerik proteindir. Her alt birim, bir koenzim balar. Her zincir 303 amino asit ierir, molekler arl 32662dir. A zinciri 11 alfa heliks ve 14 beta tabakas; B zinciri 10 alfa heliks ve 14 beta tabakas ierir 27.

ekil 13. Halofilik bir archaebacteria olan Haloarcula marismortuide MDH yaps 27

25

2.4.4. Amino Asit Dizi Benzerlii MDH amino asit dizileri, birbiriyle ilgili iki ana filogenetik enzim grubuna ayrlr. Farkl MDH izozimleri, ayn hcre eitlerinin deiik hcre organellerinde yerleim gsterir. Farkl kaynaklardaki MDH izozimlerinin dizi benzerlii kompleksdir. rnein; baz bakteri trlerinde (Escherichia coli, Salmonella typhimurium) karyotlarn mitokondriyal izozimleri ile yksek dizi benzerlii gsterirken dier bakterial MDHlar (Thermus spp) karyotik MDHlarn sitoplazmik ve kloroplast izozimleri ile benzerdir 28. MDHn aktif blgesi hidrofobik vakuolde yerlemi olup substrat ve koenzimin nikotinamit halkas iin balayc blge ierir. Enzim:koenzim:substrat boyutlu kompleks oluumuna bal olarak proteinde biimsel deiim gzlenir. Fonksiyonel olarak nemli amino asitler substrat ile yakn temasa gemitir. MDHlarn 98-110 amino asit arasndaki blgesi yksek korumaya sahiptir ve kataliz iin nemli rol oynar. MDHn farkl modler konformasyonlarnn katalitik siklusun farkl basamaklarnda rol oynadna dair bulgular mevcuttur. Floresan substrat analog almalarnda NAD+ ve NADH balanmas mitokondriyal MDHn substrat balama blgesinde iki farkl konformasyonal durum iermektedir 28. LDH ve MDH birbirlerine ok benzeyen 2-keto asit dehidrogenazlar olup eit mekanizmalarla benzer reaksiyonlar katalizlerler. Btn yapsal benzerlie ramen bu fonksiyonel olarak benzer enzimler arasnda sekans homolojisi dktr. Fakat bu enzim ailelerinde fonksiyonel aktif blge amino asitleri yksek derecede korunmu durumdadr4. LDH iin doal NADP+ spesifik enzim izole edilmemitir. Bu olay B. stearothermophilus LDHda tek amino asit (D53S) eklenmesiyle gerekletirilmitir. Bu durum unu gsterir ki LDH ve MDHda nkleotid balama karakterleri tek bir amino asit deiimiyle farkllatrlmaktadr. Ayrca ayn faktrler her iki enzimde de etkili olmaktadr28. 2.4.5. Substrat zgnlnn Dzenlenmesi Btn MDHlarda kesinlikle korunmu 3 arjinin amino asidi (R102, R109 ve R171) substrat balanmas ve kataliz iin nemlidir. R102 ve R109 haraketli blgenin altnda olup boyutlu kompleksde substrat ile etkileime girer. R109 LDHda

26

substratn transisyon aamasnda stabilizasyonunda rol oynamakta, substratn karbonil ba polarize edilerek R109 ile stabilize edilmektedir. Bu amino asidin MDHda korunmas kataliz mekanizmasnn LDHa benzer olduunu desteklemektedir 28. MDH ve LDH molekllerinin rasyonel yeni tasarmlar, tek bir amino asit deiimiyle enzim substrat zgnlnn nasl yeniden tanmlandn gstermektedir. MDHda 102. pozisyondaki amino asit arjinin; LDHda glutamindir. Tercih edilen substratlar MDH iin okzaloasetat ve LDH iin pirvattr. E. coli MDH R102Q mutant enzimi okzaloasetat substrat iin yksek derecede seicilik gstermektedir. Organizma zerinde gl evrimsel bask nedeniyle okzaloasetat iin yksek derecede seicilie sahip balayc bir mekanizma gelimekte ve R102 MDHda korunuyor gibi grnmektedir28. 2.5. Malik Enzim Malik enzim (ME) NADnin redksiyonuyla beraber L-malatn pirvata oksidatif dekarboksilasyonunu katalizlemektedir. NAD(P)+ye ek olarak enzim, divalent katyonlara (Mg+2 ya da Mn+2) ihtiya duyar (kofaktr olarak) 37,38,39,40,41. Mg+2 NAD(P)+ + L-malat NAD(P)H + pirvat + CO2 37,38,39,40,41 Bu enzimlerle malatn, pirvata dnm iki basamakta gereklemektedir; malatn oksidasyonu (dehidrogenasyon) ile okzaloasetat retilir. dekarboksilasyonuyla pirvat ve CO2 oluturulur. Okzaloasetatn MEler ihtiya duyduklar

dinkleotid kofaktre gre gruba ayrlrlar: NAD+ ya da NADP+ bal enzimler kofaktr olarak sadece NAD+ ya da NADP+ kullanr ve NAD(P)+ bal ift zgnle sahip enzimler NAD+ ya da NADP+ nin her ikisini de kofaktr olarak kullanrlar 38,40. ME aktivitesi ilk olarak gvercin karacierinde allmtr. O zamandan bu yana pek ok yaayan organizmada saptanmtr; bakteri, maya, mantar, bitki, insan ve dier hayvanlar. 40dan fazla MEin cDNA dizileri tesbit edilmitir. Memelilerde MEin izoformu bildirilmitir: sitozolik NADP+ baml ME (sNADP-ME), mitokondrial NADP+ baml ME (mNADP-ME) ve mitokondrial NAD(P)+ baml ME (mNAD-ME). mNAD-ME, NAD+ ve NADP+ yi kofaktr (ift zgnlk) olarak kullanr fakat fizyolojik artlarda NAD+ yi tercih eder 38,40,42.

27

2.5.1. Malik Enzim 1 (ME1) ME1 (EC 1.1.1.40) Alternatif isimler: ME, NADP-baml, sitozolik ME, soluble MDH, NADP-baml, soluble 572 amino asitten olumutur Molekler ktlesi 64,1kDdur ME1 geninin yerleimi 6q12 olarak belirlenmitir 43,44,45. 2.5.2. Malik Enzim 2 (ME2) ME 2 (EC 1.1.1.38) Alternatif isim: ME NAD-baml, mitokondrial 584 amino asitten olumutur Molekler ktlesi 65,4 kDdur ME2 geninin yerleimi 18q21 olarak belirlenmitir 44,45. 2.5.3. Malik Enzim 3 (ME3) ME3 (E.C.1.1.1.39) Alternatif isim ME NAD(P)-baml mitokondrial Kofaktr olarak NAD ya da NADP kullanr 2,2-kb ME3 transkripti; kalp, iskelet kas, beyin, kolon, bbrek, pankreas ve overde yksek dzeyde eksprese edilmi nce barsak, akcier ve testislerde dk dzeyde eksprese edilmitir. Karacier, periferal kan, lkosit ve plasentada eksprese edilmemitir. ME3 ekspresyonunun dk blnme oranna sahip organlarda daha fazla olduu bildirilmitir 44,45,46. ME3 geninin yerleimi 11q22.3 olarak belirlenmitir.

28

Doadaki geni dalmlarna bal olarak MEler nemli biyolojik fonksiyonlara sahiptir. ME ile katalizlenen biyokimyasal reaksiyonlar pirvat, CO2 ve NAD(P)H retir ve bu rnlerle farkl biyolojik olaylar desteklenir. rnein ME, CO2 retimi nedeniyle tropik C4 bitkilerinde fotosentetik reaksiyonlarda ok nemli rol oynar. Mantar ve dier organizmalarda NADPH retimine bal olarak MEin lipojenik fonksiyonlar vardr. Benzer ekilde memelilerde sNADP-ME izoformu NADPH oluturulmasnda, karacier ve adipoz dokuda, ya asidi ve steroid biyosentezinde rol almaktadr. sNADP-ME diyet kontrolndedir. Yksek karbohidratl diet ya da tiroit hormonlaryla indklenebilir. sNADP-ME geninin promoter blgesinde tiroit cevap elementi bulunur. sNADP-MEin vardr 38. mNAD-ME izoformu NADH ve pirvat rnlerine bal olarak hzl prolifere olan dokularda (dalak, timus, ince barsan mukozal hcreleri) ve zellikle de tmrlerde enerji retiminde nemli rol oynar. mNAD-ME glutamin metabolizmas iin nemlidir. Glutamin; plazma, doku ve hcre kltr ortamlarnda en yaygn amino asittir. Glutamin pek ok tmr hcresi iin ana enerji kaynadr, bu hcrelerin ou enerji retimi iin glukoza kesin ballk gstermez. Glutaminin pirvata metabolizmas iin olas bir yol dnlmtr 38,41. Glutamin glutamat -ketoglutarat sksinat fumarat malat pirvat
38

mikrozomal ila detoksifikasyonunda da rol

Bu yol glutaminolizizolarak adlandrlr ve glukozu pirvata dntren glikoliz yoluna analogdur. Sitrik asit dngsnde (Krebs siklusu) -ketoglutarat, malata dnmektedir. Sitrik asit siklusunda bir sonraki reaksiyon, malatn okzaloasetat retmek zere oksidasyonu olup MDH ile katalizlenir. Glutaminoliziz yolunda ise malat, oksidatif dekarboksilasyon ile pirvata dntrlr, bu tepkime ise ME ile katalizlenir38. MEler genellikle homotetramerdir. Monomerleri 550 amino asit ierir ve molekler arl 60 kDadur. Bu nedenle enzimler, dehidrogenazlardan (MDH) daha byktr. Baz bitkilerden ve termofilik bakteri B. Stearothermofilusdan heterodimerik MEler tanmlanmtr. nemli biyolojik fonkiyonlarna bal olarak deiik organizmalarn ME amino asit dizileri nemli koruma gstermektedir. rnein insan, san ve fare sNADP-MEleri %90 dizi benzerlii gsterir. nsan mNAD-ME, insan

29

mNADP-ME ya da sNADP-ME ile %55 dizi benzerlii gsterir.Yksek derecede korumayla ilgili olarak dier dikkat ekici bir rnek insan mNADP-ME ve msr kloroplast NADP-ME %47 amino asit dizi benzerlii paylamasdr 38. mNAD-ME, dier iki memeli ME izoformundan farkldr. Substrat malata bal olarak ME kooperatif bir enzimdir ve katalitik aktivitesi allosterik olarak fumarat (dk dzeyde sksinat) ile kontrol edilir. Fumarat, aktivatr; ATP inhibitr olarak alr. Fumarat ve ATP, sNADP-ME ve mNADP-ME in katalitik aktivitesi zerinde etki gstermez (ekil 16) 38,39

ekil 16. nsanda mNADME kompleksi. (A) nsanda mNADME monomerinin ematik yaps. NADH molekl aktif blgededir, NADH moleklnn ADP blm da doru yerlemitir. (B) Enzim tetramerinin ematik yaps. Fumarat molekl (F) dimer interface arasnda yer alr 39,42

30

ekil 17. Malik enzimin aktif blgesi 42 (A) Stereo diagram enzimin katalitik amino asitlerini ve katyon ligandlarn gstermektedir. (B) Diagram, ak ve
2,13

kapal .

formda

aktif

blgede

amino

asitlerin

konformasyonunu

karlatrmaktadr

mNAD-MEde 4 monomer tetrahedral konumda deil planar pozisyondadr. Tetramer; dimer dimeri grnmndedir. Bu bilgi biyokimyasal almalarla uyumludur. nk MEin solsyonda monomer dimer tetramer eklinde dengede bulunduu gsterilmitir. Gvercin karacier ME tetramerinde yaplan kinetik ve substrat balama almalar ile tetramerin 4 aktif blgesinden (ekil 18) ikisinin katalitik olarak yarma halinde olduu bildirilmitir 38,42 . Enzimin her monomerinin NAD+ balayan 2 blge ierdii; ikinci NAD+ balayc blgenin katalitik blge olduu (ekil 19) dnlmektedir. NAD+nin bu blgeye balanmasnn biyolojik fonksiyonu bilinmemektedir. Doal ligandlarn bu balanma blgesine olan benzerlii bilinmemektedir. Fakat yapsndan u

31

anlalmaktadr ki bu ikinci blge mNAD-MEin allosterik inhibitr olan ATPnin balanma yeri olabilir. ATPnin insanda iki ME izoformunun katalitik aktivitesi zerinde etkisi yoktur. Bylece bu balanma blgesinde nemli olan Arjinin amino asitleri (R197, R542, R556) dier iki ME izoformunda bulunmazlar 38.

ekil 18. Malatn enzim zerinde aktif blgeye balanmas . (A) Stereo diagram malatn aktif blgeye balanmasn gstermektedir. (B) Malat ve aktif blgede enzim arasnda hidrojen ba etkileimleri (C) NADH/malat ve NAD+/okzalatn enzime balanma modlar (D) Aktif blgede malat molekl iin 2.3 Ada rezolsyonda elektron younluu haritas 42 .

MEin katalitik aktivitesi yeni bir snf oksidatif dekarboksilaz olup divalent katyonlara (Mg+2 ya da Mn+2) ihtiya duyar. Katyonun katalizde nemli rol oynad, malat zerinde hidroksil grubunu polarize ederek dehidrogenasyonu hzlandrd ve ardndan dekarboksilasyon basamanda okzaloasetatn karbonil grubunu polarize ettii bildirilmitir 40.

32

ekil 19. Malik enzimin katalitik mekanizmas 42 (A) Substrat balanmadan nce enzim ak formda (B) Malatn balanmasyla enzim kapal formda Lizin183 ntr formda ve C2 hidroksilden proton karmak iin hazr durumda (C) Dekarboksilasyon reaksiyonu sonras; Tirozin112 C3 atomunu protone etme durumunda (D) Pirvata tautemerizasyon sonras 2,13.

33

2.5.4. MDH ve MEin Klinik Olarak nemi MDHn zellikle mitokondriyal izoenzimlerinin; hepatoseller karsinoma, akut dolam yetersizlii ve akut hepatitin dzeyini deerlendirmede faydal olduu bildirilmitir 47. ME, nemli metabolik rol nedeniyle parazitik bir nematod olan Ascaris suum ile ilgili aratrmalarda nemli bir yer edinmitir 48. zcan ve ark.nn yaptklar bir almada patojen bir parazit olan Entamoeba Histolytica sularnn patojen olmayanlardan ayrt edilmesi iin kltrde retilen rneklerde elektroforetik ayrm yaplm Entamoeba Histolytica sularnn farkl yrd izlenip MEin tanda yararl olduu gsterilmitir 49. E.colide yaplan bir almada NAD-bal MDH aktivitesi sonucunda oluan bir rn olan okzaloasetatn hidrojen peroksiti temizleyerek antioksidan rol oynad bildirilmitir 50. diopatik epilepsi (Idiopathic generalized epilepsy) genetik olarak saptanm epilepsi sendromudur. Greenberg ve ark. ME2-merkezli 9-SNP haplotip homozigot olarak bulunduunda idiopatik epilepsi riskinin arttn bildirmilerdir 44.

34

2.6. Laktat Dehidrogenaz ve C4 zoenzimi Glikolitik yolun son enzimi olan Laktat Dehidrogenaz (LDH) ( L-laktat:NAD+oksidoredktaz katalizlemektedir E.C.1.1.1.27)
51,52,53

sitozolik

bir

enzim olup

aadaki

reaksiyonu

Pirvat + NADH Laktat + NAD 51,52,53 LDH, memelilerde iki farkl altbirimin birleiminden oluan be tetramerik izozim olarak bulunur. zozimler katalitik, fiziksel ve immnolojik zellikleri ynnden farkllk gstermektedir. Cahn ve ark. (1962) polipeptit altbirimlerini H ve M olarak gstermiler. ki saf izozim eidi H4 ve M4; hibritler ise H3M, H2M2, HM3dr. H altbirimi, kalp kas; M altbirimi iskelet kas ve karacierde baskndr. Bu alt birimler bir ok kaynakta A ve B olarak tanmlanmtr. LDH klinik olarak nemlidir. nk baz izozimlerinin
51,52,53

serum .

dzeyleri

belirli

dokulardaki

patolojik

durumlar

gstermektedir

Testis ve spermatozoada sperm izozimi (izozim x) tanmlanmtr (Zinkham ve ark. 1964; Stambaugh ve Buckley 1967). McKee ve ark. (1972), Spielman ve ark. (1973); Goldberg (1972) immnolojik ve enzimatik olarak LDH-Xin deiik formlarn aklamlardr 54,55 . Olgun insan testisi (Blanco ve Zinkham,1963; Blanco ve ark. 1964) ve sperminde (Goldberg,1963;1964) altnc izozimin bulunmas, LDHn nc bir polipeptit altbiriminin bulunduunu gstermekte olup bu LDH-X olarak gsterilir. Zinkham ve ark. (1964) LDH-Xin olgun spermatozoada en baskn fraksiyon (LDH-C4) ve memeli sperm hcrelerinde iso-, allo- ve otoantijen olan tek izozim olduunu gstermilerdir
55

. Sperme zg LDH c geninin insanda 11. kromozomun ksa kolu

zerinde bulunduu bildirilmitir 56. nsanda, olgun testis ve spermde altnc izozimin gsterilmesinden sonra pek ok canlda A ve Bden baka LDH kodlayan gen bulunduu bildirilmitir (Markert ve ark. 1975). Bu gen nc LDH lokusu olarak karakterize edilmi, memeli testisi ve baz kularda gzlenmitir. Altbirim, (C) allelik genlerinin rn olup A ve B altbirimlerinin rnlerinden farkldr. Bu izozimin altbirimi LDHn A ve B altbirimleriyle in vivo koullarda etkileime (gvercin ve domuz hari) girmez (Blanco ve ark., Miskert 1963). Fakat bu etkileim in vitro artlarda (Goldberg 1965) uygun olarak gerekleir. Daha

35

sonraki almalarda Gavella ve Liporac insan sperm ve testisinde ek bir LDH formunun bulunduunu, B ve C altbirim heteropolimerlerinden olutuunu gstermilerdir 55. Testiste LDH-C sentezi cinsiyet olgunlamas srasnda gereklemekte ve LDHC olgun spermatozoada en baskn LDH fraksiyonu olmaktadr (Zinkham ve ark. 1964). Bu izozimin katalitik zellikleri olgun sperm hcrelerine ek olarak spermatogenezin metabolik ihtiyalar nda da aratrlmtr. Saflatrlan proteinin yapsal almalarnda gsterilmitir ki LDH-C4 farkl bir gen rn olup LDH izozimlerine geni homoloji gsterir. nsan ve tavanlarda yaplan biyokimyasal almalar LDHC4 n dier izozimlerden farkl zellikleri olduunu aklamtr 55,57. 2.6.1. Ontogen ve Testiste Yerleim allan her memelide LDH-C4n sadece testis ve spermatozoada bulunduu dier erkek yada kadn dokularnda olmad bildirilmitir. Dizi analiz almalar LDHC4n A4 ve B4 izozimlerinden farkl olduunu aa karmtr (Li ve ark.1983a; Whitt, 1984). Bu gen ayn oranda evrimlemi olsayd, LDH c geninin A ve B genlerinin elde edildii ortak atadan geldii dnlecekti. Fakat fare ve sanda C4 izozim dizileri beklenilenden deiik bulunmutur. Bu durum C4 izoziminin A4 ve B4 izozimlerinden daha hzl evrimletii grn ne karmaktadr (Whitt, 1984). Bylece Ldh c geni, Ldh-a yada Ldh-b geninden sonra gelimi olup yap ierisinde deimi olabilir 55. LDH-C4 ve spermatogenez arasnda bir ba vardr; prepubertal erkekler bu enzime sahip deildir ve LDH-C4 dzeyi testis olgunlamasyla artar. Fare ve sanlarda hipofizektomi yaplmasndan sonra LDH-C4 kayb ve seminiferz epitelinde gerileme kaydedilmitir (Goldberg ve Hawtrey 1968; Goldberg review,1977). Hintz ve Goldberg (1977) hcre dzeyinde, spermatogenezin ilk basama olan midpaiten spermatositlerinde flresan younluu ile LDH-C4 tesbit etmiler ve spermatogenezin ilerlemesiyle dzeyin arttn gstermilerdir. Bylece Ldh c geni, spermatogenezde zel bir zamanda aktive olmaktadr. Bu olay bir geliim programnn kontrol altnda olmaldr nk bu kompleks farkl bir diziye ynlendirilmektedir. mmnoflresan teknii kullanarak C4n fare ve tavanda sperm yzeyinde bulunduu gsterilmitir (Erickson ve ark. 1975) 28. Tilki testisinde de LDH-C ilk

36

olarak paiten spermatositlerinde ve sperm plasma membranna yerlemi durumdadr (Bradley ve ark.1996). Li ve ark. (1989) LDH-C4n germ hcrelerinde dalmn yeniden almlardr. Bu izozim, paiten spermatositleri, yuvarlak spermatidler ve kondanse spermatidlerde baskn durumda olup olgun spermatozoa sadece LDH-C izozimi iermektedir. Somatik hcrelerdeki LDHlar B altbirim iermekte olup bu altbirim germ hcrelerinde spermatogenez boyunca bulunmaktadr. Sertoli hcreleri, A ve B altbirimlerinin birleimi sonucu oluan btn izozimler iin pozitif durumdadr. Burgos ve ark. (1995) ise LDH-C4n spermatosit sitozol, spermatid, spermatozoa ve sperm mitokondria matriksinde yerleimi konusunda almalar yapmlardr. Spermatozoada bulunan total LDH-C4n %10 orannda LDH sperm yzeyinde, %85 ve %10 kadar da srasyla sitozol ve mitokondride dalm durumda olduunu gstermilerdir (Alvarej ve Storey, 1984) 55. 2.6.2. LDH-C4n Kinetii LDH-C4, kinetik zellikleri ve substrat zgnl ile A4 ve B4 izozimlerinden farkldr. eitli yazarlar tarafndan testikler izozimin deiik katalitik zellikleri aklanmtr (Battelino ve ark.1968; Hawtrey ve Goldberg, 1970). Fare LDH-C4 yksek derecede termostabiliteye sahip olup LDH-A4 ve Goldberg, 1975; Coronal ve ark. 1983; Gupta ve Goldberg, 1981)55. 2.6.3. Substratlar (Metabolik nemi) Btn LDH izozimleri pirvat ve laktat dnmn katalizler fakat bu olay deiik kinetik zelliklerle gerekleir (Battelino ve ark. 1968; Coronal ve ark. 1983; Gupta ve ark. 1988). Etkileimde zorunlu bir dizilim vardr; nce koenzim balanr sonra substrat. Balkta allelik izozimler (B altbirimler) kinetik zellikleri ynnden deimekte ve baln farkl ortamlara adapte olmas ynnden nemli olmaktadr. Sr ve domuz kalbi LDHnda pirvatn ketoformu substrat olarak kullanlr. LDH tarafndan kullanlan dier substratlar eitli -hidroksi ve hidroksi-btirat ve -ketoasitler olup -ketobtirat ierir (Schatz ve Segal 1969). -hidroksi-btirat ve ve LDH-B4 ile karlatrldnda farkl substrat ihtiyalar vardr (Hawtrey ve Goldberg, 1970; Wheat

-ketobtirat, pirvat ve laktat ile karlatrldnda dk Vmaks deerine sahiptir. Goldberg (1977) LDH-C4n substrat zgnl ve kinetik parametrelerini dier LDH

37

izozimleri ile karlatrmtr. LDH-C4 zellikle -ketoasitler iin geni bir substrat ve koenzim zgnlne sahiptir. LDH-Cnin Km lmleri laktat iin yksek duyarla sahip olduunu gstermitir (Gupta ve ark..1988). Substrat transformasyonu iin turnover says somatik LDHlarda ok daha dktr. Mita ve Hall san testisinde yuvarlak spermatidlerin, laktat enerji kayna olarak kullandn gstermilerdir. Glioksilat LDH iin substrat olarak kullanlabilir. Glioksilat, glikolik asite redklenebilecei gibi okzalata okside olabilir (Warren,1970). Reaksiyon karmnda katalitik dzeylerde koenzim bulunduunda LDH, kanizaro (canizarro) reaksiyonunu katalizler; glioksilatn %50si redkte, %50si okside olur. LDH-C4 testiste LDH-A ve LDH-Bnin yerine gemesi spermin zel adaptif metabolizmas olduunu gsterir. Spermatozoa LDH-C4 testikler germ hcrelerinde bulunur ve laktat ana enerji kayna olarak kullanr. Laktat rete testis svsnda, oviduktal svda ve seminal plazmada yksek konsantrasyonlarda bulunur. Sertoli hcreleri spermatide laktat salar (Mita ve Hall, 1982). Plazmadan dier substratlarn difzyonu germ hcre metabolizmasnn desteklenmesi iin uygun deildir. Yukarda ifade edildii gibi LDHC4 sperme zg bir enzim olup spermin plazma membranna yerlemitir ve dier somatik LDH izozimleriyle karlatrldnda farkl bir dalm sergiler. Sperm LDHC4 n sperm motilitesi iin gerekli enerjiyi retmek zere seminal plazmadan laktat kulland ne srlmektedir. Fakat Yoshida ve ark. (1989) farkl olarak saflatrlm LDH-C4n pirvat ve insanda -ketoglutarata olan duyarllnn laktattan daha yksek olduunu gstermilerdir. Substrat konsantrasyonunun artmasyla (zellikle laktat) LDH-C4n gl bir ekilde inhibe olduu bildirilmitir. LDH-C4 san epitelinde lsin metabolizmasnda nemli rol oynuyor gibi spermatogenik

grnmektedir (Grootegoed ve ark. 1985). Sertoli hcreleri lsini, metil-2 oksovalerata ve spermatosit ile spermatidler de 2-hidroksi-4-metil valerata dntrmektedir. Bu dnm spermatojenik hcrelerin sitozolnde LDH-C
4 ile

katalizlenmektedir 55.

