QUANTA LiteTM Ribosome P

For In Vitro Diagnostic Use

CLIA Complexity: High

708600

Intended Use

QUANTA LiteTM Ribosome P is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the semi-quantitative detection of Ribosome P antibodies in human serum. The presence of Ribosome P antibodies can be used in conjunction with clinical findings and other laboratory tests to aid in the diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and other related connective tissue diseases.

Summary and Explanation of the test

Antinuclear antibodies (ANA) are found in a wide variety of connective tissue diseases and as such serve as a sensitive screening assay.1 While ANA testing is an excellent screening test for SLE (a negative result virtually rules out active SLE)2 it is by no means a specific test. A variety of specific follow-up tests are generally run on ANA positive specimens to determine the "autoantibody profile." Autoantibodies reacting with cytoplasmic ribosomes are highly specific for SLE and as with antibodies to Sm and dsDNA are considered marker antibodies.3 By immunofluorescence using HEp-2 cell substrate, ribosome antibodies produce a finely granular cytoplasmic fluorescence.4 These antibodies are found in approximately 12% of patients with SLE 5,6 and in 90% of patients with lupus psychosis.7 In most patients with lupus psychosis and ribosome antibodies, titers were found to increase more than five fold during and before active phases of the disease.7 Anti ribosome-P are directed to 3 phosphoproteins, P0, P1, and P2, which are located on the larger 60S' subunit of eukaryotic ribosomes. Recently the ribosomal antigen has been very well characterized and studies have been published using either recombinant ribosome P8 or a synthetic carboxyl-terminal 22 amino acid peptide.9,10 This linear determinant peptide is common to and is the major epitope of the 3 ribosome phosphoproteins.10 Published studies using the synthetic 22 amino acid C-terminal peptide in an ELISA method show the test to perform well in the diagnosis of neurological lupus9,10 and to exhibit none of the conflicting results seen with recombinant ribosomal P11 possibly due to presence of contaminating bacterial products within the antigen. A variety of methods including Ouchterlony double diffusion, RIA and mainly indirect immunofluorescence have been used to detect antibodies to ribosome. The immunofluorescence technique can give false negative results due to presence of interfering antibodies and false positive results due to reactivity with other nonribosome cytoplasmic antigens. The using a highly defined synthetic peptide as antigen yields in a sensitive, specific and reproducible assay. The ELISA technique employed in this test is sensitive, specific and objective. It can be conveniently used to test both large and small numbers of samples.

Principles of the Procedure

Synthetic Ribosome P antigen is bound to the wells of a polystyrene microwell plate under conditions that will preserve the antigen in its native state. Pre-diluted controls and diluted patient sera are added to separate wells, allowing any Ribosome P antibodies present to bind to the immobilized antigen. Unbound sample is washed away and an enzyme labeled anti-human IgG conjugate is added to each well. A second incubation allows the enzyme labeled anti-human IgG to bind to any patient antibodies, which have become attached to the microwells. After washing away any unbound enzyme labeled anti-human IgG, the remaining enzyme activity is measured by adding a chromogenic substrate and measuring the intensity of the color that develops. The assay can be evaluated spectrophotometrically by measuring and comparing the color intensity that develops in the patient wells with the color in the control wells.

Reagents
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Polystyrene microwell ELISA plate coated with a purified Ribosome P antigen (12-1 x 8 wells), with holder in foil package containing desiccants ELISA Negative Control, 1 vial of buffer containing preservative and human serum with no human antibodies to Ribosome P, prediluted, 1.2mL Ribosome P ELISA Low Positive, 1 vial of buffer containing preservative and human serum antibodies to Ribosome P, prediluted, 1.2mL Ribosome P ELISA High Positive, 1 vial of buffer containing preservative and human serum antibodies to Ribosome P, prediluted, 1.2mL HRP Sample Diluent, 1 vial colored pink containing Tris-buffered saline, Tween 20, protein stabilizers and preservative, 50mL HRP Wash Concentrate, 1 vial of 40x concentrate - colored red containing Tris-buffered saline and Tween 20, 25mL. Refer to the Methods Section for dilution instructions. HRP IgG Conjugate, (goat), anti-human IgG, 1 vial colored blue containing buffer, protein stabilizers and preservative, 10mL TMB Chromogen, 1 vial containing stabilizers, 10mL HRP Stop Solution, 0.344M Sulfuric Acid, 1 vial colorless, 10mL

Warnings
1. 2. WARNING: This product contains a chemical (0.02% chloramphenicol) in the sample diluent, controls, and conjugate known to the State of California to cause cancer. All human source material used in the preparation of controls for this product has been tested and found negative for antibody to HIV, HbsAg, and HCV by FDA cleared methods. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the Ribosome P ELISA Low Positive, Ribosome P ELISA High Positive and ELISA
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3.

4. 5. 6. 7. 8.

Negative Control should be handled in the same manner as potentially infectious material.12 Sodium Azide is used as a preservative. Sodium Azide is a poison and may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes. Sodium azide may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides. Flush sinks, if used for reagent disposal, with large volumes of water to prevent azide build-up. The HRP conjugate contains a dilute poisonous/corrosive chemical, which may be toxic if ingested in large amounts. To prevent possible chemical burns, avoid contact with skin and eyes. TMB Chromogen contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The HRP Stop Solution consists of a dilute sulfuric acid solution. Avoid exposure to bases, metals, or other compounds, which may react with acids. Sulfuric acid is a poison and corrosive, which may be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Spilled reagents should be cleaned up immediately. Observe all federal, state and local environmental regulations when disposing of wastes.

Precautions
1. 2. 3. 4. This product is for In Vitro Diagnostic Use. Substitution of components other than those provided in this system may lead to inconsistent results. Incomplete or inefficient washing and insufficient liquid removal from the ELISA well strips will cause poor precision and/or high background. Adaptation of this assay for use with automated sample processors and other liquid handling devices, in whole or in part, may yield differences in test results from those obtained using the manual procedure. It is the responsibility of each laboratory to validate that their automated procedure yields test results within acceptable limits. A variety of factors influence the assay performance. These include the starting temperature of the reagents, the ambient temperature, the accuracy and reproducibility of the pipetting technique, the thoroughness of washing and liquid removal from the wells of the ELISA strips, the photometer used to measure the results, and the length of the incubation times during the assay. Careful attention to consistency is required to obtain accurate and reproducible results. Strict adherence to the protocol is recommended. Incomplete resealing of the zip-lock pouch containing microwell strips and desiccants will result in antigen degradation and poor precision. Unacceptably low absorbencies may be observed following two or more uses from a single bottle of HRP conjugate over a period of time. It is important to follow all recommended HRP conjugate handling procedures to prevent this occurrence. Chemical contamination of the HRP conjugate can result from improper cleaning or rinsing of equipment or instruments. Residues from common laboratory chemicals such as formalin, bleach, ethanol or detergent will cause degradation of the HRP conjugate over time. Thoroughly rinse all equipment or instruments after the use of chemical cleaners/disinfectants.

5.

6. 7. 8. 9.

Storage Conditions
1. 2. 3. Store all the kit reagents at 2-8C. Do not freeze. Reagents are stable until the expiration date when stored and handled as directed. Unused antigen coated microwell strips should be resealed securely in the foil pouch containing desiccants and stored at 2-8C. Diluted wash buffer is stable for 1 week at 2-8C.

Specimen Collection
This procedure should be performed with a serum specimen. Addition of azide or other preservatives to the test samples may adversely affect the results. Microbially contaminated, heat-treated, or specimens containing visible particulate should not be used. Grossly hemolyzed or lipemic serum or specimens should be avoided. Following collection, the serum should be separated from the clot. NCCLS Document H18-A2 recommends the following storage conditions for samples: 1) Store samples at room temperature no longer than 8 hours. 2) If the assay will not be completed within 8 hours, refrigerate the sample at 2-8C. 3) If the assay will not be completed within 48 hrs, or for shipment of the sample, freeze at -20C or lower. Frozen specimens must be mixed well after thawing and prior to testing.

Procedure
Materials provided
1 1 1 1 1 1 1 1 1 Ribosome P ELISA microwell plate (12-1 x 8 wells), with holder 1.2mL prediluted ELISA Negative Control 1.2mL prediluted Ribosome P ELISA Low Positive 1.2mL prediluted Ribosome P ELISA High Positive 50mL HRP Sample Diluent 25mL HRP Wash Concentrate, 40x concentrate 10mL HRP IgG Conjugate, (goat), anti-human IgG 10mL TMB Chromogen 10mL HRP Stop Solution, 0.344M Sulfuric Acid

Additional Materials Required But Not Provided

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Micropipets to deliver 5, 100, 200-300 and 500L Disposable micropipet tips Test tubes for patient sample dilutions, 4mL volume Distilled or deionized water 1L container for diluted HRP Wash Concentrate Microwell plate reader capable of measuring OD at 450nm (and 620nm for dual wavelength readings)

Method
Before you start
1. 2. Bring all reagents and samples to room temperature (20-26oC) and mix well. Dilute the HRP Wash Concentrate 1:40 by adding the contents of the HRP Wash Concentrate bottle to 975mL of distilled or deionized water. If the entire plate will not be run within this period, a smaller quantity can be prepared by adding 2.0mL of the concentrate to 78mL of distilled or deionized water for every 16 wells that will be used. The diluted buffer is stable for 1 week at 2-8oC. Prepare a 1:101 dilution of each patient sample by adding 5L of sample to 500L of HRP Sample Diluent. Diluted samples must be used within 8 hours of preparation. DO NOT DILUTE the Ribosome P ELISA Low Positive, Ribosome P ELISA High Positive and ELISA Negative Control. Determination of the presence or absence of Ribosome P using arbitrary units requires two wells for each of the three controls and one or two wells for each patient sample. It is recommended that samples be run in duplicate.

3. 4.

Assay procedure
1. ALL REAGENTS MUST BE BROUGHT TO ROOM TEMPERATURE (20-26C) PRIOR TO BEGINNING THE ASSAY. Place the required number of microwells/strips in the holder. Immediately return unused strips to the pouch containing desiccants and seal securely to minimize exposure to water vapor. Add 100L of the prediluted Ribosome P ELISA Low Positive, the Ribosome P ELISA High Positive, the ELISA Negative Control and the diluted patient samples to the wells. Cover the wells and incubate for 30 minutes at room temperature on a level surface. The incubation time begins after the last sample addition. Wash step: Thoroughly aspirate the contents of each well. Add 200-300L of the diluted HRP Wash buffer to all wells then aspirate. Repeat this sequence twice more for a total of three washes. Invert the plate and tap it on absorbent material to remove any residual fluid after the last wash. It is important to completely empty each well after each washing step. Maintain the same sequence for the aspiration as was used for the sample addition. Add 100L of the HRP IgG Conjugate to each well. Conjugate should be removed from the bottles using standard aseptic conditions and good laboratory techniques. Remove only the amount of conjugate from the bottle necessary for the assay. TO AVOID POTENTIAL MICROBIAL AND/OR CHEMICAL CONTAMINATION, NEVER RETURN UNUSED CONJUGATE TO THE BOTTLE. Incubate the wells for 30 minutes as in step 2. Wash step: Repeat step 3. Add 100L of TMB Chromogen to each well and incubate in the dark for 30 minutes at room temperature. Add 100L of HRP Stop Solution to each well. Maintain the same sequence and timing of HRP Stop Solution addition as was used for the TMB Chromogen. Gently tap the plate with a finger to thoroughly mix the wells. Read the absorbance (OD) of each well at 450nm within one hour of stopping the reaction. If bichromatic measurements are desired, 620nm can be used as a reference wavelength.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

Quality Control
1. 2. 3. 4. The Ribosome P ELISA Low Positive, the Ribosome P ELISA High Positive and the ELISA Negative Control should be run with every batch of samples to ensure that all reagents and procedures perform properly. Note that since the Ribosome P ELISA Low Positive, the Ribosome P ELISA High Positive and the ELISA Negative Control are prediluted, they do not control for procedural methods associated with dilution of specimens. Additional controls may be tested according to guidelines or requirements of local, state and/or federal regulations or accrediting organizations. Additional suitable control sera may be prepared by aliquoting pooled human serum specimens and storing at < -20C. In order for the test results to be considered valid, all of the criteria listed below must be met. If any of these are not met, the test should be considered invalid and the assay repeated. a. The absorbance of the prediluted Ribosome P ELISA High Positive must be greater than the absorbance of the prediluted Ribosome P ELISA Low Positive, which must be greater than the absorbance of the prediluted ELISA Negative Control. b. The prediluted Ribosome P ELISA High Positive must have an absorbance greater than 1.0 while the prediluted ELISA Negative Control absorbance cannot be over 0.2. c. The Ribosome P ELISA Low Positive absorbance must be more than twice the ELISA Negative Control or over 0.25. d. The ELISA Negative Control and Ribosome P ELISA High Positive are intended to monitor for substantial reagent failure. The Ribosome P ELISA High Positive will not ensure precision at the assay cutoff. e. The user should refer to NCCLS Document C24-A for additional guidance on appropriate QC practices.
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Calculation of Results
The average OD for each set of duplicates is first determined. The reactivity for each sample can then be calculated by dividing the average OD of the sample by the average OD of the Ribosome P ELISA Low Positive. The result is multiplied by the number of units assigned to the Ribosome P ELISA Low Positive found on the label. Sample OD Sample Value = (units) Ribosome P ELISA Low Positive OD x Ribosome P ELISA Low Positive (units)

Reactivity is related to the quantity of antibody present in a non-linear fashion. While increases and decreases in patient antibody concentrations will be reflected in a corresponding rise or fall in reactivity, the change is not proportional (i.e. a doubling of the antibody concentration will not double the reactivity). If a more accurate quantitation of patient antibody is required, serial dilutions of the patient sample should be run and the last dilution to measure positive in the assay should be reported as the patient's antibody titer.

Interpretation of Results
The ELISA assay is very sensitive to technique and is capable of detecting even small differences in patient populations. The values shown below are suggested values only. Each laboratory should establish its own normal range based upon its own techniques, controls, equipment and patient population according to their own established procedures. The sample can then be classified as negative, weak positive, moderate positive or strong positive according to the table below. Units Negative <20 Weak Positive 20 39 Moderate Positive 40 80 Strong Positive >80 1. 2. 3. A positive result indicates the presence of Ribosome P antibodies and suggests the possibility of Systemic Lupus Erythematosus or other related connective tissue diseases. A negative result indicates no Ribosome P antibody or levels below the negative cut-off of the assay. It is suggested that the results reported by the laboratory should include the statement: The following results were obtained with the INOVA QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA. Ribosome P values obtained with different manufacturers assay methods may not be used interchangeably. The magnitude of the reported IgG levels cannot be correlated to an endpoint titer.

