OSNOVE KLONIRANJA GENA

Restrikcijske endonukleaze Vektori za kloniranje stranih DNA fragmenata Metode sekvencioniranja DNA Metode sekvencioniranja proteina Lanana reakcija polimeraze (PCR) Bioinformatika

TEMELJNE SPOZNAJE Godina Autori Spoznaja

1944 AVERY, MACLEOD, McCARTY princip je DNA 1950 CHARGRAF

transformirajui 4 baze u DNA, stalan odnos pojedinih purinskih i pirimidinskih baza sekvencioniranje

1951 SANGER peptida, insulin 1952 HERSHEY i CHASE DNA odgovorna za nasljeivanje 1953 WATSON i CRICK DNA je dvostruka zavojnica 1958 CRICK adaptor molekule, (tRNA) 1961 JACOB i MONOD regulacijska jedinica, operon - BRENNER mRNA - CRICK i sur. tri baze su jedan kod - NIRENBERG i MATTHEL poliU kodira polifenilalanin 1964 YANOFSKY i sur. kolinearnost genetikog koda 1965 BRENNER i sur. besmisleni kodoni, stop 1970 MANDEL i HIGA kompetencija, transformacija st. - ARBER, SMITH, NATHANS restrikcijski enzimi 1972 BERG i sur. ugradnja strane DNA, spajanje frag. - MERTZ i DAVIS T4 DNA ligaza 1973 COHEN i sur. konstrukcija funkcionalnog plazmida 1976 MANIATIS i sur. kloniranje eukariotskih gena Prvi pravilnik o radu s rekombinantnom DNA

1977 SANGER i sur. DNA - MAXAM i GILBERT DNA 1978 CHANG i sur. - CREA, HIROSE, ITAKURA 1980 COHEN i BOYER 1983 van MONTAGU i sur.

sekvencioniranje sekvencioniranje eskspresija eukariotskog gena u bak., DHFR-aza sinteza oligonukleotida patent za kloniranje gena Ti-plazmid za transformaciju biljnih st

1. TEMELJNE METODE - Izolacija i analiza proteina o SDS-PAGE o kromatografske metode o 2D gel elektroforeza o koimunoprecipitacija o mikrosekvencioniranje (Edmanova odgradnja) o MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight)
www.sciencemag.org/feature/plus/sfg/resources/res_proteom ics.shtml

o proteinski ipovi i mikroarrayi o Western transfer - Izolacija i analiza DNA o ekstrakcija fenolom o precipitacija etanolom/NaAc o elektroforeza u gelu agaroze o ekstrakcija DNA fragmenata iz gela agaroze

o Southern transfer - Izolacija i analiza RNA o ekstrakcija fenolom/GnSCn o gradijenti gustoe Cs/Cl-ethidium bromide o elektroforeza u denaturirajuim uvjetima (formamid/formaldehid) o Northern transfer

2. RESTRIKCIJSKE ENDONUKLEAZE
-

Tri tipa restrikcijsko modifikacijskih enzima (na osnovi broja podjedinica, potrebe za kofaktorima i tipom cijepanja DNA molekula)
o

Tip I najsloeniji, sastoje se od tri tipa podjedinica i trebaju Mg2+, ATP i S-adenozinmetionin za cijepanje DNA. Njihova mjesta prepoznavanja su sloena, a cijepanje se vri na nespecifinim mjestima 400 do 7000 pb od mjesta prepoznavanja. Tip III neto manje sloen, sastoji se od dva tipa podjedinica, trebaju Mg2+, ATP, a S-adenozinmetionin stimulira enzimatsku aktivnost ali nije neophodan. Cijepanje DNA se odvija neto dalje od mjesta prepoznavanja 25-27 pb. Tip II najjednostavniji, samo jedna podjedinica. Cijepanje DNA na specifinim mjestima unutar ili neposredno pokraj mjesta prepoznavanja. Godine1973. ustanovljena je nomenklatura za njihovo obiljeavanje. Troslovna kratica organizma iz kojeg potjeu, dodatno slovo koje obiljeava soj ili serotip i rimski broj koji oznaava slijed otkrivanja ili identifikacije. HindIII Haemophilus influenzae, BamHI Bacillus amylolyquefaciens. Veina enzima

iz ove skupine prepoznaje sljedove od 4-6 nukleotida, ali pronaeni su i enzimi koji prepoznaju 7 ili 8 baza. Sljedovi nukleotida koji se prepoznaju najee su palindromi.
Klasa A Klasa C Klasa B