E colide insan c-DNA ile retilen Ldh-C, 35 kDaluk altbirimden olumu ve enzimatik olarak aktif 140-kDaluk tetramer aa kmtr. Hcre kltrlerinden saflatrlan LDH-C4 sya dayankldr, 0.3 mMn zerindeki pirvat ile inhibe olur ve bu izozim Kmi pirvat iin 0.003 mM ve turnover says 14000dir (nmol NADH okside/mol LDH/dakika) (Levan ve Goldberg 1991) 55.

38

2.6.4. nhibitrler LDHn en etkili inhibitr pirvat ve NAD+nin redkte durumda eklenmesidir. Redkte pirvat (Acpy) ve NAD+ eklenmesi, NAD+ -pirvat ilavesinden daha iyi bir inhibitrdr. Oksamat, pirvat substrat olarak kullanldnda LDH izozimlerinin yarmal inhibitrdr. N-izopropil oksamat LDH-C4 n yarmal inhibitrdr. Oksamat yapsndaki izopropil zincir LDH-C4 iin yksek affinite gsterir , dier izozimler iin affinitesi dktr 55. Btn LDH izozimleri slfidril ajanlarla inhibe olmakta ve bu etki sistein 165 (Sis165) zerinden gereklemektedir (Holbrook ve ark. 1975). Bu amino asit esansiyel tiyol olarak adlandrlmakla beraber katalize katlmaz. Aktif blgeye modifiye ajan eklenmesi, koenzim balanmas ve katalizi engeller, inhibisyon gerekleir. Bu amino asit evresindeki dizi aratrlm ve eitli LDH izozimlerinden dodekapeptit olarak izole edilmi olup ok iyi korunmutur (Taylor ve Oxley, 1976). Bu peptit zellikle ilgi ekmektedir; nk farede LDH-C, civa ieren ajanlarla ksmen inhibe olmaktadr. Bunun Sis165 delesyonu ya da bu amino asit evresinde LDH-C
4

modifikasyon ile gerekletii ne srlmektedir (Goldberg 1972). somatik LDHlarla karlatrldnda inhibisyona daha az duyarldr 55.

dier

slfidril ajanlarn kataliziyle gerekleen

Gossipol, pamuk bitkisinden elde edilen bir polifenolik pigment olup LDH-C4 n gl bir inhibitrdr. NAD-laktat reaksiyonuyla ilgili olarak gossipol yarmal bir inhibitrdr. Fakat NADH-pirvat sisteminde gossipol yarmal olmayan bir inhibitr olarak grev alr (Gupta ve ark.). LDH izozimleri arasnda LDH-C4 gossipole en hassas olandr ve erkeklerde fertilite reglasyonunda duyarl bir hedef olarak yer alr 55. 2.6.5. Molekler zellikleri LDH-C tipi LDH altbirimleri btn vertebrallarda 35 kDa arla sahiptir; fakat her canlda her altbirimde amino asit kompozisyonu deimektedir. stisna durumlar, baz canllarda 70 kDaluk dimerlerden oluan LDHlar grlrken baz canllarda da tetramerler saptanmtr (Goldberg 1977). Pan ve ark. fare ve san dokularnda LDH-Cde 330 amino asitlik dizilimini almlar, LDH-A ve LDH-B ile karlatrmlardr. Sonu olarak A, B,C altbirim dizilerinde byk bir varyasyon gsterilmitir. Li ve ark. (1983b) deiik canl ve dokulardan elde edilen fare ve san

39

testisini de ieren yedi LDH izozimini, amino asit dizilim varyasyonu ve tm dehidrogenaz polipeptit zincir ve domainleri ynnden karlatrmlardr. Koenzim balama domaininin substrat balama domaininden daha fazla korunmu olduunu bulmulardr; testikler LDH-C
4 4

izoziminin ise loop ve

4

D heliks blgesinin
2

diziliminin somatik LDH-A

ve LDH-B

izozimlerinden ok farkl olduu, NH

terminal kolunun tamamiyle deiken olduunu saptanmlardr . LDH-C izoziminin amino terminalinde yirmi amino asit byk deikenlik gsterir. Bu amino asitlerin birincil grevi dier altbirimlerin karboksi terminal blgesiyle etkileime girerek tetramerik LDHn kuarterner yapsnn stabilizasyonunu salamaktr (Adams ve ark.. 1973). Vertebrallarda filogenetik aaca gre incelenen yedi LDH yapsndan LDH-A ve LDH-B 4 izozimlerinin birbirlerine benzerlii C4lerden daha fazladr 55.
4

ekil 20. LDH moleklnn yaps 58

2.6.6. LDH-C4 le mmnizasyona Bal Olarak nfertilite Kemirgenler, tavan ve habemaymununda yaplan almada, saflatrlm heterelog LDH-C4 ile hayvanlarn immnizasyonu sonucunda fertilitede azalma olduu fakat tamamen infertilite gereklemedii bildirilmitir (Godberg, 1973; Lerum ve Goldberg 1974; Goldberg 1975; Goldberg ve ark. 1981; Gupta ve ark. 1994). LDHC4e kar gelitirilen antikorlar fertiliteyi iki ya da daha fazla yolla basklamaktadr. IgG ile enzim aktivitesinin basklanmas, spermin enerji metabolizmasna zarar vererek sperm fonksiyonlarn yok edebilmektedir. LDH-C4 yzeyinde, antikor balama blgeleri sperm agltinasyonuna yardm edebilmektedir (komplement yardml

40

sitotoksisite gibi) (Goldberg ve ark. 1981). Kadn reme kanalna anti LDH-C4 serum transfer edildiinde sperm transportunun nemli dzeyde inhibe edildii (Kille ve Goldberg, 1979) bildirilmitir. Her iki cinsiyetin de immnizasyonundan sonra iftleme gerekletirilmesi belirgin sinerjistik (synergistic) etki oluturmamtr. Gupta ve Kinsky, dii farenin LDH-C4 ile sistemik immnizasyonundan sonra izogenik gebelik orannn etkilenmediini gstermilerdir. mmunize edilmi kemirgenlerde nemli sayda canl embriyo elde edilmitir. LDH-C4n dii fertilite oran zerinde bir etkisi varsa bu etki heterelog bir antijenle hayvanda immnizasyon gerekletirildikten sonra gzlenmelidir. mmnize erkeklerin dii fareyi fertilite yeteneinin kaybolduu saptanm bunun da testikler enfeksiyon ya da oto immn benzeri aktiviteye bal olabilecei aklanmtr 55. mmnize erkeklerde spermosit interaksiyonun nasl interferans verdii tam aklk kazanmamtr, spermin ovidukta tanmasnda etki gzlenmemitir. mmnizasyondan sonra epididimisde sperm agltinasyonu gzlenmi olmas spermin antikorlarla etkileimi sonucunda agltine olduu ve bylece fertilizasyonun engellenmi olabilecei bildirilmitir (Gupta ve MAlhotra, 1994). Burada LDH-C4n diilerde alanma iin antijen olarak kullanmndan nce, erkeklerde gvenilirliinin ortaya konulmu olmasnn gerektii tavsiye edilmektedir 55. 2.6.7. Testis Hasar ve nfertilitede Bir Marker Olarak LDH-C4 Spermatogenezdeki patolojik bozukluklar, LDH-C4 de de bozukluklara neden olmaktadr. Bu izozim, azospermi ya da aspermi durumundaki infertil erkeklerin seminal plazma ya da testikler biyopsilerinde saptanmamtr. Virji ve Eliasson (1985) LDH-C4 / sperm aklamtr 55. Gavelle ve Cvitkovi (1985) ile Velasco ve ark. (1993) seminal svda LDH-C4 erkek iin infertilite indeksi olduunu aklamlardr. LDH-C4 ayrm; oligospermik ve normospermik gruplar ile fertil ve fertilitesi ispatlanm gruplarda iyi tanmlanm durumdadr. LDH-C4n germinal aktivite ve spermatozoid kalitesinin deerlendirilmesinde klinikte nemli bir marker olduu sonucu vurgulanmtr 55. orannn, seminiferz epitel etkinliiyle ilgili olduunu

41

2.7. Reaktif Oksijen Trleri ve Antioksidan Koruma nfertilite her alt iftten birinde grlmekte ve en yaygn sebep olarak sperm fonksiyonundaki bozukluklar gsterilmektedir (Hull ve ark. 1985). nsanda semen kalitesinin ylda % 3 azald ve erkek reprodktif problemlerinin artt (Auger ve ark. 1995) bildirilmitir. Bu nedenle erkek infertilitesinin sebepleri, sperm hcre yaps ve biyokimyasndaki defektler ile fertilizasyon potansiyelinin nasl etkilendii aratrlan konular arasndadr 59. 2.7.1. Reaktif Oksijen Trleri ve Oksidatif Stres Oksijen ve oksijen kaynakl oksidanlar genel olarak reaktif oksijen trleri (ROT) olarak bilinip bunlarn oluturduu hcresel hasardaki art oksidatif stres olarak ifade edilmektedir 60,61,62. ROT son derece reaktif, okside edici ajanlar olup serbest radikal snfna aittir. Serbest radikal (oksijen kaynakl olmayabilir) bir ya da daha fazla paylalmam elektron ieren bileiktir. En yaygn ROT; speroksit anyonu (O2 -), hidrojen peroksit (H2O2), peroksil radikali (ROO-) ve ok reaktif hidroksil (OH-) radikalidir. Azot kaynakl bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO) ve peroksinitrit anyonu (ONOO-) reme ve fertilizasyonda nemli rol oynamaktadr 60,61. Serbest radikaller erkek fertilitesi zerinde nemli role sahiptir. Oksidatif strese bal olarak spermde fonksiyon kaybnn ROTnin fazla retimiyle ilgili olduu gsterilmitir. Baka bir aklamaya gre, dk dzeydeki ROT baz sperm fonksiyonlarnn fizyolojik kontrolnden sorumludur. H2O2 sperm zerinde hem faydal hem de zararl etki oluturarak fertilizasyon olayn etkilemektedir 60,61. 2.7.2. Oksidatif Stres ve Lkositler Semende lkositlerin (en fazla granlositler) bulunmas ciddi erkek faktr kaynakl infertilite olgular ile ilgili bulunmutur. Semendeki lkositlerin esas kayna, etki mekanizmas, bakteri, virs ve genitoriner-inflamasyonlarn sperm fonksiyonundaki rol tam aklk kazanmamtr. Semende lkosit bulunmas spermatozoann in vitro fertilizasyon kapasitesini azaltmad fakat ykanm sperm rneklerinde lkositlerin ROT retimine neden olarak sperm fonksiyonunu azaltt aklanmtr. remeye yardmc tedavi tekniklerinde kullanlan sperm hazrlama

42

yntemlerinin (percoll gradient/sperm ykama/sentrifgasyon) seminal plazmann koruyucu etkisini ortadan kaldrd ya da spermatozoa tarafndan ROT retiminde arta neden olduu bildirilmitir 60. Lkositospermi ve ROT arasndaki ilgi, semende artan kemokin (IL-8) ve azalan SOD aktivitesiyle ilgili bulunmutur. Defektif ROT sisteminin, lkositospermi ile beraber oksidatif streste arta neden olmasn belirli proinflamatuar sitokinlerin ynlendirmi olabilecei ne srlmtr 60. 2.7.3. Oksidatif Stres ve Sperm Fonksiyonu Aitken ile Clarkson (1987) ve Alvarez (1987) insanda spermatozoann ROT oluturabileceini ve sperm fonksiyonlar zarara uradnda bu etkinin daha da artacan bildirmilerdir. Spermatozoa plazma membrannda, yksek konsantrasyonda poliunsatre ya asitleri bulunmas nedeniyle daha fazla oksidatif strese maruz kalmakta ve hcre membrannda oluan peroksidatif hasar membrann daha geirgen olmasna neden olmaktadr 59 . Spermatozoada oluturulan ROT indksiyonlu hasarn mekanizmalar, sperm plazma membran lipitleri zerinde oksidatif etki oluturarak lipit peroksidasyon kaskatnn balamasna neden olur. Bunun sonucunda spermatozoa hareket, akrozom reaksiyonu ve sperm-oosit fzyon yeteneini kaybeder (Jones 1979, Aitken 1993). Oolemma ile membran fzyon olaylar ve akrozom reaksiyonu ROT-indksiyonlu hasara motiliteden daha elverili durumdadr (Aitken 1989). Ayrca ROT sperm aksonimi, DNA, RNA ve protein sentezini (de Lamirande ve Gagnon, 1992), mitokondrial fonksiyonu etkiler 59. 2.7.4. Lipit Peroksidasyonu nsan spermatozoas, ekzojen H2O2 varlnda oluan lipit peroksidasyon rn nedeniyle hareket kaybna maruz kalmaktadr. Sperm plazma membrannda bulunan unsatre ya asitleri yapya akkanlk kazandrp fertilizasyonla ilgili olarak, membran fzyon olaylarnda etkili olmaktadr. Bu molekllerde ift ba bulunmas onlar serbest radikal etkilerine maruz brakp lipit peroksidasyon kaskatnn balamasna neden olmaktadr. nsan spermatozoasnda lipit peroksidasyonu (Aitken, 1992) baladnda sperm plazma membrannda lipit peroksitlerinin birikmesine neden olmaktadr. Lipit

43

peroksitleri membran akkanln deitirerek membran baml anahtar enzimlerin (rnein Ca+2/Mg+-ATPaz; bu hcrelerde kalsiyum homoestaznn korunmasnda nemli) aktivitesini negatif ynde etkilemektedir 59,62.

2.7.5. Antioksidan Korumalar Semende oluan hcresel hasar, ROT oluumu ve antioksidan koruma arasndaki dengenin salanamamasndan kaynaklanmaktadr. Gonadlar ve seminal svda antioksidan koruma speroksit dismutaz (SOD), katalaz, glutatyon peroksidaz ve redktaz sistemi ile salanmaktadr. Bu denge oksidatif stres dzeyi (OSD) olarak tanmlanp sperm hasar ve infertilitede nemli rol oynayabilmektedir 60. SOD, speroksit anyonunu (O2 -) O2 ve H2O2e ve katalaz da H2O2 i H2O ve O2 e dntrr 60.
SOD

2(O2 ) + 2H H2O2

--------------------------- H2O2 + O2
Katalaz
-----------------------------------------

H 2 O + O2 speroksit

SOD ve katalaz, ntrofillerde NADPH-oksidaz sonucu oluan anyonunu (O2 )

-

temizler, lipit peroksidasyonunun azaltlmasnda ve spermatozoann

genitoriner infeksiyona kar korunmasnda nemli rol oynar 60. Glutatyon peroksidaz (GPX) Selenyum ieren bir antioksidan enzim olup eitli peroksitlerdeki (H2O2) peroksil radikalinin elimine edilmesini salar. Glutatyon (GSH) elektron vericisi olarak davranr, okside glutatyon (GSSG) oluur. GSSG, glutatyon redktaz (GR) ile NADPH varlnda redkte edilir. GSH dislfit yapda olan GSSG ile bir denge oluturur 60. GPX 2GSH + H2O2
------------------------------------

GSSG + 2 H2O

GR GSSG + NADPH + H+ ------------------------- 2GSH + NADP+

44

Irvine D.S, antioksidan enzimlerin ejakle edilmi insan spermatozoasnn korunmasna katlp katlmadnn eliki halinde olduunu bildirmitir. nk bu enzimler sperm orta parasnda sitoplazmaya yerlemi durumdadr. Bu durumda sperm iin nemli olan ba ve kuyruk ksmlarnn plazma membrann koruyamamaktadr. nsan spermatozoasnn gze arpan bir zellii sitoplazmik alann eksiklii olup spermi oksidatif strese daha elverili konuma getirip antioksidan savunma kapasitesini azaltmaktadr. Mitokondriyann yksek younluu nedeniyle oksijen radikalleri sitoplazmada (orta parada) birikebilir; oysa spermatozoann oksidanlar temizleme yetenei kstldr.Bu nedenle seminal svda antioksidan kapasite bulunmas zorunluluu domutur. Seminal plazma potansiyel bir antioksidan kaynadr ve SOD (Kobayashi ve ark.1991), rik asit, alfa tokoferol, E vitamini (Jones ve ark. 1979, Zini ve ark.1993) ierir 59. Ejakle olmu spermatozoann oksidatif strese maruz kald bilinmekte olup intraseller ve ekstraseller mekanizmalar bu hcreleri spermiogenezden sonra, epididimal tama esnasnda ve ejaklasyondan sonra hasara kar korumaktadr. Oksidatif stres spermatogenez srasnda da oluabilir ve erkek infertilitesinin patofizyolojisinde rol alabilir. Antioksidan enzimler katalaz, SOD,GPX ve glutatyon transferaz (GTR) ve heksoz monofosfat yolu san testisinde bulunmakta olup testikler geliim srasnda bu enzimlerde nemli deiiklikler gzlenmitir 59. 2.7.6. Glutatyon nsanda bulunan nemli bir antioksidan, glutatyon tripeptidi olup oksidatif hasar ve toksinlere kar korumada merkezi rol oynar; glutatyon peroksidaz ve glutatyon Stransferaz iin ko-faktr olarak grev alr. Glutatyon ve glutatyon S-transferazn remede nemli rol oynad bildirilmitir fakat seminal svda glutatyon ve glutatyon S-transferaz hakkndaki literatr bilgileri kstl durumdadr 59,63. Redkte glutatyon (GSH) vcudun pek ok organ ve dokusunda bulunur ve yksek antioksidan zellie sahiptir (Meister,1992). Glutatyon memeli hcrelerinde en yaygn olarak bulunan non-protein tiol bileiidir (Irvine 1996). GSH biyolojik olaylarda anahtar rol oynar; protein ve DNA sentezi, amino asitlerin tanmas gibi. Fakat glutatyonun en nemli rol hcreleri oksidasyona kar korumalardr; slfidril

45

grubu (SH) gl bir nkleofil olup oksidanlar, elektrofiller ve serbest radikallere kar korumada etkilidir (Levy ve ark. 1993). San ve fare testisinde yksek konsantrasyonlarda glutatyon tesbit edilmitir (Grosshans ve Calvin, 1985). Spermatogenez sresinde san testisinde glutatyon konsantrasyonunda 3 kat art saptanmtr. Hamsterdan izole edilen spermatosit ve spermatidleri, yksek konsantrasyonda GSH iermekte, glutatyon sentezi yapabilmekte ve glutatyon-baml savunma mekanizmalarn kullanabilmektedir (Den Boer ve ark.1989,1990). Testis, reme kanal svlar ve epididimal spermatozoada belirli dzeylerde glutatyon bulunmasna ramen ejakle edilen spermatozoada daha az dzeyde bulunmaktadr (Agrawi ve Vahna-Perttula, 1988). Glutatyon kullanmnn erkek infertilitesini iyiletirmesi nedeniyle glutatyon dzeyini ykselten bileikler erkek infertilite tedavisinde kullanlmaktadr 65. Sistein glutatyon sentezinin nc maddesidir. Glutatyon, insan dokularnda bulunan amino asit (sistein, glisin ve glutamik asit) tripeptittir 63. Sistein (serbest bir amino asit) potansiyel olarak toksiktir, gastrointestinal kanal ve kan plazmasnda spontan olarak katabolize olur ya da ykma urar 63. zincirinden oluan bir

COO| H C CH2 SH | NH3

ekil 21. Sistein 63

Glutatyon sentezinde ilk reaksiyon, hz belirleyici bir basamaktr ve glutatyon geri dnmyle inhibe olur. Bunun anlam, yeterince glutatyon sentezlendiinde reaksiyon kendi son rn ile inhibe olur. kinci reaksiyonda glutatyon ile byle bir inhibisyon yoktur63.

46

Glutamat | ATP ADP + Pi | Sistein | - Glutamilsistein | ATP ADP + Pi | Glisin | SH | 0 CH2 0 | C NH CH C NH CH2 | | COO CH2 | CH2 | CH NH3+ | COO
ekil 22. Glutatyon sentezi 63

Glutatyon, ntralizasyon ya da zararl oksiradikallerin yok edilmesi iin kullanldnda bu geri dnml kontrol kaybedilir 63. L- sisteinin bir nc olarak kullanlabilir olmas, hcrede ne kadar glutatyon sentezlendiini belirler. Kullanlabilecek durumda olan sistein, glutatyon retimi iin hz belirleyici faktr olmaktadr 63. Sistein dzeyi dtnde, vcut metiyonini sisteine dntrr. Makrofajlar (immn scavenger hcreler) ve Astrositler (nron aktivitesini dzenleyen bir grup beyin hcresi) glutatyon retimi iin sistini tercih eder. Fakat lenfosit ve nronlar sisteini tercih eder 63. Spermatojenik hcrelerde Sistein, glutatyondan ziyade protamin sentezinde kullanlr. Bu da zellikle spermiogenez iin nemlidir ve GRn katlm azdr. Spermatozann glutatyon ieriinin ok az olmas nedeniyle Sertoli hcrelerinden GSH temini spermatojenik hcreler iin hem ROTden koruma hem de spermatogeneze amino asit kayna olarak gereklidir (ekil 23) 64.

47

ekil 23. Sertoli hcreleri de novo sentez ve glutatyon dng sistemine sahip olup spermatojenik hcrelere GSH temin eder. Sertoli hcreleri GSH sentezi iin de novo yoluna ve GSSG dng sistemine sahiptir. Spermatojenik hcreler daha az potansiyele sahiptir. Sertoli hcrelerinin yardmc bir dier fonksiyonu spermatojenik hcrelere GSH temin etmektir64.

Sertoli hcreleri direk bir etkileim ile glutatyon salyor grnmektedir. Glutatyonun Sertoli hcrelerinden sistein salamadaki nemli rol GGTden yoksun fare ile yaplan bir almayla desteklenmitir. GGT-knockout farede testis ve seminal kese hacmi azalmtr, ciddi oligozoospermik ve infertildir. Glutatyon ya da Nasetilsistein (sisteinin membran geirgen nc maddesi) takviyesi, testis ve seminal kese hacmini normale dntrr ve mutant fare fertil olur. Bu bulguya gre GGT, hcre yzeyinde glutatyonu, amino asitlere metabolize etmektedir. Aa kan sistein spermatojenik hcreler tarafndan alnp protamin biyosentezinde kullanlmaktadr 64,65. 2.7.7. Fosfolipit Hidroperoksit Glutatyon Peroksidaz Fosfolipit hidroperoksit glutatyon peroksidaz (PHGPx;GPx-4, E.C.1.11.1.12), selenosistein ieren, 7 memeli glutatyon peroksidazdan biridir amino asit olan selenosisteindir 67.
66

. GPx4 geni 19p13.3

blgesinde yerlemitir. Bu enzim 197 amino asitten olumutur, aktif merkez 73.