Limitations of the Procedure

1. 2. 3. 4. 5. 6. The presence of immune complexes or other immunoglobulin aggregates in the patient sample may cause an increased level of non-specific binding and produce false positives in this assay. Not all SLE patients are positive for Ribosome P. Not all SLE patients with neurological problems will be positive for ribosome P antibodies. It has been reported that Ribosome P antibodies increase and decrease during flares and remissions and titers are affected by therapy. Results of this assay should be used in conjunction with clinical findings and other serological tests. The assay performance characteristics have not been established for matrices other than serum.

Expected Values

The ability of the QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA to detect Ribosome P antibodies was evaluated by comparison to a commercially available indirect immunofluorescent test available from INOVA Diagnostics. Results of the immunofluorescent test were determined as positive if a fine granular cytoplasmic fluorescence was observed on the HEp-2 cell substrate and negative if no fluorescence was observed.

Normal Range
Eighty-seven normal samples were tested. The normal population was approximately 90% female and ages ranged from 18-69 years. All 87 samples were completely negative in the QUANTA Lite Ribosome P assay. The strongest sample had 10 units of activity with the majority of the others falling between 2 and 6 units. The positive cutoff is 20 units.

Relative Sensitivity and Specificity

Samples submitted to a reference lab were tested for ribosome antibodies by both the QUANTA Lite Ribosome P ELISA and by immunofluorescence on HEp-2 cells. The results appear below. ELISA + 11 2* 0 20

+ HEp-2 -

Relative Sensitivity Relative Specificity Relative Efficiency

84.6% 100% 93.9%

*Both of these samples were western blot negative.

Clinical Sensitivity and Specificity

Patient Group Normals Non-ribosome cytoplasmic antibodies SLE SLE (neurological symptoms) SLE (no neurological symptoms) SLE (neurological symptoms, ribosome positive by HEp-2 and/or western blot) No. 122 56 75 38 19 57 No. Ribosome P pos. (%) 0 0 15 (20.0%) 10 (26.3%) 0 57 (100%)

Cross-reactivity
A variety of high titered autoantibody sera were tested. These samples included the following specificities: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, smooth muscle (ASMA), mitochondria M-2 (AMA) as well as serine protease-3 (PR-3), myeloperoxidase (MPO) and gliadin. All of these samples were found to be negative in the QUANTA Lite Ribosome P ELISA. The strongest sample had a value of 6 units with the majority of the rest falling in the 2-3-unit range. The cutoff for this test is 20 units.

Precision and Reproducibility

The precision and reproducibility of the assay was measured by running six replicates each of negative, weak positive and strong positive samples in four separate assays. The mean of the strong positive was 113.7, the weak positive was 25.1 and the negative was 2.72. The standard deviation and coefficient of variation for each sample are summarized below. Negative SD CV 0.42 15.2% 0.14 5.1% 0.43 15.6% Strong Positive SD CV 5.09 4.5% 1.84 1.6% 5.40 4.7% Weak Positive SD CV 0.83 3.3% 0.81 3.2% 0.76 3.0%

Overall Within Run Between Run

QUANTA LiteTM Ribosome P

Nur fr In-Vitro Diagnostik
CLIA Kompliziertheit: Hoch

708600

Verwendungszweck

QUANTA LiteTM Ribosome P ist ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) fr die semiquantitativen Bestimmung von ribosomalen Antikrpern im Humanserum. Die Bestimmung dieser Antikrper untersttzt mit anderen serologischen Nachweisen und der Beurteilung des klinischen Bildes die Diagnostik des Systemischen Lupus erythematodes (SLE) und anderer Kollagenosen.

Informationen zum Test

Antinuklere Antikrper (ANA) werden bei Kollagenosen gebildet, ihr Nachweis gilt als sensitive Screeningmethode.1 ANA-Nachweise eignen sich auch hervorragend als Screeningmethode fr den SLE (negative Ergebnisse schlieen einen SLE aus),2 sie sind jedoch nicht spezifisch. Spezifische Folgetests werden normalerweise nach einem positiven ANA Ergebnis durchgefhrt, um das Autoantikrper-Profil zu bestimmen. Autoantikrper, die mit den Ribosomen des Zytoplasmas reagieren, stellen einen hochspezifischen Marker fr SLE dar und werden gemeinsam mit Antikrpern gegen Sm und dsDNA als Marker-Antikrper angesehen.3 Das Immunfluoreszenzmuster auf HEp-2 Zellen von anti-ribosomalen Antikrpern zeigt ein dichtes, feingranulres, zytoplasmatisches Bild.4 Anti-Ribosomen Antikrper werden bei annhernd 12% der 5,6 SLE Patienten und bei 90% der Patienten mit Lupuspsychosen7 gefunden. Die Titer steigen auf mehr als das Fnffache whrend und vor den aktiven Phasen der Lupuspsychose an.7 Anti-Ribosom P Antikrper sind gegen drei Phosphoproteine P0, P1 und P2 gerichtet, die auf der greren 60S Untereinheit von eukaryotischen Ribosomen lokalisiert sind. Vor kurzem konnte das ribosomale Antigen sehr gut charakterisiert werden. In verffentlichten Studien wurde entweder rekombinantes Ribosom P8 oder ein synthetisches, Carboxyl-terminales 22 Aminosuren umfassendes Peptid verwendet.9,10 Dieses lineare 10 Peptid stellt das Haupt-Epitop der drei ribosomalen Phosphoproteine dar. Studien, bei denen das synthetische 22 Aminosure umfassendes C-terminale Peptid in der ELISA-Methode angewandt wurde, haben gezeigt, da sich das Antigen hervorragend zur Diagnose von neurologischem Lupus eignet9,10. Probleme, die mit rekombinanten Ribosom P als Antigen auftreten11 und mglicherweise durch Verunreinigung mit bakteriologischen Komponenten verursacht werden, knnen durch die Verwendung des synthetischen Peptids nicht beobachtet werden. Eine Reihe von Methoden wie Ouchterlony Doppeldiffusion, RIA (Radio-Immunassay) und berwiegend die indirekte Immunfluoreszenz wurden verwendet, um Antikrper gegen Ribosomen nachzuweisen. Die Immunfluoreszenz-Technik kann zu falsch-negativen Ergebnissen fhren, die durch die Anwesenheit von interferierenden Antikrpern verursacht werden. Es knnen auch falsch-positive Ergebnisse durch die fehlerhafte Beurteilung nicht-ribosomaler, zytoplasmatischer Antikrper auftreten. Durch die Verwendung eines hochgereinigten synthetischen Peptids als Antigen erhlt man einen sensitiven, spezifischen und reproduzierbaren Test. Die mit diesem Test angebotene ELISA-Technik ist objektiv, semi-quantitativ und stellt die Methode der Wahl bei einem hohen Probenaufkommen dar.

Testprinzip
Synthetische Ribosom P wurde an die Kavitten der Polystyrol-Mikrotiterplatte unter Wahrung der ursprnglichen Konfiguration gebunden. Vorverdnnte Kontrollen und verdnnte Patientenseren werden in verschiedene Kavitten pipettiert. Die vorhandenen Ribosom P Antikrper binden an das Antigen. Der Rest der Probe/Kontrolle wird durch Waschen entfernt. Enzymmarkiertes anti-humanes IgG wird in die Kavitten pipettiert und bindet whrend einer zweiten Inkubation an den Patienten-Antikrper. Nachdem in einem weiteren Waschschritt das restliche Konjugat entfernt worden ist, wird ein Chromogen-Substrat zugegeben. Die Intensitt der entstandenen Farbreaktion wird nach dem Abstoppen mit dem MikrotiterplattenPhotometer gemessen. Die quantitative Auswertung erfolgt durch einen Vergleich der Extinktionswerte der Patienten mit dem Wert eines Kalibrators.

Inhalt der Testpackung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Mikrotiter-ELISA-Platte beschichtet mit hochgereinigtem Ribosom P (12-1 x 8 Kavitten), mit Streifenhalter in Folienverpackung und Trockenmittel ELISA Negative Kontrolle, 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum ohne humane Antikrper gegen Ribosom P, gebrauchsfertig vorverdnnt, 1,2 mL Ribosom P ELISA Low Positive (Kalibrator), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikrpern gegen Ribosom P, gebrauchsfertig vorverdnnt, 1,2 mL Ribosom P ELISA High Positive (positive Kontrolle), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikrpern gegen Ribosom P, gebrauchsfertig vorverdnnt, 1,2 mL HRP Probenverdnner, 1 Flasche rosa gefrbt mit Tris-gepufferter Kochsalzlsung, Tween 20, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 50 mL HRP Waschkonzentrat, 1 Flasche mit 40fachem Konzentrat rot gefrbt mit gepufferter Kochsalzlsung und Tween 20, 25 mL. Zur Verdnnung bitte das entsprechende Kapitel in der Anleitung beachten. HRP IgG Konjugat, (Ziege), anti-humanes IgG, 1 Flasche blau gefrbt mit Puffer, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 10 mL TMB Chromogen, 1 Flasche mit Stabilisatoren, 10 mL
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9. 1. 2. 3.

HRP Stopplsung, 0,344M Schwefelsure, 1 Flasche farblos, 10 mL VORSICHT: Probenverdnner, Kontrollen und Konjugat enthalten 0,02% Chloramphenicol. Es ist im US-Bundesstaat Kalifornien und allgemein bekannt, da dieser Stoff Krebs verursachen kann. Alle Reagenzien fr die Herstellung dieses Tests wurden auf Antikrper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und fr negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell infektises Humanserum oder Blutproben behandelt werden.12 NaN3 wird als Stabilisator verwendet. NaN3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben, und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Sure reagieren knnen, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist daher mit viel Leitungswasser nachzusplen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. Das HRP Konjugat enthlt eine verdnnte Chemikalie, die bei Einnahme toxisch wirken kann. Daher den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Das TMB Chromogen enthlt ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Die HRP Stopplsung besteht aus verdnnter Schwefelsure. Den Kontakt mit Basen, Metallen und anderen Stoffen, die mit Sure reagieren knnen, vermeiden. Schwefelsure ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen hervorrufen. Den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Die vorgeschriebene persnliche Schutzausrstung whrend der Arbeit mit Reagenzien tragen. Verschttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfllen alle Umweltvorschriften beachten.

Hinweise

4. 5. 6. 7. 8.

Vorsichtsmanahmen
1. 2. 3. 4. Dieser Test ist fr In-Vitro Diagnostik. Die Verwendung anderer als im Testkit vorhandenen Komponenten kann zu wider-sprchlichen Ergebnissen fhren. Unvollstndiges Waschen und ungengendes Entfernen der Flssigkeiten aus den ELISA Kavitten fhrt zu einer schlechten Przision und zu hohen Hintergrund-Extinktionen. Die Adaptation dieses Testsystems auf automatische Probenverarbeitung und andere Instrumentierung, ganz oder teilweise, kann unterschiedliche Ergebnisse zur manuellen Durchfhrung ergeben. Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, die automatische Bearbeitung so zu berprfen, da Testergebnisse innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden. Eine Reihe von Faktoren beeinflusst das Testergebnis. Hierzu zhlen die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Pipettierens, der Typ des verwendeten Photometers, die Temperatur der Reagenzien, die Umgebungs-Temperatur, die Grndlichkeit des Waschens und der Entfernung der Flssigkeiten aus den Vertiefungen der ELISA-Streifen, und die Einhaltung der Inkubationszeiten. Es ist deshalb sehr wichtig, fr gleichbleibende Bedingungen zu sorgen. Die strikte Einhaltung der Testprozedur wird empfohlen. Jede nderung im Protokoll erfolgt auf Risiko des Anwenders. Das unvollstndige Verschlieen der Mikrotiterkavitten und des Trockenmittels fhrt zu Antigenabbau und schlechter Przision. Eine unakzeptabel niedrige Absorption kann beobachtet werden, wenn eine Flasche HRP Konjugat bei zwei- oder mehrfachem Gebrauch ber einen lngeren Zeitraum benutzt wird. Daher ist es wichtig, die Hinweise zum Umgang mit dem HRP Konjugat genau zu beachten. Chemische Kontamination des HRP Konjugates kann durch unzureichendes Reinigen oder Splen der Ausrstung oder der Instrumente verursacht werden. Rckstnde gebruchlicher Laborchemikalien wie z.B. Formalin, Bleichmittel, Ethanol oder Splmittel fhren zum Abbau des HRP Konjugates im Verlauf der Zeit. Das grndliche Splen der gesamten Ausrstung und Instrumentierung nach Verwendung chemischer Reinigungsmittel ist daher unbedingt erforderlich.

5.

6. 7. 8. 9.

Lagerung
1. 2. 3. Lagerung aller Kit-Reagenzien bei 2-8C. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind stabil bis zum Ende des Haltbarkeitsdatums bei vorschriftsmiger Lagerung und Handhabung. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschlieen und in den Khlschrank zurcklegen. Der verdnnte Waschpuffer ist bei 2-8C eine Woche stabil.

Proben
Die Testdurchfhrung sollte mit Serumproben erfolgen. Werden Azide oder andere Stabilisatoren zu den Serumproben gegeben, knnen die Ergebnisse nachteilig beeinflusst werden. Mikrobakteriell kontaminierte, hmolytische, lipmische oder durch Hitzeeinwirkung inaktivierte Proben sollten nicht verwendet werden. Nach der Blutentnahme ist das Serum vom Blut zu trennen. Das NCCLS Dokument H18-A2 empfiehlt die folgenden Lagerungsbedingungen fr Patientenproben: 1) Proben bei Raumtemperatur nicht lnger als 8 Stunden lagern. 2) Kann die Testdurchfhrung nicht innerhalb von 8 Stunden erfolgen, die Proben bei 2-8C khl lagern. 3) Kann die Testdurchfhrung nicht innerhalb von 48 Stunden erfolgen ist die Probe bei -20C oder niedriger einzufrieren. Eingefrorene Proben mssen nach dem Auftauen und vor der Testung gut geschttelt werden.