5'-GAATTC-3' EcoRI GCGC-3' HhaI 3'-CTTAAG-5' CGCG-5'

5'-GGCC-3' HaeIII 5'3'-CCGG-5' 3'-

Izoshizomeri su restrikcijske endonukleaze koje prepoznaju isti slijed, ali cijepaju DNA na drugom mjestu (unutar restrikcijskog mjesta).

5'-CCCGGG-3' SmaI 3'-GGGCCC-5'

5'-CCCGGG-3' XmaI 3'-GGGCCC-5'

Grupa 1: endonukleaze koje cijepaju definirane (nedegenerirane) sljedove. U ovu skupinu spadaju klasa A i B. Grupa 2: endonukleaze koje cijepaju isprekidane palindrome. CACNNNGTG Grupa 3: endonukleaze koje prepoznaju degenerirane sljedove CCA/TGG

Grupa 4: endonukleaze koje prepoznaju nepalindromske sljedove Cijepaju DNA dalje od mjesta prepoznavanja. - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - Odabir endonukleaza - Dvostruke digestije - Cijepanje DNA na zavretcima

3. Enzimi za modifikaciju i obiljeavanje DNA i RNA

-

Klenow fragment DNA polimeraze I iz E. Coli o Jedan polipeptid dobiven proteolizom DNA polimeraze I. Enzim ima 3' 5' egzonukleaznu aktivnost ali ne posjeduje 5' - 3' egzonukleaznu aktivnost. o Klenow fragment koristi se uglavnom za ispunjavanje 3' uvuenih krajeva ili za njihovo obiljeavanje.

- Alkalna fosfataza CIP (calf intestine phospatase)

o

Uklanjanje 5'-fosfata s DNA ili RNA prije obiljaavanja s 32P ili da se sprijei neeljena intramolekularna ligacija vektora ili RNA.

- T4 polinukleotid kinaza
o

Obiljeavanje 5'-krajeva s 32P Katalizira prijenos -fosfata s ATP na 5'-hidroksi kraj DNA ili RNA. Substrat mora biti defosforiliran s alkalnom fosfatazom. Mogue je i obiljaavanje zamjenom fosfata.

o T4 polinukleotid kinaza posjeduje i 3'-fosfataznu aktivnost. Ako se substrat inkubira pri niskom pH i u odsustvu ATP ili ADP, 3'-fosfati bit e uklonjeni s DNA ili RNA molekula bez izmjene 5' krajeva. - Egzonukleaze
o

Nukleaza Bal 31 Iz soja Alteromonas espejiana. DNA egzonukleazna aktivnost koja progresivno i bidirekcionalno uklanja mononukleotide s oba lanca linearne DNA. Koristi se za mapiranje restrikcijskih fragmenata i za kontrolirano uklanjanje sekvenci s DNA krajeva. Enzim je jako ovisan o slijedu nukleotida i brzina kraenja jako varira.

o Egzonukleaza III Katalizira otputanje mononukleotida s 3' kraja DNA lanca. Enzim je i DNA 3'-fosfataza. Enzim napada jednolanani lom, ali nee rezati niti jednolananu DNA niti dvolananu DNA s 5' uvuenim krajem. Egzo III u kombinaciji s S1 nukleazom moe kontrolirano kratit dvolanane DNA.
o

egzonukleaza Enzim degradira dvostruku DNA s 5' kraja (bilo uvuenog ili izduenog) 100 puta bre od jednolanane DNA. Enzim ne moe zapoeti digestiju DNA dupleksa na lomu ili procijepu. T4 DNA polymeraza U odsustvu deoksiribonukleozid trifosfata 3' egzonukleazena aktivnost T4 polimeraze moe se koristiti za zasijecanje linearnog DNA dupleksa. DNA se moe ispuniti dodavanjem deoksiribonukleozid trifosfata. Konana DNA je dvolanana i nezasijeena.

