1

KROMATOGRAFYE GR
(Ref. Enstmantal Analiz)

Bir analitte bulunan engelleyici maddeler fiziksel veya kimyasal yntemlerle ayr-
labilir; bunlar ok bilinen distilasyon, kristalizasyon, zgen ekstraksiyonu ve kim-
yasal veya elektrolitik ktrmedir. Bilimin her dalna uygulanabilen bir ayrma
yntemi de " kromatografik " ayrmadr.
Kromatografi, 20. yzyln balarnda Rus botanikcisi Mikhail Tswett tarafndan
bulundu. Tswett, Klorofil ve ksantofiller gibi eitli pigmentleri ieren bir zeltiyi,
toz halinde kalsiyum karbonatla doldurulmu bir cam kolondan geirerek birbirin-
den ayrmay baard. Ayrlan maddeler kolonda renkli blgeler halinde gruplar
oluturdu; Bu nedenle ayrma yntemine, renkli fotoraf anlamna gelen
kromatografi (chromatography ) adn verdi.
Kromatografi uygulamalar ve yeni yntemler gelitirilmesi son 50 ylda byk
aamalar gsterdi. Bu alandaki almalar ile A.J.P. Martin ve R.L.M. Synge
1952 ylnda Nobel dln kazandlar.

Kromatografi, kompleks karmlardaki eitli maddeleri birbirinden ayrmaya ve
tanmlamaya olanak veren ve bilim adamlarnn almalarn kolaylatran bir seri
ayrma yntemleri tekniidir. Tm kromatografik uygulamalarda bir "sabit faz" ve
bir "hareketli faz" bulunur. Bir karmdaki maddeler hareketli faz ile srklenerek
sabit faz zerinden tanr; rnekteki maddelerin g etme hzlarnn farkl olmas,
her bir maddenin sabit faz zerinde gruplaarak ilerlemesine yol aar, bylece
karm iindeki maddeler birbirinden ayrlrlar.



2
Kromatografik Metotlarn Snflandrlmas
A. Ayrma Mekanizmasna Gre Snflandrma
1. Adsorbsiyon Kromatografi
2. Dalma (Partition) Kromatografi
3. yon-deitirme kromatografi (veya iyon kromatografi)
4. Jel geirgenlik veya Jel szme (Molekler-Exclusion veya Size-Exclusion)
Kromatografi)
5. Zone Elektroforez
6. Afinite (veya Bioafinite) Kromatografi
7. Chiral Kromatografi
B. Hareketrli Faza Gre Snflandrma
1. Sv Kromatografisi (LC)
2. Gaz Kromatografisi (GC)
C. Uygulanan Teknie Gre Snflandrma
1. Kolon Kromatografi
2. Dzlem Kromatografi (nce Tabaka Kromatografi, TLC; Kat Kromatog-
rafi, PC)
D. Kullanm Amacna Gre Snflandrma
1. Analitik Kromatografi (Kalitatif Kromatografi; Kantitatif Kromatografi)
2. Preparatif Uygulamalar (Karmlardan Saf madde Elde Etme)




3
Sabit Faz Tipleri
Kromatografide, ayrlacak maddeler hareketli fazda znebilmeli ve sabit faz ile
de baz etkileimlerde bulunabilmelidirler; rnein, sabit fazda znme,
adsorblanma veya kimyasal reaksiyona girme gibi. Ayrma ilemi sresince mad-
deler iki faz arasnda datlrlar.
Baz uygulamalarda sabit faz, ince bir cam veya metal ubuk iine doldurulmu
toz halinde kat bir maddedir. Gaz veya sv haldeki hareketli faz basn altnda
(veya kendi arl ile) kat iinden geirilir. Bu ynteme " kolon kromatografisi"
denir. Bir de "dzlemsel kromatografisi" vardr; bunda sabit faz porz bir kat
veya bir cam levha zerine yaylm ince toz halinde kat bir maddedir. Dzlem
kromatografisinde hareketli faz kapiler etkisi veya kendi arl ile sabit faz ze-
rinde ilerler .
Sabit faz, hareketli fazla karmayan ve akc olmayan bir sv da olabilir. Bu du-
rumda sabit sv faz bir yerde tutabilmek iin eitli yntemler uygulanr. rnein,
toz halindeki bir katnn zerine bir sabit faz svsndan ince bir tabaka kaplanr ve
kaplanm kat madde bir cam veya metal tpe doldurulur; hareketli faz bu tpten
geirilir. Burada kat maddenin ayrma ileminde herhangi bir rol yoktur, sadece
faz svsn tutma (adsorblayarak) grevi yapar.
Baka bir yntemde sabit sv faz bir kapiler tpn cidarlarna kaplanarak tutulur,
gaz hareketli faz bu tpten geirilir. Bir dier yntemde ise sabit sv faz tutmak
iin kat lifleri veya zerinde ok ince tlm kat tanecikler bulunan bir cam
levha kullanlr.
Tablo-1'de, sabit ve hareketli fazlarn yaplarna gre uygulanan eitli
kromatografik yntemler verilmitir. Bu ksmda dalma (partisyon) ve gaz-sv
kromatografisi anlatlacaktr. Gerekli deiiklikler yaplarak bu kavramlar dier
yntemlere de uygulanabilir.




4
Tablo-1: Kromatografik Ayrmalarn Snflandrlmas
Ad
Hareketli
faz tipi
Sabit faz
tipi
Sabit faz tutma yntemi
Gaz-sv Gaz Sv
Bir tp iindeki porz kat zerinde
veya kapiler bir tpn i cidar
zerinde adsorblanr
Gaz-kat Gaz Kat Bir kolon (tp) iinde tutulur
Datma Sv Sv
Bir kolon (tp) iindeki porz bir
kat zerinde adsorblanr
Adsorbsiyon Sv Kat Bir kolon (tp) iinde tutulur
Kat Sv Sv
Kaln bir kadn gzenekleri iinde
tutulur
nce tabaka Sv Sv-kat
Bir cam levhadaki ince toz halin-
deki kat zerinde tutulur
Jel Sv Sv
Polimerik bir katnn lifleri arasnda
tutulur
yon dei-
tirme
Sv Kat
Bir kolondaki (tp) iyon deitirici
reine zerinde tutulur
Dorusal Kromatografi
Tm kromatografik ayrmalar hareketli ve sabit fazlar arasnda dalan maddelerin
deiik yaylma (hareket) zelliklerine dayanr. "Datma katsays, K" denilen ve
scakla baml bir sabit ile kantitatif bir denklem verilebilir.
C
S