Testdurchfhrung
In der Testpackung vorhandenes Material
1 Ribosom P ELISA Mikrotiterplatte (12-1 x 8 Kavitten), mit Streifenhalter
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1 1 1 1 1 1 1 1

1,2 mL vorverdnnte ELISA Negative Kontrolle 1,2 mL vorverdnnte Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle 1,2 mL vorverdnnte Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle 50 mL HRP Probenverdnner 25 mL HRP Waschkonzentrat, 40faches Konzentrat 10 mL HRP IgG Konjugat (von der Ziege), anti-humanes IgG 10 mL TMB Chromogen 10 mL HRP Stopplsung, 0,344M Schwefelsure

Zustzliches bentigtes Material

Pipetten fr 5, 100, 200-300 und 500 L Einmal-Pipettenspitzen Eppendorf-Reaktionsgefe fr die Serumverdnnung, 4 mL Volumen Distilliertes oder deionisiertes Wasser 1 L Gef fr verdnntes HRP Waschkonzentrat Reader fr Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter (und 620 nm fr eine bichromatische Messung)

Methode
Testvorbereitung
1. 2. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen (20-26oC) und grndlich mischen. Den gesamten Inhalt (25 mL) des Waschkonzentrats mit 975 mL Aqua dest. mischen (1:40 Verdnnung). Die verdnnte Pufferlsung ist bei 2-8C eine Woche stabil. Soll nicht die gesamte Mikrotiterplatte auf einmal verwendet werden, so knnen fr einen Ansatz von 16 Kavitten 2 mL Konzentrat mit 78 mL Aqua dest. gemischt werden. Serumproben 1:101 verdnnen, indem 5 L Serum mit 500 L gebrauchsfertigem Probenverdnner gemischt werden. Verdnnte Proben sollen innerhalb von 8 Stunden getestet werden. Der Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle, die Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle nicht verdnnen. Jeder Test bentigt zwei Kavitten fr jede der drei Kontrollen sowie eine oder zwei Kavitten fr die Patientenprobe (Es wird empfohlen, alle Proben in Doppelbestimmung anzusetzen, bis die erforderliche Przision und Reproduzierbarkeit erreicht sind). ALLE REAGENZIEN UND PATIENTENPROBEN AUF RAUMTEMPERATUR (20-26C) BRINGEN. Die entsprechende Anzahl Mikrotiterkavitten abbrechen. Die Kavitten im Rahmen befestigen. Die unbenutzten Kavitten wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschlieen und in den Khlschrank zurcklegen, um Verdunstung zu minimieren. Je 100 L der gebrauchsfertigen Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle, der Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle, der ELISA Negative Kontrolle und der verdnnten Patientenproben in die entsprechenden Kavitten pipettieren. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Die Inkubationszeit beginnt nach Zugabe der letzten Probe. Waschen: Den Inhalt aller Kavitten absaugen. Die Kavitten vollstndig (200-300 L) mit verdnntem HRP Waschpuffer fllen und dann grndlich absaugen. Diesen Waschschritt noch zweimal wiederholen (Insgesamt: drei Waschschritte). Anschlieend die Platte auf saugfhigem Papier ausklopfen, um restliche Waschflssigkeit zu entfernen. Die Waschschritte sind in der selben Reihenfolge wie die Pipettierschritte durchzufhren. 100 L des HRP IgG Konjugates in jede Kavitt geben. Sterile Pipetten verwenden! Nur das bentigte Volumen an Konjugat aus der Flasche entnehmen. UNBENUTZTES KONJUGAT NICHT IN DIE FLASCHE ZURCKPIPETTIEREN. KONTAMINATIONSGEFAHR!! Abgedeckte Streifen bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren, wie in 2. beschrieben. Waschen: Schritt Nr. 3 wiederholen. 100 L TMB Chromogen in jede Kavitt geben. 30 Minuten im Dunkeln bei Raum-temperatur inkubieren. 100 L HRP Stopplsung in jede Kavitt pipettieren Bei der Hinzugabe der Stopplsung dieselbe Reihenfolge und Zeitplan wie bei der Hinzugabe des TMB Chromogens einhalten. Die Mikrotiterplatte vorsichtig schtteln. Die optische Dichte (OD) jeder Kavitt bei 450 nm innerhalb einer Stunde nach Abstoppen der Reaktion ablesen. Es wird eine bichromatische Messung mit 620 nm als Referenzwellenlnge empfohlen.

3.

4.

Testdurchfhrung
1.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

Qualittskontrolle
1. 2. 3. 4. Die Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle, die Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle sollten bei jedem Testansatz mitgefhrt werden, um sicherzustellen, da alle Reagenzien und der Testansatz insgesamt ordnungsgem funktionieren. Da die Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle, die Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle vorverdnnt sind, entfllt der Verdnnungsschritt der Patientenproben fr die Kontrollen. Zustzliche Kontrollen zur Qualittssicherung knnen gem den Richtlinien nationaler oder internationaler Regulierungs- oder Akkreditierungsbehrden eingesetzt werden. Geeignete Kontrollen knnen aus Humanserum gewonnen und bei <-20C gelagert werden. Um sicher zu sein, da alle Patientenwerte korrekt sind, mssen die nachfolgenden Kriterien erfllt werden (Wurden ein oder mehrere Kriterien nicht erfllt, so ist das Ergebnis als ungltig zu betrachten und der Testansatz ist zu wiederholen).
8

a.

b. c. d. e.

Die Absorption der vorverdnnten Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle mu grer sein als die Absorption des vorverdnnten Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle. Die Absorption des Low Positive Kontrolle wiederum mu grer sein als die der vorverdnnten ELISA Negative Kontrolle. Die Absorption der vorverdnnten Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle mu grer als 1,0 sein, die Absorption der vorverdnnten Negative Kontrolle darf nicht ber 0,2 liegen. Die Absorption des Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle mu mehr als doppelt so hoch sein wie die der ELISA Negative Kontrolle oder ber 0,25 liegen. Die ELISA Negative Kontrolle und die Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle dienen der Sicherstellung der ordnungsgemen Funktionsweise des Testansatzes. Die Ribosom P ELISA High Positive Kontrolle stellt die Przision am Cut-off des Tests nicht sicher. Der Anwender sollte unter anderem das NCCLS Dokument Nr. C24-A fr zustzliche Hinweise zur zeitgemen Qualittskontrolle beachten.

Berechnung der Ergebnisse

Zunchst sind die Mittelwerte der OD fr die Doppelbestimmungen zu berechnen. Alle weiteren Berechnungen werden dann mit den entsprechenden Mittelwerten durchgefhrt. Die Reaktivitt jeder Patientenprobe wird bestimmt durch die Division des Mittelwertes der Proben-OD durch den Mittelwert der Low Positive Kontrolle und der Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem chargenspezifischen Wert der Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle. Die chargenspezifischen Werte sind auf dem Flschchenetikett aufgedruckt.
OD der Probe Probenwert = x Ribosom P ELISA Low Positive Kontrollwert (Units) Ribosom P ELISA Low Positive Kontrolle OD Wert (Units)

Die Reaktivitt verhlt sich zur Konzentration der vorhandenen Antikrper nicht linear. Zunahme und Abnahme der Antikrperkonzentrationen von Patienten werden durch einen entsprechenden Anstieg oder Abfall der Reaktivitt angezeigt, diese nderungen sind jedoch nicht proportional (d.h. eine Verdoppelung der Antikrperkonzentration fhrt nicht zu einer Verdoppelung der Reaktivitt). Wird eine genauere Quantifizierung der Patientenantikrper gewnscht, sind serielle Verdnnungen der Probe durchzufhren und der Titer der zuletzt als positiv gemessen wurde, sollte als Patienten-Antikrpertiter bewertet werden.

Interpretation der Ergebnisse

Dieser ELISA-Test ist sehr sensitiv und in der Lage, sogar kleine Unterschiede in Patientenpopulationen zu messen. Die folgenden Werte dienen als Beispiel fr die Interpretation der Testergebnisse. Es wird empfohlen, da sich jedes Labor seine eigenen Normalwerte, basierend auf eigener Technik, Kontrollen, Ausrstung und Patientenpopulation erarbeitet. Die Patientenprobe kann anschlieend als negativ, schwach, deutlich positiv bis stark positiv klassifiziert werden. Negativ Schwach positiv Deutlich positiv Stark positiv 1. 2. 3. Units <20 20 39 40 80 >80

Ein positives Ergebnis zeigt das Vorhandensein von Ribosom P Antikrper an und legt die Mglichkeit des Systemischen Lupus erythematodes oder anderer verwandter Bindegewebserkrankungen nahe. Ein negatives Ergebnis deutet auf das Nichtvorhandensein von Ribosom P Antikrpern oder auf Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze des Testsystems hin. Wir schlagen vor, die Laborergebnisse mit folgendem Hinweis zu versehen: Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem INOVA QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA erzielt. Ribosom P Werte, die mit Testsystemen anderer Hersteller erzielt wurden, knnen nicht untereinander ausgetauscht werden. Die Hhe des gefundenen IgG-Titers kann nicht mit einem Endpunkttiter in Korrelation gebracht werden.

Grenzen des Verfahrens

1. 2. 3. 4. 5. 6. Immunkomplexe oder andere Immunoglobulin-Aggregate im Patientenserum knnen nichtspezifische Bindungen und falsch-positive Ergebnisse hervorrufen. Nicht alle SLE Patienten sind Ribosom P positiv. Nicht alle SLE Patienten mit neurologischen Symptomen haben Anti-Ribosomen P Antikrper. Ribosomen P Antikrper-Titer steigen whrend eines Krankheitsausbruchs und sinken whrend einer Remission. Titer sind auch therapieabhngig. Ergebnisse dieses Testes mssen im Zusammenhang mit klinischen Ergebnissen und anderen serologischen Tests verwendet werden. Die Leistungscharakteristika fr andere Untersuchungsmaterialien als Serum wurden nicht bestimmt.

Erwartungswerte
Die Fhigkeit des QUANTA Lite Ribosome P ELISA ribosomale Antikrper zu erkennen wurde u.a. durch Vergleich mit einem kommerziell erhltlichen indirekten Immunfluoreszenz-Test von INOVA Diagnostics evaluiert. Die Ergebnisse des Immunfluoreszenz Tests wurden als positiv bewertet, wenn eine feingranulre, zytoplasmatische Fluoreszenz auf dem HEp-2 Zell-Substrat zu erkennen war und negativ, wenn keine
9

Fluoreszenz gefunden wurde.

Normalbereich
Eine Gesamtanzahl von 87 zufllig ausgewhlten Normalproben wurde getestet. Die Gruppe setzte sich zu annhernd 90% aus Frauen im Alter von 18 bis 69 Jahren zusammen. Alle 87 Proben waren komplett negativ im QUANTA LiteTM Ribosome P Test. Die Mehrheit der Proben ergaben ein Ergebnis zwischen 2 und 6 Units, die strkste Probe hatte einen Wert von 10 Units. Der positive Cut-off liegt bei 20 Units.

Relative Sensitivitt und Spezifitt

Die Patientenproben wurden in ein Referenzlabor auf ribosomale Antikrper mit dem QUANTA Lite Ribosome P ELISA Test und auf HEp-2 Zellen getestet. Die Ergebnisse nachfolgend: ELISA + 11 2*

+ HEp-2

0 20 *Beide Proben waren im Western Blot negativ.

Relative Sensitivitt Relative Spezifitt Relative bereinstimmung

84,6% 100% 93,9%

Klinische Sensitivitt und Spezifitt

Patientengruppe Normalseren Nicht ribosomale zytoplasmatische Antikrper SLE SLE (neurologische Symptome) SLE (keine neurologischen Symptome) SLE (neurologische Symptome, Ribosome positive auf HEp-2 und/oder Western Blot) Anzahl. 122 56 75 38 19 57 Anzahl. Ribosome P pos. (%) 0 0 15 (20%) 10 (26,3%) 0 57 (100%)

Kreuzreaktivitt
Der QUANTA Lite Ribosome P ELISA Kit wurde mit einer groen Anzahl von Proben getestet, die hohe Werte an anderen Autoantikrpern wie Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, ASMA, M2 (AMA), PR-3, MPO und Gliadin aufwiesen. Keine dieser Proben reagierte mit dem ELISA. Die Werte dieser Proben lagen zwischen 2 und 3 Units, der hchste Wert lag bei 6 Units. Der Cut-off dieses Tests liegt bei 20 Units.

Przision und Reproduzierbarkeit

Die Przision und Reproduzierbarkeit des Tests wurde durch Messen einer negativ, einer schwach positiv und einer stark positiv Probe in sechs Wiederholungen in vier verschiedenen Testanstzen ermittelt. Die mittlere Absorption der stark positiven Probe betrug 113,7, die der schwach positiven 25,1 und die der negativen 2,72. Die Standardabweichung (SD) und der Variationskoeffizient (VK) jeder Probe sind nachfolgend aufgefhrt. Negativ SD 0,42 0,14 0,43 VK 15,2% 5,1% 15,6% Stark positiv SD VK 5,09 4,5% 1,84 1,6% 5,40 4,7% Schwach positiv SD VK 0,83 3,3% 0,81 3,2% 0,76 3,0%

Gesamt Intraassay Interassay

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QUANTA LiteTM Ribosome P

Per uso diagnostico In Vitro
Complessit CLIA: elevata

708600

QUANTA LiteTM Ribosome P un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di anticorpi antiRibosoma P nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-Ribosoma P pu essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) ed di altre patologie correlate del tessuto connettivo.

Finalit duso

Riassunto e Spiegazione del test

Gli anticorpi anti-nucleo (ANA) vengono riscontrati in un gran numero di malattie del tessuto connettivo e pertanto rappresentano un test di screening molto sensibile.1 Sebbene la ricerca di ANA sia uneccellente screening per LES (un risultato negativo praticamente esclude la presenza di LES in fase attiva)2 non per niente specifica. Una serie di test di monitoraggio specifici vengono eseguiti sui campioni positivi per ANA per valutare il "profilo autoanticorpale." Gli autoanticorpi che reagiscono con i ribosomi citoplasmatici sono altamente specifici per il LES e, come ne caso degli anticorpi anti-Sm ed anti-dsDNA, sono considerati come marker della malattia.3 Nel test di immunofluorescenza che utilizza le cellule HEp-2 come substrato, gli anticorpi anti-ribosoma danno una fluorescenza citoplasmatica finemente granulare.4 Questi anticorpi vengono riscontrati nel 12% circa dei pazienti con LES 5,6 e nel 90% di quelli con psicosi da lupus.7 E stato osservato che nella maggior parte dei pazienti affetti da psicosi da lupus e positivi per anticorpi anti-ribosoma i titoli aumentano pi di cinque volte durante e prima delle fasi attive della malattia.7 Gli anticorpi anti-ribosoma-P sono diretti contro 3 fosfoproteine, P0, P1, e P2, localizzate sulla subunit pi grande (60S') dei ribosomi eucariotici. Recentemente lantigene ribosomiale stato caratterizzato molto bene e sono stati pubblicati studi che utilizzavano sia ribosoma P8 ricombinante sia un peptide sintetico carbossil-terminale di 22 amminoacidi.9,10 Questo determinante peptidico lineare comune e rappresenta il principale epitopo delle 3 fosfoproteine ribosomiali.10 Alcuni studi pubblicati, che utilizzavano il peptide sintetico C-terminale di 22 amminoacidi in un metodo ELISA, mostrano che il test fornisce delle ottime indicazioni per la diagnosi del lupus neurologico9,10 e che non soggetto ai risultati contrastanti osservati con ribosoma P11ricombinante, probabilmente a causa della presenza allinterno dellantigene di prodotti batterici contaminanti. Una serie di metodi comprendenti doppia diffusione secondo Ouchterlony, RIA e soprattutto immunofluorescenza indiretta stata utilizzata per individuare la presenza di anticorpi anti-ribosoma. La tecnica di immunofluorescenza pu dare risultati falsi negativi, a causa della presenza di anticorpi che interferiscono, e falsi positivi, per la capacit di reagire con altri antigeni citoplasmatici non-ribosomiali. Luso di un peptide sintetico altamente definito come antigene consente di avere un test sensibile, specifico e riproducibile. La tecnica ELISA utilizzata in questo test sensibile, specifica ed oggettiva. Essa pu essere convenientemente utilizzata per testare sia grandi che piccoli numeri di campioni.