48

PHGPx biomembranlar oksidatif strese kar korumada nemli bir enzimdir. Dier glutatyon peroksidazlarn aksine PHGPx hcresel membranlardaki kolesterol ve fosfolipid hidroperoksitlerini dorudan alkol trevlerine evirir. Bylece hcreleri, lipit peroksidasyonunun zararl etkilerine kar koruma grevini gerekletirir 68. PHGPxin testisde gonadotropin baml yksek dzeyde ekspresyonu farkl bir rol olduuna dikkat ekmektedir. gpx-4 (PHGPxi kodlayan gen) testikler dokuda farkl formda eksprese edilmektedir. Alternatif balama kodonlarnn kullanlmasyla enzim sitozol, mitokondri ya da nukleusa ynlendirilebilmektedir. n situ hibridizasyon yntemi ile gpx-4n en yaygn olarak ge spermatojenik hcrelerde eksprese edildii aa karlmtr. Testisde PHGPx aktivitesi genellikle spermatidlerle ilgili bulunmutur. Fakat olgun spermatozoada olmutur . gpx-4 geninin rn olan PHGPx spermde bulunan majr selenoprotein olup fertilizasyon iin nemlidir. nk spermatogenezde hidroperoksit detoksifikasyonu, mitokondrial kapsl oluumu ve kromatin kondenzasyonu gibi pek ok olaya katlr. Buna bal olarak PHGPxi kodlayan GPx4 geninde meydana gelen mutasyonlarn infertiliteye neden olaca dnlmektedir 66. PHGPx, spermatojenik hcre ve spermatozoann majr selenoproteini olup ciddi selenyum eksikliinde yeterince oluamamaktadr. Bu durumda fertilizasyon kapasitesi kaybedilmekte, motilite zayflamakta ve orta para ile ba ve kuyrukta morfolojik deiimler tesbit edilmektedir. Yaplan almalarda insan sperminin PHGPxi PHGPx aktivitesi olarak llm ve sperm says, motilite ve yapsal btnlk arasnda pozitif korelasyon bulunmutur 69.
66

PHGPx aktivitesini tesbit etmek zor

49

2.8. Seminal Svda Fruktoz ve Glukoz Semende fruktoz varl ilk defa 1946da Mann tarafndan gsterilmitir. Seminal plazmadaki fruktoz, seminal keselerden elde edilmitir, bu aksesuar cinsiyet bezinin sekresyon fonksiyonunun deerlendirilmesinde uygun bir marker olduu dnlmektedir. Fruktoz ayn zamanda semende spermatozoa iin enerji kayna olup astenozoospermi gibi patolojik durumlarda nem kazanmaktadr 70,71. Spermatozoa mitokondrileri ile fruktozu tamamen CO2 ve H2Oya metabolize etmektedir. salamaktadr Bunu
72

fruktoliz

ve Trikarboksilikasit dngs aktiviteleri ile

Seminal fruktoz nadir olarak deferent kanallarn konjenital

eksikliinin tehisinde ve ejaklatr kanal obstrksiyonunda kullanlabilmektedir (Ozgok ve ark. 2001) 71. Spermatozoann ana enerji kayna olan fruktoz, seminal kese hcrelerinde glukozdan elde edilmektedir. Aldoz Redktaz seminal keselerde bulunur ve fruktoz sentezine katlr. Glukoz, Aldoz Redktaz enzimi katalizrlnde NADPH kullanlarak redkte edilir ve sorbitol oluturulur. Sorbitol ise Sorbitol Dehidrogenaz enzimi ile NAD+ kullanarak oksidasyona urar ve fruktoz sentezlenir (Polyol yolu ekil 24) 72.

ekil 24. Polyol yolu

73

50

Polyol yolu 1956da Hers tarafndan ilk defa seminal keselerde tanmlanm, kan glukozunun fruktoza dntrld ve sperm hcreleri tarafndan enerji kayna olarak kullanld aklanmtr 73. Fruktozun insan semeninde ortalama konsantrasyonu 2-3 mg/ml (11-16 mol)dur. Fruktoza ek olarak insan semeninde glukoz gibi dier ekerler de bulunmaktadr; fakat glukoz konsantrasyonu, fruktoz konsantrasyonunun 1/50si kadardr. Total fruktoz referans deeri WHO (1999) tarafndan ejaklat bana 13 mol olarak bildirilmitir. Seminal fruktozdan farkl olarak seminal glukozun, semen kalitesinin deerlendirilmesinde bir parametre olarak kullanlmasnn nemi detayl olarak bilinmemektedir 71. Seminal plazmadaki dk glukoz konsantrasyonuna ramen glukoz, spermatozoann eker tketiminin yarsn karlamaktadr; seminal fruktoz tketiminin ortalama dzeyi 12.4 mol/ml ve glukoz iin de 0.3 mol/ml olarak bildirilmitir (Martikainen ve ark. 1980). Glukoz kullanmndaki tercih hekzokinaza duyulan affiniteye bal olabilmektedir. Hekzokinaz, memeli spermatozoasnda fruktolizi pirvat ve balatr sadece fruktoz deil glukoz gibi dier ekerleri de fosforlar (Mann ve Lutwak-Mann, 1981). Anaerobik fruktolizin metabolik son rnleri laktattr . Yapay kltr medyumunda sperm motilitesinin glukoz konsantrasyonuna bal olduu gsterilmi, spermatozoann maksimum motilitesi 11-17 mol/ml konsantrasyonunda elde edilmitir ve bu deer siklus ortasnda servikal mukusdaki deere yakn bulunmutur. Fruktoz konsantrasyonu, glukozdan 50 kat daha fazla bulunmasna ramen seminal glukoz spermatozoa tarafndan kullanlmaktadr (Martikainen ve ark. 1980). Normal semen rneklerinde (sperm konsantrasyonu > 50x106/ml ) glukoz konsantrasyonu, oligozoospermik semen rneinden daha hzl dmekte, vazektomize ve azospermik erkeklerin semen rnekleri, normal kontrol semen rnekleriyle karlatrldnda daha yksek ve stabil glukoz konsantrasyonu gstermektedir 71. Glukozun insan sperminde optimal kapasitasyon ve fertilizasyon iin gerekli olduu bildirilmi fakat glikoliz iin ekstra metabolik enerji salayp salamad aklk kazanmamtr 71.
71

51

Spermatozoa, servikal kanalda fertilizasyondan gnler ncesinde beklemekte ve maksimal glukoz oksidasyon oranna, siklus ortasnda servikal mukusta normal dzeyde bulunan glukoz konsantrasyonunda ulamaktadr. Glukoz, dii genital kanalnda spermatozoa iin enerji kayna olup servikal mukusun glukoz ieriinde siklik deiiklikler grlp infertiliteye neden olmaktadr (van der Linden ve ark. 1992) 71. Semende glukoz konsantrasyonu dk olmasna ramen spermatozoa tarafndan enerji kayna olarak kullanlmaktadr. Deiik eker bileiklerinin semen ya da servikal kanalda insan spermatozoasnn enerji ihtiyacn karlamasndaki fonksiyonu tam olarak aklanmamtr. Fertilitenin dk olduu hastalarda glukoz konsantrasyonunun da dk olduu dnlmektedir. Ayrca normal semene glukoz eklenmesinin de bir avantaj tesbit edilmemitir 71.

52

2.9. Leptin Leptin, 16 kDaluk, ob geninin rn (Zhang ve ark1994) bir protein olup hormon/sitokin zelliine sahiptir (Campfield ve ark. 1996) (ekil 25)
74

. Bu

proteinin tersiyer yaps sitokinlerden zellikle granlosit koloni-uyarc faktre benzemektedir (Hiroike ve ark. 2000); drt alfa heliks, iki uzun ve bir ksa loop ile balanmtr (Zhang ve ark. 1997)75. Leptin, yiyecek almn azaltp enerji tketimini artrarak enerji dengesinin dzenlenmesine aktif olarak katlr (Bray ve York,1997)74. Doygunluk faktr olarak hipotalamik ve merkezi sinir sistemi zerinde etkinlik gsterir. Leptin serum dzeyleri kiisel vcut ktle indeksi ile korelasyon gstermektedir (Saad ve ark. 1997)74. Bunun yan sra leptinin pek ok grevi vardr; nroendokrin sistemin dzenlenmesi, hematopoiez, anjiogenez, puberte ve reme (Dallongevilleve ark. 1998, Cunningham ve ark. 1999, Quinton ve ark. 1999, Wauters ve ark. 2000) 74,75,76.

ekil 25. Leptin proteinin 3 boyutlu molekler yaps 77

Leptin biyolojik etkinliini,

leptin reseptrleriyle etkileime girerek

gerekletirmektedir. Leptin reseptrnde mRNAnn alternatif splicingi, fare ve insanda eitli izoformlarla sonulanmaktadr (Tartaglia, 1997) (ekil 26). Sinyal iletim yolu; leptin/leptin reseptr etkileimi, janus kinaz/sinyal iletimi ve transkripsiyon (JAK/STAT) aktivatr ve mitojen-aktive protein kinaz (MAPK) ile gereklemektedir. Birok trde yaplan almalarda leptinin, hipotalamus-hipofiz-gonadal aksisi etkiledii belirtilmitir. Leptin reseptr mRNA s da n hipofiz ve hipotalamusta fazla miktarda bulunmaktadr. Leptinin, Gonadotropin serbestletirici hormon (GnRH),

53

Lteinletirici hormon (LH) ve Follikl uyarc hormon (FSH) sekresyonu zerine zerine etkisi ift ynldr. Hem stimlatr hem de inhibitr etki gsterir. Leptin reseptrleri mevcuttur .
78

endometrium,

overler, leyding hcreleri ve meme bezi epitelinde

ekil 26. Leptin reseptr izoformlar 78

Leptin, GnRH uyararak reme fonksiyonlarn etkilemektedir (ekil 27). Serum leptin konsantrasyonlar, gonadotropinlerden bamsz olarak non-obstrktif azospermik hastalarda normozoospermik erkeklerden daha yksek bulunmutur (Steinman ve ark. 2001). Buna bal olarak, serum leptin dzeyinin erkeklerde gonadal fonksiyonun dzenlenmesinde rol oynayabilecei dnlmektedir 78.

ekil 27. Leptinin gonadal organlar zerine etkisi78

54

Leptinin kan-testis bariyerini geiinin bulunmasndan sonra (Banks ve ark. 1999) periferal rol daha ok n plana km, tbli seminiferi ve seminal plazmada bulunduu gsterilmitir (Camina ve ark. 2002, Glander ve ark. 2002). Bank ve ark. almalarnda kan kaynakl leptinin beyin ve testise gei gsterdiini fakat bu geiin iki farkl ilemle gerekletiini aklamlardr. Beyine gei doyurulabilir (saturable) tama sistemi ile salanrken testise gei szma ile olumaktadr 75,79. Leptin, periferal reseptryle etkileime girerek kemirgenlerde Leydig hcrelerde ve san testisinde testosteron salnmn basklamaktadr (Caprio ve ark1999, Tena-Sempere ve ark. 1999). Fare testisinde, germ hcrelerinin geliimi srasnda deiik leptin reseptrlerinin her basamaa zg ekspresyonu gzlenmitir (El-Hefnawy ve ark. 2000). Seminiferz tbllerde leptin indksiyonlu STAT3 fosforilasyonu, fare testisi interstitial hcrelerde STAT3 ve mitojen-aktivasyonlu protein (MAP) fosforilasyonu bu hcrelerdeki biyolojik etkinlii desteklemektedir (ElHefnawy ve ark. 2000). Son zamanlarda yaplan almalarda, leptinin insanda testikler dokuda varl ve seminal plazmadaki leptin konsantrasyonu ile insan spermatozoasnn motilitesi arasnda negatif korelasyon bulunduu gsterilmitir (Glander ve Kratzsch, 2000; Glander ve ark. 2002). Bu almalar leptinin gonadal fonksiyonunu iki ekilde desteklemektedir; merkezi nroendokrin sistem zerinden indirek olarak ya da periferal doku membran reseptrleri zerinden direk olarak 75. Leptin hipotalamik-hipofiz-testikler aks zerinde deiik dzeylerde etkinlik gstermektedir (ekil 28). Hipotalamusdaki ilk etkinlii GnRH salnmnn uyarlmas olup leptinin fizyolojik dzeylerinde etkilidir. Hipofiz dzeyinde LH ve FSH salnmn dzenler; metabolik duruma bal olarak uyarc ya da inhibe edici etki gsterir. Testis zerine direk etki ederek Testosteron salnmn inhibe eder, zellikle obesite durumunda leptin dzeyi yksektir. Testikler testosteron, beyaz adipoz dokuda leptin salnmn direk olarak inhibe eder 80.

55

ekil 28. Leptin hipotalamik-hipofiz-testikler aks 80

Seminal plazmadaki leptinin kayna tam olarak aklanmamtr (Glander ve ark. 2002). Testikler etkinlie bal olarak kan-testis bariyerinin geildii (Banks ve ark.), tbli seminiferide bulunduu (Glander ve ark. 2002) gsterilmi fakat kan ve seminal plazma leptin konsantrasyonlar arasnda bir korelasyon (Camina ve ark. 2002, Glander ve ark. 2002) gsterilmemitir
75

. Dk spermatozoa kalitesine sahip olan

semen rnekleri dk miktarda leptin reseptr ve leptin balama kapasitesine sahiptir. Yalanan salkl erkeklerde artan serum leptin dzeyleri ve azalan testosteron dzeyleriyle negatif korelasyon gsterilmi (Van Den Saffele ve ark. 1999) ve testosteron verilmesiyle bu artn drld bildirilmitir (Luukkaa ve ark. 1998)74 Von Sobe ve ark. (2003) almalarnda, semende leptin dzeyleri ile serum leptin deerleri arasnda pozitif; semen leptin dzeyi ve serum testosteron deerleri arasnda ise negatif korelasyon gsterdiini aklamlardr74. Hefneway TE ve ark. fare testisinde, leptin reseptrnn (Ob-R) dalmn, geliim ve farkllamann deiik basamaklarnda germ hcreleri ile olan korelasyonu aklamlardr. Ob-R izoform eitlerinin deiik ya gruplarnda varyasyonu leptinin farkl hcre tiplerini uyarabileceini saptamlar, buna bal olarak da

vurgulamlardr. Bu sonulara bal olarak; leptin tarafndan STAT3 sinyal yolunun

56

uyarlmas, bu hormonun (hematopoiezdeki rolne benzer ekilde) spermatojenik hcrelerin farkllamas ve yenilenmesi zerinde etkili olduunu gstermektedir (ekil 29). Ob-R yetikin testisinde, seminiferz epitel siklusunda spermatositlerin IX ve X. basamaklarnda eksprese edilmektedir. Ob-/Ob- fare infertil olup spermatosit aamasnda testisde spermatogenetik sonlanma grlmektedir. Hefneway TE ve ark. leptinin direk rolnn STAT3n fosforilasyonu ile germ hcrelerinde proliferasyon ve farkllamay salayarak gerekletiini ve bunun da leptin eksiklii bulunan farelerde grlen infertiliteyi ksmen akladn bildirmilerdir 81.

ekil 29. Leptinin spermatojenik hcrelerin farkllamas ve yenilenmesi zerinde etkileri 81

57

2.10. Testosteron Testosteron testislerde sentezlenip plazmaya salnan en nemli androjendir. Dier bir androjenik steroid olan dihidrotestosteron (DHT), testosterondan sentezlenmekte olup erkekte total kan androjenlerinin sadece kk bir ksmn oluturmaktadr. Plazma testosteron dzeyi erkeklerde yaklak olarak 700 ng/dl, DHT 45 ng/dldir 82,83. Erkeklerde kan testosteronunun % 95i testislerde Leydig hcrelerinden salanmaktadr. Daha dk dzeylerde adrenal korteks ve overde ve 3-keto grup iermektedir (ekil 30) 82,84. de testosteron sentezi gereklemektedir. Testosteron, yapsnda aktivitesi iin nemli olarak 17--OH

ekil 30. Testosteron yaps

82

Testosteron reseptr 76.000 molekler arlkta Tip I protein olup sitoplazma ve nkleusda bulunmaktadr 82. 2.10.1. Testosteron Sentezi Kolesterol Leydig hcrelerinde asetattan sentezlemekte ya da kan ile testise tanmaktadr. Kolesterol Leydig hcrelerinde, kolesterol yan zincir krc enzim ile pregnenolona dntrlmektedir. 3--hidroksisteroid dehidrogenaz/izomeraz enzimi le pregnenolon; progesteron oluturulmaktadr. 17-- hidroksilaz enzimi ile 17hidroksipregesteron aa karlp 17,20 Liyaz enzimi ile androstendion oluturulur. Son olarak 17--hidroksisteroiddehidrogenaz enzimi ile testosteron sentezlenmi olur51. Testosteron sentez ve salnm n hipofizden, LH ile uyarlmaktadr. Testosteron feedback mekanizmas ile hipotalamusta, Luteinletirici Hormon Salc Hormon zerine etki gstererek kendi sentezini inhibe eder 85,86. Testosteron, kanda % 100 orannda proteinlere bal olarak tanr: % 55i seks hormon-balayc globuline (SHBG) % 40 albmine

58

% 5i kortizol-balayc globulin proteinlere balanarak tanr.

SHBG dzeyinde art erkeklerde strojen benzeri etkilerin fazlalamasna neden olmaktadr 84. Testosteronun inaktivasyonu ekilde gerekleir: 17-OH grubun oksidasyonu A halkasnn redksiyonu 3-keto grubun redksiyonu ile 82.

2.10.2. Testosteronun Etki Mekanizmalar Testostereon direk olarak ya da metabolitler zerinden etki gsterir. Testosteron hedef dokularda biyolojik olarak daha aktif olan DHT ya da stradiole dnr. DHT dnm salg bezlerinde, sa folikllerinde, dermal fibroblastlarda ve prostatta gerekleir 84. Testosteronun Direk Etkileri -

Wolffian kanalnn farkllamas ve i genital yapnn geliimi Kas zerinde anabolik etkiler Spermatogenezin uyarlmas Grtlan genilemesi Seks gcnn artmas 84 DHTa kesin ihtiya duyulduu durumlar: Erkek d genital yapnn geliimi Prostat geliimi DHTa ksmen ihtiya duyulan durumlar: D genital yapda gelime Erkek tipinde vcut tylerinin geliimi Testislerin inmesi 84

Testosteronun DHT zerinden Etkileri -

Testosteron prenatal geliim, puberte dnemi ve puberte sonrasnda cinsiyet organlar ve cinsiyet zelliklerinin geliiminde nemli roller stlenmektedir. Ayrca kas ve kemik geliimi zerinde anabolik etki gstererek kaslarda protein sentezini ve kas ktlesini artrr. Hematolojik ve immnolojik etkileri vardr. Bbreklerde

59

eritropoetini artrr. Su-elektrolit dengesine dzenlemesi) katlr 84. 2.10.3. Testosteron ve nfertilite

(Na+ tutulumu, K+, kalsiyum, fosfat

Testosteron testisler tarafndan retilen ana hormon olup normal geliim, erkek cinsiyet organlar ve cinsiyet karakterlerinin geliimi iin nemli bir role sahiptir. Testosteron, yetikin erkeklerin yaam boyunca sperm retimi, seks gcnn korunmas, erektil potansiyel, prostat bezinin fonksiyonu ve dier reprodktif yaplar iin ihtiya duyulan bir hormondur. Testosteron retimi gonadotropin hormonlar ile kontrol edilirler. Hipofiz bezi beyinin hipotalamus blgesi ile kontrol edilir. Hipotalamus GnRH retir. GnRH , hipofizden iki hormon retimini kontrol eder: FSH ve LH 85. LH ve FSH kan dolamna katlarak farkl etkinlikler gsterirler. LH zellemi Leydig hcrelerinde testosteron retimini uyarr, sperm retimini uyarr (ekil 31). Dk testosteron dzeyleri seks gcnn azalmasna, mental ve fiziksel aktivitenin dmesine, infertiliteye bal olarak sperm retiminde azalma ve kemik kaybna neden olmaktadr. Testosteron yetersizlii hipogonadizm olarak adlandrlp erkek faktrl infertilite sebeplerinin % 2-5i bu sebebe dayandrlmaktadr 85.

ekil 31. FSH ve LHn hedef dokudaki etkinlikleri

85

60

2.10.4. Seminal Plazmada Hormonal Steroidler Seminal plazma zengin metabolit ieriinin yan sra eitli hormonal steroidler ve onlarn nc molekllerini iermektedir 86. Leydig hcreleri, androjenlerin (testosteron , DHT) ve onlarn nc molekllerinin (androstendion, 17 -hidroksiprogesteron, pregnenolon ve dehidroepiandrosteron-DHEAS) ana kaynadr 86. Seminal plazmada bulunan en nemli steroid DHEAS slfattr. Seminal plazmadaki DHEAS slfat konsantrasyonu vazektomide, dihidrotestosteron (% 40 azalma) gstermez
86,87

ve

testosteronda

(% 23 azalma)

olduu

gibi dme

. strojenler de seminal plazmann elemandr ve kayna

prostatn sekretuar aktivitesidir 87. Baz steroidlerin seminal plazma dzeyi kan dzeyinden nemli lde dktr. Testosteronun, kan dihidrotestosteronun 1.7dir .
izelge 3. nsan semeninde bulunan steroidler 87
87

plazmas/seminal plazma

oran40 iken

Testosteron Testosteron konjugatlar Dihidrotestosteron Dihidrotestosteron slfat Andrstendion Dehidoepiandrosteron Dehidoepiandrosteron slfat 5a-Androsten-3a,17b-diol ve 3b-izomeri stradiol ve slfat stron ve slfat Progesteron 17a-Hidroksiprogesteron Pregnenolon ve slfat Kortizol 5a-Androsten-16-en-3a-ol ve 3b-izomeri 5,16-Androstadien-3b-ol ve 4-en-izomeri

61

3. GERE VE YNTEMLER
3.1. Cihazlar Mikrosantrifj Elektrikli terazi Elektrikli terazi pH metre Spektrofotometre 3ml, 1 ml Kuvars kvet Otomatik pipet Derin dondurucu Manyetik kartrc Su banyosu (Ben-mari) Gama sayac Ik mikroskop Elektron mikroskop Etv Santrifj Makler sperm sayma kameras Mekanik homojenizatr Ultrasonik homojenizatr Ozmometre Buz makines Buzdolab nkbatr Heidolph VIRTIS-Virsonic 300 Knauer Forma scientific Arelik Shel Lab TC2323 Beckman Mettler P1210 ve Mettler AJ100 Lbror Aeu-210 WTW Sentix 50 UV-260 Shimadzu Hellma Gilson (p-20, p-200), Socorex (200-1000) Uur, Arelik Nm 110 Nve Electro-mag Berthold LB2111 Pleuger XSZ 107 Nikon Eclipse E600 Memmert Heraus sepatech

62

3.2. rneklerin Temini ve Gruplandrlmas ..T.F. Etik Kurulu karar dorultusunda planlanan bu almada, spermiyogram tetkiki ..T.F. Kadn Hastalklar ve Doum Anabilim Dal-remeye Yardmc Tedavi Merkezine infertilite problemi ile mracaat ederek yaptrmas tavsiye edilen hastalarn semen rnekleri, olgularn olurlar alndktan sonra bu almada kullanlmtr. Semen rnekleri spermiyogram zellikleri ynnden deerlendirilip sonular rapor edildikten sonra alma iin ayrlmtr. Hastalar ile yaplan ilk grmede rnek vermee gelecekleri gn 3-5 gnlk bir cinsel perhiz sresine uyarak gelmeleri tavsiye edilmitir. 2-7 gn arasndaki cinsel perhiz sresi yeterli grlrse de ksa sreli cinsel perhizde semendeki sperm says az, uzun sreli cinsel perhizde de (erkek faktr mevcut ise) sperm says yeterli olsa bile motilitenin dk olduu gzlenmitir. Yaplan aratrmalarda, uzun sreli cinsel perhizin spermlerin akrozin ieriinde de azalmaya neden olduu gsterilmitir. nerilen cinsel perhiz sresine uyulduunda, dikkatli bir ekilde yaplan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin almas hakknda salkl bilgi sahibi olunmasn salayacaktr. Hastalarn steril artlarda, steril kutular kullanarak bu amala dzenlenmi sperm verme odasn kullanmalar salanmtr. Hastalar, mastrbasyonla rnek vermeleri gerektii konusunda bilgilendirilmi, kullandklar kutularn zerine isimleri etiketle yaptrlmtr. rnek verme esnasnda nelere dikkat etmeleri gerektii nceden hazrlanm bir bildiri ile kendilerine aklanmtr. rnek toplanmas esnasnda krem ya da kayganlatrc bir madde kullanmamas, rnek toplanan kutuya su ya da baka bir madde karmamas sylenmitir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha nceden yaplan kimyasal ve biyolojik testlerle toksik olmad ispatlanm kutular satn aln mtr. Hastann rneini aldktan sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili biyologlara teslim etmeleri gerektii izah edilmitir. Semen rnekleri spermiyogram zellikleri ynnden deerlendirilip sonular rapor edildikten sonra alma iin ayrlmtr. rneklerin ayrm yaplrken hastann herhangi patolojik bir yks esas alnmam ancak lkosit ieren, viskoz olan ve anormal bir grntye sahip (rnein kanl) rnekler

63

almaya alnmam, perhiz sresine uygun olarak (ortalama 3-5 gn) toplanm rnekler seilmeye dikkat edilmitir. rnekler spermiyogram zelliklerine gre; hacim, konsantrasyon, motilite ve morfoloji ynnden deerlendirilmi, sperm ve seminal sv ierii birbirinden ayrldktan sonra ve aada belirtildii ekilde bir gruplandrmayla saklamaya alnmlardr: A Grubu (n = 40) - Konsantrasyon, motilite ve morfoloji normal (Kontrol grubu, normospermi) B Grubu (n = 25) - Konsantrasyon ve morfoloji dk, motilite normal (oligoteratospermi) C Grubu (n = 26)- Konsantrasyon ve motilite normal , morfoloji dk (teratospermi) D Grubu (n = 12)- Motilite dk (astenospermi) E Grubu (n = 16)- Azospermik (semende sperm bulunmamas)

Dnya Salk rgtnn 1992 verilerine gre konsantrasyon, motilite ve morfoloji iin normal olarak kabul edilen deerler: Hacim Konsantrasyon Motilite Morfoloji 2 ml 20x106/ml > %50 %14 (Kruger)

64

Deneysel alma Plan 3-5 Gnlk perhiz sresine uygun olarak steril artlarda alnan semen rnei 37Cde likefikasyon Mikroskopik inceleme (spermiyogram) (konsantrasyon, motilite ve morfolojik kriterlere gre kontrol grubu ve dier gruplar ayrlr) Seminal sv ve sperm ierii birbirinden ayrlr -70Cde derin dondurucuda bekletilir Deneysel alma yaplaca zaman rnekler zlr Seminal sv * Malat Dehidrogenaz aktivitesi (NAD ve NADP baml) * Laktat Dehidrogenaz aktivitesi * Redkte Glutatyon dzeyi * Glukoz dzeyi * Fruktoz dzeyi * Serbest testosteron dzeyi * Leptin dzeyi Sperm Sperm homojenizasyonu * Malat Dehidrogenaz aktivitesi (NAD ve NADP baml) * Laktat Dehidrogenaz aktivitesi

65

3.3. Sperm Homojenizasyonu Homojenizasyonla ilgili olarak, almalarmzda standart olarak tm rneklere uygulamay kararlatrdmz ideal artlar u basamaklarla sralanabilir: Ejaklat 37Cde likefiye olduktan sonra mikroskopik (sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi) olarak deerlendirilir. Ejaklat 2000 rpmde 10 dakika santrifj edilir. Sperm ve seminal sv ierii birbirinden ayrlr. Sperm ierii ykama (swim up) yapldktan sonra homojenize edilir (ykama ilemi ileri sayfalarda aklanmtr). Bu basaman ardndan, sperm ve seminal sv ierii, birbirinden ayr olarak homojenizasyonun yaplaca gne kadar derin dondurucuda (-70 Cde) bekletilip, homojenize edilecei gn tekrar zlr Dijitonin (% 0.02) ve fosfat tamponu (pH 8.0 ve 0.1M) zeltilerinden 1/1 orannda bir karm hazrlanr. Sperm ierii yukardaki karm ile istenilen sperm konsantrasyonuna gre makler kamerasnda saylarak dile edilir (almamzda 20x106/ml). Seyreltilmi sperm rnei ultrasonik homojenizatrde 6 mikro probe iddette ve 11.5 dakika cam ie buz ierisinde tutularak homojenize edilir. Homojenizasyon sonucunda sperm paralanmas k mikroskop ile deerlendirildi. Spermlerin grntlendi. Seminal sv ve sperm ieriklerinde deneysel almalar ayr ayr gerekletirildi. Hem sperm hem seminal svda ortak olarak NAD ve NADP baml MDH aktivitesi ile LDH aktivitesi tesbit edildi. Seminal svda ayrca aadaki almalar yapld : * Redkte Glutatyon dzeyi * Glukoz dzeyi * Fruktoz dzeyi * Serbest testosteron dzeyi * Leptin dzeyi orta blm ve kuyruk ksmnda paralanma tesbit edildi. Homojenizasyon sonucundaki paralanma grntleri elektron mikroskop ile

66

3.4. Sperm Ykama (Swim up) Ejaklat 37Cde likefiye olduktan sonra mikroskopik olarak incelenir. Ejaklat 2000 rpmde 10 dakika santrifj edilir. Seminal sv ierii stten ayr bir tpe alnr ve derin dondurucuya kaldrlr. Altta kalan sperm zerine (tpte kalan sperm pelletinin konsantrasyonuna gre) 2 ml ykama medyumu (Ykama medyumu olarak hcre kltr ilemlerinde kullanlan bikarbonat, Hepesli tampon ve nsan Serum Albmin ieren medyumlar tercih edilmektedir. Ykama medyumu 37Cde %6lk CO2e ayarlanm inkbatrde bir gece bekletilir.) eklenir 1500 rpmde 5 dakika santrifj edilir. stten, spernatan pastr pipeti ile atlr. Sperm pelleti zerine tekrar 1-2 ml ykama medyumu eklenir. 1500 rpmde 5 dakika santrifj edilir. stten, spernatan pastr pipeti ile atlr. Tpte kalan sperm pelleti alma iin kullanlr ya da derin dondurucuda bekletilir.