K = (1)
C
M

Burada C
S
maddenin sabit fazdaki analitik konsantrasyonu, C
M
ayni maddenin
hareketli fazdaki konsantrasyonudur. deal halde, geni bir madde konsantrasyo-
nu aralnda dalma kat says sabittir; yani C
S
, C
M
ile doru orantldr.
ok sk olmasa da C
S
ile C
M
arasnda dorusal olmayan bir ilikiyle karlalabilir.
ekil-1'de baz tipik dalma erileri verilmitir. ekilde grlen C erisi ideal bir
hali gsterir. Bu eri ayrma (disosiyasyon) veya birleme (asosiyasyon) reaksi-
yonlar bulunmayan ve birbiriyle karmayan iki sv arasndaki dalma dengesine
yaklar.
5
A
B
D
C
C
S
C
M

ekil-1: Tipik dalma erileri; C
S
, maddenin sabit fazdaki konsantrasyonu, C
M
,
ayn maddenin hareketli fazdaki konsantrasyonu
B ve D erileri byle bir dengenin bulunduu hale daha ok benzerlik gsterirler.
rnein, eer sabit faz su hareketli faz da benzen ise, zayf bir organik asit ieren
bir madde iin Bde grlen ekilde bir eri elde edilir. Burada benzen iinde sa-
dece disosiye olmayan asit znrken, sulu zeltide bir miktar disosiye olma-
yan asit ile onun konjuge baz da bulunur; asit ve konjuge baz asndaki oran kon-
santrasyona baml deildir. Bu nedenle dk konsantrasyonlarda, toplam asitin
az bir miktarnn iki solvent arasnda dalmas yeterlidir ve dalma katsays
byktr. Dier taraftan, eer hareketli faz benzen deil de su ise D'deki gibi bir
eri elde edilir. Buharn hareketli faz olduu buhar-sv dengelerinde de eriler B
eklindedir.
A erisi tipik bir "adsorbsiyon izotermi" dir ve bir kat yzey zerinde adsorblanan
madde miktarnn, katnn temasta olduu zeltideki madde konsantrasyonu ile
olan ilikisini gsterir. Madde konsantrasyonu arttka kat yzeyde adsorbsiyon
da artar ve bu durum yzeyin adsorblama kapasitesi doluncaya kadar devam
eder; sonra madde konsantrasyonundan bamsz hale gelir. Bu tip eriler k ve n
sabit olmak zere,
C
S
= k C M
n

eitliiyle tanmlanr.
6
Fraksiyonlama proseslerinde uygulanabilir bir denklem elde edebilmek iin yakla-
k bir K sabiti kullanlr. ekil-1'deki drt erinin de dk konsantrasyonlar aral-
nda dorusal olmas, snrl bir blgede yaklak K deerinin kullanlmasnn
nemli hatalara neden olmayacan gsterir. Geni konsantrasyon aralklarnda
ise yukardaki denklem, madde konsantrasyonunun K da yapaca deiiklikler
dikkate alnarak deitirilir. Bir kromatografik kolondaki konsantrasyon, ounlukla
dktr. K 'nn sabit olduu bu koullarda alnan kromatograflara "dorusal
kromatografi" denir. Bu blmde, bu tip kromatograflar ele alnacaktr.
Dorusal Syrma Kromatografisi
Syrma (elusyon) kromatografide, bir miktar rnek nce hareketli fazda (solvent)
zlr ve hazrlanan zelti kolona verilir (ekil-2) ; kolonda, rnein ierdii
maddeler kendi kendine iki faz (hareketli ve sabit) arasnda dalr. zelti
injeksiyonundan sonra kolona bir miktar saf halde hareketli faz (syrc) verilir.
Syrc olarak alan bu ksm, zeltiyi kolonun alt ksmlarna doru iter: byle-
ce hareketli faz (iinde hala sabit faza geecek ksmlar vardr) ile aa ksmlar-
daki taze sabit faz arasnda daha ileri derecelerde dalma salanr. Ayni anda
taze hareketli faz ile st ksmlardaki sabit faz (iinde hareketli faza geecek k-
smlar vardr) arasnda da yeniden dalma olur. Srekli olarak taze zgen ilave
edilerek rnekdeki molekller, hareketli ve sabit fazlar arasndaki geilerle kolo-
nun altna kadar tanr. Maddedeki molekller sadece hareketli faz eliinde
ilerleyebildiklerinden, bir maddenin ortalama gme (ilerleme) hz, onun hareketli
fazda kalma sresine baldr. Bu sre, maddelerin dalma oranlarndan anla-
labilir; sabit fazdaki madde konsantrasyonu yksekse sre ksa, hareketli fazdaki
konsantrasyon yksekse sre uzundur. En ideal hal, hzlar arasndaki farklarn,
bir karmdaki maddeleri kolon uzunluu boyunca ayr bantlar halinde ayrabildii
durumdur. (ekil-2 ve 3). Kolondan yeteri kadar hareketli faz geirilerek blgeler
halinde toplanm maddeler kolondan sra ile karlr ve kendilerini tanmlayan
bandlar halinde kaydedilir. Baka bir yntemde, her maddenin topland kolon
dolgu maddesi blgesi llerek hesapla sonuca gidilir.
Kolona verilen rnein taze zgen ilavesiyle ykanmas ilemine "syrma" veya
"elsyon" denir. Kolonun sonunda rnekteki madde konsantrasyonlarn alglayan
bir detektr bulunmas halinde alnan sinyaller zamann fonksiyonu olarak simetrik
eriler verir (ekil-2 nin alt ksmndaki eriler). Byle bir grafie "kromotogram"
denir ve kalitatif/kantitatif analizlerde kullanlr. Piklerin konumlar maddenin cinsi-
ni, alanlar ise konsantrasyonlarn tanmlar.
7
Syrma (Elsyon) Kromatografisi Teorileri
ekil-3'de, bir kromatografik kolonda A ve B maddeleri karm bir rnein, syr-
ma ileminin ksa ve uzun olmas halinde verdii konsantrasyon profili grlmek-
tedir. Maddelerden A'nn ayrlma katsays B'ninkinden daha byktr; bu nedenle
g ilemi srasnda A geride kalr. Kolonun buyu uzadka iki pik arasndaki u-
zaklk artar. Ayni zamanda iki bandda da genileme olur; bu durum kolonun ayr-
ma verimini drr. Ancak g mesafesi uzadka grlen bu band genilemesi,
ayni koullarda bandlarn birbirinden ayrlma etkinliine gre daha zayftr. Byle-
ce ekil-3 de ikinci ksmdaki gibi iyi bir ayrm elde edebilmek iin yeteri kadar
uzun bir kolona gereksinim vardr.

rnek zc
A + B
dolgulu
kolon
B
A
B
A
B
A B
t
0
t
1
t
2
t
3
t
4
Zaman, t
S
i
n
y
a
l
A B
dedektr
h
t
t
p
:
/
/
w
w
w
2
.
f
i
u
.
e
d
u
/
~
c
a
i
/
i
n
d
e
x
_
f
i
l
e
s
/
C
h
a
p
t
e
r
%
2
0
2
6
%
2
0
C
h
r
o
m
a
t
o
g
r
a
p
h
i
c
%
2
0
S
e
p
a
r
a
t
i
o
n
.
p
p
t
#
9

ekil-2: ki maddeli bir karmn ayrma kromatografisi yntemiyle ayrlmasn
gsteren ematik diyagram
8
G edilen mesafe, L
K
o
n
s
a
n
t
r
a
s
y
o
n
t
1
t
2

ekil-3: A ve B maddeleri kolondan aa ilerlerken iki ayr noktada alnan kon-
santrasyon profilleri