Principio della Metodica

Lantigene di Ribosoma P sintetico adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare lantigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-Ribosoma P eventualmente presenti di legarsi allantigene adsorbito. Leccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-IgG umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-IgG umane marcati con lenzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare leccesso di anticorpi anti-IgG umane marcati con lenzima, lattivit dellenzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando lintensit del colore che si sviluppa. Il test pu essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando lintensit del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli.

Reagenti
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Piastra microtiter ELISA in polistirene, adsorbita con antigene Ribosoma P purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente siero umano senza anticorpi umani antiRibosoma P e conservante, prediluito, 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo per Ribosoma P, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-Ribosoma P, prediluito, 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo per Ribosoma P, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-Ribosoma P, prediluito, 1,2mL Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL
11

9.

Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL

Avvertenze
1. 2. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HbsAg e per anticorpi antiHCV mediante metodi approvati dallFDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dellassenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo Ribosoma P, ELISA debolmente positivo Ribosoma P ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.12 La sodio azide usata come conservante. La sodio azide un veleno e pu essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide pu reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantit di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che pu essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che pu essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare linalazione, lingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Soluzione di arresto HRP costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare lesposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. Lacido solforico velenoso e corrosivo e pu essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.

3.

4. 5. 6.

7. 8.

Precauzioni
1. 2. 3. 4. Questo prodotto stato messo a punto per luso diagnostico In Vitro. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit pu causare risultati non attendibili. Un lavaggio incompleto o non accurato e linsufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA pu causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Ladattamento di questo test alluso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, pu causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilit di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilit. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono liniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dellambiente, laccuratezza e la riproducibilit della tecnica di pipettamento, la scrupolosit delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante lesecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dellantigene ed una scarsa precisione nei risultati. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o pi volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. Uneventuale contaminazione chimica del coniugato HRP pu essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo luso di detergenti chimici.

5.

6. 7. 8. 9.

Condizioni di conservazione
1. 2. 3. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8C. Il tampone di lavaggio diluito stabile per 1 settimana a 2-8C.

Raccolta dei campioni

Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. Laggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti pu influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche luso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dellNCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non pi di 8 ore. 2) Se il test non pu essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8C. 3) Se il test non pu essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di
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essere testati.

Procedura
Materiali forniti
1 1 1 1 1 1 1 1 1 Piastra microtiter ELISA Ribosoma P (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P prediluito 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo Ribosoma P prediluito 50mL Diluente per campioni HRP 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane 10mL Cromogeno TMB 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico

Materiali richiesti ma non forniti

Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, 200-300 e 500L Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza donda)

Metodica
Prima di incominciare
1. 2. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26oC) e mescolarli bene. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa lintera piastra in una sola volta, si pu preparare una minore quantit di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita stabile per 1 settimana a 2-8oC. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5L di siero a 500L di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo Ribosoma P, ELISA fortemente positivo Ribosoma P ed ELISA Negativo. La determinazione della presenza o dellassenza di Ribosoma P usando unit arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare lesposizione allumidit ambientale. Distribuire 100L dei Controlli ELISA debolmente positivo Ribosoma P, ELISA fortemente positivo Ribosoma P ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo laggiunta dellultimo campione. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-300L di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo lultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per laspirazione mantenere la stessa sequenza usata per laggiunta dei campioni. Distribuire 100L di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantit di coniugato necessaria per lesecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2. Lavaggio: Ripetere la procedura descritta la punto 3. Distribuire 100L di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Distribuire 100L di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per laggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per laggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. Leggere lassorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dallaggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza donda, si pu usare la lunghezza donda di 620nm come riferimento.

3.

4.

Esecuzione del test

1.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

Controllo di qualit
1. 2. I Controlli ELISA debolmente positivo Ribosoma P, ELISA fortemente positivo Ribosoma P ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. Si deve notare che, poich sono prediluiti, i Controlli ELISA debolmente positivo Ribosoma P, ELISA fortemente positivo Ribosoma P ed ELISA Negativo non rappresentano un controllo procedurale per
13

3. 4.

le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20C. Perch i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. Lassorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo Ribosoma P prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo Ribosoma P prediluito deve avere unassorbanza maggiore di 1,0 mentre lassorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. Lassorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo negativo ELISA oppure > 0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo ed il Controllo ELISA fortemente positivo Ribosoma P servono per controllare uneventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo Ribosoma P non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. Lutente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dellNCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualit.

Calcolo dei risultati

Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattivit di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P e moltiplicando il risultato per il numero di unit assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P, che stampato sulletichetta del flacone.
Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P (unit) (unit) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo Ribosoma P

La reattivit collegata in modo non lineare alla quantit di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattivit, il cambiamento non proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattivit). Se si desidera una pi accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. Lultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente.

Interpretazione dei risultati

Il metodo ELISA molto sensibile alla procedura ed in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalit basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sullapparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione pu essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Negativo Debolmente Positivo Moderatamente Positivo Fortemente Positivo 1. 2. 3. Unit <20 20 39 40 80 >80

Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro Ribosoma P e suggerisce la possibilit della malattia Lupus Eritematoso Sistemico o di altre patologie correlate del tessuto connettivo. Un risultato negativo indica lassenza di anticorpi diretti contro Ribosoma P oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilit del metodo. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA della INOVA. I valori di anticorpi diretti contro Ribosoma P ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non pu essere correlato ad un titolo endpoint.

Limitazioni del test

1. 2. 3. 4. 5. 6. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline pu causare un aumento del livello di reazioni aspecifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. Non tutti i pazienti affetti da LES risultano positivi per la presenza di anticorpi anti-Ribosoma P. Non tutti i pazienti affetti da LES con problemi neurologici sono positivi per anticorpi anti-ribosoma P. E stato segnalato che il livello di anticorpi anti-Ribosoma P aumenta e diminuisce durante gli episodi acuti e le guarigioni e che i titoli sono influenzati dalla terapia. I risultati di questo test devono essere usati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.

Valori attesi
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La capacit del kit QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA di individuare anticorpi umani anti-Ribosoma P stata valutata paragonando i risultati con quelli ottenuti mediante un test di immunofluorescenza indiretta disponibile in commercio, prodotto dalla INOVA Diagnostics, Inc. I risultati del test di immunofluorescenza sono stati considerati positivi se era presente una fluorescenza citoplasmatica finemente granulare sulle cellule HEp-2 e negativi se non si osservava nessuna fluorescenza.

Range normale
Sono stati testati 87 campioni normali. La popolazione normale era formata per il 90% circa da femmine ed il range di et andava da 18 a 69 anni. Tutti gli 87 campioni sono risultati completamente negativi con il test QUANTA Lite Ribosome P. Il campione pi reattivo aveva un valore di 10 unit mentre quello della maggioranza degli altri era compreso tra 2 e 6 unit. Il valore soglia per i campioni positivi pari a 20 unit.

Sensibilit e specificit relative

I campioni inviati ad un laboratorio di riferimento sono stati testati per la presenza di anticorpi anti-ribosoma sia con ilkit QUANTA Lite Ribosome P ELISA sia mediante immunofluorescenza su cellule HEp-2. I risultati sono riassunti qui di seguito. ELISA + 11 2* 0 20

+ HEp-2 -

Sensibilit relativa Specificit relativa Efficienza relativa

84,5% 100% 93,9%

*Entrambi questi campioni sono risultati negativi in Western blot.

Sensibilit e specificit clinica

Categoria di pazienti Normali Presenza di anticorpi non anti-ribosoma LES LES (sintomi neurologici) LES (assenza di sintomi neurologici) LES (sintomi neurologici, presenza di anticorpi anti-ribosoma con IF su HEp-2 e/o western blot) N. 122 56 75 38 19 57 N. pos Ab anti-Ribosoma P. (%) 0 0 15 (20%) 10 (26,3%) 0 57 (100%)

Reazioni crociate
E stata testata una serie di sieri contenenti elevati titoli di autoanticorpi. Questo gruppo comprendeva campioni positivi per: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, muscolo liscio (ASMA), mitocondrio M-2 (AMA) come pure serina proteasi-3 (PR-3), mieloperossidasi (MPO), e gliadina. Tutti questi campioni sono risultati negativi con il test QUANTA Lite Ribosome P ELISA. Il campione pi reattivo aveva un valore di 6 unit mentre quello della maggioranza degli altri era compreso tra 2 e 3 unit. Il valore soglia per i campioni positivi pari a 20 unit.

Precisione e riproducibilit
La precisione e la riproducibilit del metodo sono state valutate testando sei repliche di ciascun campione negativo, debolmente positivo e fortemente positivo in quattro esperimenti diversi. Il rapporto medio del campione fortemente positivo era pari a 113,7, quello del campione debolmente positivo era 25,1 e quello del campione negativo 2,72. La deviazione standard ed il coefficiente di variazione per ciascun campione sono riportati nella seguente tabella. Negativo SD 0,42 0,14 0,43 CV 15,2% 5,1% 15,6% Fortemente Positivo SD CV 5,09 4,5% 1,84 1,6% 5,40 4,7% Debolmente Positivo SD CV 0,83 3,3% 0,81 3,2% 0,76 3,0%

Generale Intra-test Inter-test

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QUANTA LiteTM Ribosome P

Para Diagnstico In Vitro
Complejidad de CLIA: Alto

708600

QUANTA-LiteTM Ribosome P es un ensayo basado en la tcnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la deteccin semi cuantitativa de anticuerpos anti-Ribosoma P en suero humano. La presencia de anticuerpos antirribosomas puede ser utilizada en conjuncin con hallazgos clnicos y otras pruebas de laboratorio como ayuda en el diagnstico de Lupus Eritematoso Sistmico (LES) y otras enfermedades del tejido conectivo.

Aplicacin

Sumario y Explicacin de la prueba

Los Anticuerpos Antinucleares (ANA) se encuentran en una gran variedad de enfermedades del tejido conectivo y son por ello utilizados como prueba de cribaje gracias a su elevada sensibilidad.1 Mientras que la deteccin de ANA es una excelente prueba de cribaje para Lupus Eritematoso Sistmico (LES) (un resultado negativo virtualmente descarta un LES activo)2, no es en ninguna manera especfica. Se suele realizar una serie de tests de seguimiento para las muestras ANA positivas, con el fin de determinar el "perfil autoinmune". Los anticuerpos que reaccionan con los ribosomas citoplasmticos son muy especficos del LES e, igual que ocurre con los anticuerpos anti Sm y anti-ADN de doble cadena, se consideran anticuerpos marcadores.3 Mediante inmunofluorescencia en substrato celular HEp-2, los anticuerpos antirribosomas producen una fluorescencia citoplasmtica de grnulos finos.4 Estos anticuerpos se encuentran en aproximadamente el 12% de los pacientes con LES 5,6 y en un 90% de los pacientes con psicosis producida por el lupus.7 En la mayora de los pacientes con psicosis inducida por el lupus y anticuerpos antirribosomas, se observ que la presencia de anticuerpos se multiplica por ms de cinco durante y antes de las fases activas de la enfermedad.7 Los antirribosomas P estn dirigidos a 3 fosfoprotenas, P0, P1, y P2, situadas en la subunidad mayor 60S' del los ribosomas eucariticos. Recientemente, el antgeno ribosmico ha sido perfectamente caracterizado y se han publicado estudios en los que se ha utilizado tanto ribosoma P recombinante8 como un pptido sinttico de 22 aminocidos con un extremo carboxil terminal.9,10 Este pptido lineal determinante es comn a las 3 fosfoprotenas ribosmicas y es el mayor eptope de ellas.10 Los estudios publicados utilizando el pptido sinttico de 22 aminocidos con un extremo carboxil terminal en un mtodo ELISA demuestran que el test funciona bien para la diagnosis de lupus de carcter neurolgico9,10 y no muestran ninguno de los resultados contradictorios que se han observado con el recombinante ribosmico P11, posiblemente debido a la presencia de productos contaminantes de origen bacteriano en el antgeno. Se ha utilizado una serie de mtodos para detectar los anticuerpos antirribosomas, incluyendo la prueba de doble difusin de Ouchterlony, el radioinmunoensayo (RIA) y, sobre todo, la inmunofluorescencia indirecta. La tcnica de inmunofluorescencia puede dar falsos negativos debido a la presencia de anticuerpos indeseados y falsos positivos debido a la reactividad con otros antgenos citoplasmticos no ribosmicos. El uso de pptidos sintticos muy definidos como antgenos da lugar a un ensayo sensible, especfico y reproducible. La tcnica ELISA empleada en este test es sensible, especfica y objetiva. Resulta igualmente adecuada para tests con un gran nmero de muestras como para nmeros reducidos.

Procedimiento de trabajo
Los pocillos de la microplaca contienen antgeno sinttico de Ribosoma P altamente purificado que se ha unido en condiciones que mantienen su estado nativo. Se aaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, unindose durante la incubacin los anticuerpos anti Ribosoma P al antgeno que los recubre. El resto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se aade conjugado anti IgG humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubacin permite que el conjugado se una a los anticuerpos presentes. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se aade un sustrato cromognico y tras incubacin la actividad enzimtica presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. El ensayo puede ser evaluado fotomtricamente comparando la intensidad de color en las muestras con la de los controles.

Reactivos
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Microplaca ELISA de poliestireno con pocillos recubiertos con antgeno Ribosoma P purificado (12-1 x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante Control negativo ELISA, 1 frasco de tampn conteniendo conservante y suero humano ausente de anticuerpos humanos anti Ribosoma P, prediluido, 1.2 ml Control ELISA Ribosoma P Positivo Dbil, 1 frasco de tampn conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos anti Ribosoma P, prediluido, 1.2 ml Control ELISA Ribosoma P Positivo Fuerte, 1 frasco de tampn conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos anti Ribosoma P, prediluido, 1.2 ml Diluyente de Muestra HRP, 1 frasco color rosado conteniendo tampn con Tris, Tween 20 y conservante, 50 ml Solucin de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampn con Tris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Seccin Metodologa para instrucciones de dilucin. Conjugado HRP IgG, con anti- IgG humana de cabra, 1 frasco - color azul conteniendo tampn, estabilizante de protena y conservante, 10ml
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8. 9.

Cromgeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml Solucin de Parada HRP, Acido Sulfrico 0.344 M, 1 frasco, incolora, 10 ml

Advertencias
1. 2. Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles y conjugado considerado en el estado de California como causante de cncer. Todo material de origen humano usado en la preparacin de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HbsAg, y HCV por mtodos aprobados por la FDA. Ningn mtodo puede sin embargo ofrecer garanta completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estn ausentes. Por lo tanto, los controles Ribosoma P ELISA positivo fuerte, Ribosoma P ELISA positivo dbil y ELISA negativo deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.12 Dado que se utiliza azida sdica como conservante, este producto puede ser txico por ingestin o absorcin a travs de piel o mucosas. La azida sdica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberas para formar azidas metlicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desages para la eliminacin de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formacin de dichas azidas metlicas. El Conjugado HRP contiene diluido un producto qumico venenoso y corrosivo que puede ser txico si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos. El Cromgeno TMB contiene un irritante. Puede ser daino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalacin, ingestin o contacto con piel y ojos. La Solucin de parada HRP consiste de una solucin diluida de cido sulfrico. Evitar exposicin a bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con cidos. El cido Sulfrico es venenoso y corrosivo, puede ser txico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminacin de residuos.

3.

4. 5. 6.

7. 8.

Precauciones
1. 2. 3. 4. Este producto es para ser usado en el Diagnstico In Vitro. La sustitucin de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminacin insuficiente de lquido de los pocillos puede dar lugar a una prdida de precisin y/o un fondo elevado. La adaptacin de este ensayo para su uso en procesadores automticos u otros dispositivos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparacin con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento automatizado y comprobar que produce resultados dentro de los lmites aceptables. Existe una variedad de factores que influyen en la realizacin del ensayo. Esto incluye la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de tcnica de pipeteo, la calidad de la tcnica de lavando, el fotmetro que se utiliza para medir los resultados, y los tiempos de incubacin durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un trabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. El sellado incompleto de la bolsa zip-lock que contenga tiras sin usar y desecante provocar la degradacin del antgeno que se apreciar en un empeoramiento de la precisin de resultados. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o ms usos separados de un conjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulacin especficas para este producto para evitar que esto ocurra. La contaminacin qumica del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o secado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos qumicos comunes en el laboratorio como formalina, leja, etanol, o detergente causan la degradacin del conjugado HRP con el tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos despus de usar dichos productos.

5.

6. 7. 8. 9.

Condiciones de Almacenaje
1. 2. 3. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes cerrndola hermticamente y almacenndola a 2-8C. La solucin de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8C.

Recoleccin de Muestras
Este kit requiere suero como muestra. La adicin de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partculas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipmicas o hemolizadas. Tras la recoleccin de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del cogulo. El documento NCCLS H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no ms de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse.
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Procedimiento
Materiales Suministrados
1 1 1 1 1 1 1 1 1 Microplaca Ribosoma P ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte 1.2 ml control prediluido ELISA negativo 1.2ml control prediluido Ribosoma P ELISA Positivo Dbil 1.2ml control prediluido Ribosoma P ELISA Positivo Fuerte 50ml Diluyente de muestra HRP 25ml Solucin de lavado concentrada 40X 10ml Conjugado IgG (cabra) anti IgG humana 10ml Cromgeno TMB 10ml Solucin parada HRP (cido Sulfrico 0.344M)

Material necesario no incluido

Micropipetas para 5, 100, 200-300 y 500l Puntas desechables para micropipeta Tubos para dilucin de muestras, 4ml Agua destilada Recipiente de 1L para la solucin de lavado reconstituida Lector de microplacas capaz de medir densidades pticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble longitud de onda)

Metodologa
Antes de empezar
1. 2. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26C) y agitar. Diluir la solucin de lavado HRP 1:40 aadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml de agua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solucin de lavado aadiendo 2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan a utilizarse. El tampn diluido es estable 1 semana a 2-8C. Preparar una dilucin 1:101 de cada muestra a procesar aadiendo 5 l de muestra a 500 l de diluyente. Las muestras diluidas deben ser utilizadas dentro de las 8 horas de su preparacin. NO DILUIR los controles Ribosoma P ELISA positivo dbil, positivo fuerte y ELISA negativo. La determinacin de la presencia o ausencia de anticuerpos anti Ribosoma P usando unidades arbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cada muestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado.

3. 4.

Procedimiento de Ensayo
1. TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26C) ANTES DE EMPEZAR EL ENSAYO. Ponga el nmero necesario de tiras en el soporte. Devolver inmediatamente las tiras sin utilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para minimizar la exposicin a la humedad. Agregar 100l de los controles prediluidos Ribosoma P ELISA Positivo Dbil, Ribosoma P ELISA Positivo Fuerte, ELISA Negativo y las muestras prediluidas a los pocillos. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie plana . El tiempo de incubacin empieza despus de la adicin de la ltima muestra. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300l de solucin de lavado a todos pocillos y aspirar. Repetir esta secuencia dos veces ms para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearla suavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el ltimo lavado. Es importante que cada pocillo est completamente vaco despus de cada paso de lavado. Mantener la misma secuencia para la aspiracin que la usada para la adicin de muestras. Agregar 100l de Conjugado IgG HRP a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condiciones ms aspticas posibles y siguiendo buenas tcnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad de conjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIN POTENCIAL MICROBIANA Y/O QUMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso 2. Lavado: Repetir el paso 3. Agregar 100l de Cromgeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Agregar 100l de Solucin de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalizacin que la efectuada en la adicin de Cromgeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos. Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo mximo de una hora. Si se desea seguir el mtodo de lectura bicromtica puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

Control de Calidad
1. 2. 3. Los controles Ribosoma P ELISA Positivo Dbil, Ribosoma P ELISA Positivo Fuerte y Control Negativo ELISA deben procesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionan correctamente. El usuario debe notar que debido a que los controles Ribosoma P ELISA Positivo Dbil, Ribosoma P ELISA Positivo Fuerte y ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilucin de especmenes. Pueden aadirse controles adicionales segn las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden prepararse controles vlidos haciendo alcuotas de un pool de suero humano que debe
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4.

almacenarse a < -20C. Para considerar vlidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios especificados a continuacin, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse invlida y repetirse. a. La absorbancia del control Ribosoma P Positivo debe ser superior a la del control Ribosoma P positivo dbil y la de este debe ser superior a la del control negativo. b. El control Ribosoma P positivo fuerte debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que la del control negativo no debe exceder de 0.2. c. La absorbancia del control Ribosoma P positivo dbil debe ser superior al doble del control negativo, o superior a 0.25. d. Los controles ELISA negativo y Ribosoma P positivo fuerte estn pensados para monitorizar problemas de reactivo de magnitud substancial. El control Ribosoma P positivo fuerte no puede asegurar precisin alguna en el punto de corte del ensayo. e. El usuario puede referirse al documento NCCLS (National Committee of Clinical Laboratory Standards) C24-A para una gua adicional acerca de buenas prcticas de laboratorio.

Clculo de Resultados
Debe determinarse en primer lugar el promedio de densidades pticas de cada juego de duplicados. La reactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad ptica promedio de la muestra por la densidad ptica promedio del control Ribosoma P positivo dbil. El resultado se multiplica por el nmero de unidades asignadas al control Ribosoma P positivo dbil indicado en la etiqueta. DO Muestra Valor de la Muestra = x Valor ELISA Positivo Dbil (unidades) DO ELISA Positivo Dbil (unidades) La reactividad de la muestra est relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente. Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentracin de anticuerpos del paciente se reflejarn en el aumento o disminucin correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (por ejemplo, al doblarse la concentracin de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara una cuantificacin ms precisa de la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el ttulo de anticuerpo de la muestra la ltima dilucin positiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra.

Interpretacin de los Resultados

La tcnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeas diferencias entre poblaciones de pacientes. Los valores presentados a continuacin son slo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propio rango normal basado en su propia metodologa, controles, equipo y poblacin de pacientes. La muestra puede clasificarse con un valor negativo, positivo dbil, positivo moderado o positivo fuerte segn la tabla siguiente. Unidades Negativo <20 Positivo Dbil 20 39 Positivo Moderado 40 80 Positivo Fuerte >80 1. 2. 3. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-Ribosoma P y sugiere la posibilidad de Lupus Eritematoso Sistmico (LES) y enfermedades relacionadas del tejido conectivo. Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos anti-Ribosoma P o niveles inferiores al punto de corte del ensayo. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmacin Los siguientes resultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA LiteTM Ribosome p ELISA. Los valores obtenidos con kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud de los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final.

Limitaciones del Procedimiento

1. 2. 3. 4. 5. 6. La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra del paciente puede producir un aumento de uniones inespecficas y causar falsos positivos en este ensayo. No todos los pacientes son positivos para Ribosoma P. No todos los pacientes de LES con problemas neurolgicos dan positivo en los tests de anticuerpos antirribosomas P. Se ha comprobado que los anticuerpos antirribosoma P aumentan y disminuyen durante las crisis y remisiones de la enfermedad, y que la presencia de anticuerpos se ve alterada por la terapia. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clnicos y otras pruebas serolgicas. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.

Valores Esperados

La capacidad del kit QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA para detectar anticuerpos anti Ribosoma P fue evaluada en comparacin con un test de inmunofluorescencia indirecta comercializado por INOVA Diagnostics. Los resultados del test de inmunofluorescencia se determinaron como positivos cuando se observaba una fluorescencia citoplasmtica de grnulos finos en el substrato celular HEp-2, y negativos si no se observaba fluorescencia.
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Rango Normal
Se sometieron a test ochenta y siete muestras normales. La poblacin normal estaba formada aproximadamente por un 90% de mujeres con edades comprendidas entre los 18 y los 69 aos. Todas las muestras resultaron negativas con el ensayo QUANTA Lite Ribosome P. La muestra ms reactiva contena 10 unidades de actividad y la mayora de las dems estaba entre 2 y 6 unidades solamente. El umbral positivo es de 20 unidades.

Sensibilidad y Especificidad Relativas

Las muestras enviadas a un laboratorio de referencia fueron sometidas al test de anticuerpos antirribosoma tanto con el mtodo QUANTA Lite Ribosome P ELISA como por inmunofluorescencia sobre un substrato celular HEp-2. Los resultados se muestran a continuacin. ELISA + 11 2* 0 20

+ HEp-2 -

Sensibilidad relativa Especificidad relativa Eficiencia relativa

84.6% 100% 93.9%

*Los dos de estas muestras eran negativo por el Western blot.

Sensibilidad y Especificidad Clnicas

Grupo de pacientes Normales Anticuerpos citoplasmticos no ribosmicos LES LES (sntomas neurolgicos) LES (sin sntomas neurolgicos) LES (sntomas neurolgicos, positivos para ribosomas con HEp-2 y/o western blot) Nm. 122 56 75 38 19 57 Nm. de positivos al Ribosoma P (%) 0 0 15 (20.0%) 10 (26.3%) 0 57 (100%)

Reactividad Cruzada
Se sometieron a prueba una variedad de sueros con una elevada cantidad de autoanticuerpos. Estas muestras incluan las siguientes caractersticas: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, msculo liso (ASMA), mitocondrias M-2 (AMA), as como serinproteasa-3 (PR-3), mieloperoxidasa (MPO), y gliadina. Todas estas muestras resultaron negativas al test QUANTA Lite Ribosome P ELISA. La muestra ms reactiva mostraba un valor de 6 unidades y la mayora de las restantes entre 2 y 3 unidades. El umbral para este test es de 20 unidades.

Precisin y Reproducibilidad
La precisin y reproducibilidad del ensayo se midi mediante seis replicados de muestras fuertemente positivas, dbilmente positivas y negativas en cuatro ensayos separados. El promedio de positivos fuertes fue de 113.7, de 25.1 para los positivos dbiles y de 2.72 para los negativos. La desviacin estndar y el coeficiente de variacin para cada muestra se resume a continuacin. Negativo SD CV 0.42 15.2% 0.14 5.1% 0.43 15.6% Positivo Fuerte SD CV 5.09 4.5% 1.84 1.6% 5.40 4.7% Positivo Dbil SD CV 0.83 3.3% 0.81 3.2% 0.76 3.0%

Global Intra ensayo Inter ensayo

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QUANTA LiteTM Ribosome P

Uniquement pour Diagnostic In-Vitro
Complexit de CLIA: Haut

708600

QUANTA LiteTM Ribosome P est un test ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) pour la dtection semi-quantitative des anticorps anti-Ribosomes P dans le srum humain. La dtection des anticorps antiRibosomes P peut tre utilise conjointement avec les signes cliniques et dautres tests de laboratoire pour faciliter le diagnostic du Lupus Erythmateux Dissmin (LED) et des autres maladies du tissu conjonctif.

Application

Informations concernant le test

La recherche des anticorps anti-nuclaires (ANA) est un test sensible pour le dpistage dune grande varit de maladies du tissu conjonctif.1 Bien que la recherche dANA soit une excellente mthode de dpistage du LED (des rsultats ngatifs excluent un LED)2, elle nest pas spcifique. Plusieurs tests spcifiques complmentaires sont gnralement effectus sur les srums ANA positifs pour dterminer les profils dauto-anticorps. Les auto-anticorps anti-ribosomes cytoplasmiques sont hautement spcifiques du LED et sont considrs, de la mme faon que les anticorps anti-Sm et anti-DNA natif, comme des anticorps marqueurs3. Sur les cellules HEp-2, les anticorps anti-ribosomes prsentent une immunofluorescence cytoplasmique paisse et 5,6 finement granulaire4. Ces anticorps sont trouvs chez environ 12% des patients atteints du LED et chez 90% des patients avec un lupus psychosis7. Chez la plupart des patients atteints du lupus psychosis, les titres danti-Ribosomes augmentent cinq fois plus avant et pendant les phases actives de la maladie.7 Les anticorps anti-ribosomes P sont dirigs contre trois phosphoprotines P0, P1 et P2 qui sont localises sur la plus grande sous-unit 60S des ribosomes dEucaryotes. Rcemment lantigne ribosomial a t caractris de manire prcise. Dans des tudes publies, on a utilis soit des ribosomes recombinants P8, soit un peptide synthtique carboxyl-terminal compos de 22 amino-acides.9,10 Ce peptide linaire prsente lpitope principal commun des trois phosphoprotines ribosomiales.10 Des tudes utilisant le peptide synthtique C-terminal de 22 aminoacides en ELISA, ont montr que cet antigne convient parfaitement pour le diagnostic du lupus neurologique9,10 et quil ne prsente pas de rsultats conflictuels comme dans le cas o lantigne est un ribosome P recombinant11 . Ceci peut-tre d une contamination bactriologique de lantigne. Plusieurs mthodes telles que lOuchterlony double diffusion, le RIA (Radio-Immuno-Assay) et surtout limmunofluorescence indirecte, ont t utilises afin de dtecter des anticorps contre les ribosomes. La technique dimmunofluorescence peut donner des faux-ngatifs cause de la prsence dautres anticorps et des faux-positifs dus une ractivit avec dautres antignes cytoplasmiques non-ribosomiaux . Lutilisation dun peptide synthtique bien dfini comme antigne fournit un test sensible, spcifique et reproductible. La mthode ELISA, utilise pour ce test, est sensible, spcifique et objective, et convient pour tester un nombre important ou non dchantillons de patients.