- DNaza I
o

DNaza I iz pankreasa ima endonukleaznu aktivnost i katalizira hidrolizu dvolanane i jednolanane DNA. DNaza I koristi se za stvaranje jednolananih lomova kao npr. za pripremanje substrata za nick translaciju. Nick translacija koristi svojstvo DNA polimeraze I iz E. coli da dodaje nukleotide na 3'-hidroksi zavretka s istodobnim uklanjanjem nukleotida s pokrajnjeg 5'fosforilnog zavretka.

- S1 nukleaza / Mung bean nukleaza o Ima 5' - 3' egzonuleaznu aktivnost. Uklanja nukleotide s 5'-izduenog kraja. Moe posluiti za stvaranje tupih DNA krajeva.

4. Ligacija DNA molekula

-

Godine 1967. znanstvanici iz nekoliko laboratorija gotovo su istovremeno objavili pronalazak DNA ligaze. Ovaj enzim katalizira stvaranje fosfodiesterske veze izmeu 3'hidroksi grupe na jednoj strani lanca s 5'-fosforilnim zavretkom na drugoj strani lanca. Za ovu je rekciju potrebna energija. Kod bakterija to je NAD+, a u ivotinjskim stanicama i bakteriofagima izvor energije je ATP. Proces spajanja je neophodan za normalnu sintezu DNA, popravak oteene DNA i splicing DNA lanaca prilikom genetike rekombinacije. DNA ligaza ne moe spojiti dvije molekule jednolanane DNA. Bakterijska ligaza stvara fosfodiesterske veze samo ako postoji nekoliko parova baza pokraj mjesta spajanja. Ligaza iz bakteriofaga T4 moe spojiti dva tupa kraja dvolananih DNA ovo svojstvo iskoriteno je u genetikom inenjerstvu.

- Mnogi faktori utjeu na efikasnost ligacije, ali najvaniji je da li su DNA krajevi tupi ili ljepljivi. Duina izduenog kraja takoer je vana. Svako zagaenje s fosfatazama, endonukleazama, ili eksonukleazama prilikom cijepanja DNA (ili ligacije) moe znaajno smanjiti sposobnost stvorenih zavretaka da se poveu.
-

Vaan je odabir restrikcijake endonukleaze!!! Neki enzimi (npr. BstNI) stvaraju na zavretcima produetke od samo jedne baze. Ovakve krajeve mnogo je tee povezati ligazom. Enzimi poput Taq polimeraze ostavljaju na 3 zavretcima jednolanne A krajeve.

- Zbog svojstva grupe 3 endonukleaza da cijepaju DNA daleko od mjesta prepoznavanja ili da prepoznju degenerirane sljedove, obino nije mogue ligirati nastale fragmente. U ovom sluaju najjednostavnije je modificirati zavretke i onda ih ligirati. Mogue je ligirati i adaptore na stvorene tupe krajeve

5. Lanana reakcija polimeraze (PCR)

-

Tehnika je revolucionirala genetiko inenjerstvo u trenutku kada je iz organizma Thermus aquaticus izolirana DNA polimeraza otporna na visoku temperaturu. PCR tehnika bazira se na tri jednostavna koraka neophodna za sintezu DNA, a to su:

1. Denaturacija DNA matrice na dva jedinstvena lanca. Lanci molekule DNA dre se zajedno slabim nekovalentnim vezama (vodikovim) i mogu se lako odvojiti zagrijavanjem. Ovako odvojeni lanci mogu se ponovo povezati ako se temperatura spusti neznatno ispod Tm. Naglo sputanje temperature termodinamiki je nepovoljno, pa nee doi do ponovog spajanja lanaca.