yi bir kromatografik ayrmada, (a) maddelerin g etme hz, ve (b) madde pikle-
rinin genilemeye balad blgenin (uzaklk) tanmlanmas nemlidir.
Kromatografinin orijinal teorisi "tepsi teorisi" dir ve g hzn kantitatif anlamda
tarif eder. Ancak bu teori piklerin blgesel genilemelerine yol aan ok saydaki
deikeni aklayamaz. Bu nedenle tepsi teorisinin yerini, bu deikenleri de ta-
nmlayan "kinetik" veya "hz teorisi" almtr.
Kinetik teoride kullanlan iki terim vardr: "teorik tepsi says" ve "teorik tepsinin
edeer ykseklii, TTEY" (veya teorik tepsinin ykseklik edeeri). Bu iki terimi
aklayabilmek iin tepsi teorisine ksaca deinmek gerekir. Kromatografi tepsi
teorisini Martin ve Synge gelitirmitir. Buna gre bir kromatografik kolonun ayr
ayr, fakat birbirine bitiik dar, yatay bir seri tabakalardan (teorik tepsi denen) o-
lutuu varsaylr. Her tepside maddenin hareketli ve sabit fazlar arasnda denge-
ye ulat kabul edilir. Madde ve zcnn hareketi, bir tepsiden dierine ka-
demeler halinde gei eklindedir.
Kromatografik bir kolonun bir ayrma sistemi olarak verimi, denge saysnn art-
masyla ykselir, yani teorik tepsi says arttka kolonun verimi de artar. Buna
gre yukarda belirtilen birinci terim "teorik tepsilerin says, N" kolon veriminin bir
lsdr. kinci terim "edeer tepsi ykseklii, H"da bu kavrama yardmc bir
parametredir. Bu iki parametre arasnda,
N = L / H (2)
9
bants bulunur; L kolon dolgusunun yksekliini gsterir. Kolon verimi yksel-
dike H der, H 'n klmesi kolonun belirli bir uzunluundaki denge saysnn
bymesine yol aar. Ksaca, H kk, N byk olduunda kolon verimlilii artar.
H ve N hz teorisinde verim parametreleridir ve denklem (2) uygulanabilir. Ancak
bir kolonda fiziksel anlamda tepsi bulunamaz, tepsi ve tepsi ykseklii terimleri
kolon verimi iin kullanlan birer deer birimleridir.

KROMATOGRAFK HIZ TEORS
Kromatografik hz teorisi, bir bandn geniliini etkileyen deikeleri ve bu bandn
kolondan kma zamann tanmlayabilen baarl bir teoridir.
Blge (Zone) ekilleri
Tipik bir kromatogram (ekil-2 ve 3) Gaussian erilerine benzer. Bir Gaussian
erisi,normal bir hata erisidir ve tekrarlanan lm deerlerinin ortalama deer-
den sapma miktarlarna gre grafie alnmasyla elde edilir. Byle bir eri, her-
hangi bir lmdeki hatann, ok sayda kk, tayin edilemeyen ve rasgele hata-
larn (pozitif veya negatif) bir toplam olduu kabul edilerek izilir. Bu hatalarn
ou birbirini giderir ve bir ortalama deer bulunur. Veriler, ortalama deere gre
simetrik dalm gsterirler. Bir kromatogramn Gaussian eklindeki erisi de,
kromatografik banddaki veya blgedeki saysz madde taneciklerinin rasgele ha-
reketlerinin birbirine eklenmesiyle oluur.
Tek bir madde taneciinin davran incelenirse, tanecik g etme srasnda sabit
ve hareketli fazlar arasnda binlerce defa gidip gelir. Fazlardan birinde, bir gei-
teki kalma sresi dzensizdir ve evresinden tesadfen ald termal enerji yeterli
dzeye ulatnda dier faza geer. Bylece bir fazda kalma sresi bazan ok
ksa bazan da ok uzun olabilir. Tanecik sadece hareketli fazda kal sresince
kolonda ilerleyebilir. Buna gre, kolondaki ilerlemesi de dzensizdir. Fazlarda
kal sresinin kararl olmay her taneciin hareketli faza geiindeki ortalama
hzn da deiik olmasna yol aar. Baz tanecikler hareketli fazda tesadfen daha
uzun sre kalrlar. Bazlarnn da, tersine sabit fazda kal sreleri ortalamadan
daha uzun olur. Bu rasgele bireysel olaylarn sonucunda hz, ortalama deer etra-
fnda simetrik bir dalm gsterir.
10
Kolonun alt blgelerine inildike alnan kromatografi erisinin genilii artar; n-
k taneciklerin bir fazda kalma zaman dolaysyla g etme sresi uzar. Buna
gre blgesel band genilemesi kolondaki kalma sresi ile bantldr ve hareketli
fazn ak hzyla ters orantldr. Hareketi fazn ak hz sv ve gaz
kromatografisinde olduka frakldr. Tipik bir rnek ekil-4de grlmektedir.
GCde H deerleri daha yksektir, ancak verim de yksektir.

m

s
a
y

,

y
Ortalamadan sapma, (x
i
- )
0
-(x
i
- )
2
/ 2o
2
e
y =
o 2 t

- o + o
- 2 o + 2 o
- 3 o + 3 o
Gaussian
Erisi


http://www2.fiu.edu/~cai/index_files/Chapter%2026%20Chromatographic%20Separation.ppt#9

ekil-4: Hareketli fazn ak hz; (a) sv kromatografisi, (b) gaz kromatografisi (H:
tepsi ykseklikleri, u: ak hz)
11
Blge Genilemesinde Standart Sapma
Bir Gaussian erisinin genilii standart sapma (o) denilen tek bir parametreye
baldr. Erinin altndaki alann yaklak %96's, eri maksimumunun, 2o stan-
dart sapma deeri iindedir. Buna gre,bir kromatogramdan karlan standart
sapma, blgesel genilemenin kantitatif bir lsdr.
Bir kromatografik pikin standart sapmas, zaman birimi ile veya kolon uzunluu
boyunca olan mesafe ile tarif edilir. Buna gre ekil-3'deki blge profillerinden
karlan bir standart sapmann birimi uzunluk (cm cinsinden) olacaktr. ekil-5
'deki kromatogramda grld gibi bir kromatogramn apsisinin saniye veya
dakika gibi zaman birimleri cinsinden ifadesi daha ok uygulanan bir yntemdir.
Hangi birimin kullanld tannan sembollerle belirtilir; uzunluk birimi iin o sembo-
l, zaman birimi iin de t sembol kullanlr.
t veya o 'nun bir kromatogramdaki ifadesi, ekil-5'de gsterilmitir. Erinin iki
tarafndan izilen teetler apsis eksenine doru uzatlrsa birer gen elde edilir.
Uzantlarn ekseni kestii nokta, maksimumdan eksene inilen dikin, ekseni kestii
noktadan yaklak olarak 2 t kadardr; ve tabii W = 4 t 'dir.


D
e
d
e
k
t

r

s
i
n
y
a
l
i
Zaman, dakika
0
0
http://www2.fiu.edu/~cai/index_files/Chapter%2026%20Chromatographic%20Separation.ppt
W

ekil-5: Bir kromatografik pikten standart sapma t nun tayini; W = 4t, t
R
: kolon
dolgusu iinde maddenin alkonma zaman, t
M
: kolonda tutulmayan ksmn kma
zaman (t
M
, kolondan geen hareketli faz moleklnn kma zaman)
12
Blge Genilemesinden H ve N in Hesaplanmas
Kromatografik bir blgenin genilemesi birim uzunluktaki kolon iin standard
sapmann karesi(deiiklik) olarak aadaki eitlikle verilir.
o
2

H = (3)
L
Burada H cm cinsinden tepsi yksekliini gsterir ve verimi ifade eder, L kolonun
uzunluunu (cm) gsterir; o nin birimi H ve L ile olan bants nedeniyle uzunluk
birimidir (cm). Denklem(3), (2) ile biletirilip yeniden dzenlenirse bir kolonunun
ayrma zelliklerini tanmlayan dier bir ifade elde edilir.
L
2