Principe du test
Lantigne Ribosome P synthtique est fix sur les puits dune plaque de microtitration en polystyrne dans des conditions prservant son tat natif. Les contrles pr-dilus et les srums de patients dilus sont ajouts dans diffrents puits. Une tape dincubation permet la liaison entre les anticorps anti-Ribosomes P prsents dans le srum et lantigne immobilis dans le puits. Les molcules non lies aux antignes sont limines par lavage. Un conjugu enzymatique anti-IgG humaine est alors ajout dans chaque puits pour rvler les autoanticorps du patient. Aprs une tape dincubation, le conjugu non fix est limin par lavage. Lactivit enzymatique rsiduelle est quantifie grce laddition dun substrat chromogne suivie dune tape de mesure de lintensit de la coloration ainsi dveloppe. Les rsultats peuvent tre valus par comparaison entre la couleur du puits chantillon et celle des puits des contrles.

Contenu du coffret
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Plaque de microtitration ELISA revtue dantignes Ribosomes P, portoir de 12 barrettes de 8 puits en polystyrne scables, dans un sachet daluminium avec un dessiccateur Contrle Ngatif pr-dilu, 1 flacon de 1,2 ml de srum humain sans anticorps humains antiRibosomes P, dans du tampon avec stabilisateur Contrle ELISA Ribosomes P faiblement positif pr-dilu, 1 flacon de 1,2 ml de srum humain avec des anticorps humains anti-Ribosomes P, dans du tampon avec stabilisateur Contrle ELISA Ribosomes P fortement positif pr-dilu, 1 flacon de 1,2 ml de srum humain avec des anticorps humains anti-Ribosomes P, dans du tampon avec stabilisateur Diluant dchantillons HRP, teint en rose, 1 flacon de 50 ml contenant du tampon Tris salin, du Tween 20, des stabilisateurs de protines et des conservateurs Tampon de lavage HRP concentr 40X tampon Tris salin avec du Tween 20, teint de rouge, 1 flacon de 25 ml. Consulter le paragraphe Mthode pour la dilution. Conjugu IgG-HRP, anticorps de chvre anti-IgG humaines dans du tampon contenant des stabilisateurs de protines et des conservateurs, teint en bleu, 1 flacon de 10 ml TMB Chromogne, avec stabilisateurs, 1 flacon de 10 ml Solution darrt HRP, acide sulfurique 0,344 M, non teint, 1 flacon de 10 ml

Avertissements
1. 2. ATTENTION: Le diluant des chantillons, les contrles et le conjugu contiennent 0,02% de chloramphnicol, considr comme cancrigne dans ltat de Californie. Tout le matriel d'origine humaine utilis pour la prparation des contrles a t test et trouv
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3.

4. 5. 6.

7. 8.

ngatif lors de la recherche d'anticorps anti-VIH, anti-antigne de surface de l'Hpatite B et anti-Virus de lHpatite C l'aide de tests approuvs par la FDA. Cependant, aucune mthode ne peut donner une garantie complte quant l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. En consquence, tous les srums humains de contrle doivent tre manipuls avec les mmes prcautions que celles utilises pour un matriel potentiellement infectieux.12 Lazide de sodium (NaN3) est utilis comme conservateur. NaN3 est un poison et est toxique en cas dingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de lexposer aux bases, mtaux ou autres composants, ragissant avec les acides. Aprs lvacuation des ractifs, laver grande eau afin dviter des dpts dans les canalisations. Le conjugu Peroxydase HRP contient un composant chimique dilu qui est un poison corrosif, toxique en cas d'ingestion en grande quantit. Pour viter des brlures chimiques, il est recommand d'viter tout contact avec la peau ou les yeux. Le chromogne TMB est irritant et peut tre toxique en cas d'inhalation, d'ingestion et dabsorption en grande quantit. Eviter tout contact avec la peau ou les yeux et toute inhalation. La solution d'arrt HRP est une solution dilue d'acide sulfurique. Eviter de lexposer aux bases, aux mtaux, aux oxydants ou tout autre compos susceptible de ragir avec les acides. Lacide sulfurique est toxique et corrosif en cas dabsorption. Eviter le contact avec la peau et les yeux pour viter toute brlure chimique. Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les quipements de protection appropris. Les claboussures de ractifs doivent tre nettoyes immdiatement. Respecter les rglements en vigueur concernant llimination des dchets.

Prcautions
1. 2. 3. 4. Ce test est destin au diagnostic in vitro. Toute substitution par dautres ractifs que ceux fournis dans le coffret entrane des variations de rsultats. Un lavage incomplet ou insuffisant et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits ELISA entranent des imprcisions et un bruit de fond lev. Lautomatisation, complte ou partielle, du traitement des chantillons dans ce test peut produire des diffrences de rsultats par rapport au traitement manuel. Chaque laboratoire est responsable de la validation des procdures automatiques afin que les rsultats des tests restent dans les limites acceptables. Un certain nombre de facteurs influencent la performance du test: la temprature initiale des ractifs, la temprature ambiante, lexactitude et la reproductibilit de la technique de pipetage, la qualit du lavage et de vidange des puits ELISA, le photomtre utilis pour mesurer les rsultats et la dure des temps dincubation. Il est donc recommand de prter attention tous ces facteurs pour obtenir des rsultats reproductibles et rigoureux. Il est recommand de suivre strictement le protocole. Chaque modification est au risque de lutilisateur. La fermeture incomplte de la pochette contenant les puits de microtitration et le dessiccant entrane la dgradation de lantigne et en consquence une mauvaise prcision des rsultats. Des valeurs faibles et inacceptables dabsorption peuvent tre progressivement observes ds le deuxime prlvement dans le mme flacon de conjugu HRP. Il est donc important de suivre exactement les instructions fournies pour viter ce risque. Un nettoyage ou rinage inappropri des appareils et instruments pourrait provoquer une contamination chimique du conjugu HRP. Des rsidus de produits chimiques courants de laboratoire comme le formol, leau de javel, lthanol ou les dtergents, entranent la dgradation progressive du conjugu HRP. Il est absolument recommand de rincer abondamment tous les instruments et appareils aprs lutilisation des dtergents chimiques.

5.

6. 7. 8. 9.

Conditions de conservation
1. 2. 3. Conserver tous les ractifs du coffret entre 2-8C. Ne pas congeler. Les ractifs sont stables jusqu la date limite dutilisation dans des conditions de stockage et dutilisation conformes. Les puits non utiliss devront tre remis dans lemballage en aluminium avec le dessiccateur, bien referm et stock 2-8C. La solution de tampon dilue reste stable une semaine 2-8C.

Echantillons
Ce test doit tre ralis avec des srums comme chantillons. Laddition dazide ou dautres conservateurs aux chantillons peut affecter le bon droulement de la procdure. Les srums contamins par des agents microbiens, prtraits par la chaleur ou contenant des particules visibles ne doivent pas tre utiliss. Les srums ou chantillons hmolyss ou hyperlipmiques sont viter. Aprs prlvement, le srum doit tre spar du culot. Le document H18-A2 du NCCLS recommande les conditions suivantes de conservation: 1) Conserver les chantillons temprature ambiante pendant moins de 8 heures. 2) Si le test ne peut pas tre fait dans les 8 heures, conserver les chantillons 2-8C. 3) Si le test ne seffectue pas dans les 48 heures ou si on doit envoyer les chantillons, les congeler 20C ou plus basse temprature. Bien agiter les chantillons dcongels.

Procdure
Matriel fourni
1 1 1 Plaque microtitration ELISA Ribosomes P portoir de (12-1 x 8 puits) avec support 1,2 ml Contrle ELISA Ngatif pr-dilu 1,2 ml Contrle ELISA Ribosomes P faiblement positif pr-dilu
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1,2 ml Contrle ELISA Ribosomes P fortement positif pr-dilu 50 ml diluant HRP pour chantillons 25 ml tampon de lavage HRP concentr 40X 10 ml conjugu anti-IgG humaines de chvre 10 ml substrat TMB 10 ml solution darrt HRP (acide sulfurique 0,344M)

Matriel ncessaire mais non fourni

Pipettes 5, 100, 200-300 et 500 l Cnes jetables Tubes de 4ml pour la dilution de srum Eau distille ou dionise Rcipient de 1 litre pour le tampon de lavage HRP dilu Lecteur ELISA avec filtre de 450nm (et 620nm pour les lectures double longueur dondes)

Mthode
Prparation du test
1. 2. Porter tous les ractifs et chantillons la temprature ambiante (20-26oC) et bien les mlanger avant de les utiliser. Diluer la totalit de la solution de lavage (25ml) avec 975 ml deau distille (1/40). La solution de tampon dilue reste stable une semaine 2-8C. Si la totalit de la plaque de microtitration nest pas utilise en une seule fois, un plus petit volume de tampon sera suffisant, par exemple pour traiter 16 puits, diluer 2ml de tampon concentr dans 78ml deau distille. Prparer les srums des patients en les diluant au 1/101 dans le diluant dchantillon (5l dans 500l). Les srums doivent tre utiliss dans les 8 heures qui suivent leur dilution. Ne pas diluer les contrles ELISA fortement positif, faiblement positif en Ribosomes P et ngatif. La dtermination de la prsence ou de labsence de la Ribosomes P en units arbitraires ncessitent deux puits pour chacun des trois contrles et un ou deux puits pour chacun des srums de patients. Il est recommand de tester les chantillons en double.

3. 4.

Excution du test
1. PORTER TOUS LES REACTIFS ET LES ECHANTILLONS TEMPERATURE AMBIANTE (2026oC) AVANT DE LES UTILISER. Placer le nombre ncessaire de micro puits ou de barrettes sur le portoir. Remettre immdiatement les barrettes non utilises dans la pochette en aluminium avec le dessiccant, fermer hermtiquement pour viter toute condensation de vapeur deau. Distribuer 100 l de chacun des contrles ELISA fortement positif, faiblement positif en Ribosomes P et ngatif pr-dilus et de srums dilus des patients dans les puits. Recouvrir les barrettes et laisser incuber pendant 30 minutes temprature ambiante. Le temps dincubation commence aprs lajout du dernier chantillon. Lavage: aspirer le contenu de tous les puits. Ajouter 200-300 l de tampon dilu dans tous les puits et laspirer ensuite compltement. Rpter cette opration deux fois supplmentaires pour un total de trois lavages. Aprs le dernier lavage, retourner la plaque en la tapotant sur du papier absorbant, pour enlever tout liquide de lavage rsiduel. Pour l'aspiration, maintenir la mme squence que celle utilise lors de la distribution des chantillons. Distribuer 100 l de conjugu HRP IgG dans chaque puits. Le conjugu doit tre prlev du flacon dans des conditions aseptiques. Prlever en une seule fois la quantit de conjugu ncessaire la ralisation de la srie. POUR EVITER LE RISQUE DE CONTAMINATION, NE JAMAIS REMETTRE LE RESTE DU CONJUGUE NON UTILISE DANS LE FLACON. Recouvrir les barrettes et incuber pendant 30 minutes temprature ambiante, comme dcrit ltape 2. Lavage: Rpter la procdure dcrite ltape 3. Distribuer 100 l de chromogne TMB dans chaque puits et laisser incuber lobscurit 30 minutes temprature ambiante. Ajouter 100 l de solution darrt HRP dans chaque puits. Maintenir la mme squence et le mme timing lors de laddition de la solution darrt que ceux utiliss lors de la distribution du chromogne TMB. Tapoter dlicatement les plaques pour bien mlanger le contenu des puits. Lire la densit optique (DO) de chaque puits 450nm dans lheure qui suit larrt de la raction. Pour une lecture bichromatique, la longueur donde de rfrence peut tre 620nm.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

Contrle de qualit
1. 2. 3. Les contrles ELISA fortement positif Ribosomes P, faiblement positif en Ribosomes P et ngatif doivent tre inclus chaque srie de tests afin de sassurer du bon fonctionnement des ractifs et du bon droulement de la procdure. Etant donn que les contrles ELISA fortement positifs Ribosomes P, ELISA faiblement positifs en Ribosomes P et ngatifs sont prdilus, il nest pas possible de valider le procd de dilution des chantillons. Des contrles de qualit supplmentaires peuvent tre raliss selon les directives nationales, les rglementations internationales ou celles des organismes daccrditation. Des contrles appropris peuvent tre obtenus en aliquotant un pool de srums humains conserv une temprature infrieure ou gale -20C. Pour valider les rsultats obtenus, tous les critres dcrits ci-dessous devront tre vrifis. Si un ou plusieurs de ces critres ne sont pas raliss, le test devra tre considr comme non valide et refaire. a. La densit optique du Contrle ELISA fortement positif en Ribosomes P pr-dilu doit tre suprieure celle du contrle ELISA faiblement positif en Ribosomes P pr-dilu. Dautre
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b. c. d. e.

part, la densit optique du contrle ELISA faiblement positif en Ribosomes P doit tre suprieure celle du contrle ELISA ngatif pr-dilu. La densit optique du contrle ELISA fortement positif en Ribosomes P pr-dilu doit tre suprieure 1,0. Celle du contrle ngatif pr-dilu doit tre infrieure 0,2. Labsorbance du Contrle ELISA faiblement positif en Ribosomes P doit tre deux fois suprieure celle du contrle ngatif dELISA ou suprieure 0,25. Les contrles ELISA ngatif et ELISA fortement positif en Ribosomes P permettent de contrler le bon fonctionnement des tests. Le Contrle ELISA fortement positif en Ribosomes P nassure pas la prcision de la valeur seuil du test. Lutilisateur du test peut se rfrer au document C24-A du NCCLS pour des informations supplmentaires concernant le contrle qualit.

Calcul des rsultats

Dterminer dabord la valeur moyenne des duplicates. La ractivit de chaque chantillon est calcule en divisant la DO moyenne de lchantillon par la DO moyenne du contrle faible et multiplier le rsultat obtenu par la valeur (en units) affecte au contrle faible. La valeur en units est indique sur ltiquette du flacon de contrle ELISA faiblement positif en Ribosomes P. DO de lchantillon Valeur de lchantillon = x valeur du contrle faible (units) DO du contrle faible (units) La raction nvolue pas de manire linaire en fonction de la quantit danticorps prsents dans le srum. Laugmentation et la diminution de la concentration danticorps se traduisent par une augmentation ou une diminution de ractivit correspondante mais ces modifications du signal ne sont pas proportionnelles (par exemple un doublement de la quantit danticorps ne fera pas doubler le signal). Pour une valuation quantitative rigoureuse des anticorps du patient, il faudra raliser des dilutions sries du srum. Dans ce cas, la dernire dilution du srum qui donne encore un signal positif sera considre comme tant le titre en anticorps du patient.