67

3.5. Analiz Yntemleri 3.5.1. Malat Dehidrogenaz (MDH) Aktivite Tayini MDH, NAD/NADPyi koenzim olarak kullanan ve L-malat ve okzaloasetatn birbirlerine dnmn katalizleyen bir oksideredktazdr30. L-malat + NAD+ Okzaloasetat + NADH + H+ (NADP) (NADPH)

Prensip Reaksiyon hzn tesbit etmek iin malatn okzaloasetata dnm srasnda, 340 nmde NAD/NADPnin indirgenmesiyle oluan NADH/NADPHa bal olarak abzorbanstaki art llmektedir30.

Ayralar Fosfat tamponu (0.1 M pH 8.0) 12.25 g Na2HPO4 1.84 g KH2PO4 saf su ile litreye tamamlanp pH = 8.0e ayarlanr. - Fosfat tamponu (0.067 M pH = 7.4) 9.464 g/L Na2HPO4den 19.2 ml 1.072 g/L KH2PO4den 80.2 ml alnp kartrlr ve pH = 7.4e ayarlanr.

- Tris-HCl tamponu (0.1 M pH = 9.0) 0.1 M Tris etanolamin hazrlanr 0.1 M Tris-HCl ile pH 9.0a ayarlanr.

68

- Malik enzim (0.006 M) 0.008 g malik enzim tartlp 0.067 M pH = 7.4 fosfat tamponu ile hacim 10 mlye tamamlanr (gnlk hazrlanr). - NAD (0.00375 M) 0.0248 g NAD tartlp 0.067 M pH = 7.4 fosfat tamponu ile hacim 10 mlye tamamlanr (gnlk hazrlanr). - NADP (0.00375 M) 0.028 g NADP tartlp 0.067 M pH = 7.4 fosfat tamponu ile hacim 10 mlye tamamlanr (gnlk hazrlanr).

Yntem Spektrofotometre 37Cde 340 nmye ayarlanr. Aadaki ekilde pipetleme yaplr: Kr (ml) - 0.1 M pH 9.0 Tris-HCl tamponu - NAD/NADP - Enzim (seminal sv/sperm) * 2.9 --0.1 rnek (ml) 2.6 0.2 0.1

Kvetler 5 dakika inkbe edilir. Kvete 0.1 ml malat eklenir. Abzorbanstaki deiim (A) 5 dakika izlenir30.

* Seminal sv ve sperm rneklerinde MDH aktivitesi ayr ayr allmtr. zlen seminal sv rnekleri mikrosantrifjde 13000 rpmde 5 dakika santrifj edildikten sonra spernatan enzimatik aktivite tayininde kullanlmtr. Sperm rnekleri de zldkten sonra homojenize edilmi ve bu homojenatta MDH aktivitesi llmtr.

69

Hesaplama mU/ml = = = A A / (6.22 x rnek hacmi / ml reaksiyon karm) A / (6.22x0.1/3) A / 0.21

= 340 nmde dakika bana abzorbansta deiim (Ekstinksiyon katsays) (mmol-1)

6.22 = NADHn 340 nmde milimolar abzorbtivitesi

70

3.5.2. Laktat Dehidrogenaz Aktivite Tayini

Laktat dehidrogenaz (LDH,EC 1.1.1.27), sitozolik bir enzim olup glikolitik yolun son basama olan pirvatn laktata dnmn katalizlemektedir88: LDH Pirvat + NADH

Laktat + NAD

Deneyde enzimin ift ynl almasndan ve laktatn pirvata oksidasyonu srasnda NADnin redkte olmasndan faydalanlarak redkte durumdaki NADHn olumas 340 nmde abzorbans artna neden olmaktadr. Bu art hz, rnekteki LDH aktivitesiyle doru orantldr88.

Ayra - Laktat 50 mmol/L - NAD 7 mmol/L - Tampon 0,1M HCl tamponu H 8.9 - Sodyum azide % 0.05 (koruyucu olarak) rneklerin Hazrlanmas almada sperm ve seminal sv ierikleri birbirinden ayr ayr deerlendirilmitir. Sperm rnekleri homojenizasyon blmnde anlatld ekilde hazrlanmtr. Tm rnekler ift allmtr. rnekler 50 l karm ierisinde (25 l rnek + 25 l su olarak) hazrlanm ve aktivite deeri 2 ile arplarak hesaplanmtr.

Deneysel lem Spektrofotometrede (Shimadzu UV-260) 340 nmde allr ve kr olarak su kullanlr. Kvete 1 ml ayra eklenir ve 37Cde 30 saniye bekletilir. 50 l rnek eklenerek hafifce kartrlr. 30 saniye bekletilir.

71

340 nmde abzorbans okunur. lk okunan deer balang A olarak kabul edilir. 60. Saniyede tekrar abzorbans okunur, bu deer de final Adr. Final Adan balang A deeri karlarak dakika bana abzorbans deiimi (A) hesaplanr.

* Seminal sv ve sperm rneklerinde LDH aktivitesi ayr ayr allmtr. zlen seminal sv rnekleri mikrosantrifjde 13000 rpmde 5 dakika santrifj edildikten sonra spernatan enzimatik aktivite tayininde kullanlmtr. Sperm rnekleri de zldkten sonra homojenize edilmi ve bu homojenatta LDH aktivitesi llmtr.

Aktivite Hesab LDH aktivitesi (U/L) = A x TV x 1000 6.22x SV x LP A = 340 nmde dakika bana abzorbansta deiim TV = Total reaksiyon hacmi SV = rnek hacmi 6.22= NADHn 340 nmde milimolar abzorbtivitesi (Ekstinksiyon katsays) LP = Ik yolu (1 cm) 1000 = mlyi litreye evirme birimi LDH Aktivitesi (U/L) = A x 1.05 x 1000 6.22 x 0.05 = A(dakika) x 3376

72

3.5.3. Redkte Glutatyon (GSH) Tayini Prensip 5-5-ditiyobis [2-nitrobenzoik asit] [DTNB:3-karboksi-4-nitrofenil dislfit: Elman Ayrac] slfidril bileikleri ile tepkimeye girdiinde bir dislfit bileii olan sar renkli kompleks yap oluturur. Bu sar bileiin optik dansitesi 412 nmde okunarak GSH miktar saptanr89. Ayralar ktrc zelti Glasiyel metafosforik asit Disodyum EDTA Sodyum klorr 100 ml saf su iinde znr. 2. Na2HPO4 (0.3M) 3. DTNB zeltisi DTNB 20 mg 100 ml %1lik sodyum sitrat zeltisi iinde eritilir. Yntem Yntem Beutlerden modifiye edilmitir. Seminal sv direk allmtr. rnek (l) Numune Su ktrc 100 -300 Kr (l) -100 300 1.67 g 0.2 g 30 g

Ependorf tpndeki rnek 5 dakika santrifj edilir (ktrme amal). st ksm alnr. Sznt Na2HPO4 200 800 200 800

73

412 nmde kre kar okunur (OD1). Sonra tplere 100er l DTNB eklenir. 412 nmde kre kar tekrar okuma yaplr (OD2).

Hesaplama C = OD2 OD1 x 11 x 4 x 100 13600 2 2

100 : mole dnm katsays 13600: Ekstinksiyon katsays 11 x 4 seyrelme faktr 2 1

C = OD x 11618 (mol/L)

74

3.5.4. Glukoz Tayini [Glukoz oksidaz (GOD-PAP) metodu, Enzimatik-Trinder yntemi] (Glucon)90 Prensip Glukozun, ortamda bulunan glukoz oksidaz ile enzimatik oksidasyon sonucunda oluan H2O2 peroksidaz katalizrlnde 4-aminofenazon ile reaksiyona girerek krmz mor renkte kinonimin oluturmaktadr. Spektrofotometrik olarak 500 nmde llen renk iddeti glukoz konsantrasyonunu yanstmaktadr. almada, seminal sv rneklerinde glukoz dzeyi llmtr90.

GOD Glukoz + O2 + H2O Glukonik asit + H2O2 POD 2 H2O2 + 4-aminofenazon + Fenol Kinonimin + H2O

Ayralar 1. Tampon Fosfat tamponu Fenol 2. GOD-PAP ayrac 4-aminofenazon Glukoz oksidaz Peroksidaz 3. Standart Glukoz 5.55 mmol/l (100 mg/dl) 0.77 mmol/l 1.5 kU/l 1.5 kU/l 0.1 mol/l, pH 7,0 11 mmol/l

75

Yntem Ependorf tplerine aadaki gibi pipetleme yaplr Kr Standart Seminal sv Ayra -----1000 l Standart 10 l --1000 l rnek --10 l 1000 l

Tpler kartrlr. 15-25 Cde inkbe edilir. 500 nmde kre kar okuma yaplr.

Hesaplama Glukoz konsantrasyonu (mmol/l) = Abzorbans (rnek) x 5.55 Abzorbans (standart) (mg/dl) = Abzorbans (rnek) x 100 Abzorbans (standart)

76

3.5.5. Seminal Svda Fruktoz Tayini (Solomon Metodu)91 Prensip Testin esas Seliwanoff testidir. Seliwanoff Testinin Prensibi: Heksozlar asit ortamda stldklarnda hidroksi metil furfural trevleri oluur. Keto heksozlar bu reaksiyona daha hassastr. Aldoheksozlar ise daha ge dnmektedirler. Seliwanoff ayracndaki rezorsinol ile ketoheksozlarn furfural trevleri pembe renk verdikleri iin aldoheksozlardan kolaylkla ayrtrlrlar. Ayra Aadaki ekilde Resorsinol ayrac hazrlanr: - Resorsinol - Konsantre HCl - Saf su Teknik 1. Seminal sv santrifj edilmi ve spernatandan 100 l bir tp ierisine konulup 1 ml yukardaki karmdan eklenmitir 2. Karm, kaynar su banyosuna konur 3. Deney artlarmzda ilk 10 saniyede renk deiimi gzlenir gzlenmez deney tpleri su banyosundan karlarak soutmaya alnmtr. Souyan rnekten 1 ml alnarak 340 nmde kr olarak suya kar spektrofotometrik okuma yaplmtr. almada fruktoz standart erisi iin dalga boyu taramas yaplarak en uygun dalga boyu olarak 340 nm tesbit edilmitir. 2,7 mM/L, 5,5 mM/L, 8,3 mM/L, 11,0 mM/L, 13,0 mM/L, 160 mM/L konsantrasyonlarda fruktoz standartlar hazrlanarak standart eri izilmi deerlendirilmitir. (ekil 32) ve rneklerin fruktoz konsantrasyonu bu eriden 50 mg 30 ml 100 ml

77

0,6 0,5
abzorbans (340 nm)

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10

fruktoz konsantrasyonu (mM/L)

15

20

ekil 33. Fruktoz standart erisi

78

3.5.6. Serbest Testosteron (Bosource KIPB19000) 92 Prensip Radyoaktif

125

I kullanlarak rnekteki Serbest Testosteron (ST) ierii tesbit

125

edilmektedir. Tplerdeki anti-testosteron balanan ierii ile ters orantl olmaktadr. Ayralar 125

I-ST dzeyi rnein ST

I-Testosteron tracer

Serbest testosteron standartlar (pg/ml) : 0 0,25 1 5 20 65 coated tpler

Yntem Tplere 100 l standart, rnek ve kontrol eklenir. 1 ml,

125

I-Testosteron tracer eklenerek kartrlr.

3 saat oda scaklnda inkbe edilir. Tplerin ierii aspire edilir. Gama sayacnda bir dakika okuma yaplr. Standart eriden deerlendirilir.

79

LEPTN (IRMA DSL-23100)93 Prensip Bu test, iki ynl immnoradiometrik yntem (IRMA) prensibine dayanmaktadr. IRMA yarc olmayan bir yntem olup iki antikor arasnda lm yapmaktadr. lk antikor tplerin duvarlarna yerlemi, dier antikor tesbit iin radio etiketleme yaplmtr.

Ayralar - Anti-Leptin (I-125) ayrac - Standartlar (A,B,C,D,E,F,G) (ng/ml) 0 0,25 0,5 2,5 10,0 30,0 120,0 - Ykama solsyonu Yntem almaya balamadan nce btn kimyasallar oda ssnda bekletilmeli ve hafifce kartrlmaldr. 1. ki tp total saym iin ayrlr. 2. Standart, kontrol ve rneklerden 100 l tplere pipetlenir. 3. Her tpe 200 l, Anti-Leptin (I-125) ayrac eklenir. 4. 1-2 saniye hafifce kartrlr. 5. Btn tpler, oda scaklnda ( 25C) 18-24 saat bekletilir. 6. Total saym tpleri dnda btn tplerin ierii aspire edilir. 7. Total saym tpleri dnda btn tplere 3 ml ykama solsyonu eklenir. 8. Total saym tpleri dnda btn tplerin ierii aspire edilir. 9. 7 ve 8. basamaklar iki kez tekrarlanr. 10. Gama sayacnda bir dakika okuma yaplr. 11. Standart eriden deerlendirilir.

80

4. BULGULAR
almada, semen rnei likefiye olduktan sonra mikroskopik incelemesi yaplm daha sonra santrifj edilerek seminal sv ve sperm blmleri birbirlerinden ayrlmtr. eitli analizler; seminal sv ve sperm blmlerinde ayr ayr gerekletirilmitir. Spermde yaplacak incelemelerden nce sperm homojenizasyonu iin ideal artlar aratrlmtr. Bu amala mekanik ve ultrasonik homojenizatrde denemeler yaplm, farkl tamponlarla, deiik srelerde deney dzenei tekrarlanmtr. En verimli sonular ultrasonik homojenizatrde elde edilmitir. Homojenizasyon sonrasnda spermin kuyruk ve orta blmesinde krlmalar saptanm, ban paralanmas gereklememitir. Homojenizasyon sonucunda spermde oluturulan paralamalar k mikroskopu ile grntlenmitir. ekil 33de homojenizasyon ncesi normal sperm grntleri, ekil 34de ise homojenizasyondan sonra elde edilen krlmalar gsterilmektedir.

ekil 33. Homojenizasyon ncesinde spermlerin morfolojik grnm (x100)

81

ekil 34. Homojenizasyondan sonra spermlerin morfolojik grnm (x100)

Semen

rnei

mikroskopik

olarak

incelendikten

sonra

spermiyogram

zelliklerine gre aadaki ekilde gruplandrlmtr: A Grubu (n = 40) - Konsantrasyon, motilite ve morfoloji normal (Kontrol grubu, normospermi) B Grubu (n = 25) - Konsantrasyon ve morfoloji dk, motilite normal (oligoteratospermi) C Grubu (n = 26)- Konsantrasyon ve motilite normal , morfoloji dk (teratospermi) D Grubu (n = 12)- Motilite dk (astenospermi) E Grubu (n = 16)- Azospermik (semende sperm bulunmamas) Deneyler seminal sv ve sperm homojenatlarnda ayr ayr gerekletirilmitir. Bu blmde ncelikle seminal svda yaplan almalar tanmlanacaktr: - izelge 4,5,6,7,8de srasyla btn gruplarda olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri verilmitir.

82

- izelge 9,10,11,12,13de srasyla btn gruplarda MDH (NAD/NADP) ve

LDH aktiviteleri verilmitir. - izelge 14,15,16,17,18de srasyla btn gruplarda GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri verilmitir. - izelge 19,20,21,22,23de srasyla btn gruplarda serbest testosteron ve leptin dzeyleri verilmitir. Bu blmn ardndan seminal svda yaplan almalarn istatiksel

deerlendirmeleri yer almaktadr. - izelge 24de ya, semen hacmi ve spermiyogram zelliklerinin gruplardaki ortalama deerleri verilmitir. - izelge 25de tm gruplarn seminal svda NAD/NADP-MDH ve LDH aktivitelerinin ortalamalar verilmitir. - izelge 26de tm gruplarda seminal svda GSH, glukoz ve fruktoz deerlerinin ortalamalar verilmitir. - izelge 27de tm gruplarda seminal svda serbest testosteron ve leptin dzeylerinin ortalamalar verilmitir. almann ikinci blmnde sperm homojenatlarnda yaplan enzimatik deneyler ve bunlara ait istatistiksel deerlendirmeleri iermektedir: - izelge 28,29,30,31de tm gruplarda sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri verilmitir. - izelge 32de tm gruplarda sperm rneklerinde MDH ve LDH aktivitelerinin ortalamalar verilmitir. - izelge 33de gruplardaki deikenlerin A (kontrol) grubu ile karlatrlmalar sonucunda bulunan p deerleri - izelge 34de gruplarn birbirleriyle karlatrlmalar sonucunda bulunan p deerleri verilmitir. - izelge 35,36,37,38,39 da gruplarn kendi iinde korelasyonlar sonucunda elde edilen r ve p deerleri verilmitir.

83

izelge 4. Grup A- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Ya 36 34 27 35 28 28 28 35 30 36 30 27 28 20 41 33 30 27 20 26 45 39 35 37 36 33 30 32 40 26 30 36 28 31 29 34 28 47 27 41

Semen hacmi (ml) 1.5 4.0 3.0 4.0 2.0 3.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 4.0 4.0 2.0 3.0 4.0 5.0 5.0 3.0 5.0 5.0 3.0 2.5 2.0 4.0 3.0 6.0 3.0 4.0 3.0 4.0 4.0 4.0 3.0 4.0 6.0 3.0 3.0 1.5

Konsan. (x106/ml) 50 40 30 120 50 40 35 35 150 60 23 40 45 45 120 30 45 50 45 70 80 80 150 75 40 45 35 30 30 26 45 40 70 60 35 24 40 28 45 24

Motilite (% motil) %70 %80 %70 %80 %75 %70 %70 %70 %70 %45 %70 %70 %80 %80 %80 %75 %75 %70 %70 %70 %70 %60 %80 %60 %70 %70 %65 %70 %70 %80 %75 %70 %80 %70 %70 %70 %75 %70 %70 %70

Morfoloji (% normal) %16 %14 %28 %20 %16 %17 %15 %20 %14 %18 %14 %16 %16 %16 %30 %14 %14 %16 %20 %20 %20 %20 %21 %16 %20 %14 %14 %28 %14 %30 %15 %15 %15 %17 %15 %16 %23 %15 %16 %16

84

izelge 5. Grup B- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Ya 32 34 37 32 33 30 23 34 42 36 34 27 34 36 35 32 32 58 40 32 25 33 33 34 33

Semen hacmi (ml) 5.0 3.0 2.0 4.0 2.0 3.0 2.0 3.0 2.0 2.0 4.0 2.0 3.0 3.0 2.0 3.0 3.0 2.0 5.0 4.0 4.0 2.0 3.0 2.0 2.0

Konsan. (x106/ml) 14 10 7 16 12 6 14 7 10 13 18 10 15 16 17 15 15 16 15 7 4 10 15 16 14

Motilite (% motil) %50 %40 %65 %50 %75 %50 %50 %60 %70 %55 %80 %60 %70 %70 %70 %70 %75 %75 %70 %65 %50 %70 %70 %70 %65

Morfoloji (% normal) %2 %4 %6 %2 %3 %1 %3 %2 %1 %4 %9 %2 %5 %4 %5 %5 %2 %8 %4 %6 %2 %6 %3 %7 %3

85

izelge 6. Grup C-Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Ya 28 28 30 38 35 20 34 34 31 33 58 26 26 30 43 42 30 25 25 35 27 31 31 19 29 39

Semen hacmi (ml) 3.0 3.0 2.0 3.0 4.0 2.0 2.0 2.0 8.0 5.0 3.0 6.0 3.0 2.0 3.0 5.0 4.0 3.0 2.0 3.0 4.0 8.0 3.0 3.0 4.0 3.0

Konsan. (x106/ml) 30 50 50 23 60 20 50 40 100 50 130 25 45 60 45 26 40 30 45 30 80 40 40 35 33 30

Motilite (% motil) %70 %70 %70 %65 %80 %70 %75 %75 %80 %75 %80 %50 %65 %70 %70 %50 %70 %60 %60 %75 %60 %70 %70 %60 %70 %70

Morfoloji (% normal) %7 %4 %5 %3 %10 %10 %9 %10 %10 %8 %6 %1 %7 %7 %10 %2 %6 %2 %8 %7 %7 %8 %7 %6 %5 %6

86

izelge 7. Grup D- Olgu ya, semen hacmi ve spermiyogram deerleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ya 29 38 34 30 34 21 31 32 28 27 23 21

Semen hacmi (ml) 3.0 4.0 4.0 3.0 3.0 5.0 4.0 4.0 5.0 2.0 2.5 5.0

Konsan. (x106/ml) 15 8 15 35 40 20 25 90 10 40 8 20

Motilite (% motil) %0 %35 %1 %30 %30 %20 %0 %0 %30 %30 %30 %20

Morfoloji (% normal) %2 %3 %2 %1 %6 %5 %1 %1 %1 %1 %2 %5

izelge 8. Grup E- Olgu ya ve semen hacmi

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ya 28 30 40 40 25 40 29 32 31 25 35 30 37 31 33 37

Semen hacmi (ml) 2.0 4.0 3.0 2.0 2.5 1.0 4.0 3.0 8.0 2.0 2.0 3.0 2.0 2.0 2.0 3.0

87

izelge 9. Grup A- Seminal sv rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

NAD-MDH (mU/ml) 105 114 152 152 47 90 143 176 133 105 24 95 71 33 14 95 86 95 180 28 105 180 47 76 24 109 76 143 105 76 24 100 33 38 152 38 24 95 185 188

NADP-MDH (mU/ml) 400 123 62 238 176 143 214 123 100 219 266 290 133 142 53 114 190 98 238 56 100 100 95 81 143 124 333 162 80 124 219 95 133 114 58 190 143 152 238 143

LDH (U/L) 2903 556 573 934 1417 641 1215 1215 1080 607 1924 1890 1316 877 3000 1053 2734 875 2430 880 1809 1742 1721 1809 2052 640 680 610 540 540 540 837 810 705 708 1148 1250 1317 1350 550

88

izelge 10. Grup B- Seminal sv rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

NAD-MDH (mU/ml) 62 223 171 238 133 114 123 110 209 180 71 109 10 285 133 33 52 104 85 24 14 52 85 85 90

NADP-MDH (mU/ml) 166 200 133 109 176 105 138 95 19 85 128 252 66 95 295 38 62 28 119 95 266 276 85 109 95

LDH (U/L) 810 304 351 472 938 472 445 330 300 675 877 1147 1512 743 877 580 810 513 844 965 1363 1226 763 1120 932

89

izelge 11. Grup C- Seminal sv rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

NAD-MDH (mU/ml) 76 114 100 123 166 52 160 143 190 180 100 57 57 38 110 124 86 47 110 28 128 66 47 162 95 147

NADP-MDH (mU/ml) 476 119 285 190 90 71 238 238 38 52 105 147 95 110 71 47 62 66 314 305 114 181 100 157 100 110

LDH (U/L) 900 574 700 472 404 310 520 541 550 466 1782 1620 1944 1552 614 506 1350 1256 1148 1013 1094 1418 1755 743 605 750