N = (4)
o
2

N, L uzunluundaki bir kolondaki tepsi saysn verir; yani, tepsi saysnn artmas
ve tepsi yksekliin azalmas kolon veriminin ykselmesini salar.
N ve H n Deneysel Olarak Deerlendirilmesi
ekil-5'de grld gibi deneylerde elde edilen kromatogramlarn ounda apsis
ekseni zaman gsterir. Tabii bu tip erilerden karlan standart sapmann birimi
de uzunluk (cm) deil zaman (saniye, dakika) birimi olacaktr. ekil-5 deki t
R

alkonma zamandr ve rnein injeksiyonundan, kromatografik kolonun sonun-
dan kna kadar geen zaman gsterir. Madde taneciklerinin kat ettikleri yol
boyunca olan ortalama hareket hzlar L/t
R
'dir. Buna gre standart sapmann
uzunluk ve zaman birimleri arasndaki iliki,
o
t = (5)
L/t
R

ifadesi ile verilebilir. Burada t zaman birimli standart sapmay gsterir. Daha n-
ce de deinildii gibi ekil-5 'deki gibi bir Gaussian erisi iin W = 4 t dur. Bu
eitliin denklem (5) de yerine konmasyla aadaki bant elde edilir.
L W
o =
4 t
R

Bu ifade denklem (3) de yerine konursa,
L W
2

H = (6)
16t
R
2

13
denklemi bulunur. N 'yi elde edebilmek iin denklem(2) 'deki H yerine yukardaki H
ifadesi yazlr ve denklem yeniden dzenlenir. Buna gre,
t
R
N = 16 ()
2
(7)
W
denklemi karlr. Bu ifade kullanlarak iki zaman lmesi olan t
R
ve W den N
hesaplanabilir, H 'n bulunmas iin kolon uzunluunun da bilinmesi gerekir.
Band Genilemesinin Kaynaklar
Kromatografik pikler kinetik olarak kontrol edilen ilem nedeniyle geniler; bun-
lar: (1) girdap difzyonu, (2) boylamasna difzyon ve (3) dengesiz ktle transferi-
dir. Bu etkilerin byklklerini ak hz, dolgu maddesinin tanecik bykl,
difzyon hzlar ve sabit fazn kalnl gibi kontrol edilebilen deikenler belirler.
Bu ilemi de kapsayacak ekilde kromatografik kolonlarn verimini hesaplama-
da kullanlabilecek eitli denklemler gelitirilmitir. Bunlardan ilk bulunan ve en
basit olan "van Deemter" denklemidir ve gaz-sv kromatografisi iin karlmtr;
denklem, ak hz u ile tepsi ykseklii H arasnda yaklak bir iliki verir; burada
A girdap difzyonu ile, B boylamasna difzyon ile ve C dengesiz ktle transferi ile
ilgili terimlerdir.
B
H = A + + C u (8)
u
Girdap Difzyonu
Bir molekln dolgulu bir kolondan geerken karlat patikalarn says artka
girdap difzyonu etkisiyle blge genilemesi meydana gelir. ekil-6'da grld
gibi bu patikalarn uzunluklar farkldr; bunun sonucu olarak ayni maddeye ait
molekllerin kolonda alkonma sreleri de farkl olur. Bylece tm molekllerin
kolonun sonuna ulamalar bir zaman aralnda gerekleir ve kan band da
geni bir ekil alr.
Denklem(8) deki A miktar girdap difzyonun etkisini gsterir ve sabit fazn tane-
cik bykl, geometrisi ve kolondaki skkl ile ilikilidir. Birinci yaklatrma
olarak A 'nn ak hzna bal olmad varsaylr ve aadaki ifade yazlabilir
A = 2 d
R

14
Burada d
R
ortalama tanecik cap, skklk faktrdr. nn deerlerini, sabit
fazn tanecik bykl aral ve doldurulma ekli belirler.

ak
yn
A 1 2
B
(2) numaral molekln kat ettii yol
(1) numaral olana kyasla daha
uzundur; bu durumda (2) molekl
kolon sonuna (1) moleklnden
daha sonra ular

ekil-6: Kromatografik syrma ilemi srasnda ayn maddeye ait iki molekln
izledii patika yollar

rnein, 20-40 mesh aralndaki tanecikler iin ~ 1 dolaynda, 200-400 meshlik
tanecikler iin ise 8 dolayndadr. Bir kolon doldurulurken kk ve kresel, dar
aralkl boyutlarda dolgu maddesinin kullanlarak girdap difzyonu nedeniyle olu-
an band genilemesi en dk dzeye indirilebilir. Kolondaki dolgu maddesinin
aralarnda ak kanallar bulunmamaldr. zenle doldurulan bir kolonda girdap
difzyonu ok dk seviyelerdedir.
Boylamasna Difzyon
Boylamasna difzyon bir bandn youn merkez ksmndaki molekllerin, bandn
iki tarafndaki daha seyreltik blgelere doru g etme eilimlerinden kaynaklanr.
Hareketli ve sabit fazlarn her ikisinde de oluabilen bu tip difzyonun yaratt
band genilemesi olduka fazladr. Boylamasna difuzyon hareketli fazn gaz ol-
duu bir ortamda ok nem kazanr, nk gaz fazndaki difzyon hzlarnn b-
ykl svlara gre birka derece fazladr. Difzyon miktar zamanla artar; ak
hz azaldka band genilemesi de artar.
15
Denklem(8)'deki ikinci terim (boylamasna difzyon terimi) ak hzyla ters orant-
ldr. B bir sabittir ve D
M
ile,
B = 2 D
M

denklemiyle belirtilen bir ilikidedir.
Burada, D
M
hareketli fazda bulunan maddenin difzyon katsays, blokaj fakt-
rdr ve sabit fazdaki taneciklerin, serbest molekler difzyonu engellemelerinin
bir lsdr; dolgu maddesinin tipine gre deeri 0.5 - 0.9 aralnda deiebi-
lir. Boylamasna difzyonun neden olduu band genilemesi scakl drmek
(bylece D
M
de der) ve ak hzn artrmakla azaltlabilir.
Dengesiz Ktle Transferi
Kromatografik bandlarn genilemesine yol aan bir dier neden de hareketli faz
aknn ok hzl olmas ve fazlar arasnda gerek bir dengenin kurulamamasdr.
rnein, hareketli fazn taze sabit fazla karlat band blgesinin n tarafnda
henz denge konumuna ulalmamtr. Bu durumda madde, kolonun gerek
dengeye gelindii halde bulunmas gereken ksmndan daha ileride bir yerde bu-
lunur. Benzer ekilde, blgenin sonunda, sabit fazdaki maddeler taze hareketli
fazla karlarlar. Yine, madde taneciklerinin fazlar arasndaki geii hemen ger-
ekleemez ve denge konumuna gelinmesi iin yeterli zaman olmadndan bl-
genin uzants yaylr.
Dengesiz ktle transferinin etkisi ak hz drlerek kltlebilir (Denklem-8),
nk dengeye ulalabilmesi iin daha fazla zamana gereksinim vardr. Ayrca,
hareketli fazn akt kanallarn dar olmas halinde madde molekllerinin sabit
faza difzlenmeleri daha kolay olacandan denge konumuna daha abuk ulalr.
Ayni nedenle, sabit bir faz zerine akmayan svlarn kapland hallerde sv ta-
bakalarn mmkn olduu kadar ince olmas gerekir.
Denklem(8)deki son terim hareketli fazn bir gaz olduu durumda, yksek ak
hzlarnda ok nemlidir. C deeri iki terimden oluur. Birincisi sabit fazdaki ktle
transferi ile, dieri hareketli fazdaki hzla ilikilidir. Bu iki terimin C ye ball
aadaki denklemle verilir.
q R (1 - R) d
f
2
w d
R
2
C = +
D
S
D
M