Interprtation des rsultats

Le test ELISA est une technique trs sensible et peut en consquence dtecter de trs faibles diffrences au sein dun groupe de patients. Les valeurs limites dtailles dans le paragraphe calcul des rsultats sont indicatives. Il est recommand chaque laboratoire dtablir ses propres valeurs seuils dinterprtation en fonction de ses techniques, contrles, quipements et populations de patients. Les chantillons peuvent tre interprts comme ngatifs, faiblement, modrment ou fortement positif selon les valeurs en units dtailles ci-dessous: Ngatif Faiblement positif Modrment positif Fortement positif 1. 2. 3. Units <20 20 39 40 80 >80

Un rsultat positif indique la prsence danticorps Ribosomes P et la possibilit du Lupus Erythmateux Dissmin (LED) ou de maladies relatives au tissu conjonctif. Un rsultat ngatif indique labsence danticorps anti-Ribosomes P ou bien un taux danticorps en dessous de la valeur seuil. Nous suggrons de rendre les rsultats avec la remarque suivante: Les rsultats suivants ont t obtenus avec le test ELISA de INOVA QUANTA LiteTM Ribosome P. Les valeurs danti-Ribosomes P obtenues avec des tests de diffrents fabricants ne sont pas interchangeables. Le taux danti-IgG trouv nest pas corrl une titrage en point final.

Limites du test
1. 2. 3. 4. 5. 6. La prsence de Complexes Immuns ou dautres agrgats dImmunoglobulines dans le srum humain peut entraner laugmentation dune liaison non spcifique et des rsultats faussement positifs. Tous les patients atteints du LED sont positifs en Ribosomes P. Les patients atteints du LED avec des symptmes neurologiques nont pas tous des anticorps antiRibosomes P. Les titres danticorps anti-Ribosomes P augmentent au cours de lapparation de la maladie et baissent pendant la phase de rmission. Les titres dpendent aussi des thrapies. Les rsultats obtenus laide de ce test devront tre corrls avec les signes cliniques et dautres tests srologiques. Les performances du coffret pour les chantillons autres que les srums nont pas t tablies.

Performances
La capacit du test ELISA QUANTA Lite Ribosome P dtecter les anticorps anti-Ribosomes P a t value en le comparant au test dimmunofluorescence indirect de INOVA Diagnostics, dj commercialis. Les rsultats en immunofluorescence sont considrs positifs sil apparat une fluorescence cytoplasmique finement granulaire sur les cellules HEp-2 et ngatifs sil ny a aucune fluorescence.

Valeur normale
87 chantillons normaux ont t tests. Cette population est compose denviron 90% de femmes ges de18 69 ans. Les 87 chantillons sont tous compltement ngatifs par le test ELISA QUANTA Lite
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Ribosome P. La valeur la plus leve est de 10 units alors que la majorit des chantillons ont entre 2 et 6 units. La valeur seuil est de 20 units.

Sensibilit et spcificit relatives

Des chantillons ont t envoys un laboratoire de rfrence pour tre tests par le coffret ELISA QUANTA Lite Ribosome P ainsi que par limmunofluorescence sur les cellules HEp-2. Les rsultats sont rsums dans le tableau ci-dessous. ELISA + + 11 2* Sensibilit Relative 84,6% HEp-2 Spcificit Relative 100% 0 20 Efficacit Relative 93,9% *Ces deux chantillons sont ngatifs en Western blot.

Sensibilit et spcificit clinique

Groupe de patients Srum normal Anticorps cytoplasmiques non ribosomiaux LED LED (avec symptmes neurologiques) LED (pas de symptme neurologique) LED (symptmes neurologiques, ribosomes positifs sur HEp-2 et/ou en Western Blot) Nombre 122 56 75 38 19 57 Nombre de Positifs en Ribosomes P (%) 0 0 15 (20,0%) 10 (26,3%) 0 57 (100%)

Ractions croises
Un grand nombre dchantillons ayant des titres levs en anticorps de diffrentes spcificits telles que : Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, muscle lisse (ASMA), mitochondrie M2 (AMA), protase 3 (PR-3), myloperoxydase (MPO) et gliadine. Aucun de ces chantillons na ragit au test ELISA QUANTA LiteTM Ribosome P. La valeur la plus leve est de 6 units alors que la majorit des rsultats stalent entre 2 et 3 units. La valeur seuil de ce test est de 20 units.

Prcision et Reproductibilit
Un srum ngatif , un srum faiblement positif et un srum fortement positif ont t tests chacun 6 fois par essai dans 4 essais spars. La valeur moyenne du srum fortement positif est de 113,7 units, celle du faiblement positif est de 25,1 units et celle du ngatif est de 2,72 units. Les carts type (ET) et les coefficients de variation (CV) de chaque chantillon sont rsums dans le tableau ci-dessous. Ngatif ET 0,42 0,14 0,43 CV 15,2% 5,1% 15,6% Fortement Positif ET CV 5,09 4,5% 1,84 1,6% 5,40 4,7% Faiblement Positif ET CV 0,83 3,3% 0,81 3,2% 0,76 3,0%

Global Intra-essais Inter-essais

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QUANTA LiteTM Ribosome P

Para utilizao em diagnstico In Vitro
Complexidade CLIA: Elevada

708600

QUANTA LiteTM Ribosome P um ensaio imunoenzimtico (ELISA) para a deteco semi-quantitativa de anticorpos Ribossoma P no soro humano. A presena destes anticorpos pode ser utilizada em conjunto com as concluses clnicas e outros testes de laboratrio para ajudar no diagnstico de lpus eritematoso sistmico (SLE) e de outras doenas relacionadas com o tecido conjuntivo.

Aplicao Diagnstica

Resumo e Explicao do teste

Os anticorpos antinucleares (ANA) podem ser encontrados numa grande variedade de doenas do tecido conjuntivo e representam um ensaio sensvel de rastreio.1 Embora o teste ANA seja um excelente teste de rastreio para o SLE (um resultado negativo elimina virtualmente a possibilidade do SLE activo)2, no de modo algum um teste especfico. Por norma, so efectuados vrios testes de seguimento s amostras ANA positivas para determinao do perfil de auto-anticorpos. Os auto-anticorpos que reagem com ribossomas citoplasmticos so muito especficos para o SLE e, tal como os anticorpos anti Sm e anti dsDNA, so considerados anticorpos marcadores.3 Por meio de imunofluorescncia e utilizando como substrato clulas HEp-2, os anticorpos anti ribossomas produzem uma fluorescncia granular fina citoplasmtica.4 Estes anticorpos so observados em cerca de 12% dos doentes com SLE5,6 e em 90% dos doentes com psicose do lpus.7 Na maioria dos doentes com psicose do lpus e anticorpos anti ribossomas, observou-se que o titulo aumenta cinco vezes mais durante e antes das fases activas da doena.7 Os anti-ribossomas-P so direccionados para 3 fosfoprotenas, P0, P1 e P2, localizadas na subunidade maior 60S dos ribossomas eucariticos. Recentemente, o antignio ribossmico foi muito bem caracterizado e foram publicados estudos em que foram utilizados ribossomas P8 recombinantes ou um pptido sinttico carboxil-terminal com 22 aminocidos.9,10 Este pptido linear determinante comum e o eptopo principal das 3 fosfoprotenas ribossmicas.10 Os estudos publicados que utilizaram o pptido sinttico C-terminal com 22 aminocidos num mtodo ELISA permitem demonstrar que o teste eficaz no diagnstico de lpus neurolgico9,10 e que no apresenta quaisquer dos resultados conflituosos observados com o ribossoma P11 recombinante, possivelmente devido presena de produtos bacterianos de contaminao contidos no antignio. Foram utilizados uma variedade de mtodos para detectar os anticorpos anti ribossomas, incluindo a dupla difuso de Ouchterlony, o RIA e principalmente a imunofluorescncia indirecta. A tcnica de imunofluorescncia pode originar resultados falsos negativos devido presena de anticorpos interferentes e resultados falsos positivos devido reactividade com outros antignios citoplasmticos no ribossmicos. A utilizao de um pptido sinttico altamente definido como antignio origina um ensaio sensvel, especfico e reprodutvel. A tcnica ELISA aplicada neste teste sensvel, especfica e objectiva. Pode ser convenientemente usada para testar grandes e pequenas quantidades de amostras.

Princpio do mtodo
O antignio Ribossoma P sinttico ligado aos poos de uma placa de micropoos de poliestireno, sob condies que vo preservar o antignio no seu estado nativo. Os controlos pr-diludos e o soro diludo dos doentes so adicionados aos diferentes poos, permitindo que quaisquer anticorpos Ribossoma P presentes se liguem ao antignio imobilizado. A amostra no ligada lavada e adiciona-se um conjugado IgG antihumano marcado a cada poo. Uma segunda incubao permite ao conjugado enzimtico ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoos. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas medida adicionando um substrato cromognico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poos do doente com a cor dos poos de controlo.

Reagentes
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Placa ELISA de micropoos de poliestireno, revestida com antignios purificados de Ribossoma P (12-1 x 8 poos), com suporte em embalagem de proteco com dessecantes Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de soluo tampo com conservantes e soro humano sem anticorpos humanos anti Ribossoma P, pr-diludo, 1,2 ml Positivo baixo Ribossoma P ELISA, 1 frasco de soluo tampo com conservantes e soro humano com anticorpos anti Ribossoma P, pr-diludo, 1,2 ml Positivo alto Ribossoma P ELISA, 1 frasco de soluo tampo com conservantes e soro humano com anticorpos anti Ribossoma P, pr-diludo, 1,2 ml Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor de rosa, contm soluo tampo salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml Soluo de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com soluo tampo salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instrues de diluio encontram-se na Seco Mtodo. Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco de cor azul com soluo tampo, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml Cromognio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml Soluo de paragem HRP, cido sulfrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml

Advertncias
1. ADVERTNCIA: Este produto contm um qumico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos
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4. 5. 6.

7. 8.

controlos e no conjugado, considerado como cancergeno no Estado da Califrnia. Todo o material de origem humana utilizado na preparao dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para mtodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausncia de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo baixo Ribossoma P ELISA, o Positivo alto Ribossoma P ELISA e o Controlo negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso.12 A azida de sdio utilizada como conservante. Este produto venenoso e pode ser txico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sdio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizaes formando azidas metlicas explosivas. Por esta razo, ao deitar fora os restos de reagentes necessrio deixar correr gua em quantidade abundante para evitar a formao destas substncias. O conjugado HRP contm um qumico diludo venenoso/corrosivo, que pode ser txico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrncia de queimaduras qumicas. O cromognio TMB contm um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar leses. A soluo de paragem HRP consiste numa soluo de cido sulfrico diludo. Evitar a exposio a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com cidos. O cido sulfrico venenoso e corrosivo e pode ser txico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrncia de queimaduras qumicas. Usar equipamento de proteco apropriado para trabalhar com os reagentes. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentaes ambientais nacionais e locais relativas eliminao de resduos.

Precaues
1. 2. 3. 4. Utilizar somente para diagnstico In Vitro. A substituio de componentes do dispositivo por outros que no pertenam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspirao insuficiente dos lquidos dos poos ELISA pode dar origem a impreciso e/ou a uma elevada interferncia de fundo. A adaptao, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de lquidos pode dar origem a diferenas nos resultados obtidos nos testes por tcnica manual. da responsabilidade de cada laboratrio garantir que o seu procedimento automtico d origem a resultados dentro dos limites aceitveis. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a preciso e a reprodutibilidade da tcnica de pipetagem, a eficcia da lavagem e aspirao dos poos das tiras ELISA, o fotmetro utilizado na leitura dos resultados e a durao das incubaes dos testes durante o ensaio. Deve ser dada ateno especial consistncia, necessria para obter resultados precisos e reprodutveis. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoos e dessecantes pode provocar a degradao do antignio e baixa preciso dos resultados. Absorvncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizaes do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado perodo de tempo. importante cumprir todas as recomendaes de preparao e manipulao do conjugado HRP para evitar estas ocorrncias. A contaminao qumica do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resduos dos agentes qumicos comuns em laboratrios, tais como a formalina, lixvia, etanol ou detergentes provocam a degradao do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos aps o uso de detergentes/desinfectantes qumicos.

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Precaues particulares de conservao

1. 2. 3. Conservar todos os reagentes a 2-8 C. No congelar. Os reagentes permanecem estveis at data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. As tiras dos micropoos revestidas com antignios que no forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8 C. O tampo de lavagem depois de diludo estvel durante uma semana a 2-8 C.

Colheita da amostra
Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adio de azida ou de outros conservantes s amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminao bacteriana, que sofreram tratamento trmico ou contendo partculas visveis no devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipmicos devem ser evitados. Aps a colheita, o soro deve ser separado do cogulo. O documento H18-A2 da NCCLS recomenda as seguintes condies de armazenamento para as amostras: 1) No armazenar as amostras temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste no for concludo num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8 C. 3) Se o teste no for concludo num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20 C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas.

Procedimento
Material fornecido
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1 1 1 1 1 1 1 1 1

Placa de micropoos Ribossoma P ELISA (12-1 x 8 poos), com suporte. 1,2 ml Controlo negativo ELISA, pr-diludo 1,2 ml Positivo baixo Ribossoma P ELISA, pr-diludo 1,2 ml Positivo alto Ribossoma P ELISA, pr-diludo 50 ml Diluente da amostra HRP 25 ml Soluo de lavagem HRP, 40x concentrado 10 ml Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana 10 ml Cromognio TMB 10 ml Soluo de paragem HRP, cido sulfrico 0,344 M

Material adicional necessrio mas no fornecido

Micropipetas de 5, 100, 200-300 e 500 l Pontas descartveis para as micropipetas Tubos de teste para diluies de amostras de doentes, volume de 4 ml gua destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para Soluo de lavagem HRP diluda Fotmetro para leitura da placa de micropoos, com capacidade de medio da densidade ptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda)

Mtodo
Antes de iniciar
1. 2. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se temperatura ambiente (20-26 C) e ser bem misturados. Diluir a soluo de lavagem HRP 1:40, adicionando o contedo do frasco da soluo de lavagem HRP a 975 ml de gua destilada ou desionizada. Se no for utilizada a placa toda durante este perodo, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de gua destilada ou desionizada por cada 16 poos utilizados. A soluo tampo diluda mantmse estvel durante uma semana a 2-8 C. Preparar uma diluio de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 l de amostra a 500 l de diluente da amostra HRP. As amostras diludas devem ser usadas num prazo de 8 horas aps a sua preparao. NO DILUIR o Positivo baixo Ribossoma P ELISA, o Positivo alto Ribossoma P ELISA e o Controlo negativo ELISA A determinao da presena ou ausncia de Ribossoma P utilizando unidades arbitrrias requer o uso de dois poos para cada um dos trs controlos, e um ou dois poos para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C). Coloque o nmero de tiras/micropoos necessrios no suporte. Guarde imediatamente as tiras que no foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposio ao vapor de gua. Adicione 100 l de Positivo baixo Ribossoma P ELISA, de Positivo alto Ribossoma P ELISA, de Controlo negativo ELISA, pr-diludos e das amostras diludas aos poos. Tape os poos e efectue, numa superfcie nivelada, a incubao durante 30 minutos temperatura ambiente. A incubao inicia-se aps a adio da ltima amostra. Lavagem: Aspire bem o contedo de cada poo. Adicione 200-300 l de soluo de lavagem HRP diluda a todos os poos e, em seguida, aspire. Repita esta sequncia mais duas vezes num total de trs lavagens. Depois da ltima lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer lquido residual. imprescindvel esvaziar completamente os poos aps cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequncia para a aspirao como aplicada na adio das amostras. Adicione 100 l do Conjugado HRP IgG a cada poo. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condies padro asspticas e boas prticas de laboratrio. Retire do frasco apenas a quantidade necessria para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAO MICROBIANA E/OU QUMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NO USADO NO FRASCO. Faa a incubao dos poos durante 30 minutos, como descrito no passo 2. Lavagem: Repita o passo 3. Adicione 100 l do cromognio TMB a cada poo e faa a incubao durante 30 min., no escuro e temperatura ambiente. Adicione 100 l de soluo de paragem HRP a cada poo. Mantenha a mesma sequncia e contagem de tempo na adio da soluo de paragem HRP, tal como efectuado para o cromognio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homognea nos poos. Determine a densidade ptica (DO) de cada poo a 450 nm num prazo de 1 hora aps a paragem da reaco. Se desejar uma leitura bicromtica, pode usar como referncia um comprimento de onda de 620 nm.