A=T 2C 4C

GC

2. Sljepljivanje (annealing) klica na svaki originalni lanac 3. Sinteza novog DNA lanca poevi od klica - Ovaj slijed reakcija moe se napraviti sa svakom DNA polimerazom, ali da bi se uspjelo nainiti vie od jedne sinteze potrebno je ponovno denaturirati lance zagrijavanjem. - Jedan od najvanijih preduvjeta za uspjeano izvoenje lanane reakcije polimeraze je pravilan izbor klica (oligonukleotida). Vano je pritom voditi rauna da klice stvaraju stabilan dupleks s lancem matricom. Isto je tako vano da obje klice imaju podjednaku Tm. Klice nesmiju biti komplementarne na svojim 3' krajevima jer to moe dovesti do stvaranja njihovih dimera i do znatnog smanjenja prinosa. Treba voditi rauna o broju AT i GC parova baza. Najbolje je da klica na 3'-kraju zavrava s nekoliko GC parova baza jer e to doprinjeti boljem sparivanju. Treba paziti i da se slijed nukleotida u oligonukleotidu ne ponavlja nigdje drugdje u matrici. Mogue je i tako dizajnirati klice da one stvaraju neko mjesto za cijepanje restrikcijskim endonukleazama. - to je potrebno za PCR? DNA matrica Klice dNTP Taq polimeraza

Pufer s Mg2+ ionima

6. Vektori za molekularno kloniranje Osnovni tipovi vektora: insercijski i zamijenski

-

DNA o je temperirani bakteriofag E. coli. Viralna DNA je linearna i dvolanana (48502 pb) s 12 pb jednolananim komplementarnim 5'-krajevima (COS krajevi). o Nakon ulaska kromosoma u bakterijsku stanicu on se cirkularizira spajanjem krajeva. U litikom putu eksprimirani su geni koji kodiraju za proteine replikacije, lize i proteina viriona. Replicirani kromosom se ree i pakira u glave faga. U lizogenom putu, ekspresija gena faga je zakoena, a kruni se kromosom integrira u bakterijski kromosom rekombinacijom. o Moe se pakirati samo tono odreena koliina DNA. Fragmenti koji se mogu klonirati ne prelaze 20 kbp.

- Jednolanani DNA vektori

o

X174 je prvi otkriveni bakteriofag s jednolananom krunom DNA. DNA X174 duga je 5386 pb. DNA lanac koji se pakira u virion naziva se plus lanac. DNA faga replicira se kao dvostruka zavojnica.

Prednosti o Laka transfekcija bakterija putem F-pilusa. o Veliina viralne estice ovisi o koliini DNA moe se pakirati 6x vie DNA od koliine u divljem tipu.

o Jednolanana DNA pogodna je za sekvencioniranje. - Plazmidi o Plazmidi su ekstrakromosomalni DNA elementi koji kod bakterija nose gene s nekim dodatnim svojstvima. o Najvie se koriste u molekularnoj biologiji. Postoje tzv. high copy i low copy plazmidi. o pBR322 jedan od najee koritenih E. coli vektora. Duina mu je 4361 pb i sadri: 1) replikon rep zaduen za replikaciju plazmida 2) gen rop slui za smanjivanje broja kopija 3) gen bla kodira -laktamazu i omoguuje rezistenciju na ampicilin 4) gen tet kodira protein za rezistenciju na tetraciklin o pBluescript vrlo popularan vektor. Duina mu je 2961 pb. Dizajniran je za kloniranje DNA, dideoksi DNA sekvencioniranje, in vitro mutagenezu, i in vitro transkripciju. Najvanije svojstvo ovog vektora je postojanje lacZ gena, tonije njegovog 5'-kraja koji kodira za Nterminalni dio -galaktozidaze u kojeg je dodana tzv. MCS regija. MCS regija ne prekida okvir itanja. Vektor se koristi s bakterijskim stanicama koje kodiraju C-terminalni dio -galaktozidaze. Svaki za sebe, niti N-terminalni, niti C-terminalni dio nisu aktivni, ali kada su zajedno mogu stvoriti aktivni enzim. Ovaj tip komplementacije naziva se + komplementacija. Lac bakterije koje nastaju komplementacijom mogu se jednostavno raspoznati jer stvaraju plave kolonije u prisustvu kromogenog substrata 5-bromo-4-kloro-3-indolyl--D-galaktizida