16
d
f
, filmin veya ap d
R
olan sabit faz taneciklerinin kalnln gsterir. R miktar
alkonma orandr ve t
M
/t
R
ye eittir (ekil-5). D
S
ve D
M
terimleri maddenin sabit ve
hareketli fazlardaki difzyon katsaylardr. q ve w; dolgu maddesinin yaps ve
konfigrasyonuna bal sabitlerdir. W, 1.3 civarnda bir deerdir. Kat bir destek
zerinde bulunan dzgn bir sv filmi iin q = 0.5 'dir. C'iyi etkileyen en nemli
deiken d
f
dir. ok ince sv faz tabakalar kullanlarak kolon verimi nemli dere-
cede artrlabilir. Yksek scaklklarda ve dk solvent viskozitelerinde dengeye
daha abuk ulalabilir.
Bant Genilemesi Yapan Proseslerin Net Sonular
ekil 7(a)'da van Deemter denklemindeki terimin erileri izilmitir (Kesikli
izgi); eriler H deerinin hareketli faz hz ile deiimini gstermektedir. Bu
terimin net sonucu ise kesiksiz eri ile verilmitir. Grld gibi optimum verim
kesiksiz erinin minimumunda elde edilir. Bu tip deneysel erilerden herhangi bir
kolon iin A, B, C deerleri bulunabilir. Bu gibi veriler bir dolgu maddesinin daha
verimli koullarda kullanlmasna yardmc olur.
van Deemter denklemi tepsi yksekliinin bulunmasnda kullanlan ilk yaklatrma
yntemidir. Kolon verimi etkileyen deikenleri tanmlamada bundan daha hassas
baz yntemler de gelitirilmitir.


T
e
p
s
i

y

k
s
e
k
l
i

i
i

H
,

m
m
Hareketli faz hz, u, cm/s
net etki
C u
B / u
A
Dorusal hz, cm/s
(a) (b)

ekil-7: (a) (H = A + B/u + C u) denklemindeki deikenlerin tepsi yksekliine
etkisi, (b) Van Deemter eitlii; ak hznn kolon verimi ile ilikisi
17
KOLONLARDAK AYIRMA
Bir kromatografik kolonun verimi, ierdii teorik tepsi says ile belirlenir. Burada
herhangi bir ayrma ileminde, bir kolondaki tepsilerin says ile gerekli zaman
arasndaki iliki anlatlacaktr.
Maddenin G Etme Hz
ekil-5de verilmi olan kromatogramda zaman eksenindeki sfr, rnein kolona
injekte edildii ve syrma ileminin balad an gsterir. t
M
de kan pik, kolon
dolgu maddesi tarafndan tutulmayan maddeye (ounlukla hava) aittir; bu mad-
denin hareket hz, hareketli fazdaki rnek molekllerinin ortalama hz ile aynidir.
Alkonma zaman t
R
(rnek pikine aittir), maddenin kolonun sonundaki detektre
ulamas iin gerekli zaman gsterir.
Maddenin ortalama g etme hz v aadaki denklemle verilir.
L
v = (9)
t
R

Benzer ekilde molekllerin hareketli fazdaki ortalama hz u da,
L
u = (10)
t
M

denklemiyle verilir.
Maddenin g etme hz ayni zamanda hareketli fazn hzna gre de tarif edilebi-
lir, buna gre,
v = u (maddenin hareketli fazda bulunduu zamann kesri)
Bu kesir herhangi bir anda maddenin hareketli fazda bulunan mol saysna (orta-
lama), kolondaki toplam mol saysna blnmesiyle bulunur. Yani,
hareketli fazdaki mol says
v = u ()
toplam mol says
veya,
C
M
V
M
1
v = u () = u ()
C
M
V
M
+ C
S
V
S
1 + C
S
V
S
/ C
M
V
M

18
Burada C
M
ve C
S
, hareketli ve sabit fazlardaki madde konsantrasyonlar, V
M
ve V
S

iki fazn kolondaki toplam hacimleridir.
Denklem(1) deki eitlik yukardaki ifade ile birletirilerek aadaki eitlikler bulu-
nur.
1
v = u ()
1+K V
S
/ V
M

veya,
1
v = u () (11)
1 + k
k kapasite faktrdr ve maddenin datma katsays ile ilikilidir.
K V
S
k = (12)
V
M

Denklem (9), (10) ve (11)'den t
R
karlr.
K V
S
t = t (1 + k ) = (1 + ) (13)
R M
V
M

Buna gre bir maddenin alkonma zaman t
R
, maddenin datma katsays ve
fazlarn hacimleri arasndaki oran ile artar.
Denklem(13) yeniden dzenlenerek, deneysel parametreler olan t
R
ve t
M
den, bir
maddenin kapasite faktr k 'nn hesaplanabilecei bir denklem bulunur.
t - t
R M
k = (14)
t
M


Kolon Resolusyonu (Ayrma Gc)
Kromatografideki en nemli konu bir kolonun iki maddeyi birbirinden ayrabilme
zelliidir. Bir kolonun kantitatif anlamdaki ayrma gc, "rezolusyon" terimi ile
tarif edilir ve R
S
ile gsterilir.
2 AZ 2 [(t
R
)
S
-(t
R
)
A
]
R = = (15)
S
W
A
+ W
B
W
A
+ W
B

19
W
A
ve W
B
piklerin taban genilikleridir ve birimleri zamandr. AZ maddelerin detek-
tre ulama zamanlar arasndaki fark gsterir (ekil-8). ki pikin genilikleri W ile
gsterilirse denklem(15) aadaki ekilde basitleir.
AZ
R =
S
W
Birbirine yakn kan piklerde W
X
ve W
Y
de birbirine yakn deerlerde olurlar; bu
durumda tek bir deerin llmesi yeterlidir.
ekil-8 'de iki maddenin bulunduu bir karmn ayr rezolusyonda alnan
kromatogramlar grlmektedir. R
S
= 1.5 da A ve B maddeleri birbirlerinden tam
olarak ayrlmlardr. R
S
= 0.75 'de ise ayrma yaplamamtr.
R
S
= 1.0 deerindeki uygulamada A maddesinde % 4 kadar B maddesi ve B de
de % 4 kadar A maddesi kalmtr; rezolusyonun 1.5 olduu durumda bu karma
% 0.3 kadardr. Ayn kolon dolgu maddesi ile rezolusyonun ykseltilmesi iin ko-
lon boyu uzatlr; dolaysyla teorik tepsi says artrlm olur.
R
S
ile Kolon zellikleri Arasndaki liki
Bir kromatografik kolonun baz zellikleri ile R
S
arasnda eitli ilikiler bulunabilir.
Aadaki rnekte bu ilikilerin nasl karlabilecei gsterilmitir.