90

izelge 12. Grup D- Seminal sv rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 NAD-MDH (mU/ml) 14 38 24 24 52 28 10 14 81 86 52 57 NADP-MDH (mU/ml) 105 33 271 276 95 28 171 133 62 400 71 47 LDH (U/L) 1350 675 1458 1937 1282 730 2430 2565 1485 2633 1114 554

izelge 13. Grup E- Seminal sv rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 NAD-MDH (mU/ml) 10 24 62 47 19 10 10 19 24 62 112 24 0 162 19 5 NADP-MDH (mU/ml) 62 176 209 157 105 109 95 105 190 143 238 19 343 0 152 105 LDH (U/L) 621 1107 830 1647 743 1350 945 554 729 830 554 473 1485 297 878 1998

91

izelge 14. Grup A-Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

GSH (mol/L) 48.48 40.40 36.36 56.56 40.40 38.38 44.44 30.30 36.36 36.36 42.42 50.50 46.46 32.32 40.40 46.46 30.30 42.42 38.38 36.36 40.40 30.30 54.54 66.66 80.80 72.72 54.54 30.30 40.40 36.36 34.34 28.28 50.50. 30.30 40.40 42.42 40.40 38.38 80.80 34.34

Glukoz (mg/dl) 0.0 0.0 0.4 1.4 2.8 5.2 4.5 2.1 3.0 0.7 6.0 5.0 5.3 6.3 5.5 4.6 6.6 0.0 0.0 0.0 2.0 0.4 2.0 0.4 4.4 1.0 1.4 2.3 0.0 0.4 0.3 0.2 0.8 0.0 0.0 0.3 0.9 2.2 1.6 0.0

Fruktoz (mg/100 ml) 260 168 320 400 253 246 320 233 170 265 108 24 126 156 159 66 60 54 72 60 213 54 20 68 66 74 82 275 40 62 380 311 244 243 473 207 217 213 502 127

92

izelge 15. Grup B-Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

GSH (mol/L) 20.20 20.20 42.42 34.34 28.28 26.26 38.38 36.36 24.24 36.36 38.38 46.46 30.30 22.22 30.30 24.24 22.22 16.16 30.30 28.28 40.40 24.24 40.40 28.28 32.32

Glukoz (mg/dl) 3.0 1.8 1.7 2.3 6.0 3.4 2.2 3.3 8.3 7.7 1.3 1.5 1.5 2.4 1.6 1.8 1.6 1.0 6.3 1.1 4.0 3.8 1.0 1.5 1.2

Fruktoz (mg/100 ml) 307 253 300 234 260 192 150 280 410 348 314 317 301 196 166 195 156 181 396 387 534 435 154 204 133

93

izelge 16. Grup C-Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri

Olgu GSH no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 (mol/L) 30.30 22.22 14.14 20.20 8.08 20.20 14.14 38.38 38.38 32.32 56.56 48.48 46.46 60.60 34.34 26.26 22.22 44.44 46.46 42.42 24.24 48.48 40.40 57.57 32.32 60.60

Glukoz (mg/dl) 2.3 1.5 1.4 2.8 4.0 5.7 1.8 2.4 3.1 1.6 0.0 3.4 3.0 0.0 0.6 0.0 0.2 0.3 2.0 0.6 0.0 2.0 4.0 0.2 4.3 0.0

Fruktoz (mg/100 ml) 240 180 280 250 210 250 280 190 190 200 206 270 316 300 206 124 370 380 217 126 90 211 319 206 316 52

94

izelge 17. Grup D-Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

GSH (mol/L) 46.46 36.36 48.48 38.38 52.52 12.12 60.60 60.60 46.46 80.80 60.60 44.44

Glukoz (mg/dl 5.5 3.0 6.6 3.6 2.6 3.0 4.2 6.7 3.7 3.4 3.4 2.8

Fruktoz (mg/dl) 500 705 798 800 584 506 900 705 760 782 900 540

95

izelge 18. Grup E-Seminal sv rneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

GSH (mol/L) 12.12 14.14 10.10 12.12 12.12 15.15 12.12 16.16 22.22 7.07 48.48 16.16 50.50 20.20 30.30 18.18

Glukoz (mg/dl 6.4 9.6 10.0 14.0 8.2 12.0 9.3 11.0 20.2 19.3 20.0 19.0 29.5 17.3 17.6 24.0

Fruktoz (mg/dl) 135 149 143 242 198 236 215 163 391 540 259 496 550 180 550 964

96

izelge 19. Grup A- Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Ser.Testosteron Leptin (pg/ml) (ng/ml) 0.3 0.6 1.0 3.0 1.8 1.4 1.7 3.7 4.0 1.7 1.4 1.0 2.8 8.5 4.6 3.5 2.3 1.1 2.7 1.2 1.3 0.8 1.3 1.2 3.1 2.6 2.8 5.4 1.5 1.8 2.2 1.5 1.6 2.7 3.3 1.7 1.6 1.9 2.8 2.2 0.10 0.15 0.35 0.11 0.11 0.11 0.17 0.12 0.12 0.36 0.41 0.11 0.08 0.2 0.18 0.16 0.01 0.0 0.0 0.27 0.31 0.0 0.0 0.08 0.4 0.26 0.12 0.12 0.04 0.90 0.10 0.27 0.07 0.06 0.04 0.24 0.11 0.51 0.24 0.16

97

izelge 20. Grup B-Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Ser.Testosteron Leptin (pg/ml) (ng/ml) 1.5 1.3 1.1 4.5 5.2 1.7 3.5 3.0 1.6 1.3 2.3 1.1 1.1 5.0 1.7 1.0 6.5 1.2 3.5 0.6 0.9 0.5 0.9 1.3 1.1 0.05 0.02 0.00 0.00 0.00 0.04 0.00 0.22 0.00 0.00 0.00 0.10 0.12 0.10 0.36 0.32 0.34 0.27 0.04 0.08 0.09 0.15 0.12 0.00 0.18

98

izelge 21. Grup C-Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Ser.Testosteron Leptin (pg/ml) (ng/ml) 4.5 6.1 1.7 5.1 2.2 8.7 3.2 0.8 2.5 4.9 6.4 3.1 5.0 5.0 8.0 1.8 5.2 1.0 0.9 2.8 6.5 5.4 3.0 0.8 0.9 1.3 0.09 0.19 0.01 0.08 0.04 0.17 0.24 0.21 0.29 0.47 0.14 0.05 0.07 0.02 0.12 0.16 0.15 0.02 0.16 0.00 0.16 0.14 0.31 0.36 0.29 0.18

99

izelge 22. Grup D-Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ser.Testosteron Leptin (pg/ml) (ng/ml) 2.5 5.0 4.2 4.1 3.5 3.2 5.8 2.6 3.6 1.0 4.8 3.4 0.52 0.05 0.10 0.07 0.13 0.13 0.07 0.07 0.25 0.12 0.05 0.15

izelge 23. Grup E-Seminal sv rneklerinde serbest testosteron ve leptin dzeyleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ser.Testosteron Leptin (pg/ml) (ng/ml) 1.4 0.6 0.3 0.4 0.9 1.8 0.7 0.3 0.9 0.5 1.7 0.3 2.1 0.1 0.4 1.8 0.00 0.01 0.20 0.01 0.50 0.01 0.01 0.10 0.01 0.10 0.20 0.20 0.30 0.14 0.40 0.30

100

izelge 24. Ya, Semen hacmi ve spermiyogram zelliklerinin gruplardaki ortalama deerleri

Grup A OrtalamaSD Ortanca (min-maks) B OrtalamaSD Ortanca (min-maks) C OrtalamaSD Ortanca (min-maks) D OrtalamaSD Ortanca (min-maks) E OrtalamaSD Ortanca (min-maks)

Ya 32.15.9 30.5 (20-47) 34.06.4 33.0 (23-58) 31.87.9 30.5 (19-58) 295.3 29.5 (21-38) 32.65.0 31.5 (25-40)

Semen hacmi (ml) 3.31.1 3.0 (1.5-6.0) 2.80.9 3.0 (2.0-5.0) 3.51.6 3.0 (2.0-8.0) 3.71.0 4.0 (2.0-5.0) 2.81.5 2.2 (1.0-8.0)

Konsantrasyon (x106/ml) 53.131.6 45.0 (24.0-150.0) 12.43.9 14.0 (4.0-18.0) 46.424.5 40.0 (20.0-130.0) 27.122.9 20.0 (8.0-90.0)

Motilite (% motil) 71.36.6 70.0 (45.0-80.0) 64.010.0 70.0 (45.0-80) 68.47.9 70.0 (50.0-80.0) 18.814.3 25.0 (0.0-35.0)

Morfoloji (% normal) 17.84.4 16.0 (14.0-30.0) 3.92.1 4.0 (1.0-9.0) 6.52.6 7.0 (1.0-10.0) 2.51.8 2.0 (1.0-6.0)

101

izelge 25. Seminal svda NAD-MDH, NADP-MDH ve LDH aktivitelerinin ortalamalar

Grup A OrtalamaSD Ortanca (min-maks) B OrtalamaSD Ortanca (min-maks) C OrtalamaSD Ortanca (min-maks) D OrtalamaSD Ortanca (min-maks) E OrtalamaSD Ortanca (min-maks)

Seminal sv NAD-MDH (mU/ml) 93.952.1 95.0 (14.0-188.0) 111.872.1 104.0 (10.0-285.0) 104.046.8 105.0 (28.0-190.0) 40.025.7 33.0 (10.0-86.0) 38.043.6 21.5 (0.0-162.0)

Seminal sv NADP-MDH (mU/ml) 155.177.7 137.5 (53.0-400.0) 129.476.5 109.0 (19.0-295.0) 149.2104.4 110.0 (38.0-476.0) 141.0117.1 100.0 (28.0-400.0) 138.084.3 126.0 (0.0-343.0)

Semen LDH (U/L) 1236.9687.0 1066.5 (540-3000) 774.7335.4 810.0 (300-1512) 945.6493.0 746.5 (310-1944) 1517.7729.8 1404.0 (554-2633) 940.0465.8 830.0 (297-1998)

102

izelge 26. Seminal svda GSH, glukoz ve fruktoz deerlerinin ortalamalar

Grup A OrtalamaSD Ortanca (min-maks) B OrtalamaSD Ortanca (min-maks) C OrtalamaSD Ortanca (min-maks) D OrtalamaSD Ortanca (min-maks) E OrtalamaSD Ortanca (min-maks)

GSH (mol/L) 43.512.9 40.4 (28.2-80.8) 30.47.9 30.3 (16.1-46.4) 35.715.0 36.3 (8.0-60.6) 48.916.7 47.4 (12.1-80.8) 18.713.6 14.6 (0.0-50.5)

Glukoz (mg/dl) 2.02.1 1.2 (0.0-6.6) 2.82.1 1.8 (1.0-8.3) 1.81.6 1.7 (0.0-5.7) 4.01.4 3.5 (2.6-6.7) 15.46.4 15.6 (6.4-29.5)

Fruktoz (mg/100 ml) 184.7124.8 169.0 (20.0-502) 272.1104.3 260.0 (133.0-534.0) 229.979.9 214.0 (52.0-380.0) 706.6143.3 732.5 (500-900) 338.1228.2 239.0 (135-964)

103

izelge 27. Seminal svda serbest testosteron ve leptin dzeylerinin ortalamalar

Grup A OrtalamaSD Ortanca (min-maks) B OrtalamaSD Ortanca (min-maks) C OrtalamaSD Ortanca (min-maks) D OrtalamaSD Ortanca (min-maks) E OrtalamaSD Ortanca (min-maks)

Serbest Testosteron (pg/ml) 2.41.3 1.8 (1.2-8.5) 2.11.6 1.3 (0.5-6.5) 3.72.3 3.1 (0.8-8.7) 3.61.2 3.5 (1.0-5.8) 0.90.6 0.65 (0.1-2.1)

Leptin (ng/ml) 0.201.9 0.12 (0.0-0.9) 0.110.1 0.08 (0.0-0.3) 0.160.11 0.15 (0,0-0.4) 0.140.13 0.11 (0.0-0.5) 0.150.15 0.12 (0.0-0.5)

104

izelge 28. A Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Sperm NAD-MDH (mU/ml ejaklat) 48 80 52 33 57 95 33 95 43 95 104 57 81 48 109 147 48 95 109 105 119 95 109 86 95 76 76 90 86 71 114 95 124 114 95 114 100 95 105 100

Sperm NADP-MDH (mU/ml ejaklat) 19 14 9 14 14 14 9 19 0 14 0 0 0 0 0 0 24 28 9 0 9 0 0 0 38 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Sperm LDH (U/L) 202 1721 1755 1654 500 1458 1633 1147 2870 670 404 1958 972 2093 1242 702 1238 608 547 486 378 1215 1147 810 1215 2498 1020 810 770 980 1800 1458 1210 1100 972 1210 810 780 1020 980

105

izelge 29. B Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Sperm NAD-MDH (mU/ml ejaklat) 9 57 9 19 0 0 28 132 147 147 100 105 147 124 124 128 105 114 81 124 128 86 100 100 95

Sperm NADP-MDH (mU/ml ejaklat) 0 76 66 76 19 66 0 28 38 38 33 0 0 0 0 33 0 0 0 28 0 0 0 0 0

Sperm LDH (U/L) 2160 405 405 1580 540 607 310 607 540 864 635 1370 1755 864 540 162 304 743 750 158 290 1478 472 1472 985

106

izelge 30. C Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Sperm NAD-MDH (mU/ml ejaklat) 162 171 166 214 235 142 285 166 223 214 114 124 110 105 119 119 38 105 95 100 62 47 86 180 114 62

Sperm NADP-MDH (mU/ml ejaklat) 71 66 80 71 71 19 19 57 28 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0

Sperm LDH (U/L) 1418 783 1350 1654 378 432 1120 460 1053 702 460 680 500 547 1020 1350 460 870 702 1120 680 608 810 910 610 1120

107

izelge 31. D Grubu sperm rneklerinde MDH ve LDH aktiviteleri

Olgu no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sperm NAD-MDH (mU/ml ejaklat) 81 95 143 105 86 114 66 81 95 119 147 105

Sperm NADP-MDH (mU/ml ejaklat) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 95 0 0

Sperm LDH (U/L) 2295 581 607 607 337 493 472 95 607 2633 175 472

izelge 32. Sperm rneklerinde NAD-MDH, NADP-MDH ve LDH aktivitelerinin ortalamalar

Grup A OrtalamaSD Ortanca (min-maks) B OrtalamaSD Ortanca (min-maks) C OrtalamaSD Ortanca (min-maks) D OrtalamaSD Ortanca (min-maks)

Sperm NADMDH (mU/ml) 87.326.5 95.0 (33.0-147.0) 88.349.3 100.0 (0.0-147.0) 136.861.8 119.0 (38-285) 103.024.6 100.0 (66.0-147.0)

Sperm Sperm NADP-MDH (U/L) (mU/ml) 6.09.3 0.0 (0.0-38.0) 20.026.7 0.0 (0.0-76.0) 21.029.2 0.0 (0.0-80.0) 7.927.4 0.0 (0.0-95.0)

LDH

1152.2576.0 1060.0 (202-2870) 799.8537 607.0 (158-2160) 838.3349.3 742.5 (378-1654) 781.1806.8 537.0 (95-2633)

108

izelge 33. Gruplardaki deikenlerin A (Kontrol) grubu ile karlatrlmalar sonucunda p deerleri

Konsantrasyon A Motilite A Morfoloji A Seminal sv NAD-MDH A Sem. Sv LDH A GSH A Glukoz A Fruktoz A Testosteron A Leptin A Sperm NAD-MDH A Sperm LDH A

B 0.000 0.000 0.000

D 0.001 0.000

0.000

0.000 0.001 0,000

0.006 0.000 0.025 0.006 0.014 0.013 0.01 0.008 0.020 0.055

0.01 0,000 0.002 0.000 0.004 0,000 0,015 0,000

0.005

Gruplar kontrol grubu ile karlatrldnda p<0,05 dzeyinde anlaml kabul edilmitir.

109

izelge 34. Gruplardaki deikenlerin birbirleri ile karlatrlmalar sonucunda p deerleri

Konsantrasyon B C Motilite B C Morfoloji B C Seminal sv NAD-MDH B C Semi. Sv LDH C GSH B C D Glukoz B C D Fruktoz B C D Testosteron B C D Sperm NAD-MDH B

C 0.01

D 0.01 0.01 0.01

0.01 0.01 0.01 0.01 0.000 0.000

0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

0.001 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000

0.000 0.01 0.01 0.003 0.000 0.000

0.01

Gruplar birbirleri ile karlatrldnda p<0,01 dzeyinde anlaml kabul edilmitir.

110

izelge 35. A Grubundaki deikenlerin kendi ierisinde korelasyonu (r= korelasyon katsays)

Karlatrlan deikenler Sperm motilitesi ile semende NADMDH Seminal sv LDH ile sperm konsantrasyonu Leptin ile sperm konsantrasyonu Semi. sv LDH ile glukoz Glukoz ile testosteron Sperm NADP-MDH ile sperm NAD-MDH Sperm NAD-MDH ile sperm LDH

r - 0,367 0,339 - 0,328 0,421 0,424 - 0,356 - 0,343

P 0,02 0,03 0,03 0,007 0,006 0,02 0,03

izelge 36. B Grubundaki deikenlerin kendi ierisinde korelasyonu

Karlatrlan deikenler Hasta ya ile sperm motilitesi Hasta ya ile sperm morfolojisi Sperm konsantrasyonu ile sperm motilitesi Sperm konsantrasyonu ile sperm morfolojisi Sperm motilitesi ile sperm morfolojisi Glukoz ile sperm morfolojisi Fruktoz ile sperm konsantrasyonu Semi.sv NAD-MDH ile semi. sv LDH Semi.sv NAD-MDH ile testosteron Semi.sv NAD-MDH ile leptin Glukoz ile fruktoz Semi.sv NAD-MDH ile sperm NADP-MDH

r 0,440 0,437 0,544 0,416 0,468 - 0,460 - 0,424 - 0,648 0,497 - 0,416 0,481 0,461

P 0,02 0,02 0,005 0,03 0,01 0,02 0,03 0,000 0,01 0,03 0,01 0,02

111

izelge 37. C Grubundaki deikenlerin kendi ierisinde korelasyonu

Karlatrlan deikenler Hasta ya ile sperm motilitesi Semi.sv NADPH-MDH ile semen hacmi Hasta ya ile fruktoz Sperm konsantrasyonu ile sperm motilitesi Sperm motilitesi ile sperm morfolojisi Semi.sv NAD-MDH ile semi.sv LDH Semi.sv LDH ile GSH Semi.sv NAD-MDH ile fruktoz Semi.sv NAD-MDH ile leptin Sperm NAD-MDH ile semi.sv NAD-MDH Sperm NAD-MDH ile semi.sv LDH Semi.sv NAD-MDH ile GSH

r 0,516 - 0,475 - 0,393 0,487 0,579 - 0,607 0,662 - 0,547 0,536 0,572 - 0,702 - 0,470

P 0,007 0,01 0,04 0,01 0,002 0,001 0,000 0,004 0,005 0,002 0,000 0,01

izelge 38. D Grubundaki deikenlerin kendi ierisinde korelasyonu

Karlatrlan deikenler Semen hacmi ile semi.sv NADPMDH Sperm motilitesi ile semi.sv NADMDH Sperm morfolojisi ile semi.sv NADP-MDH Semi.sv NAD-MDH ile sperm motilitesi Semi.sv NADP-MDH ile semen hacmi Semi.sv NADP-MDH ile sperm morfolojisi Semi.sv LDH ile sperm konsan. Semi.sv LDH ile sperm morfolojisi Semi.sv NADP-MDH ile GSH Glukoz ile sperm motilitesi Glukoz ile sperm morfolojisi Glukoz ile semi.sv NAD-MDH

r - 0,603 0,703 - 0,603 0,703 - 0,603 - 0,652 0,577 - 0,864 0,603 - 0,630 - 0,703 - 0,616

P 0,03 0,01 0,03 0,01 0,03 0,02 0,04 0,000 0,03 0,02 0,01 0,03

112

izelge 39. E Grubundaki deikenlerin kendi ierisinde korelasyonu

Karlatrlan deikenler Semi.sv NAD-MDH ile semen LDH Glukoz ile fruktoz Hasta ya ile leptin dzeyi

r - 0,513 0,842 0,591

P 0,042 0,000 0,016

statistiksel Deerlendirme almada elde edilen tm

verilerin

istatistiksel

analizinde

ve

grafiklendirilmesinde SPSS (12.0) ve Excell paket programlarndan yararlanlmtr. Gruplarn karlatrlmasnda Mann Whitney U Testi kullanlmtr. Gruplar kontrol grubu ile karlatrldnda p<0,05 dzeyinde anlaml kabul edilmitir. Gruplar birbirleri ile karlatrldnda p<0,01 dzeyinde anlaml kabul edilmitir.

113

80 70 60 50 40 30 20 10 0 A grubu B grubu C grubu D grubu

ekil 35. Spermiyogram deerlendirilmesine gre gruplarn karlatrlmas

konsantrasyon motilite morfoloji

konsantrasyon- x106/ml motilite% motil morfoloji% normal olarak deerlendirilmitir

Bu blmde yer alan grafikler, deikenlerin ortalama deerleri kullanlarak gsterilmi, btn gruplar kontrol grubuyla karlatrlarak p<0.05 dzeyinde anlaml kabul edilen stunlar * ile iaretlenmitir.

114

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu E Grubu
ekil 36. Seminal svda NAD-MDH ve NADP-MDH aktiviteleri (mU/ml)
NAD-MDH NADP-MDH

115

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

LDH

A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu E Grubu

ekil 37. Seminal svda LDH aktivitesi (U/L)

60 50 40 30 20 10 0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu E Grubu

GSH

ekil 38. Seminal svda GSH dzeyi (mol/L)

116

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu E Grubu

ekil 39. Seminal svda glukoz dzeyi (mg/dl)

*
Glukoz

800 700 600 500 400 300 200 100 0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu E Grubu
ekil 40. Seminal svda fruktoz dzeyi (mg/100 ml)

*
Fruktoz

117

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 A Grubu

* *

*
serbest testosteron

*
B C D E Grubu Grubu Grubu Grubu

ekil 41. Seminal svda serbest testosteron dzeyi (pg/ml)

0,25

0,2

0,15

0,1

leptin

0,05

0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu E Grubu

ekil 42. Seminal svda leptin dzeyi (ng/ml)

118

160 140 120 100 80 60 40 20 0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu NAD-MDH NADP-MDH

ekil 43. Sperm homojenatlarnda NAD ve NADP bal MDH aktiviteleri (mu/ml)

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 A Grubu B Grubu C Grubu D Grubu

sperm LDH

ekil 44. Sperm homojenatlarnda LDH aktivitesi (U/L)

119

5. TARTIMA Yaplan aratrmalarda, toplumlarda infertilite orannn % 10-15 dolaynda olduu bildirilmitir. nfertilite problemi ile bavuran iftlerin yaklak % 50sinde erkee bal faktrn olmas, erkek fertilizasyon kapasitesinin aratrlmasn atlacak ilk adm olarak beraberinde getirmektedir. nfertilitede erkek faktrnn kesinlik kazanabilmesi iin; yk, genel fizik muayene, semen analizi ve hormonal tetkikler srasyla yaplmal ve gereinde testis biyopsisi; biyokimyasal ve fonksiyonel testlerle desteklenmelidir. Bu nedenle erkek faktrn ortaya koyan en basit test spermiyogramdr. Dikkatli bir ekilde yaplan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin almas hakknda salkl bilgi sahibi olunmasn salayacaktr. 5.1. rnek Seimi ve Spermiyogram zelliklerine Gre Deerlendirme almada, rneklerin seimi yaplrken olgularn herhangi patolojik bir yks esas alnmam ancak lkosit ieren, viskoz olan ve anormal bir grntye sahip (rnein kanl) rnekler almada kullanlmam, perhiz sresine uygun olarak (ortalama 3-5 gn) toplanm rneklerin ayrlmasna dikkat edilmitir. Bunun dnda rnekler; ya ve semen hacmi ynnden bir seime tabi tutulmam, mevsimsel ve kiisel varyasyonlar gz nne alnmayp hi bir olgu allan hi bir deeri ynnden zaman ierisinde takibe alnmadan tamamen rastgele seimler yaplmtr. Olgular sadece spermiyogram (konsantrasyon, motilite ve morfoloji) zelliklerine bal olarak aada belirtildii ekilde gruplandrlmlardr: A Grubu (n = 40) - Konsantrasyon, motilite ve morfoloji normal (Kontrol grubu, normospermi) B Grubu (n = 25) - Konsantrasyon ve morfoloji dk, motilite normal (oligoteratospermi) C Grubu (n = 26)- Konsantrasyon ve motilite normal , morfoloji dk (teratospermi) D Grubu (n = 12)- Motilite dk (astenospermi) E Grubu (n = 16)- Azospermik (semende sperm bulunmamas)

120

Gruplar arasnda ya ve semen hacmi karlatrldnda istatistiksel olarak anlaml bir fark tesbit edilmemitir. Yaplan almalarda yaa bal olarak ylda; semen hacminin 0.03 ml, motilitenin % 0.7, progresif motilitenin % 3.1 azald bildirilmitir. Salkl erkeklerde semen hacmi, sperm says, motilite ve morfoloji zellikleri ynnden varyasyonlar olabilecei vurgulanmtr art olduu aklanmtr
94