(X-gal). Meutim, insercija stranog DNA fragmenta u MCS mjesto gotovo uvijek dovodi do stvaranja Nterminalnog dijela koji nije u stanju -komplementirati. Za ekspresiju s lacZ promotora potreban je induktor IPTG (isopropylthio--D-galaktozid).

o Umjetni kromosomi BAC bacterial artificial chromosome Zasniva se na E. coli single-copy plazmidnom F faktoru. U njega je mogue kloniranje DNA fragmenata veih od

300 kbp. Revolucionirao je kloniranje itavih genoma. Klonirana DNA je stabilna i nakon 100 generacija uzastopnog rasta. YAC yeast artificial chromosome Shuttle plazmidi koji se mogu replicirati i u E. coli i u kvascu. Plazmid sadri gen za selekciju i MCS, origin of replication tipa ARS (autonomous replicating sequence), centromernu regiju i telomere. U njih se moe uklonirati jo vie nego u BAC.

7. Metode unosa strane DNA Bioloke metode - Transformacija o Otkrie DNA kao osnove transformacije (pretvorbe) pneumokoka bilo je glavni doprinos u spoznaji nukleinskih kiselina kao osnovnog nasljednog materijala. o Fred Griffith je ustanovio da se sojevi pneumokoka R i S razlikuju u obliku kolonija i virulenciji. o MacLeod i Avery su dodali temperaturom ubijene S stanice ivim R stanicama i ustanovio rast S kolonija. Te su S kolonije bile virulentne. o DNA izolirana iz temperaturom ubijenih S stanica moe takoer uzrokovati isti efekat. o Pretvorba organizama jednog fenotipa u drugi inkubacijom s neivim materijalom naziva se transformacija. - Transfekcija

o Eksperimenti s tobamovirusima su pokazali da i RNA moe nositi nasljednu informaciju. o Postoji nekolioko sojeva virusa mozaika duhana (TMV) koji uzrokuju tono odreene simptome infekcije. o estice TMV mogu se razdvojiti na RNA i proteinske komponente. RNA i proteini mogu se ponovo pomijeati i stvoriti infektivne virusne estice. Mogue je stvoriti i mijeane estice, s RNA od jednog soja i proteinima od drugog soja. Simptomi infekcije odgovarati e onom soju iz koje je potekla RNA. o Postupak unosa genetike informacije u stanice uz pomo uklapanja nukleinskih kiselina u virusne ili fagne omotae naziva se transfekcija. - T-DNA transformacija T-DNA Ti plazmida bakterije Agrobacterium tumefaciens moe se koristiti za unos stranih gena u biljke. o itav Ti plazmid je prevelik za laku manipulaciju in vitro. o Geni za sintezu hormona i opina nisu neophodni za integraciju DNA u jezgru. Potrebni su samo vir geni koji se nalaze izvan T-DNA na Ti plazmidu. o Binarni vektori repliciraju se i u E. coli i u A. tumefaciens. Prvo se umnoe u E. coli, a onda se transformiraju u A. tumefaciens soj koji sadri pomoni plazmid s vir funkcijama. o Rutinski se mogu transformirati dikotiledone, a tek je nedavno postalo mogue transformirati monokotiledone. o Mjesta integracije T-DNA u genom su sluajna.
o