RNEK
R
S
ile (t
R
)
A
ve (t
R
)
B
arasnda bir iliki karlmas; son iki terim ekil-8'deki
kromatogramdan llen alkonma zamanlardr.
Daha nce de belirtildii gibi,
W = W
B
W
A

alnabilir. Bu durumda denklem(15) aadaki gibi yazlr.
(t ) - (t )
R B R A
R =
S
W
B

Denklem(7), W
Y
yi (t
R
)
X
ve N cinsinden vermektedir. Buna gre
(t
R
)
B
- (t
R
)
A

N

R = x
S
(t
R
)
B
4
20

D
e
d
e
k
t

r

s
i
n
y
a
l
i
Zaman, dakika 0
http://www2.fiu.edu/~cai/index_files/Chapter%2026%20Chromatographic%20Separation.ppt

ekil-8: ayr ayrma gc iin kromatogramlar; RS = 2 Z / (WA + WB)

21
Denklem (13)'deki t
R
nin yukardaki ifade ile birletirilmesiyle, R
S
deeri X ve Y nin
kapasite faktrleri ile tanmlanm olur.
( k
B
- k
A
)
N

R = x
S
(1 + k
B
) 4
k
B
/ k
A
terimine "seicilik faktr" denir ve o ile gsterilir
k
B
o = (16)
k
A

k
B
/k
A
terimi yerine o konularak R
S
denklemi yeniden dzenlenir ve k
A
denklem-
den karlr.

N
o - 1 k
B

R = () ( ) (17)
S
4 o 1 + k
B

En uygun rezolusyonu bulmak iin gerekli teorik tepsi says hesaplanmaldr.
Bunun iin de denklem(17) yeniden dzenlenerek elde edilen aadaki eitlik
kullanlr.
o 1 + k
B
N = 16 R
2
()
2
( )
2
(18)
S
o -1 k
B

Seicilik Faktrnn (o) zellikleri
Denklem(17) ve (18)in uygulamalarna gemeden seicilik faktr o nn zellikle-
rini bilmek yararl olacaktr. Bu deer ekil-8de grld gibi bir
kromatogramdan doru olarak bulunabilir.o deeri denklem(14) n denk-
lem(17)de yerine konmasyla ve sonra da denklem(12) nin denklem(16)da yerine
konmasyla iki farkl ekilde ifade edilebilir.
(t
R
)
B
- t
M

o = (19)
(t
R
)
A
- t
M

K
B

o = (20)
K
A

Rezolusyon ve Ayrma Zaman
Denklem(17) ve (18)'de, nemli bir performans zellii olan, tam bir ayrma iin
gerekli olan zaman yoktur. Bu nemli deikenin de rezolusyon ile ilikisini sa-
22
lamak iin denklem (19) dan, nce daha yava hareket eden maddenin(B) hz
bulunur
1
v =
B
(t
R
)
B

Sonra bu bant denklem(11) ve (12) ile birletirilerek (t
R
)
B
karlr
NH (1+ k )
B
(t ) =
R B
u
Burada (t
R
)
B
, hareketli fazn hz u olduunda B nin kmas iin gerekli zaman
gsterir. Bu eitlik denklem(18) ile birletirilerek (t
R
)
B
iin rezolusyon (R
S
) ile ilikili
aadaki denklem elde edilir.
16 R
2
H o (1+ k )
3

S B
(t ) = ()
2
(21)
R B
u o -1 (k
B
)
2


Kolon Performansnn Optimizasyonu
Denklem(17) ve (21), kolon kromatografisinde ok nemlidir; uygun rezolusyon
derecesini salayacak koullarn seiminde bu iki denklemden yararlanlr. Denk-
lemler er ksmdan olumulardr. Birinci terimler kolonun
N
veya H cinsinden
verimini tanmlar. kinci terimlerde o katsays vardr ve secicilik terimidir; bu terim
rnekteki iki maddenin sadece zelliklerine baldr. Denklemlerdeki nc te-
rimler kapasite terimleridir, k
B
faktrn ierirler ve hem maddenin ve hem de
kolonun zelliklerine baldr.
Kolon Verimi
Denklem(17)'de grld gibi rezolusyon, kolondaki tepsi saylarnn kare kk
ile orantldr. iyi bir ayrma yapabilmek iin tepsi says artrlabilir. Bu durumda H
deerinin kltlp kolon boyunun da uzatlmasyla ayrma ilemi iin gerekli
zamann uzamamas salanabilir. Daha nce anlatlan hz teorisinde (2. ksm)
verimin en yksek, H n ise en dk olmasn salayan deikenler tanmlanm-
tr.
23
Kapasite Faktrndeki Deime
Bir maddenin kapasite faktr k
B
, hareketli veya sabit fazlarn bileimlerinin de-
itirilmesiyle farkl deerler alr. Hareketli fazn bileiminin deitirilmesi kolaydr
ve bir ayrma ileminin optimize edilmesinde ounlukla uygulanan bir yntemdir.
Denklem(12)'ye gre k
B
deeri, sabit fazn hareketli faza orannn deitirilmesiy-
le de artrlabilir veya azaltlabilir. Sabit faz oluturan malzemenin tanecik boyut-
larnn kltlmesi de k
B
deerini artrr, nk yzey alan artar ve dolaysyla
V
S
byr. k
B
nin artmas rezolusyonu (R
S
) artrr, fakat pikin kma zamann
([tr]
B
)uzatr. Bu iki etkiyi daha iyi anlayabilmek iin, Denklem(17) ve (21) aadaki
ekilde yazlabilir.
k
B
(1+ k
B
)
2

R
S
= Q ve, (t
R
)
B
= Q
1+ k
B
(k
B
)
2

Burada, denklem(17) ve (21)'deki ilk ikier terim Q ve Q harfleri ile gsterilmitir.
R
S
/Q ve (t
R
)
B
/ Q deerleri k
B
nin fonksiyonu olarak grafie alndnda, ekil-
9'daki gibi iki eri elde edilir; Q ve Q nun sabit kald varsaylmtr. k
B
deerinin
10'dan daha byk olmas istenmez, nk bu deerin stnde, ekilde de grl-
d gibi rezolusyondaki artn ok az olmasna karn ayrma zamanndaki u-
zama fazladr. Maddenin ayrld en ksa zaman sresi k
B
'nin 2-3 arasnda ol-
duu blgedir. knin optimum deeri; ounlukla 2 - 5 arasndadr.
(
t
R
)
Y

/

Q

v
e
y
a

R
S

/

Q
rezolusyon R
S
kma zaman
(t
R
)
Y
0 5 10 15
Kapasite faktr, k
X

ekil-9: Kapasite faktr k
y
nin kma zaman (t
R
)
y
ye etkisi, k nn deiiminde
Q ve Q nn sabit olduu kabul edilmitir
24
Seicilik Faktrndeki Deime
Denklem(17) 'ye gre, seicilik faktr bydke rezolusyon da artar. Bu para-
metrenin 2 'den byk olmas halinde en ksa zamanda iyi bir ayrma yaplabilir.
Dier taraftan, o nn 1 'e yaklamas durumunda ok uzun bir kolon kullanlmazsa
rezolusyon kaybolur. Denklem(21)'de grld gibi 1 'e yakn deerlerinde ayr-
ma zaman anormal derecede uzar. rnein, o 'nn 1.1 deerine karlk 1.01
olmas durumunda ayni rezolusyon iin gerekli zaman 84 kat daha fazla olur.
RNEK
30.0 cm 'lik bir kolonda A ve B maddelerin alkonma sreleri srasyla 16.40 ve
17.63 dakikadr. Tutulmayan ksmlar kolondan 1.30 dakikada kmaktadr. Pik
genilikleri 1.11 ve 1.21 mm olduuna gre aadaki ; (a) kolon rezolusyonunu,
(b) kolondaki ortalama tepsi saysn, (c) tepsi yksekliini, (d) rezolusyonun 1.5
olmas iin gerekli kolon uzunluunu, ve (e) uzun kolonda B maddesinin kmas
iin gerekli zaman hesaplaynz.
(a) Kolon rezolusyonu (R
S
) denklem (15)'den hesaplanr
2 AZ 2 [(t
R
)
B
- (t
R
)
A
]
R
S
= =
W
A
+ W
B
W
A
+ W B
2 (17.63 - 16.40)
R
S
= = 1.06
1.11 + 1.21
(b) Ortalama tepsi says denklem(7)'den bulunur.
t
R
16.40
N = 16 ( )
2
N = 16 ( )
2
= 3493
W 1.11
17.63
N = 16 ()
2
= 3397
1.21
N
ort
= (3393 + 3397)/2 = 3445 = 3.44 x 10
3