. rnein perhiz (abstinans) sresine bal olarak gn . allan rneklerde sperm saysndaki dmenin %

bana semen hacminde 0.62 ml, sperm saysnda 17.6 x 106/ml ve motilitede % 1.2lik
95

motilitede azalmaya ve morfolojik olarak % anormal olarak ifade edilen sperm saysnda da arta neden olduu bildirilmitir. almamzda B grubundaki rneklerde, sperm konsantrasyonu (12.43.9 x106/ml) korelasyon ile morfoloji (3.92.1) arasnda pozitif C grubundaki rneklerde ise sperm (r = 0.416 p = 0.03) saptand.

konsantrasyonu (46.424.5) ile motilite (68.47.9) arasnda pozitif korelasyon (r = 0.487 p = 0.01) tesbit edildi. Normal (ya da fertil) kabul edilecek semen rneinde; sperm konsantrasyonu, motilite ve morfoloji deerlerinin de normal kabul edilen snrlarda bulunmas beklenmektedir. Doal olarak konsantrasyon, motilite ve morfoloji arasnda saptanan korelasyonlar o semen rneinin fertil ya da infertil olarak hangi grupta yer alacan belirtecektir. 5.2. MDH Aktivitesi le lgili Deerlendirme MDH pek ok metabolik yolun nemli bir enzimidir. karyotik hcrelerde mitokondrial ve sitoplazmik olmak zere iki izozim olarak bulunmaktadr. Mitokondriya ve sitozolde bulunan MDH, NADyi koenzim olarak kullanr; malat, okzaloasetata redklenirken NADH aa kar. Dier NADP baml MDH ise, daha ok sitozolde bulunan temizleyici bir enzimdir. Bu snf MDHn birincil grevi, malatn dekarboksilasyonunu gerekletirerek oluturmasdr . MDH1 geni; bbrek, akcier, kalp, iskelet kas, karacier, pankreas, prostat, dalak, timus, beyin ve omurilikte eksprese edilmitir ieriine sahip olduunu aklamtr
96 35 28

pirvat,

NADPH

ve CO2

Brooks,

(1978)

spermatozoann epididimal dokudan 5-400 kat daha aktif NADP+-malat dehidrogenaz . Prasad ve ark. (1976) normal, vazektomize, oligospermik ve infertil erkeklerden elde edilen 99 semen rneinde MDH dzeyini

121

elektroforetik olarak almlar, bu gruplarda MDHn farkl bir sonu gstermediini aklamlardr 97. Gronczewska J ve ark. (2003) ringa bal spermatozoasnda malik
98

enzim aktivitesini gstermilerdir

. Yaptmz aratrmalarda, bu bilgiler dnda,

insan semeninde, sperminde MDH aktivitesi ile ilgili aklama ya da reme zerinde olas direk ya da dolayl bir etkisini vurgulayan bir literatr bilgisine rastlamadk. Karlatrlan kaynaklar daha fazla MDHn molekler yapsn aklayan zellikteydi. Bu nedenle MDH aktivitesi ile ilgili sonularmz tartrken herhangi bir literatr bilgisiyle karlatrma imkan olmadan verilerimizi kendi iinde kyaslama durumunda kalnd. MDH aktivitesi alma gruplarnn seminal sv ve sperm blmlerinde NAD ve NADP baml olmak zere iki formda incelenmitir. Seminal svda NAD-MDH aktivitesi (ortalamaSD) A grubunda, 93.952.1 mU/ml); D (40.025.7 mU/ml ) ve E (38.043.6 mU/ml) gruplarna oranla anlaml dzeyde (D ve E grubu iin p<0,05) yksek bulunmutur. D grubundaki olgularn ortak zellii motilitesi dk rneklerin seilmi olmasdr. Bu durumda MDH aktivitesindeki artn, sperm motilitesinin artmasna destek olduu sonucunu dndrmektedir. E grubu azospermik rneklerden olumaktadr. Bu grup seminal svnn dierlerinden olduka dk MDH aktivitesine sahip olmas ilgin grnmtr. Dier gruplarn seminal svsnda NAD-MDH aktivitesi karlatrldnda; B grubu D ile Eden, C grubu da D ile Eden anlaml dzeyde (p<0,01) yksek bulunmutur. Kontrol grubuna (A grubu) benzer ekilde B (111.872.1 mU/ml) ve C (104.046.8 mU/ml) gruplarnda da MDH aktivitesi D ve E gruplarndan yksek bulunmutur. B ve C gruplar belirli sperm zellikleri ynnden (morfoloji ya da motilite) A grubundan farkldr. Bunlarn seminal svlarnda MDH aktivitesi A grubundan anlaml olarak farkldr. Oysaki D grubu btn zellikleri ynnden (konsantrasyon, motilite ve morfoloji ortalamas dk) A grubundan farkl bulunmutur. Bu durumda sperm aktivitesini etkileyen faktrlerin (konsantrasyon, motilite, morfoloji) hepsinin yetersiz dzeylerde bulunmas ile MDH aktivitesinin dkl arasnda bir iliki bulunduu ve bunda da motilitenin en yksek pay oluturduu dnlmtr. nk D grubu seminal sv rneklerinde MDH aktivitesi ile sperm motilitesi arasnda da pozitif korelasyon (r=0.703 p=0.01) saptanmtr.

122

Seminal sv rneklerinde NADP-MDH aktivitesi de saptanm olup oligoteratospermik grupta bu aktivite (129.476.5 mU/ml) kontrol grubundan (155.177.7 mU/ml) biraz dk gibi grnmekle beraber istatistiksel olarak anlaml bir fark vermemitir. Oysa Dikmen ve ark. seminal svda NADP-baml dehidrogenaz aktivitesini almlar; oligospermik rneklerde dehidrogenaz aktivitesini kontrol grubundan anlaml dzeyde dk bulduklarn aklamlardr 99. Bu aktivitenin MDH ya da G6PD dnda olas bir baka dehidrogenazdan kaynaklanabilecei ve bu konunun daha ileri aratrmalarla aydnlatlmas gerektii dnlmektedir. almann bir dier blmnde sperm rnekleri homojenize edilerek hazrlanan homojenatta sperm konsantrasyonu 20x106/ml olarak dzenlenmi ve NAD/NADP MDH ve LDH enzim aktiviteleri mU/ml (mU/20x106/ml) homojenat olarak deerlendirilmitir. C grubu sperm rneklerinde NAD-MDH aktivitesi (ortalamaSD) 136.861.8 mU/ml ejaklat) A (87.326.5 mU/ml) ve B ( 88.349.3 mU/ml) gruplarndan anlaml dzeyde (A grubu iin p<0.05 B grubu iin p<0.01) yksek bulunmutur. C grubunun A grubundan tek fark morfolojinin bozuk olmasdr. Bu durumda, morfolojideki defektlerin snflandrlarak deerlendirilmesinin enzim aktivitesindeki farklar aklamaya k tutabilecei dnlmektedir. MDH, malat-aspartat shuttle yolunun nemli bir enzimi olup sitozolik NADHn mitokondriye tanmasnda etkili bir rol oynar ve oksidatif ATP retimi gerekleir. MDH aktivitesindeki dme dokularda ATP retiminin de azalmasna yol amaktadr. LDH ise eitli metabolik durumlarda stabil yapda olan bir enzimdir ve sitozolik MDH/LDH orannn hayvan dokularnda enerji metabolizmasnn deerlendirilmesinde faydal bir indikatr olduu bildirilmitir. Hosoya ve ark. almalarnda yar atlarnn yarlarda yksek performans gsterebilmek iin etkili bir enerji retim sistemine ihtiya duyduklarn ve bu hayvanlarn lkositlerinde sitozolik MDH/LDH orannn yar atlarnn enerji metabolizmasn deerlendirmede nemli bir gsterge olduunu aklamlardr 100. alma planlanrken spermin enerji metabolizmas zerinde etkili olabilecek unsurlar zerinde durulmu ve MDH aktivitesinin sperm fonksiyonlarn etkileyebilecei dnlmtr. Yukarda yaplan almada olduu gibi sperm

hcreleri de etkinliklerini gerekletirebilmek ve dolaysyla hareket yetenekleri iin

123

etkili bir enerji metabolizmasna ihtiya duyarlar. almada MDH aktivitesi ve sperm motilitesi arasnda pozitif korelasyon bulunmutur. Bu durum, MDH aktivitesinin deerlendirilmesinin sperm enerji metabolizmasnn hangi ynde iledii konusunda destekleyici bilgi oluturaca grn destekliyor grnmektedir. MDH/LDH orannn deerlendirilmesinin hcrelerde enerji metabolizmasn irdeleme ynnde iyi bir gsterge olduu grnden yola karak gruplarda MDH ve LDH arasndaki ilgi aratrld. Bu durumda : - A grubunda sperm NAD-MDH ile sperm LDH arasnda negatif korelasyon (r= -0.343 p=0.03) - A grubunda spermde NAD-MDH ile NADP-MDH arasnda negatif korelasyon (r= -0.356 p= 0.02) tesbit edilmitir. - B grubunda seminal sv NAD-MDH ile seminal sv LDH arasnda negatif korelasyon (r= -0.648 p=0.000) - C grubunda seminal sv NAD-MDH ile seminal sv LDH arasnda negatif korelasyon (r= -0.607 p=0.001) - C grubunda sperm NAD-MDH ile seminal sv LDH arasnda negatif korelasyon (r= -0.702 p=0.000) - C grubunda sperm NAD-MDH ile seminal sv NAD-MDH korelasyon (r= 0.572 p=0.002) - E grubunda seminal sv NAD-MDH ile seminal sv LDH arasnda negatif korelasyon (r= -0.513 p=0.042) Yukardaki yedi maddeyle ilgili korelasyonlar toplu olarak deerlendirildiinde; genel olarak gruplarda seminal sv ya da spermde NAD-MDH ve LDH aktivitesi arasnda negatif korelasyon grlmtr. Spermde mitokondriler aktif duruma geip malat (ayn zamanda koenzim olarak da NAD) kullanlmaya baladnda MDH aktivitesi artmakta fakat bu arada laktat kullanm azald iin LDH aktivitesinin dmekte olduunu dnlmtr. Buna bal olarak pirvatn kullanmnn yetersiz kald ve mitokondrilerin yeterince aktivite gsteremedii (rnein yeterince oksijen alamad) olgularda; mitokondriyal bir enzim olan MDH aktivitesi dk kalmakta bu durumda laktatn, glikolitik yolu kullanmaya ynelerek LDH aktivitesinin ykselmesine neden olmas muhtemel gibi grnmektedir. arasnda pozitif

124

Gerez ve ark. almalarnda medyumda belirli konsantrasyonda (0.5-4 mM) bulunan malatn, sperm mitokondrisi tarafndan pirvat tketimi ve Pirvat Dehidrogenaz aktivitesini artrdn bildirmilerdir 101. Lahnsteiner ve ark. bir alabalk eidi olan Oncorhynus mykissde semen fertilizasyon kapasitesi ve sperm motilitesi, seminal plazma kompozisyonu ile sperm metabolizmas arasndaki ilgiyi aratrarak semen kalitesinin biomarkerlarn belirlemeye almlardr 102. Seminal plazmada sperm metabolizmas iin fikir verebilecek derecede neme sahip u analizler bildirilmitir: 1. Spermatozoa iin izotonik ortam salayan, motiliteyi inhibe eden inorganik bileikler (pH, sodyum, potasyum, kalsiyum, ozmolilite) (Morisawa ve ark. 1983). 2. Enerji metabolizmasnn belirteci olan organik bileikler (trigliseritler, gliserol, ya asitleri, glukoz, laktat) (Lahnsteiner ve ark. 1993). 3. Litik enzimler (asit fosfataz, alkalen fosfataz, -D-glukuronidaz, proteaz); dejenere spermatozoann elimine edilmesinden sorumlu ve muhtemelen spermatozoa dna szan enzimler (malat dehidrogenaz, laktat dehidrogenaz, adenozin trifosfataz, aspartat aminotransferaz) 102. Sperm metabolizmasyla ilgili olarak yaplan almalarda MDH, solunum aktivitesi, aspartataminoransferaz aktivitesi ve total lipit dzeylerinin fertilizasyon orannda (multiple regresyon modelinde % 75den fazla total varyans ile) semen kalitesini aklayan belirteler olduu bildirilmitir. Uzun sre bekletilen semen rneinde MDH szmasnn gerekletii ve solunum aktivitesinin artt aklanmtr. Enzim dzeylerindeki art anoksik artlarda yetersiz enerji ihtiyacna cevap vermek amacyla gereklemektedir. Bu enzimler ve sperm motilitesi arasnda korelasyon saptanmtr. Metabolik blokerlerle yaplan (Lahnsteiner ve ark. 1997) 102. Memeli spermatozoas, oosit fertilizasyonu ncesi biyokimyasal modifikasyonlara ihtiya duymaktadr. Bu modifikasyonlar bir hazrlk dnemi olan kapasitasyon ve akrozom reaksiyonunu ierir. Sperm katabolik olaylar sonucunda kapasitasyon ve akrozom reaksiyonunu iin gereken enerjiyi retir. MDH, redkte ekivalenlerin i mitokondrial membran boyunca tanmasnda nemli rol oynar; deneyler sperm enerji metabolizmas ve motilitesinin oksidatif fosforilasyon ve sitrat siklusuna bal olduunu gstermitir

125

MDHn somatik hcrelerde mitokondrial izoenzimlerinin bulunmas bu durumda etkilidir. MDH-NADP enzimi, pentoz fosfat yolu ile sitozolde yerlemitir ve hcrede redkte NADPnin ana kaynadr. MDH-NAD ko, domuz ve sr spermatozoasnn orta parasnda bulunmutur. Redkte ekivalenlerin sitozolden mitokondriaya tanmas malat-aspartat shuttle ile gereklemektedir. Cordoba ve ark. sr spermatozoasnda yaptklar almada, kapasitasyon ve akrozom reaksiyonu indksiyonu sonrasnda NAD(P)-baml MDH ve izositrat dehidrogenaz aktivitesini lmler; MDHn NADP formunun aktivitesinin daha sabit seyrettiini, MDH-NAD aktivitesinin ise azaldn bildirmilerdir. Cordoba ve ark. almalar sonunda bu enzimlerin kapasitasyon ve akrozom reaksiyonlarnda redkte ekivalen ve/veya temininde nemli rol oynadklarn aklamlardr. Biz de bu almaya benzer ekilde, MDHn NAD formunda gruplar arasnda (hem seminal sv hem de sperm iin) istatistiksel olarak anlaml farklar bulup NADP formunun ise daha stabil seyrettiini tesbit ettik. Bu durum NAD bal MDHn dndrd 103. Sperm rneklerinde MDH aktivitesi incelendiinde baz rneklerde NADP formunda aktiviteyi youn bir ekilde 0 olarak tesbit edildi. Sperm homojenizasyonu esnasnda s faktrn korumaya almamza ramen enzimin s stabilitesinin dk olduu ve bu nedenle 0 aktivite bulunduunu dnld. Scheibe ve ark. da kloroplastlarda yaptklar almada NADP-MDHn sya rezistansnn dk olduunu, NADPH eklenmesiyle s instabilitesinin kazanldn aklamlardr 104. Morfolojik deerlendirme, sperm aratrmalarnda kullanlan temel parametrelerden biridir. Sperm defektlerinin eitlilii morfolojik deerlendirme iin nemli olmakla beraber infertilite problemlerinin aratrmasnda ve spermin kiisel deerlendirilmelerinde ek metodlara ihtiya duyulmaktadr (Piasecka 2001)105. Rutin sperm boyamalaryla yaplan incelemelerde (Wang 1991, Kruger 1995, Marin 1995) sperm ba detayl olarak; orta para ise genel olarak deerlendirilmektedir.Bu inceleme orta para hakknda aklayc bilgi vermemektedir. Oysa ki orta para mitokondrial tabakay ierip bu tabaka; enerji retimi, iyonlarn tanmas, akrozom reaksiyonu ve motiliteden sorumludur 105. Olgun memeli sperminde yaklak olarak 50-75 mitokondria bulunmakta ve spermatogenez boyunca sperm mitokondrisi nemli morfolojik deiiklikler ve hcresel sperm enerjisi ile ilgili olaylarda daha aktif olduunu

126

organizasyonlar

geirmektedir.

Spermatozoada

bulunan

mitokondri

(sperm-tip

mitokondria), morfoloji ve biyokimyasal zellikleri ynnden somatik hcre mitokondriasinden deiiktir. Sperm ve somatik hcre mitokondrisi arasndaki morfolojik farkllklar 105: 1. D mitokondrial membrann fiziksel ve kimyasal zellikleri (Keyhani ve Storey 1973; Hrudka 1978,1987; Baccetti 1984; Cataldo 1996). 2. Baz enzimlerin sperm mitokondriasna yerlemi zel izoformlar vardr; rnein laktat dehidrogenaz iin LDHX (Hutson ve ark. 1977; Valesco ve ark. 1993; Gallino ve ark. 1994; Orlando ve ark. 1994) diaforaz (Gavella ve Lipovac, 1992), kreatin fosfokinaz (Tombes ve ark 1985; Orlando ve ark. 1994; Gavella ve ark. 1995), E1-pirvat dekarboksilaz (Burgos ve ark. 1994); hekzokinaz (Travis ve ark. 1998) ve sitokrom cT testise zg formu (Hess ve ark. 1993) 3. Mitokondrial substrat ve inhibitrlere farkl duyarllk bulunmas (Dop ve ark. 1977; Storey ve Kayne 1977; Gallina ve ark.1994; Burgos ve ark. 1994). Piasecka ve ark. da sperm enerji metabolizmasnn karakteristik zelliklerini ve sperm mitokondrial metabolizmay vurgulamlardr 105. Kohsaka ve ark. da inceledikleri hayvanlar ierisinde LDHn sperm ba orta para ve kuyrukta yerletiini MDHn ise orta parada mitokondrial matriksde bulunduunu (1992) aklamlardr
106

akla kavuturacak yeni metodlara ihtiya duyulduunu

. Matsuzawa ve ark. da MDHn spermde iki

izozim halinde (MDH-A ve MDH-B) bulunduunu (1987) ifade etmilerdir 107. Yukarda verilen bilgilere bal olarak; sperm mitokondrial aktivitesinde MDHn enerji metabolizmas zerindeki nemini vurgularken, motiliteye ek olarak enzimin sperm morfolojisi zerinde de etken, nemli bir kriter olabileceini dnmekte ve MDH zerinde daha detayl ileri almalarn faydal olabileceine inanmaktayz. 5.3. LDH Aktivitesi le lgili Deerlendirme LDH glikolitik yolda, laktat ve pirvatn dnml reaksiyonunu katalizlemektedir. Memelilerde LDHn 5 tetramerik izozimi bulunmakta bunlar oluturan alt birimler A ve B ya da H ve M eklinde gsterilmektedir. Bu tetramerlerin farkl somatik dokulardaki oranlar deimekte fakat LDH-C4 sadece

127

olgun testis ve spermatozoada grlmektedir. LDH-C4, spermatozoada sitozolde ve akrozomun kk bir blmnde bulunmaktadr.Yaplan almalarda somatik LDH (zellikle LDH-4) aktivitesinin klinik bir parametre olarak kullanlmasnn, germinal aktivite ve seminiferz tbl spermatozoid kalitesinin deerlendirilmesinde iyi bir marker olduu aklanmtr 55. almamzda seminal sv ve sperm rneklerinde LDH aktivitesini ayr ayr deerlendirildi. Li ve ark.
108

almalarnda, kontrol grubu seminal sv rneklerinde LDH

aktivite deerini ortalama 1.490.02x10-3 U/ml; Verdejo ve ark.109 da kontrol grubu seminal sv rneklerinde LDH aktivitesini 2465339 IU/L olarak aklamlardr. Biz de almamzda kontrol grubu seminal sv rneklerinde LDH aktivite dzeyini (ortalamaSD) (A grubu) 1236.9687.0 U/L olarak tesbit ettik. Aktivite deerlerindeki bu varyasyonun rnek seimi ve deney artlarna bal olabileceini dnmekteyiz. B grubu seminal sv rneklerinde LDH dzeyi (ortalamaSD 774.7335.4 U/L) kontrol grubundan anlaml dzeyde dk (p<0.05) bulunmutur. B grubu oligoteratospermik (konsantrasyon ve morfoloji dk) rneklerden olumaktadr. Orlando CC ve ark. almalarnda oligozoospermik hastalarda LDH-X (LDH-C) dzeyini kontrol grubunun1/3 kadar bulduklarn aklamlardr (p<0.01) bulmulardr 111. almada D grubu (motilite dk ) seminal sv rneklerinde LDH aktivitesini (ortalamaSD 1517.7729.8 U/L) kontrol grubundan anlaml dzeyde yksek (p<0.05) bulundu. Beklentimiz bunun tam tersi ynndeydi. nk yaplan aklamalar LDH aktivitesinin sperm motilitesi ile ilgili olduu eklindeydi. Yine bu grupta LDH aktivitesi ve morfoloji arasnda negatif korelasyon (r= -0.864 p=0.000) saptand. D grubu seminal sv rneklerindeki LDH aktivitesinin yksek olmasnn seminal vezikllerden bir szmaya bal ya da sperm morfolojisindeki bozukluk neticesinde szmaya bal olabileceini dnyoruz. D grubundaki olgularn sperm LDH dzeyinin (781.1806.8 U/L) kontrol grubundan (1152.2576.0 U/L) anlaml dzeyde (p<0.05) dk olmas da bu durumu dorulamaktadr. Bu durum sperm metabolizmasnda olumsuz etki oluturarak hareket kaybn provoke ettii dncesini telkin etmitir.
110

. Benzer ekilde

Sawane ve ark. da oligozoospermik grupta LDH-C4 aktivitesini nemli dzeyde dk

128

A ve D grubu seminal sv rneklerinde LDH aktivitesi ve sperm says arasnda pozitif korelasyon (A grubu iin r=0.339 p=0.03 ve D grubu iin r=0.577 p=0.04) bulundu. almamz destekler ekilde Velasco JA ve ark.112, Keltimlidis ve ark Orlando CC ve ark
110 113

, ile Sawane ve ark.