- Transpozoni ___________________________________ - Prioni

o Ne prenosi se svaka nasljedna informacija uz pomo DNA ili RNA. o Mnoge spore neurobioloke bolesti (scrapie, bovine spongiform encephalopathy BSE, Creutzfeld-Jakobov sindrom) su meusobno srodna infektivna oboljenja. o Infektivno svojstvo izolirano je iz mozgova zaraenih ivotinja i nazvano PRION. Prion se sastoji od jednog proteina, PrSc, od 26 kDa koji ne sadri nukleinske kiseline. PrSC je identian normalnom proteinu iz mozga PrP. o Infekciju izaziva samo injiciranje PrSC u normalnog mia. o Injiciranje PrSC u mia koji ne proizvodi PrP protein ne dovodi do oboljenja. o Genetika informacija koja uzrokuje oboljenje prenosi se proteinom PrSC. PrSC mora prenjeti informaciju na PrP da bi se stvorilo vie PrSC. __________________________________ Fizike metode - Elektroporacija o Osnovni princip je zatvaranje strujnog kruga. o Mogu se transformirati ljudske stanice, stanice kvasca, protoplasti i bakterije. - Mikroinjiciranje o Stanica se privrsti laganim vakuumon, a finom se iglom u jezgru direktno ubrizga DNA. - Mikroprecipitacija o Standardna metoda za integraciju gena u jezgrinu DNA kultiviranih stanica sisavaca.

o DNA gena koji se unosi i DNA selekcijskog markera se otope u fosfatnom puferu. o Otopina kalcijevog klorida se polako dodaje na DNA u otopini. Stvara se vrlo fini precipitat kalcijevog fosfata na kojem je absorbirana DNA. o Otopina se kratko inkubira sa stanicama u kulturi. Zapoinje se sa selekcijom. o Metoda se moe koristiti za stvaranje transgeninih organizama ako su ciljane stanice stem stanice. - Biolistika o Bombardiranje tkiva mikroprojektilima. Sitne estice metala na kojima je precipitirana DNA. o Perticle gun ili Gene gun - Liposomi o Liposomi su vezikuli lipidnih dvosloja koji nastaju hidratacijom lipida u vodenoj otopini. Ako je pri tom prisutna DNA onda ona postaje inkorporirana u liposome. o Liposomi interagiraju sa stanicama bez stanine stijenke. Sadraj liposoma se prenosi u stanicu uz pomo mehanizama fuzije i endocitoze. o Moe se koristiti za transformaciju stanica kvasca i za biljne stanice, ako se od njih naprave sferoplasti ili protoplasti. o Varijacija je fuzija stanica nastaju somatski hibridi.

8. Sekvencioniranje DNA - Metoda kemijskog cijepanja

o Razvijena od strane Allana Maxama i Waltera Gilberta. 32 o DNA je obiljeena na jednoj strani lanca s P. Za obiljeavanje na 5'-zavretku koristi se polinukleotid kinaza. Oznaena DNA se zatim diferencijalno cijepa na mjestu svakog pojedinog nukleotida. Uvjeti su tako odabrani da dolazi do prosjeno jednog cijepanja po lancu. Svaka reakcija odvija se u posebnoj tubi. Purini se oteuju uz pomo dimetilsulfata koji metilira guanin na N-7 i adenin na N-3. Glikozidna veza metiliranog purina lako se cijepa zagrijavanjem pri neutralnom pH, tako nastaje eer bez baze. Onda se reze eerna osnovica zagrijavanjem u alkalnim uvjetima. Pirimidini se cijepaju s hidrazinom, a eerna osnovica s piperidinom. U reakcijskoj smjesi za svaki pojedini nukleotid svaki polomljeni lanac stvara radioaktivni fragment koji se nastavlja od 32P oznake do poloaja odreene baze u lancu. Tako nastaje smjesa lanaca razliite duljine. Sekvenca: 5'-32P-GCTACGTA-3' stvorit e fragmente rezano na A: P-GCT 32 P-GCTACGT 32 rezano na G: P-GCTAC 32 rezano na C: P-G 32 P-GCTA 32 rezano na T: P-GC 32 P-GCTACG Fragmenti se onda razluuju elektroforezom u PAA gelu. - Metoda kontroliranog prekida replikacije (Sangerova dideoksi metoda)
32