3.

4.

Tcnica
1.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

Controlo de qualidade
1. 2. 3. O Positivo baixo Ribossoma P ELISA, o Positivo alto Ribossoma P ELISA e o Controlo negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. Uma vez que o Positivo baixo Ribossoma P ELISA, o Positivo alto Ribossoma P ELISA e o Controlo negativo ELISA so pr-diludos, no controlam o procedimento associado diluio das amostras. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou
28

4.

nacionais ou de acordo com as disposies de organizaes acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20C. Para que os resultados dos testes possam ser considerados vlidos, devem ser cumpridos todos os critrios a seguir definidos. Se algum no for cumprido, o teste deve ser considerado invlido e o ensaio repetido. a. A absorvncia do Positivo alto Ribossoma P ELISA pr-diludo deve ser superior absorvncia do Positivo baixo Ribossoma P ELISA pr-diludo, que deve ser superior absorvncia do Controlo negativo ELISA pr-diludo. b. O Positivo alto Ribossoma P ELISA pr-diludo deve ter uma absorvncia superior a 1,0, enquanto que o Controlo negativo ELISA pr-diludo no pode ter uma absorvncia superior a 0,2. c. A absorvncia do Positivo baixo Ribossoma P ELISA deve ser mais do dobro da absorvncia do Controlo Negativo ELISA, ou superior a 0,25. d. O Controlo negativo ELISA e o Positivo alto Ribossoma P ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo alto Ribossoma P ELISA no consegue assegurar a preciso no ponto de deciso do teste. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A da NCCLS para obter instrues suplementares sobre as prticas do Controlo de Qualidade apropriadas.

Clculo dos resultados

Em primeiro lugar determinada a densidade ptica mdia (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ento ser calculada dividindo a DO mdia da amostra pela DO mdia do Positivo baixo Ribossoma P ELISA. O resultado multiplicado pelo nmero de unidades atribudo ao Positivo baixo Ribossoma P ELISA que se encontra no rtulo. Densidade ptica da amostra Valor da amostra = (unidades) DO do Positivo baixo Ribossome P ELISA x Positivo baixo Ribossoma P ELISA (unidades)

A relao entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes no linear. Apesar de o aumento ou a diminuio das concentraes de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuio da reactividade, a alterao no proporcional (ou seja, a duplicao da concentrao de anticorpos no duplica a reactividade). Se for necessria uma quantificao mais exacta dos anticorpos do doente, ser necessrio efectuar diluies em srie das amostras do doente, e a ltima diluio com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o ttulo de anticorpos do doente.

Interpretao dos resultados

O teste ELISA muito sensvel tcnica aplicada e capaz de detectar at pequenas diferenas em populaes de doentes. Os valores abaixo indicados so apenas valores sugeridos. Cada laboratrio deve estabelecer os seus prprios valores de referncia, baseados nas suas tcnicas, controlos, equipamentos e populao de doentes e em funo dos seus prprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode ser classificada de negativa, fracamente positiva, moderadamente positiva ou fortemente positiva, de acordo com a tabela seguinte. Negativa Fracamente Positiva Moderadamente positiva Fortemente positiva 1. 2. 3. Unidades <20 20 39 40 80 >80

Um resultado positivo indica a presena de anticorpos de Ribossoma P e sugere a possibilidade de Lpus Eritematoso Sistmico ou de outras doenas relacionadas com o tecido conjuntivo. Um resultado negativo indica ausncia de anticorpos Ribossoma P ou nveis abaixo do ponto de deciso do ensaio. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratrio devem incluir a declarao: Os seguintes resultados foram obtidos com INOVA QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA. Valores de Ribossoma P atravs de mtodos de ensaio de outros fabricantes no podem ser comparados. A magnitude dos nveis de IgG descritos no pode ser correlacionada com um ttulo final.

Limitaes do mtodo
1. 2. 3. 4. 5. 6. A presena de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente pode causar um aumento do nvel de ligao no-especfica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. Nem todos os doentes com SLE so Ribossoma P positivos Nem todos os doentes com SLE com problemas neurolgicos so positivos para os anticorpos anti ribossoma P. Foi referido que os anticorpos anti Ribossoma P aumentam e diminuem durante os surtos e remisses, e que os ttulos so afectados pela teraputica. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as concluses clnicas e outros testes serolgicos. As caractersticas de desempenho do ensaio no foram determinadas para outras matrizes alm do soro.

Valores esperados
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A capacidade do teste QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA para detectar anticorpos Ribossoma P foi avaliada atravs da comparao com um teste de imunofluorescncia, disponvel no mercado, da INOVA Diagnostics. Os resultados do teste de imunofluorescncia eram considerados positivos se fosse observada uma fluorescncia granular fina citoplasmtica no substrato de clulas HEp-2, e negativos caso no fosse observada qualquer fluorescncia.

Intervalo de valores normais

Foram testados oitenta e sete amostras normais. A populao normal era aproximadamente 90% feminina com idades compreendidas entre os 18 e os 69 anos. As 87 amostras foram completamente negativas no ensaio QUANTA Lite Ribosome P. A amostra mais forte apresentou 10 unidades de actividade, tendo a maioria das outras apresentado entre 2 a 6 unidades. O ponto de deciso de 20 unidades.

Sensibilidade e Especificidade Relativa

As amostras foram testadas num laboratrio de referncia, quanto presena de anticorpos anti ribossomas atravs do QUANTA Lite Ribosome P ELISA e por meio de imunofluorescncia nas clulas HEp-2. Os resultados so apresentados em baixo. ELISA + 11 2* 0 20

+ HEp-2 -

Sensibilidade Relativa Especificidade Relativa Eficincia Relativa

84,6% 100% 93,9%

*Estas duas amostras foram negativas no western blot

Sensibilidade e Especificidade Clnica

Grupo de doentes Normais Anticorpos citoplasmticos no-ribossmico SLE SLE (sintomas neurolgicos) SLE (sem sintomas neurolgicos) SLE (sintomas neurolgicos, ribossoma positivo por meio de HEp-2 e/ou western blot) N. 122 56 75 38 19 57 N. de Ribossoma P-positivos (%) 0 0 15 (20,0%) 10 (26,3%) 0 57 (100%)

Reactividade cruzada
Foram testados vrios soros com ttulos elevados de autoanticorpos. Estas amostras incluram as seguintes especificidades: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, msculo liso (ASMA), mitocndria M-2 (AMA) bem como a protease-3 serina (PR-3), mieloperoxidase (MPO), e gliadina Todas estas amostras foram negativas no QUANTA Lite Ribosome P ELISA. A amostra mais forte apresentou um valor de 6 unidades, tendo as restantes apresentado valores situados entre 2-3 unidades. O ponto de deciso deste teste de 20 unidades.

Preciso e Reprodutibilidade
A preciso e a reprodutibilidade do ensaio foram medidas testando seis rplicas de cada tipo de amostra negativa, fracamente positiva e fortemente positiva, em quatro ensaios distintos. A mdia da amostra fortemente positiva foi de 113,7; da fracamente positiva foi de 25,1 e da negativa de 2,72. O desvio padro e o coeficiente de variao para cada amostra encontram-se resumidos na tabela que se segue. Negativa DP CV 0,42 15,2% 0,14 5,1% 0,43 15,6% Fortemente positiva DP CV 5,09 4,5% 1,84 1,6% 5,40 4,7% Fracamente Positiva DP CV 0,83 3,3% 0,81 3,2% 0,76 3,0%

Total Dentro do teste Entre testes

30

QUANTA LiteTM Ribosome P

In Vitro
CLIA :

708600

QUANTA LiteTM Ribosome P (ELISA) IgG . (SLE) .

() .1 SLE ( SLE)2 . . SLE Sm dsDNA .3 HEp-2, .4 12% SLE5,6 90% .7 , .7 -- 3 , 0, 1 2, 60S . 8 - 22 .9,10 3 .10 22 C- ELISA 9,10 11 . (Ouchterlony) , RIA . . , . ELISA , . .

. - , . - IgG . IgG , . - , . .

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. ELISA Ribosome P (12-1 x 8 ), ELISA Negative (1 1.2ml ) Ribosome P ELISA Low Positive ( ), 1 , , 1.2ml Ribosome P ELISA High Positive ( ), 1 , , 1.2ml HRP Sample Diluent, 1 , Tris , Tween 20, , 50mL HRP Wash Concentrate, 1 40x , Tris Tween 20, 25mL. . HRP Conjugate IgG (), - IgG, 1 , , , 10mL
31

8. 9.

TMB Chromogen, 1 , 10mL HRP Stop Soulution, 0,344M , 1 , 10mL

1. 2. : (0.02% chloramphenicol) , , . HIV, HbsAg, HCV FDA. HIV, HBV, HCV. .12 . . . , . / . A . TMB . , , . (Stop Solution) , . . . . , .

3.

4. 5. 6. 7. 8.

1. 2. 3. 4. 5. In Vitro. . . , . . : , , , , , . . . ( ) . . . . , , , . . 2-8C. . . , , 2-8C. 2 - 8C.

6. 7. 8. 9.

1. 2. 3.

. . , . . , . NCCLS Document H18-A2 : 8 . ,

32

 (2 8C) 48 . , 20C. .

1 1 1 1 1 1 1 1 1 Ribosome P ELISA (12-1x8 ), 1.2ml ELISA Negative ( ) 1.2ml Ribosome P Low ( ) 1.2ml Ribosome P High ( ) 50ml HRP Sample Diluent, HRP 25ml HRP Wash Concentrate, HRP , 40x 10ml HRP Conjugate, HRP IgG (), 10ml TMB Chromogen, TMB 10ml HRP Stop Solution, HRP , 0.344M

5, 100, 200 300 500 L 4 ml 1L HRP Wash Concentrate ( ) 450 620 nm

1. 2. (20 26C) . HRP 1:40 975 ml . 2 ml Wash 78 ml 16 . 2-8C. 1:101 5 l 500l . 8 . . , . . (2026C) . , . 100 l , , , . 30 . . : . 200-300L HRP . , . . . . 100 l HRP IgG . . . / , . 30 , 2. : 3. 100 l TMB . 30 . 100L (HRP Stop Solution) . (HRP Stop Solution) TMB. , . , 450 nm 620 nm .

3. 4.

1.

2.

3.

4.

5. 6. 7.

8.

33

1. 2. 3.

4.

. . . , , . \ . -20C. . . . (high positive) (low positive) . . (high positive) 1.0 0.2. . (low positive) 0.25. . . . . C24-A to NCCLS .

(O.A.) . Ribosome P ELISA Low, Ribosome P ELISA Low. Ribosome P ELISA Low (units) . () .A. = X O.A. Ribosome P Ribosome P o ()

- . , (. ). , .

ELISA . . , , ... , , . 1. 2. 3. <20 20-39 40-80 80

(SLE) . . INOVA QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA. . . IgG .

1. 2. - . (SLE) .
34

3. 4. 5. 6.

(SLE) . . . .

QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA INOVA Diagnostics. HEp-2 .

- . 90% 18 69 . 87 QUANTA LiteTM Ribosome P. 10 2 6 . 20 .

QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA HEp-2. . ELISA + 11 2* 0 20

+ HEp-2 -

84.6% 100% 93.9%

* western blot.

122 - 56 SLE 75 SLE ( ) 38 SLE (- ) 19 SLE ( , 57 HEp-2 \ western 0 0 15 10 0 57 (%)

(20.0%) (26.3%) (100%)

. : Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, smooth muscle ( ) (ASMA), M-2 (AMA), -3 (PR-3), - (MPO) . QUANTA LiteTM Ribosome P ELISA. 6 2-3 . 20 .

6 , , . 113.7, 25.1 2.72. . SD CV 0.42 15.2% 0.14 5.1% 0.43 15.6% SD CV 5.09 4.5% 1.84 1.6% 5.40 4.7% SD CV 0.83 3.3% 0.81 3.2% 0.76 3.0%

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References Referenzen Bibliografa Referencias Rfrences Referncias

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. Yasuma M, et al.: Clinical Significance of IgG Sm Antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. J Rheumatology 17: 469, 1990. Miyachi K and Tan EM: Antibodies reacting with ribosomal ribonucleoproteins in connective tissue disease. Arthritis and Rheumatism 22: 87, 1979. Elkon KB, et al.: Lupus autoantibodies target ribosomal P proteins. J Exp Med 162: 459, 1985. Bonfa E and Elkon KB: Clinical and serologic associations of the antiribosomal P protein antibody. Arthritis and Rheumatism 29: 981, 1986. Bonfa E, et al.: Association between lupus psychosis and anti-ribosomal P protein antibodies. N Engl J Med 317: 265, 1987. Arnett FC, et al.: Ribosomal P autoantibodies in systemic lupus erythematosus: Frequencies in different ethnic groups and clinical and immunogenetic associations. Arthritis and Rheumatism 39: 1833-1839, 1996. Isshi K and Hirohata S: Association of anti-ribosomal P protein antibodies with neuropsychotic systemic lupus erythematosus. Arhtritis and Rheumatism 39: 1483-1490, 1996. Elkon KB, et al.: Identification and chemical synthesis of a ribosomal protein antigenic determinant in systemic lupus erythematosus. Proc Natl Acad Sci 83: 7419-7423, 1986. Yoshio T, et al.: Quantitation of antiribosomal P0 protein antibodies by ELISA with recombinant P0 fusion protein and their association with central nervous system disease in systemic lupus erythematosus. J Rheumatology 22: 1681-1687, 1995. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395).

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