111

da (oligozoospermik grupta) sperm says

ile LDH aktivitesi arasnda gl korelasyon bulduklarn aklamlardr. Sperm rneklerinde, btn gruplar kontrol grubuyla karlatrldnda LDH aktivitesi anlaml dzeyde (p<0.05) dk bulunmutur. Gruplarda LDH aktivitesi (ortalama SD): A grubu (1152 576.0) B grubu (799.8 537) C grubu (838.3 349.3) D grubu (781.1 806.8)

Gruplar kendi iinde karlatrldnda C grubunda LDH aktivitesi B grubundan anlaml dzeyde (p<0.01) yksek tesbit edilmitir. Gavella ve ark
114

ile Casano R. ve ark

115

. almalarnda sperm rneklerinde

LDH-C4 aktivitesini oligozoospermik hastalarda, kontrol grubundan daha yksek bulduklarn aklamlardr. almamzda sperm rneklerinde total LDH aktivitesini lerek bunun tam tersi bir sonu elde edildi. Dier aratrmaclarn LDH-C4 aktivitesini lm olmalarnn belki daha hassas bir deerlendirme imkan salam olabilecei dncesindeyiz. 5.4. GSH Aktivitesi le lgili Deerlendirme nsanda bulunan nemli bir antioksidan, glutatyon tripeptidi olup oksidatif hasar ve toksinlere kar korumada merkezi rol oynar. Glutatyon ve glutatyon S-transferazn remede nemli rol oynad bildirilmi olmakla beraber seminal svda glutatyon ve glutatyon S-transferaz hakkndaki literatr bilgileri kstl durumdadr . GSH vcudun pek ok organ ve dokusunda bulunur ve yksek antioksidan zellie sahiptir . almamzda seminal sv rneklerinde GSH dzeyini saptayarak antioksidan etkinlik ve dier enzim aktiviteleri arasnda olas bir ilgiyi aratrmay dndk. B ile E gruplarnda GSH dzeyi (ortalamalar B iin 30.47.9mol/L ve E iin 18.7 13.6 mol/L) kontrol grubundan (A grubu ) (43.512.9 mol/L) anlaml

129

dzeyde dk (p<0.05) bulunmutur. Dier gruplarda ortalamalar karlatrldnda aadaki sonular elde edilmitir: D grubu (48.916.7mol/L), B grubundan dzeyde (p<0.01) yksek B grubunda (30.47.9mol/L), E grubundan (18.713.6mol/L) dzeyde (p<0.01) yksek C grubu (35.715.0 mol/L) E grubundan (18.713.6mol/L) anlaml D grubu (48.916.7 mol/L) E grubundan (18.713.6mol/L) anlaml dzeyde yksek (p<0.01) dzeyde yksek (p<0.01) olarak tesbit edilmitir. Genel olarak sonularmz Bhardwaj ve ark 116. sonular ile uyum gstermektedir. Onlar da bizim sonularmza paralel olarak almalarnda, oligozoospermik ve azospermik grupta GSH dzeyinin kontrol grubundan anlaml dzeyde dk bulduklarn aklamlardr. Ayrca azospermik grubun oligozoospermik gruptan daha dk dzeyde GSH ieriine sahip olduunu vurgulamlardr. Bhardwaj ve ark. almalarnn sonunda; glutatyonun membran btnl ve sitoskeletal btnln korunmasnda rol oynad, glutatyondaki kaybn oksidatif yanmada arta bal olarak germ hcre harabiyetine neden olabilecei, bunun sonucunda da oligospermi ve azospermi durumlarnn grlebileceini aklamlardr 116. C grubu seminal sv rneklerinde LDH aktivitesi ile GSH dzeyi arasnda pozitif korelasyon (r=0.062 p=0.000) saptanmtr. Bu durumda, GSH dzeyinin LDH aktivitesini deerlendirmede destekleyici bir katks olabileceini dnmekteyiz. C grubu seminal sv rneklerinde NAD-MDH aktivitesi ile redkte GSH dzeyi arasnda negatif korelasyon (r=- 0.470 p=0.01) ve D grubu seminal sv rneklerinde NADP-MDH ile redkte GSH dzeyi arasnda pozitif korelasyon (r= 0.603 p=0.03) saptanmtr. Bu sonuca bal olarak; MDHn NAD formunun motiliteden etkilenmesi nedeniyle D grubu dndaki dier alma gruplarnda aktif, NADP formunun ise yetersiz motiliteye sahip olan D grubunda aktif olduunu ve bu nedenle sz edilen korelasyonlar vermi olabileceini telkin etmektedir. anlaml (30.47.9mol/L) anlaml

130

Lenzi ve ark. GSHn sperm motilitesini artrc rol oynadn ve infertil erkeklere glutatyon verilmesinin motilitede arta neden olduunu bildirmilerdir almamzda GSH dzeyi ve motilite arasnda bir ilgi saptanmad. Ochsendorf FR ve ark. spermde GSH dzeyini aklamlardr 119. Fakat biz sperm rneklerinde kullandmz yntem ile redkte GSH dzeyini tesbit edemedik. 5.5. Fruktoz ve Glukoz Dzeyi le lgili Deerlendirme Fruktoz, seminal keselerden salglanr ve yine vezikler kaynakl zel proteinlerle kompleks oluturur. Normal likefikasyon artlarnda fruktoz tamamen dialize olabilir. Fakat semenin asidik artlara maruz kalmas likefikasyonu bloke eder ve fruktoz dialize olamaz. Bylece fruktoz semenin likefikasyonunda rol oynar. Likefikasyon esnasnda glukoz olumaya balar. Fruktozun glukoza dnmeye balamas prostatik sekresyon kaynakldr. Ejaklasyondan sonra spermatozoa fruktoliz olarak tanmlanan olayla fruktoz kullanmaya balar. Spermatozoa semen ierisinde bulunduu sre boyunca onun enerji kayna fruktozdur
120,121 117,118

. Yksek sperm konsantrasyonunda seminal sv

fruktoz konsantrasyonunun dk olmas beklenir. Bu nedenle azospermik ve oligozoospermik olgularn seminal fruktoz dzeyi normozoospermik gruptan yksek bulunmutur. Seminal fruktoz konsantrasyonunun, motil sperm says ile negatif korelasyon gstermesi ejaklasyondan sonra sadece motil spermin fruktoz tketecei gereine dayanmaktadr (Gustavo 2001) 120. Glukozun insan sperminde optimal kapasitasyon ve fertilizasyon iin gerekli olduu bildirilmi fakat glikoliz iin ekstra metabolik enerji salayp salamad aklk kazanmamtr. Glukoz dndaki dier ekerlerin kapasitasyon iin esansiyel olmad ancak kk, hzlandrc bir katks olabilecei aklanmtr. Servikal mukusun glukoz ieriinin yksek olduu fakat fruktoz iermedii, burada sperm tarafndan glukoz kullanld bildirilmitir. Seminal svdaki glukoz konsantrasyonu fruktozun 1/50si kadar olmasna ramen glukoz spermin enerji tketiminin yarsn karlamaktadr. Glukoz kullanmndaki tercih hekzokinaza duyulan affiniteye bal olabilmektedir. Hekzokinaz, memeli spermatozoasnda fruktolizi balatr sadece fruktoz deil glukoz gibi dier ekerleri de fosforlar. Normal semen rneklerinde (sperm konsantrasyonu > 50x106/ml ) glukoz konsantrasyonu, oligozoospermik semen rneinden daha hzl dmekte, vazektomize ve azospermik erkeklerin semen

131

rnekleri, normal kontrol semen rnekleriyle karlatrldnda daha yksek ve stabil glukoz konsantrasyonu gstermektedir 71. Memeli spermatozoas fertilizasyon olay ncesi kapasitasyon ilemine ihtiya duymaktadr. Kapasitasyon esnasnda spermatozoa, hiperaktivasyon olarak tanmlanan motilite deiimine maruz kalr; fertilizasyon ve dii reme kanalnda mukozal bariyeri aabilmek iin daha etkin bir performans kazanm olur. Bu ilemin vitro artlarda kltr medyumuna eklenen bileiklerle desteklenmektedir. Kapasitasyon olay srasnda gerekletirilen anahtar olaylardan biri tirozin fosforilasyonu olup protein kinaz A ve Cnin kapasitasyondaki etkisi gsterilmitir. n vitro artlarda medyumda bulunan HCO3-, Ca+2 ve albmin dzeyleri kapasitasyon olayn etkilemektedir. Sperm aktivitesini etkileyen medyumdaki dier nemli bileikler enerji komponentleri olan glukoz, pirvat ve laktattr. nsan ve fare spermatozoasnda glukozun birincil derecede karbon kayna ve glikolizin de kapasitasyon iin en nemli metabolik yol olduu bildirilmitir. Farede glukoz yokluunda zona pellusida penetrasyonu ve sperm-oosit fzyonunun engellendii bildirilmitir. Oositten ziyade spermin, pentoz fosfat yolu (PFY) ile glukozu metabolize etmesi gerekmektedir. NADPHn insan sperminde protein tirozin fosforilasyonunu modle etmesi; PFY ile metabolize edilen glukozun protein tirozin fosforilasyonuna katldn gstermektedir. Tirozin fosforilasyonuna bal olarak gerekleen kapasitasyonun ardndan olay , akrozom reaksiyonu ile sonlanmaktadr. Akrozom reaksiyonu srasnda d akrozomal membran, spermatozoann plazma membran ile birleir ve vezikler ierik dar salnr. Akrozomal ieriin boaltlmas oosit zona pellusida penetrasyonu iin nemlidir 121,122. Spermatogenez; son derece senkronize, dzenli, devaml ve kompleks hcresel farkllama olaylarn iermekte olup spermatogonial kk hcre yksek dzeyde zellemi haploid spermatozoaya dnmektedir. Spermatogonia enerji kayna olarak glukozu kullanmakta fakat spermatosit ve spermatidler, ATP konsantrasyonunu belirli bir dzeyde tutabilmek iin laktat/pirvata ihtiya duymaktadrlar. Spermatozoa ise enerji kayna olarak glukoz ya da fruktozu kullanabilmektedir. Bylece spermatogenezin her aamasnda enerji iin ihtiya duyulan substrat deimektedir 123. almamzda, glukoz dzeyleri B (2.82.1 mg/dl) , D (4.01.4 mg/dl) ve E (15.46.4 mg/dl) gruplarnda kontrol grubundan A (2.02.1 mg/dl) anlaml dzeyde

132

(p<0.05) yksek bulundu. Dier gruplar birbirleriyle karlatrdmzda B grubunun deeri (2.82.1 mg/dl) D (4.01.4 mg/dl) ve E (15.46.4 mg/dl) gruplarndan anlaml dzeyde (p<0.01) dk; yine ayn ekilde C grubu da (1.81.6) D ve E gruplarndan, D grubu da E grubundan anlaml dzeyde (p<0.01) dk olarak tesbit edilmitir. Yukardaki sonular yorumladmzda sperm tarafndan glukoz kullanmnn olduunu bizim verilerimiz de desteklemi oldu. nk kontrol grubunda glukoz deeri dier gruplardan anlaml olarak dk ve azospermik grupta ise en yksektir. Spermiyogram zelliklerine gre glukoz deeri dier gruplar arasnda da deiiklik gstermekte; rnein motilitenin dk olduu D grubunda glukoz kullanmnn da dk olduunu grmekteyiz. Ayrca B grubu seminal sv rneklerinde glukoz dzeyi ile sperm morfolojisi arasnda negatif bir korelasyon (r= -0.460 p=0.02) saptand. Bu durumu normal morfolojiye sahip spermlerin glukoz tketiminde arta neden olabilecei eklinde yorumlamay dndk. Literatr bilgilerinde bu ynde bir bulguya rastlamadk. D grubu rneklerde glukoz dzeyi ile sperm motilitesi arasnda negatif korelasyon (r= -0.630 p=0.02) ve glukoz dzeyi ile morfoloji arasnda yine negatif bir korelasyon (r= -0.703 p=0.01) saptanmtr. Povoa ve ark. da almalarnda sperm motilitesi ile glukoz konsantrasyonu arasnda negatif korelasyon bulduklarn aklamlardr 124. Povoa ve ark Diamandis ve ark 0.4 mM gstermektedir. Testislerde glukoz tanmasnn GLUT-3 ile yksek affinitede bildirilmitir
126,127 124

. normal insan semeninde glukoz ieriini 0.410.09 mmol/l,

125

. normal grupta glukoz ieriini 7.37 mmol/l ve Setchell BP26 ise

olarak aklamtr. Glukoz dzeyi ile ilgili aklanan deerler varyasyon gerekletii, glukoz

fruktoz tanmad, spermde ise GLUT-5 ile fruktoz tanp glukoz tanmad . Wang ve ark. ise spermde, glukozun tanmasnn tayclarndan GLUT 3 ve 14 ile gerekletiini bildirmilerdir 128. Fruktoz sonularn incelediimizde B (272.1104.3 mg/100 ml), D (706.6143.3 mg/100 ml) ve E (338.1228.2 mg/100 ml) gruplarnn ortalama deerlerinin kontrol grubundan A (184.7124.8 mg/100 ml ) anlaml dzeyde (p<0.05) yksek bulunmutur. Fruktoz iin bulunan bu sonular ayn gruplarda glukoz iin de paralellik gstermektedir. Dier gruplar birbirleriyle karlatrldnda D (706.6143.3 mg/100 ml) grubu B (272.1104.3) grubundan, D grubu C (229.979.9) grubundan ve

133

D grubu E grubundan anlaml dzeyde (p<0.01) yksek bulunmutur. Burada karmza kan tablo kontrol grubunda fruktoz kullanmn en fazla (glukoz iin de benzer durum geerli) olduu, motilitenin yetersiz olduu D grubunda ise fruktoz deerinin yksek, dolaysyla enerji tketiminin az olduudur. Bu durumda sperm motilitesi ile fruktoz dzeyi arasnda bir ilgi beklerken istatistiksel olarak bir korelasyon saptanmad. Patel ve ark
129

. motil sperm says ve fruktoz dzeyi arasnda pozitif korelasyon bulduklarn fruktoz dzeyi ile sperm konsantrasyonu

aklamlar. te yandan B grubunda

arasnda negatif bir korelasyon (r= -0.424 p=0.03) saptand. B ve E gruplarnda glukoz ve fruktoz dzeyleri arasnda pozitif korelasyon (B iin r=0.481 p=0.01 E iin r=0.842 p=0.000) tesbit edildi. Bu durum bize Patel ve ark129. yapt aklamada olduu gibi glukoz ve fruktozun ayn kaynaktan regle edildiini dndrmtr. C grubu seminal sv rneklerinde NAD-MDH aktivitesi ile fruktoz dzeyi arasnda negatif korelasyon (r= -0.547 p=0.004) saptand. iin de geerlidir. Bu sonular ayn zetlediimizde; kaynaktan, fruktoz ve glukozun sperm regle tarafndan edildiklerini kullanldn, benzer mekanizmalarla Bu durum glukoz dzeyi

dndmz vurgulamak isteriz. 5.6. Hormonlar ve Erkek reme Sistemi Erkek reme fonksiyonlar hipofiz bezinden salglanan FSH (folikl uyarc hormon) ve LH (luteinize edici hormon) hormonlaryla kontrol edilir. FSH erkeklerde testisde sperm retimini, LH ise testisde bulunan leydig hcrelerini uyararak testosteron hormonunun salglanmasn salar. Testosteron erkeksi fiziksel karakterlerinin gelimesini etkiler ve sperm retimine katkda bulunur 85. Son zamanlarda yaplan almalarda leptinin kadn ve erkek reme sistemi zerinde nemli roller stlendii aklanmtr78. almada sperm enerji metabolizmasnn yan sra seminal svda hormon profilini de gzden geirmek ve hangi dzeyler arasnda iliki olabileceini aratrmak amacyla testosteron ve leptin dzeyleri de incelendi. zellikle testosteron dzeyi ile dehidrogenaz aktivitesi gsteren enzimler arasndaki olas bir ilgi merak ettiimiz konular arasndayd.

134

5.6.1. Leptin Dzeyi le lgili Deerlendirme 167 amino asitlik bir protein olan leptin adipoz dokunun yan sra plasenta, mide ve iskelet kasnda da retilmektedir. Leptin, kan akmna salnr ve parakrin mekanizmalarla etki gsterir, yetikinlerde GnRH salglanmasn uyarp gonadlar zerinde indirek etkiler oluturur. Leptin remedeki periferal roln MAP kinazlar indkleyerek gerekletirmektedir. Ayrca leptinin ob/ob farede 17 -hidroksilaz iin mRNA dzeyini artrd in vivo olarak gsterilmitir. Bylece leptinin remede direk veya indirek bir rol stlendii bildirilmektedir 74,75. Kontrol grubunda seminal svda leptin dzeyini ortalama 0.20 1.9 ng/ml olarak saptadk. Literatrde leptin dzeyi ile deiik sonulara rastlanld. Bu farklln, allan gruplarn zelliklerinden ya da yntemin deiikliinden kaynaklanabilecei dnld. rnein Glander ve ark.76 normal semen rneinde leptin dzeyini 1.450.18 ng/ml, Sohbe ve ark.74 0.210.21 g/l, Lackey ve ark.130 da genel olarak insan semeni iin 0.55-1.15 ng/ml olarak aklamlardr. B grubu (oligoteratospermi) seminal sv rneklerinde leptin dzeyini (0.110.1 ng/ml) kontrol grubundan (0.20 1.9 ng/ml) anlaml olarak (p<0.05) dk saptadk. B grubundaki rnekler konsantrasyon ve morfoloji ynnden kontrol grubundan daha dk deerlere sahipti. Bu durumda, leptin konsantrasyonunun sperm konsantrasyonu ve morfolojisini etkiledii dnlmtr. Camina ve ark.131 almalarnda sperm konsantrasyonu, motilite, vitalite, morfoloji ve leptin konsantrasyonu arasnda korelasyon bulmadklarn aklamlardr. te yandan Jope ve ark.75 dk kalitede sperm ieriine sahip semen rneklerinin daha dk dzeyde leptin reseptr ve leptin balama kapasitesine sahip olduklarn aklamlardr. Sohbe ve ark.74 yine bizim almamza ters decek ekilde alma gruplarndaki sonularn u ekilde aklamlardr; obstrktif azospermi ve dk dzey azospermi gruplarnda leptin dzeyini kontrol grubundan hemen hemen iki kat fazla bulmulardr. Oysa ki bizim normal olgularda leptin dzeyi, infertil spermiyogram ieriine sahip semen rneinden daha yksek deerde tesbit edilmiti. Yine bir baka grup, Glander ve ark.76 almalarnda seminal svda kontrol grubunda leptin dzeyini, orannda) bulmulardr. patolojik (vazektomi yaplan) gruptan daha dk (1/2

135

Dier almaclarn olgularnda sonularn daha farkl olmas, bu almaclarn olgularnda reseptr dzeyinde bir bozukluk olabileceini, bizim infertil gruplarda ise hormonun seminal svya geiiyle ilgili bir problem olabilecei sonucunu dndrmtr. Verilerimize gre leptin normal, olgun sperm oluumu iin nemli bir faktrdr. B grubu seminal sv rneklerinde NAD-MDH aktivitesi ile leptin dzeyi arasnda negatif korelasyon (r= -0,416 p=0,03), C grubunda ise pozitif korelasyon (r=0,536 p=0,005) saptanmtr. E grubu seminal sv rneklerinde leptin dzeyi ile hasta ya arasnda pozitif korelasyon (r=0,591 p=0,016) saptand. Van Den Saffele ve ark
74

(1999) yalanan

salkl erkeklerde serum leptin dzeyinde art olduunu bildirmilerdir. Fakat seminal svda leptin dzeyi ve ya arasnda korelasyon gsterecek bir literatr bilgisine rastlamadk. 5.6.2. Testosteron Dzeyi le lgili Deerlendirme Testosteron testisler tarafndan retilen ana hormon olup normal geliim, erkek cinsiyet organlar ve cinsiyet karakterlerinin geliimi iin nemli bir role sahiptir. Testosteron, yetikin erkeklerin yaam boyunca sperm retimi, seks gcnn korunmas, erektil potansiyel, prostat bezinin fonksiyonu ve dier reprodktif yaplar iin ihtiya duyulan bir hormondur. Testosteron retimi gonadotropin hormonlar ile kontrol edilir. almamzda seminal sv rneklerinde, kontrol grubunda testosteron dzeyi ortalama 2.41.3 pg/ml olarak saptand. B ve E gruplarnda testosteron dzeyi (B grubu ortalamas 2.11.6 pg/ml ve E grubu ortalamas 0.90.6 pg/ml) kontrol grubundan anlaml dzeyde (p<0.05) dk; C (3.72.3 pg/ml) ve D (3.61.2 pg/ml) gruplarnda ise kontrol grubundan anlaml dzeyde (p<0.05) yksek bulundu. Tohoku ve ark.132 normal erkeklerde seminal plazmada testosteron dzeyini 72 ng/100 ml ve hasta grupta 5241 ng/100ml olarak aklamlardr. Zalata ve ark133. anormal sperm karakterlerine sahip semen rneklerinin testosteron dzeyinin normozoospermik rneklerden dk olduunu bildirmilerdir. Luboshitzky ve ark.134 da infertil erkeklerin kontrollerden daha dk seminal plazma testosteron dzeyine sahip olduunu, sperm says, motilite ve morfoloji zelliklerinin seminal plazmada testosteron dzeyi ile nemli dzeyde

136

korelasyon gsterdiini aklamlardr. Bu literatre paralel olarak, bizim alma gruplarmz ierisinde oligoteratospermik ve azospermik grup kontrol grubundan dk dzeyde testosteron dzeyine sahip iken C ve D gruplarndaki yksek dzeyi ileri incelemelere deer bir bulgu olarak deerlendirdik. A grubu rneklerde glukoz ve testosteron dzeyleri arasnda pozitif korelasyon saptanmas (r=0.424 p=0.006) bu hormon ve bu metabolit arasnda sentez ve kullanm mekanizmas asndan bir ilgi olabilecei sonucunu dndrmtr. te yandan B grubu rneklerde seminal sv NAD-MDH aktivitesi ile testosteron dzeyi arasnda pozitif korelasyon (p=0.497 p=0.01) saptanmtr. Bu durumda testosteron dzeyinin NAD-MDH enziminin aktivitesine katkda bulunan bir faktr olabileceini dnmekteyiz.

137

5.6.3. Seminal Svda NAD-MDH Aktivitesi < 20 mU/ml Olan rneklerin Deerlendirilmesi Seminal svda NAD-MDH aktivitesi < 20 mU/ml olan rnekler, allan belirli zellikleri ynnden incelenerek bu bulgular aada sunulmutur: No NADMDH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 10 14 14 10 14 14 10 19 10 10 19 0 19 NADP -MDH 66 266 105 171 133 53 62 105 109 95 105 343 152 LDH Testos U/L pg/ml Leptin ng/ml 0.12 0.09 0.52 0.07 0.07 0.18 0.0 0.5 0.01 0.01 0.01 0.3 0.4 Sperm konsan. x106/ml 1512 1.1 1363 0.9 1350 2.5 2430 5.8 2565 2.6 3000 4.6 621 1.4 743 945 554 878 0.9 0.7 0.3 0.4 1350 1.8 15 4 15 25 90 120 Azosp. Azosp. Azosp. Azosp. Azosp. Azosp. Azosp. % 70 % 50 %0 %0 %0 % 80 %5 %2 %2 %1 %1 % 30 yok bekar yok yok yok ? yok yok yok yok yok yok yok Motilite % motil Morfo. Gebelik % nor.

mU/ml mU/ml

1485 2.1

Bu sonulardan yola karak; MDH aktivitesinin, spermde fertilizasyon potansiyelini ve erkek infertilitesini deerlendirmede nemli bir katks olabileceini dnmekteyiz.

138

6. SONULAR VE NERLER
1. Erkek infertilitesi ile ilgili olarak yaplan aratrmalarda atlacak ilk ve en nemli adm spermiyogramdr. Spermiyogram incelemesi ynlendirici noktalara tayabilmektedir. 2. Sperm metabolizmasn deerlendirebilmek amacyla deiik seminal sv ve sperm rneklerinde MDH aktivitesi NAD ve NADP baml olmak zere iki formda incelendi. Fertil grup seminal sv rneklerinde NAD-MDH aktivitesini infertil gruptan anlaml olarak yksek bulundu. Genel olarak MDHn NAD formunun NADP formuna oranla hem seminal sv hem de sperm blmlerinde daha aktif olarak alt tesbit edildi. Ayrca bir grup seminal sv rneinde MDH aktivitesi ve sperm motilitesi arasnda pozitif korelasyon saptand. Buna bal olarak MDH aktivitesinin sperm fonksiyonlar, motilitesi zerinde etkili olduunu dnmekteyiz. Bu konuda MDH enzimi zerinde yaplacak daha ileri almalarn sperm fonksiyonlarn deerlendirmede yol gsterici rol oynayacana inanyoruz. nsan semeni ya da sperminde MDH ile ilgili, bu konuya katks bulunabilecek literatr bilgisine rastlanmamtr. nsan semeni ya da spermatozoasnda MDH ile ilgili mevcut bilgileri tartabilecek daha ileri almalarn, erkek reme potansiyelini deerlendirmede yeni bir bak as kazandrabilecei dnlmtr. 3. Sunulan almada seminal sv ve sperm rneklerinde LDH aktivitesi deerlendirildi, enzim aktivitesini fertil grupta, infertil gruptan daha yksek olarak tesbit edildi. Son zamanlarda yaplan almalarda LDH aktivitesini MDH ile beraber deerlendirmenin (MDH/LDH oran olarak) daha faydal olduu belirtilmektedir. 4. almada zerinde durulan bir dier nokta GSH dzeyi ve dehidrogenaz enzimleri arasnda olas bir ilginin varlyd. GSH dzeyi; fertil grupta, infertil gruptan anlaml olarak yksek saptand. sonucunda ulalan deerler, yaplan pek ok ileri aratrmalar destekleyici ya da

139

Baz gruplarda MDH aktivitesi ile GSH dzeyleri arasnda farkl ynlerde (pozitif ve negatif) korelasyonlar gzlendi. Bu durumun enzimin farkl formlarnn (NAD/NADP) etkinliine bal olabileceini dnmekte fakat genel olarak GSH dzeyinin MDH aktivitesini deerlendirmede destekleyici rol olabileceine inanmaktayz. 5. almay planlarken; seminal svda fruktoz dzeyini saptamamzn, dier deerlere (rnein enzim aktivitelerine) destekleyici bir bilgi verebileceini dnmtk. Genel olarak, fruktozun spermin enerji ihtiyacn karlad bilgisinden yola karak seminal svda glukoz dzeyini de gzden geirmek istemitik. Bulgularmz deerlendirdiimizde sperm tarafndan fruktozun yan sra glukozun da aktif bir ekilde kullanld ve fruktoz ile glukoz tketimi arasnda yksek dzeyde benzerlik bulunduu dikkatimizi ekti. Bu bulgularla, spermde enerji ihtiyacnn nasl karland konusuna biz de destekleyici bir bilgi eklediimize inanyoruz. 6 Seminal svda leptin dzeyini inceleyerek gruplar arasnda olas bir fark aratrld ve oligoteratospermik grupta, kontrol grubundan anlaml dzeyde dk saptand. Buna bal olarak leptin dzeyinin; sperm konsantrasyonu ve morfolojisi zerinde etkili olduunu dnmekteyiz. Bu konuda yaplabilecek yeni almalarn bizim bulgularmz destekleyici olabilecei grndeyiz. 7. almada seminal svda incelemeye aldmz bir dier hormon serbest testosterondur. Oligoteratospermik ve azospermik grupta testosteron dzeyini kontrol grubundan anlaml dzeyde dk saptand. Yine oligoteratospermik grupta testosteron dzeyi ile NAD-MDH aktivitesi arasnda pozitif korelasyon saptanm olmas testosteronun bu enzimin aktivitesini etkileyen bir faktr olabileceini dndrmtr. 8. almann son blmnde NAD-MDH aktivitesi < 20 mU/ml olan rnekleri, gruptaki rneklerde genel olarak, sperm fonksiyonlarnn

140

olumsuz ynde etkilenmesi ve bu kiilerde gebelik elde edilmemi olmas dikkatimizi ekti. Bu noktadan yola karak MDH aktivitesi ile infertilite arasndaki ilikinin daha iyi planlanm, ileri almalarla irdelenmesi gerektiini dnmekteyiz. MDH aktivitesinin sperm fonksiyonlar zerindeki etkilerini daha detayl gsterebilecek ve hatta spermatogenez aamalarnda, olgun bir sperm oluuncaya kadar MDH dzeylerinin nasl seyrettiini aklayabilecek almalarn yaplabilmesi dncelerimizin aydnlatlabilmesi konusunda ok nemli olabileceine inanmaktayz.