o Metodu je razvio Frederick Sanger i suradnici. o DNA polimeraza I se koristi za kopiranje odreenog slijeda jednolanane DNA. Kao klica koristi se kratak oligonukleotid. Osim radioaktivno obiljeena sva etiri deoksi-ribonukleozid trifosfata, smjesa sadri i 2',3'dideoxy analog jednog od njih. Ugradnja ovog analoga blokira daljnju sintezu novog lanca jer ne postoji 3'-hidroksilni zavretak potreban za stvaranje sljedee fosfodiesterske veze.Tako se stvaraju fragmenti razliitih duljina. Njih se ponovo razluuje u PAA gelu.

9. Konstrukcija DNA biblioteka (osnove) - Biblioteka malih genoma o Prokariotski ili genomi organela. o Neki restrikcijski enzimi cijepaju npr. kloroplastnu DNA rijetko (PstI, SalI, SmaI), a neki esto (BamHI, EcoRI, HindIII) o Cilj je stvoriti banku DNA fragmenata koja e sadravati potpuni genom o Metoda shot gun kloniranja u plazmidne vektore. Moe se koristiti i metoda direkcijskog kloniranja u fagne vektore. o Vano je da se fragmenti preklapaju. - Biblioteka velikih genoma o Koriste se BAC ili YAC vektori o Najmanji potrebni broj neovisnih rekombinanata, npr. u genomu od 2,8 x 106 kb. To ovisi o enzimu s kojim cijepamo DNA, ako koristimo enzim koji ree DNA na fragmente od 4 kb onda moramo imati najmanje 2,8 x 106 : 4 = 700 000 neovisnih rekombinanata.

- cDNA biblioteke veliina inserta 0-7,2 kbp o veinom u vektorima o izolacija mRNA 3' poliadenilacija (oligo dT celuloza) o sinteza cDNA i reverzna transkripcija o ligiranje adaptor molekula i fosforiliranje T4 polnukleotid kinazom.
o

HO-OH

EcoRI BamHI KpnI NcoI AA TTC GAG GAT CCG GGT ACC ATG G G CTC CTA GGC CCA TGG TAC C

gt10 je insercijski vektor u kojeg se strana cDNA klonira u odreenom smijeru. Koriste se mjesta NotI i SalI na poveznicama (linkerima). Oba enzima reu DNA sisavaca ili biljaka rijetko pa postoji mala vjerojatnost da e cDNA klon biti porezan. o Pakiranje u glave bakteriofaga i transfekcija. Vektor sadri na temperaturu osjetljiv represor s kojim je mogue kontrolirati replikaciju bakteriofaga. o Selekcija rekombinanata hibridizacijom plaa (plaques). Titar faga i pfu.
o

o Frakcionirane cDNA biblioteke o mRNA se frakcionira po veliini u gelu agaroze, eluira i onda se iz nje sintetizira cDNA. o Imobilizirane cDNA biblioteke o mRNA imobilizirana na paramagnetske estice. Moe se koristiti u kombinaciji s PCR tehnikom. o Diferencijalne cDNA biblioteke

o mRNA se izolira iz organizma nakon izlaganja nekim posebnim uvjetima (npr. temperaturni stres, svjetlosni stres...). Moe se koristiti u kombinaciji s mikro i makro arrayima. (to je to?) 10. Ekspresija stranih gena u E. coli - Plazmidni vektori pET tipa Za ekspresiju kloniranih nizova potrebno je imati promotorski niz kojeg prepoznaje RNA polimeraza domaina, te kao to je sluaj kod E. coli, odgovarajui Shine-Dalgarnov niz. o Problemi kod ekspresije rekombinantni protein moe biti toksian za stanicu, bakterija moe brzo razgraditi novosintetizirani protein, moe ga modificirati ili ak mutirati strani DNA fragment.
o