(c) Tepsi yksekliinde, denklem(3) ve (4)'den karlan H = L/N eitlii kullanlr.
o
2
L
2

H = N =
L o
2

L
2
L
2
L
o = H = H =
N NL N
25
30
H = = 8.708 x 10
-3
= 8.71 x 10
-3
cm
3445
(d) N ve L nin artmas ile k ve o deimez. Denklem(18) N
1
ve N
2
cinsinden yaz-
lr ve iki denklem birbirin blnerek N
1
/N
2
bulunur.
o 1+ k
B
N = 16 R
2
()
2
()
2

S
o - 1 k
B

o 1 + k
B
N = 16 (R )
2
()
2
( )
2

1 S 1
o -1 k
B

o 1 + k
B
N = 16 (R )
2 S 2
o -1 k
B

2
()
2
( )
2

N (R )
2

1 S 1
=
N
2
(R
S
)
2
2
Burada (1) ve (2) orijinal ve daha uzun kolonlar gsterir. N
1
, (R
S
)
1
ve (R
S
)
2
'nin
deerleri yerlerine konularak N
2
hesaplanr.
3445 (1.06)
2

=
N
2
(1.5)
2

2.25
N = 3445 x = 6.90 x 10
3

2
1.124
L = N
2
H = 6.90 x 10
3
x 8.71 x 10
3
L = 60.1 cm
(e) Denklem(21) den (t
R
)
1
/(t
R
)
2
eitlii bulunur.
16 R
2
H o (1 + k )
2

S B
(t ) = ()
2

R B
u o - 1 (k
B
)
2

(t
R
)
1
(R
S
)
1
2
17.63 (1.06)
2

= = = (t
R
)
2
= 35.3 dakika
(t
R
)
2
(R
S
)
2
2
(t
R
)
2
(1.5)
2


Kromatografide kullanlan terimler, miktarlar ve bunlarn birbirleri ile olan ilikileri
ok ve olduka karmaktr. Tablo-2'de baz tanmlarn zeti verilmitir.
26
Tablo-2: nemli Kromatografik Deerler ve likilerin zeti
Deneyle Bulunan Deerler
Ad Sembol Nereden Bulunduu
Alkonma zaman, hareketli faz t
M
Kromatogramdan (ekil-8)
Alkonma zaman, A ve B nin (t
R
)
A
, (t
R
)
B
Kromatogramdan (ekil-8)
Pik genilikleri, A ve B nin W
A
, W
B
Kromatogramdan (ekil-8)
Kolon dolgu maddesinin uzunluu L Dorudan lme
Ak hz F Dorudan lme
Sabit fazn hacmi V
S
Dogu hazrlama verisi
Maddenin sabit ve hareketli faz-
lardaki konsantrasyonlar
C
M
, C
S
Analiz ve hazrlama verileri


Hesaplanan Deerler
Ad Hesaplama Deerleri Dier zelliklerle likileri
Hareketli
fazn hz
u = L / t
M

Hareket
fazn hacmi
V
M
= t
M
F
Kapasite
faktr
t - t
R M
k =
t
M

K V
S
k =
V
M

Datma
katsays
k V
M
K =
V
S

C
S
K =
C
M

Seicilik
faktr
(t ) - t
R Y M
o =
(t
R
)
X
- t
M

k K
Y Y
o = =
k
X
K
X

Rezolusyon
2 [(t ) (t ) ]
R Y R X
R
S
=
W
X
+ W
Y

N o - 1 k'
Y
R
S
= () ()
4 o 1 + k'
Y

Tepsi says
t
R

N = 16 ()
2
W
L o 1 + k
Y

N = = 16 R
2
()
2
()
2
S
H o 1 k
Y

Alkonma
zaman
16 R
S
2
H o
2
(1 + k
Y
)
3
(t
R
)
Y
=
u (o 1)
2
(k
Y
)
2


27
Kromatografi, benzer zellikteki maddelerin birbirinden ayrlmasnda uygulanan
yntemler arasnda birinci sray alr. Ayrca, ayrlan maddelerin kalitatif tanm-
lanmasnda ve kantitatif tayininde de kullanlr. Bu blmde tam bir analizin ya-
plmasnda kullanlan genel kromatografik kavramlar aklanacaktr.

Kalitatif Analiz
Bir kromatogram, rnekteki her bir madde hakknda ok az bilgi verir; bunlar
maddenin alkonma zaman veya bir syrma periyodu sresince maddenin sabit
fazdaki konumunu gsteren bilgilerdir. lave bilgiler elde edilebilmesi iin hareketli
ve sabit fazlar deitirilip eitli syrma scaklklar uygulanabilir. Yine de bir mad-
de iin kromatografide alnan veriler, IR, NMR veya ktre spektrumunda alnanla-
ra gre olduka azdr. Spektral apsislerdeki veriler (, o, veya m/e) kromatografik
apsiste alnana (t
R
) kyasla daha hassastr.
Bu gerekler kromatografinin kalitatif analizlerde baarsz bir yntem olduunu
gstermez. simleri bilinen ve ounlukla birarada bulunan baz madde karmla-
rnn tanmlanmas yaplabilir. rnein, bir protein hidroliz rneinde 30 veya da-
ha ok saydaki amino asidin varl veya yokluu, ince bir kromatografik levhada
aa kan grntlerin iddetine gre saptanabilir. Yine de tehisin kesin olmas
iin ayrlan maddelerin spektral veya kimyasal tanmna gerek vardr.
Karmak yapl bir rnein spektroskopik yntemlerle tanmlanmas iin nceden
kromatografik bir ayrmaya gereksinim vardr. Yani kalitatif spektroskopik analiz-
lerde analizin gelecei kromatografiye baldr.