141

7. KAYNAKLAR
1. Male Infertility-Overview & Causes-Urologychannel Eriim: http:/ urologychannel.com/maleinfertility/index.shtml Eriim tarihi: 7.1.2005 Delilba L. Tp Bebek-Yardmc reme Tekniklerinde Laboratuar Yntemleri.Bayndr Salk, Eitim ve Aratrma Vakf, Ankara, 1997. Gnalp S. Kadn Doum Hekiminin Erkek Faktrnn Aratrlmas ve Deerlendirilmesindeki Rol Ne Olmaldr? Trk Jinekoloji ve Obstetrik Dernei Uzmanlk Sonras Eitim Dergisi, 2004;7(29:129-140. Lens JW. The Spermatozoon. Bras M, Lens JW, Piederiet MH, ivf lab-Laboratory aspects of in vitro fertilization, Organon pres.1996. Irvine SD. Glutathione as a treatment for male infertility. Rev of Reprod., 1996;1:6-12. Antony van Leewenhoek (1632-1723) Eriim: http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leewenhoek.html Eriim tarihi: 2.12.2004 Ruestow EG. Leeuwenhoeks Perception of the Spermatozoa. Eriim: http://zygote.swathmore.edu/fert1a.html Eriim tarihi 1.12.2004 Eriim: http://www.amuseum.de/physik/exh96/sperm.gif Eriim tarihi: 19.4.2005 Liphultz LI. The Continuing Debate Over The Possible Decline in Semen Quality. Fertil Steril, 1996;65:909-911. Eriim: http://www.infertility-male.com/treatment/debate.htm Eriim tarihi: 19.4.2005 Rrumbullaku L. Semen Analysis. Eriim: http://Semen Analysis.htm Eriim tarihi: 19.4.2005 World Health Organization (1992). WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Cervical Mucus Interaction. 3rd Edn. Cambridge University Pres, Cambridge. Male Factor Infertility Eriim://uuhsc.utah.edu/healthinfo/adultmen/infertil.htm Eriim tarihi: 19.4.2005 Andrology: Causes, symptoms, treatment for male infertility, impotence. The Male Factor Infertility. Eriim://www.andrology.com/maleinfertility.htm Eriim tarihi: 19.4.2005 Infertility: Infertility Causes Infertility Testing and Infertility Treatment Eriim: http://www.advabcedfertility.com/infert.htm Eriim tarihi: 20.4.2005

2. 3.

4. 5. 6.

7.

8. 9.

10.

11. 12.

13.

14.

142

15.

Infertility-Causes of Infertility Eriim://www.holistic-online.com/Remedies/infertility/inf_causes.htm Eriim tarihi:20.4.2005 Causes of Infertility Eriim://www.fertilitydocs.com/causesof.html Eriim tarihi:20.4.2005 Causes of Male Infertility Eriim://www.wrongdiagnosis.com/m/male_infertility/causes.htm Eriim tarihi:20.4.2005 Causes of Male Infertility Eriim://www.andrologyaustralia.org/infertility/causes.htm Eriim tarihi:20.4.2005 Eriim:http://www.fertijin.com.tr/ili.asp?id=ef1 Eriim tarihi:22.4.2005 Duru NK. Subfertil ve nfertil Sperm Parametreleri. GATA Tp Fakltesi Kadn Hastalklar ve Doum Anabilim Dal Notlar Ankara, 1998. Semen Evaluation Eriim:http://www.zdlinc.com/maklercc.htm Eriim tarihi: 21.4.2005 Makler Counting Chamber Eriim:http://sepalreproductivedevices.com/template_products.cfm?classID=50www.zdlinc.com /maklercc.htm Eriim tarihi: 21.4.2005 Enginsu E, Gnalp S, Orhon E. Sperm Morfoloji Atlas. Trkiye nfertilite Vakf Yaynlar No :4, Ylmaz Ofset, 1995. Ik AZ, Vicdan K. n Vitro Fertilizasyon Uygulamalarnda Laboratuar. ada Medikal Ankara, 1999. Spermiogram Eriim :http://www.jinekolognet.com/detay.asp?pid=181 Eriim tarihi:21.4.2005 Setchell BP, Maddocks S. The Male Reoroductive System. Knobil E, Neill JD. The Physiology of Reproduction. Raven Pres, Ltd. New York, 1994:1063-1175. Malate Dehydrogenase Eriim: http//www. Arches.uga.edu/~lxyang/bcmb8010/malate%20dehyrogenas.pdf Eriim tarihi 14.3.2005 Christopher RG, Nicholls DJ. Malate Dehydrogenase: A model for structure, evolution, and catalysis. Protein Science, 1994;3:1883-1888. Malate Dehydrogenase Eriim:./query.fcgi?cmd=Retrieve&db=OMIM&dopt=Detailed&tmpl=dispomimTemplate&listu ids=1 Eriim tarihi: 9.3.2004

16.

17.

18.

19. 20. 21.

22.

23. 24. 25.

26. 27.

28. 29.

143

30.

Malate Dehydrogenase Eriim: wwwworthington-biochem.com/MDH/default.html Eriim tarihi: 9.3.2004 Wright SK, Kish MM, Viola RE. From Malate Dehydrogenase to Phenyllactate dehydrogenase. J Biol Chem, 2000;275(41):31689-31694. Lindstrom A. Immunulogical Investigation of Chlamydomonas Malic Enzyme,1977. Eriim:http://www.bio.davidson.edu/old_site/student/Lindthesis/AmyThesis.html Eriim tarihi: 11.6.2004 Yang Z, Zhang H, Hung HC, Kuo CC, Tsai LC, Yuan HS, Chou WY. Structural studies of the pigeon cytosolic NADP+-dependent malic enzyme. Prot Scien 2002;11:332-341. Enzyme 1.1.1.37 Eriim :http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?enzyme+1.1.1.37 Eriim tarihi: 28.6.2004 GeneCard for MDH1 Eriim :http://genome-www.stanford.edu/cgi-bin/genecards/carddisp?MDH1 Eriim tarihi: 7.6.2004 Human Protein-MDH1 Eriim :http://harvester.embl.de/harvester/P409/P40925.htm Eriim tarihi: 7.6.2004 Voegele RT, Mitsch MJ, Finan TM. Characterization of two members of a novel malic enzyme class. BBA 1999;1432:275-285. Xu Y, Bhargava G, Wu H, Loeber G, Tong L. Crystal structure of human mitochondrial NAD(P)+- dependent malic enyme.: a new class of oxidative decarboxylases. Structure, 1999;7(8):877-889. Yang Z, Lanks CW, Tong L. Molecular Mechanism for the Regulation of Human Mitochondrial NAD(P)+-Dependent Malic Enzyme by ATP and Fumarate. Structure, 2002;10:951-960. Yang Z, Batra R, Floyd DL, Hung HC, Chang GG, Tong L. Potent and Competitive Inhibition of Malic Enzymes. Biochem Biophys Res Commun, 2000;274:440-444. Bhargava G, Mui S, Pav S, Wu H, Loeber G, Tong L. Preliminary Crystallographic Studies of Human Mitochondrial NAD(P)+- Dependent Malic Enzyme. J Struc Biol, 1999;127:72-75. Tao X, Yang Z, Tong L. Crystal Structures of Substrate Complexes of Malic Enzyme and Insights into the Catalytic Mechanism. Structure, 2003;11:1141-1150. Malic enzyme 1 Eriim:http//harvester.embl.de/harvester/Q167/Q16797.htm Eriim tarihi: 24.3.2005 Malic enzyme 1,2,3 Eriim:http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=omim Eriim tarihi: 22.3.2005 Mitsch MJ, Voegele RT, Cowie A, Osteras M, Finan TM. Chimeric Structure of the NAD(P)+- and NADP+-dependent MalicEnzymes of Rhizobium meliloti. J Biol Chem, 1998;273(15):9330-9336.

31. 32.

33. 34.

35.

36.

37. 38.

39.

40. 41. 42. 43.

44.

45.

144

46. 47.

Zelewski M, Swerczynsk J. Malic enzyme in human liver. Eur J Biocem, 1991;201:339-345. Kawai M, Hosaki S. Clinical usefulness of malate dehydrogenase and its mitochondrial isoenzyme in comparison with aspartate aminotransferase and its mitochondrial isoenzyme in sera of patients with liver disease. Clin Biochem, 1990;23(4):327-334. Rao GSJ, Coleman DE, Karsten WE, Cook PF, Haris BG. Crystallographic Studies on Ascaris NAD-Malic Enzyme Bound to Reduced Cofactor and Identification of an Effector Site. J. Biol. Chem.2003;278(39):38051-38058. zcan K, Kolta IS, Aras D. ukurova Blgesinde Amoebosis Olgularnda zole Edilen Entamoeba Histolyticann zoenzim Elektroforeziyle Patojenitesinin Aratrlmas, TBTAK Projesi, Proje No:1585, 2000. Oh TJ, Kim IG, Park SY, Kim KC Shim HW. NAD-dependent malate dehydrogenase protects against oxidative damage in Escherichia coli K-12 through the action of oxaloacetate. Env Toxicol Pharmacol, 2002;11:9-14. Murray RK, Mayes PA, Granner DK, Rodwell VW. Harpers Biochemistry.25th.Ed .Appleton & Lange Publications, 2000. Kosinski RJ. Additional Information on Lactate Dehydrogenase Eriim:http://biowww.clemson.edu/bpc/bpLLab/111/LDH.html Eriim tarihi:5.3.2002 Laudat A, Foucault P, Palluel AM. Relationship between seminal LDH-C4 and spermatozoa with acrosome anomalies. Clin Chim Acta, 1997;265:219-224. Wong C, Paez,LR, Nogueda B; Perez A, BaezaI. Selective inhibition of the sperm-specific lactate dehydrogenase isozyme-C4 by N-isopropyl oxamate. BBA, 1997;1343(1):16-22. Gupta GS. LDH-C4: A Unique Target of Mammalia Spermatozoa. Clin Rev Biochem Molec Biol, 1999;34(6):361-385. Edwards Y, West L, Van HV, Cowell J, Goldberg E. Regional localization of the spermspecific lactate dehydrogenase, LDHC gene, on human chromosome 11.Ann Hum Genet, 1998;Jul-53(3):215-9. Velasco JAN, Zapata I, HernandezP, Albacete MP, Oltra JTO, Paricio JJP. Lactic dehydrogenase C4 activity in seminal plasma and male infertility. Fertil Steril, 1993;60(2):331-335 Eriim:http//upload.wikimedia.org/wikipedia/en/a/a1/LDH.PNG Eriim tarihi: 6.5.2005 Irvine DS. Glutathione as a treatment for male infertility. Rev Reprod, 1996;1:6-12. Sikka SC Oxidative Stress and Role of Antioxidants in Normal and Abnormal Sperm Functions. Eriim:http://www.bioscience.org/1996/v1/e/sikka1/htmls/sikka.pdf Eriim tarihi: 9.3.2005. Sanocka D, Miesel R, Jedrerzejczak P, Kurpsz M. Oxidative Stres and Male Infertility. J Androl, 1996;7(4):449-454. Storey BT. Biochemistry of the induction and prevention of lipoperoxidative damage in human spermatozoa. Molec Hum Reprod, 1997;3(3):203-213.

48.

49.

50.

51. 52.

53. 54. 55. 56.

57.

58. 59. 60.

61. 62.

145

63. 64.

Eriim: http://www.1whey2health.com/glutathione_cysteine.htm Eriim tarihi:23.12.2004 Roles of glutathione redox system Eriim:http://www.asiaandro.com/1008-682X/4/231.htm Eriim tarihi: 23.12.2004 Donnelly ET, Mcclure N, Lewis SEM. Glutathione and hypotaurine in vitro:effects on human sperm motility, DNA integrity and production of reactive oxygen species. Mutagenesis, 2000;15:61-68. Maiorino M, Bosello V, Ursini F, Foresta C, Garolla A, Scapin M, Sztajer H, Flohe L. Genetic Variations of gpx-4 and Male Infertility in Humans. Biol Reprod, 2003;68:1134-1141. Kelner MJ, Montoya MA. Structural organization of the human selenium-dependent phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene (GPX4):chromosomal location to 19p13.3. Biochem Biophys Commun, 1998;249:53-55. Eriim: www.medicine.viawa.edu/esr/education/.../Paper3/2haOLPaper3.pdf Eriim tarihi: 2.1.2005 Garrido N, Meseguer M, Alvarez J, Simon C, Pellicer A. Relationship among standard semen parameters, glutathione peroxidase/glutathione reductase activity, and mRNA expression and reduced glutathione content in ejaculated spermatozoa from fertile and infertile men. Fertil Steril, 2004;82(3):10591066. Phadke AM, Samant NR, Deval SD. Significance of seminal fructose studies in male infetility. Fertil Steril, 1973;24(11):894-903. Suominen J. Seminal fructose and glucose in asthenozoospermia. Int J Androl, 2001;24:253254. Eriim:www.biochem.wisc.edu/biochem875/pdfs/wk 7/Devlin_chapter7pdf Eriim tarihi: 23.12.2004 Polyol pathway first identified in the seminal vesicle. Pharm Rev, 1998;50(1):21-34 Eriim:http://pharmrev.aspetjournals.org/cgi/content/full/50/1/21 Eriim tarihi: 23.12.2004 Sobbe HU, Koebnick C, Jenne L, Kiesewetter. Leptin concentrations in semen are correlated with serum leptin and elevated in hypergonadism. Andrologia, 2003;35:233-237. Jope T, Lammert A, Kratzsch J, paasch U, Glander HJ. Leptin and leptin receptor in human seminal plasma and in human spermatozoa. Int J Androl ,2003;26:335-341. Glander HJ, Lammert A, Paasch U, Glasow A, Kratzsch J. Leptin exists in tubuli seminiferi and in seminal plasma. Andrologia, 2002;34:227-233. Eriim :http://marketing.appliedbiosystems.com/iscience_v3/v1i3_focus_snps.asp Eriim tarihi: 6.1.2005 Caprio M, Fabbrin E, sidori AM, Aversa A, Fabbri A. Leptin in reproduction. TIEM, 2001;12(2):65-72.

65.

66.

67.

68. 69.

70. 71. 72. 73.

74. 75. 76. 77. 78.

146

79. 80. 81. 82.

Banks WA, McLay RN, Kastin AJ, Sarmiento U, Scully S. Passage of leptin across the bloodtestis barrier. Am J Physiol Endocrinol Metab, 1999;276:1099-1104. Sempere MT, Barreiro ML. Leptin in male reproduction: the testis paradigm. Molec Cell Endoc, 2002;188(1-2):9-13. Hefnawy TE, Ioffe S, Dym M. Expression of the leptin receptor during germ cell development in the mouse testis. Endocrinology, 2000:141(7)2624-2630. Androgens. Eriim:http//www.neurosci.pharm.utelodo.edu/MBC3320/androgens.htm Eriim tarihi. 4.1.2005 Testosterone implant. Eriim:http://www.tiscali.co.uk/lifestyle/healthfitness/health_advice/netdoctor/archieve/10000 Eriim tarihi: 7.1.2005 Eriim:http://Endotext_com-Endocrinology of Male Reproduction Eriim tarihi: 6.5.2005 Diagnosis of male infertility Eriim:http//www.andrologyaustralia.org/infertility/diagnosis/diagnosis1hormonal.htm Eriim tarihi. 7.1.2005 Hypogonadism and infertility: a guide for men Eriim:http://www.pituitary.org.uk/resources/hypogon-m.htm Eriim tarihi: 7.1.2005 Pohanka M, Hampl R, Sterzl I, Starka L. Steroid hormones in human semen with paticular respect to dehydroepiandrosterone and its immunumodulatory metabolites. Endoc Regul, 2002;36:79-86. Sigma-lactate dehydrogenase kit (228-UV). Beutler E. Red cell Metabolism.3rd.Ed., Orlando:Grune and Stratton,1984. Glucon-glukoz kiti (Glukoz oksidaz GOD-PAP metodu). zkurt . Laboratuar Metodlar, GATA Basmevi. Ankara, 1975 Serbest testosteron kiti-Biosource KIPB19000 Leptin kiti- IRMA DSL-23100 New findings confirm male fertility declines with age. Eriim:http://eurekalert.org/pub_release/2003-02/esfh-nfc020203.php Eriim tarihi:17.1.2005 Eriim:http//.jpgmonline.com/article.asp?issn=0022-3859;year=volume=42;issue Eriim tarihi:17.1.2005 Brooks DE. Activity and androgenic control of enzymes associated with the tricarboxylic acid cycle, lipid oxidation and mitochondrial shuttles in the epididymal spermatozoa of the rat. Biochem J, 1978;174:741-752. Prasad R, Mumford D, Gordon H. Lactate and malate dehydrogenase and alpha-esterases in oligospermia. Fertil Steril, 1976;Jul27(7):832-5.

83.

84. 85.

86.

87.

88. 89. 90. 91. 92. 93. 94.

95. 96.

97.

147

98.

Gronczewska J, Zietera MS, Biegniewska A, Skorkowski EF. Enzyme activities in fish spermatozoa with focus on lactate dehyrogenase isoenzymes from herring Clupea harengus. Comp Biohem Physiol,2004;134C:207-213. Leventerler H, Taga S, alar E, Kibar M, Dikmen N. Seminal svda NADP-baml dehidrogenaz ve ndirgenmi glutatyon dzeyinin incelenmesi. 17. Ulusal Biyokimya Kongresi ODT Kongre ve Kltr Merkezi-Ankara 24-27 Haziran 2002. Hosoya M, Inoue A, Kimura N, Arai T. Enzyme activities in some types of peripheral leukocytes of thoroughbred race horces before and after the races. Res Vet Sci, 2004;77:101-104. Gerez BNM, Gallina F, Burgos C, Blanco A. Effect of L-malate on pyruvate dehydrogenase activity of spermatozoa. Arch Biochem Biophys, 1994; 308(2):520-4. Lahnsteiner F, Berger B, Weismann T, Patzner RA. Determination of semen quality of the rainbow trout, Onchorynchus mykiss, by sperm motility, seminal plasma parameters, and spermatozoal metabolism. Aquaculture, 1998;163(1-2).163-181. Cordoba M, Pintos L, Beconi T. Differential activities of malate and isocitrate NAD(P) dependent dehydrogenases are involved in the induction of capacitation and acrosome reaction in cryopreserved bovine spermatozoa. Andrologia, 2004;37.40-46. Scheibe R, Geissler A, Rother T. Analysis of biophysical differences between oxidized and reduced chloroplast NADP-malate dehydrogenase. Arch Biochem Biophys, 1993;300(2):635640. Piasecka M, Rozewicka WR, Ogonski T. Computerized analysis of cytochemical reactions for dehydrogenases and oxygraphic studies as methods to evaluate the function of the mitochondrial sheath in rat spermatozoa. Andrologia, 2001;33:1-12. Kohsaka T, Takahara H, Tagami s, Sasada H, Masaki J. A new tecnique for the precise location of lactate and malate dehydrogenase in goat, boar and water buffalo spermatozoa using gel incubation film. J Reprod Fertil , 1992;May95(1):201-9. Matsuzawa T, Sawada H. Histochemical changes in rat sperm malate dehydrogenase activities during passage through epididymis. Endocrinol Jpn. 1987;34(2):231-5. Li H, Chen Q, Li S, Yao W, Li L, Shi X, Wang Y, Castranova V, Vallyathan V, Ernst E, Chen C. Effect of Cr(VI) exposure on sperm quality: human and animal studies. Anu Occup Hyg, 2001;45(7):505-511. OrlandoC,Casano R, Caldini AL Forti G, Barni T, Bonfanti L, Serio M. Measurement of seminal LDH-X and transferrin in normal and infertile men. J Androl 1998 May-June;9(3):2203. Sawane MV, Kaore Sb, Gaikwad RD, Patil PM, Patankar SS, Dehkar AM. Seminal LDHC4 isoenyme and sperm mitochondrial activity : a study in male partner of infertile couples. Indian J Med Sci., 2002; Nov 56(11):560-6. Velasco N, Zapata T, Hernandez M, Albacete P, Oltra T, ParicioP. Lactic dehydrogenase C4 activity in seminal plasma and male infertility. Fertil Steril 1993 Aug;60(2):331-5. Keltimlidis K, Papadimas J, Bontis J, Mantalenakis S. LDH ioenzymes in semen of infertile men. Arch Androl., 1989;22(1):77-84. Gavella M, Lipovac V, Vucic M, Rocic B. Relationship of sperm superoxide dismutase-like activity with other sperm-specific enzymes and experimentally induced lipid peroxidation in fertile men. Andrologia. 1996 Jul-AUg;28(44):223-9

99.

100. 101. 102.

103.

104.

105.

105.

106. 107.

108.

109.

110. 111. 112.

148

113.

Bhardwaj A, Verma A, Majumdar S, Khanduja KL. Status of vitamin E and reduced glutathione in semen of oligozoospermic and azoospermic patients. Asian J Androl, 2000 Sep;2:225-228. Lenzi A, Lombardo F, Gandini L, Culasso F, Dondero F. Glutathione therapy for male infertility. Arch Androl, 1992 Jul-Aug;29(1):65-8. Lenzi A, Culasso F, Gandini L, Lombardo F, Dondero F. Placebo-controlled, double-blind, cross-over trial of glutathione therapy in male infertility. Hum Rerod, 1993 Oct;8(10):1657-62. Ochsendorf FR, Buhl R, Bastlein A, Beschmann H. Glutathione in spermatozoa and seminal plasma of infertile men. Hum Reprod, 1998 Feb;13(2):353-9. Gonzales GF. Function of seminal vesicles and their role on male infertility. Asian J Androl 2001 Dec;3.251-258. Kendirci A. Erkek nfertilitesinin Deerlendirilmesi, Doktora Tezi, ukurova niversitesi, Adana, 1995. Urner F, Luisier GL, Sakkas D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biol Reprod, 2001;64:1350-1357. Mitra K, Shivaji S. Novel tyrosine phosphorylated post pyruvate metabolic enzyme, dihydrolipoamide dehydrogenase, involved in capacitation of hamster spermatozoa. Eriim: www.biolreprod.org/cgirapidpdf/biolreprod.103.022780v1.pdf Eriim tarihi: 9.3.2005 Bajpai M, Gupta G, Setty BS. Changes in carbohydrate metabolism of testicular germ cells during meiosis in the rat. Euro J Endoc, 1998;138:322-327. Povoa HJ, Bastos JJ, Silva ME, Ariza A, Moreas MI, Rodrigues RE, Silva MS. Glucose in human semen. Biomed Biochim Acta, 1986;45(5):685-6. Diamindis EP, Arnett WA, Foussias G, Pappas H, Ghandi S, Melegos DN, Mullen B, Yu H, Srigley J, Jarvi K. Seminal plasma biochemical markers and their association with semen analysis findings. Urology, 1999 March; 53(3):596-603. Bowen R. Hexose transporters. Eriim : http://cvmbs.colostate.edu/hbooks/molecules/hexose _xport.html Eriim tarihi: 4.3.2005 Glucose transport proteins. Eriim : http://www.medbio.info/Horn/Time%203-4glucose _transport _proteins.htm Eriim tarihi: 4.3.2005 Wang H, Xu M, Li J, Xiao J, Xu Z, Zhou Z, Sha J. A spermatogenesis-related gene expression profile in human spermatozoa and its potential clinical application. Eriim : http://www.njmu.edu.cn/shenzhi/research _date/spermatozoa.htm Eriim tarihi: 11.1.2005 Patel SM, Skandhan KP, Mehta YB. Seminal plasma fructose and glucose in normal and patholog conditions. Acta Eur Fertil, 1998 Nov-Dec;19(6):329-32. Lackey BR, Gray SL, Henricks DM. Measurement of leptin and insulin-like growth factor-1 in seminal plasma from different species. Physiol Res, 2002;51:309-311.

114. 115. 116. 117. 118. 119. 120.

121.

122.

123.

124.

125.

126.

127. 128.

149

129.

Camina JP, Lage M, Menendez C, Grana M, Devesa J, Casanueva FF. Evidence of free leptin in human seminal plasma. Endocrine, 2002 Apr;17(3):169-74. Shirai M, Matsuda S, Mitsukawa S, Nakamura M, Yonezawa K. FSH, LH and testosterone levels in human seminal plasma. Tohoku J Exp Med, 1975 Jun;116(2):201-2. Zalata A, Hafez T, Verdonck L, Vermeulen L, Comhaire F. Androgens in seminal plasma markers of the surface of the male reproductive tract. Int J Androl, 1995;18(5): 271-277. Luboshitzky R, Zverling MK, Orr ZS, Nave R, Herer P. Seminal plasma androgen/oestrogen balance in infertile men. Int J Androl, 2002;25:345-351.

130. 131.

132.

150

8. ZGEM

1968 Ceyhan-Adana doumlu olan Hlya Leventerler, Adana zel Ayas Lisesini bitirdikten sonra Orta Dou Teknik niversitesi Fen Edebiyat Fakltesi Biyoloji blmnden mezun olmutur. ukurova niversitesi Tp Fakltesi Kadn Hastalklar ve Doum Anabilim Dal, remeye Yardmc Tedavi Merkezinde almaya balad. Bu arada ukurova niversitesi Salk Bilimleri Enstitsne bal olarak Biyokimya Anabilim Dalnda Yksek Lisans Eitimini tamamlad. Daha sonra ayn anabilim dalnda doktora almasna balad. Halen ukurova niversitesi Tp Fakltesi Kadn Hastalklar ve Doum Anabilim Dal, remeye Yardmc Tedavi Merkezinde almaya devam etmektedir. Evli ve bir kz, bir erkek 2 ocuk annesidir.

151

152