Kantitatif Analizler
Kromatografi sratli, basit, ve ok iyi bir ayrma yntemi olmas nedeniyle son 30
ylda byk bir alana yaylmtr. Bunda kromatografinin kantitatif analizlerde ok
kullanlmas en nemli etken olmutur.
Kantitatif kromatografide analit pikinin ykseklii veya alan bir veya daha ok
saydaki standartla kyaslanr. alma koullar kontrol edilebiliyorsa bu iki para-
metre de konsantrasyonla dorusal olarak deiir.
28
Pik Yksekliine Gre Analiz
Bir kromatografik pikin yksekliini lmek iin pikin iki yanndaki taban izgileri
dz bir doru ile birletirilir ve pik tepesinden bu doruya bir dik inilir; dikin uzun-
luu, pik yksekliidir. Ykseklik ok hassas olarak llebilir. Kolon koullarn
etkileyen deikenler, rnek ve standartlarn kromatogramlarnn alnd sre
boyunca sabit tutulmaldr. ok iyi kontrol edilmesi gereken deikenler kolon
scakl, syrcnn ak hz ve rnein injeksiyon hzdr. Ayrca kolonun ar
yklenmemesine de dikkat edilmesi gerekir. rnek injeksiyon hz bir
kromatogramda ilk kan pikler iin nemlidir ve % 5-10 'a kadar ulaan relatif
hatalara yol aar.
Pik Alanlarna Gre Analiz
Yukardaki paragrafta belirtilen deikenler pik alannda genileme etkisi yapmaz-
lar. Bu bakmdan alana gre yaplan analizler ykseklie gre yaplanlara kyasla
daha yeterlidir. Dier ynden pik yksekliklerin llmesi daha kolaydr ve dar
piklerde bu yntemle daha doru sonular alnr.
Modern kromatografi cihazlarnda bilya ve disk veya elektronik bilgisayarlar var-
dr. Bunlarda pik alanlar hassas olarak llebilir. Bu tip sistemlerin olmamas
durumunda hesaplamalar el ile yaplr. Uygun genilikteki simetrik piklerde alan
basit bir yntemle hesaplanr; pikin ykseklii, yksekliin tam ortasndan izilen
yatay dorunun uzunluu (o noktadaki pik genilii) ile arplr. Pik alan pikin bir
planimetre ile taranmasyla da bulunabilir. Bir baka yntem de pikin kesilerek
tartlmas ve tartmn, ayni kaydedici kadn alan bilinen bir parasnn arl ile
kyaslanmasdr. McNair ve Bonelli, 10 rnek zerinde bu yntemlerin hassasiyet-
lerini inceleyen bir alma yapmlardr. alma sonularna gre aadaki
standart sapmalar belirlenmitir.
Standartlarla Yaplan Kalibrasyon
Kantitatif kromatografik analizde en ok uygulanan yntem rnekteki maddelerin
bileimine yakn bileimlerdeki bir seri standart zelti ile allmasdr. Standart-
larn kromatogramlar alnarak pik yksekliklerinin veya alanlarnn, madde kon-
santrasyonlarna gre " kalibrasyon grafii" izilir; grafik orijinden geen bir doru
eklindedir. rnein analizi bu grafie gre yaplr. Yksek hassasiyet alnabilme-
si iin standart zeltilerin ve kalibrasyon grafiinin sk sk kontrol edilmesi gere-
kir.
29
Analizdeki en nemli hata kayna, injekte edilen standart ve analit rnek hacmi-
nin tam sabit olamaydr; ayrca injeksiyon hz da hataya neden olan bir faktr-
dr. rnek miktar ounlukla 1 mikrolitre gibi ok az miktarlardr ve her defasnda
ayni hacimde madde verebilmek iin bir mikro rnga kullanlarak relatif hata %
birka seviyesine kadar drlebilir. Bu hata gaz-sv kromatografisinde daha da
byktr; rnek scak bir utan injekte edildiinde, rnga ucundaki buharlama
kolona verilen madde hacminde byk farkllklar olmasna yol aar.
rnek hacmindeki hatalar, ekil-10'da grlen bir "dner gaz rnek valfi ile veri-
len miktarn % 1-2'sine kadar drlebilir. (a)'daki rnek yuvas rnekle dolduru-
lur; valfin 45
0
dndrlmesiyle yuvadaki rnekten belirli bir miktar hareketli faz
akm iine verilir.
srkleyici
girii
srkleyici
kolona
srkleyici
girii
srkleyici ve rnek
kolona
rnek girii rnek k rnek girii rnek k
(a) (b)
A C
B A
C
B

ekil-10: Dner bir rnek valfi; (a) rnek yuvas ABC nin doldurulduu valf konu-
mu, (b) rnein kolona verilmesi
Standart Yntemi
Kantitatif kromatografide en hassas sonular rnek injeksiyonundan kaynaklanan
hatalarn bulunmad i standart yntemi ile elde edilir. Bu yntemde rnek ve
standartlara ok hassas tartlm bir i standart maddesi ilave edilir; analit pik
alannn (veya yksekliinin) i standart pik alanna (veya yksekliine) oran
analitik parametre olarak kullanlr. Yntemin baarl olabilmesi iin i standart
pikinin tnekdeki dier maddelerin piklerinden uzakta (R
S
> 1.25), analit pikinin
30
yaknnda olmas gerekir. Uygun bir i standart kullanldnda relatif hata %0.5-1
civarndadr. (Ref. Kalibrasyon)
Alan Normalizasyonu Yntemi
rnek injeksiyonundaki dzensizliin yarat hata alan normalizasyonu ile de
giderilebilir. Bu yntemde rnekteki tm maddelerin kolondan kmas gerekir.
Kromatogramdaki tm piklerin alanlar hesaplanr ve her madde iin bilinen detek-
tr alglama faktr ile arplarak dzeltilir. Analitin konsantrasyonu, analit pikine
ait alann toplam pik alanlarna blnmesiyle hesaplanr. Aada bu yntemdeki
hesaplamalara bir rnek verilmitir. (Ref. Kalibrasyon)

RNEK
Aadaki veriler butil-alkoller karm bir rnein kromatogramndan alnmtr
(detektr hassasiyeti dzeltme faktrleri bilinen miktarlarda saf alkoller kullanla-
rak ayr deneylerde saptanmtr).

Alkol Pik alan, cm
2 Dedektr alg-
lama faktr
Dzeltilmi
alanlar, cm
2

n-btil 2.74 0.603 1.652
i-btil 7.61 0.530 4.033
s-btil 3.19 0.667 2.128
t-btil 1.66 0.681 1.130
toplam: 8.943

n-btil alkol, % = 1.652 x 100/8.943 = 18.5
i-btil alkol, % = 4.033 x 100/8.943 = 45.1
s-btil alkol, % = 2.128 x 100/8.943 = 23.8
t-btil alkol, % = 1.130 x 100/8.943 = 12.6
toplam, %: 100
31
Bilgisayarl Kromatografi
Modern kromatografi cihazlarnda kolon scakl, syrc ak hz, rnek
injeksiyon zaman ve rnek scakl gibi parametreler " mikroprosesr" lerle kont-
rol edilir. Bunlarda kiiler tarafndan yaplan hi bir kontrol yoktur veya ok azdr.
Cihazlar ok karmak fakat son derece otomatiktir. rnekler (bir ka dzine ola-
bilir) dnen bir sistem iine konur. Her analizden sonra kolon otomatik olarak ba-
lang noktas gelir, dner rnek tablas da yeni bir rnei kolonun nne getire-
cek ekilde dner, rnek otomatik olarak ekilir ve kolona injekte edilir,
ktomatogram alnr ve bir bilgisayar hafzasna yerletirilir. Veriler kromatogram
ve tablo eklinde alnr; tabloda alkonma zamanlar, relatif pik alanlar ve bazla-
rnda her pikin hangi bileie ait olduu da kaydedilir.
ROM RMM RAM KASET
alma yntem pik alanlar adlar ve
program deposu ve RT ler faktrler
N CPU
PANEL aritmetik kaydedici TTY
ilemler balants balants
kaydedici
TTY
hesaplama integratr
kanal modl
GC
REC.
digital
analog
GC kanal hesaplama integratr kaydedici
modl

ekil-11: Bir kromatografi hesaplama integratr
Yararlanlan Kaynaklar
Principles of Instrumental Analysis, D.A.Skoog, D.M. West, II. Ed. 1981