Doc. dr. sc.

Erim Bei
Zavod za biofiziku Farmaceutskobiokemijskog fakulteta Sveuilita u Zagrebu

Spektroskopija elektronske paramagnetske rezonancije (EPR)

Zagreb, 2010.

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

SADRAJ

Sadraj 1. MAGNETSKA SVOJSTVA ELEKTRONA 1.1 Orbitalno gibanje elektrona oko jezgre 1.2 Spin elektrona 1.3 Ukupni moment koliine gibanja atoma 2. TVARI U MAGNETSKOM POLJU 3. SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE 3.1 Osnovna naela EPR spektroskopije 3.2 EPR spektrometar 3.3 Parametri EPR spektra 3.3.1 gvrijednost 3.3.2 Intenzitet rezonantnih linija 3.3.3 irina rezonantnih linija 3.3.4 Hiperfino cijepanje rezonantnih linija 4. POMONE TEHNIKE EPR SPEKTROSKOPIJE 4.1 Metoda spinskih zamki 4.2 Metoda spinskih oznaka 4.3 EPR oksometrija 5. PRIMJENA EPR SPEKTROSKOPIJE 6. PITANJA Literatura

1 2 2 4 5 7 8 8 9 11 11 11 11 12 15 15 16 17 18 19 23

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

1. Magnetska svojstva elektrona

1.1 Orbitalno gibanje elektrona oko jezgre
Elektron koji se giba oko jezgre ini zatvorenu strujnu petlju odreenog magnetskog r momenta L . Ovaj magnetski moment povezan s tzv. orbitalnim gibanjem elektrona oko jezgre dan je izrazom

L = ili u vektorskom obliku

e L, 2 me

(1)

v e v L = L,

2 me

(2)

r gdje je L orbitalni moment koliine gibanja elektrona. Predznak je negativan jer je smjer r struje suprotan smjeru gibanja elektrona. Slijedi da su orbitalni magnetski moment L i prir padni magnetski moment L suprotnih smjerova, kao to je to prikazano slikom 1.

r L
e
r L

r Orbitalni magnetski moment elektrona L r i pridrueni magnetski moment L .

SLIKA 1.

Konstanta razmjernosti u jednadbi (1) (omjer L / L) zove se giromagnetski omjer i za orbitalno gibanje elektrona iznosi e / 2 me. Iako je izraz (1) dobiven upotrebom zakona klar sine fizike, on vrijedi i u kvantnoj fizici za bilo koje gibanje momenta koliine gibanja L . Moe se pokazati da je iznos orbitalnog momenta koliine gibanja kvantiziran na nain

L=

l ( l + 1)

h , 2

(3)

gdje je h Planckova konstanta. Uvrtavanjem izraza (3) u izraz (1) dobiva se L = gdje je

e 2 me
B =

l ( l + 1)

h = B 2

l ( l + 1) ,

(4)

eh J = 9,26 10 24 T 4 me

(5)

Bohrov magneton. Bohrov magneton je zapravo orbitalni moment koliine gibanja elektrona koji krui oko protona po Bohrovoj krunici. Svaka estica rezultantnog magnetskog momenta razliitog od nitice naziva se magnetski dipol. Energija magnetskog dipola koji se nalazi u vanjskom magnetskom polju r indukcije B dana je izrazom

r r EB = L B .

(6)

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Dakle, s obzirom da elektron koji se giba oko jezgre posjeduje odreeni magnetski moment (tj. ponaa se kao magnetski dipol), u vanjskom e se magnetskom polju energija atoma uveati za EB. Dodatna energija EB kao funkcija orbitalnog momenta koliine gibanja dana je izrazom

r r EB = L B =

e r v L B . 2 me

(7)

Za vanjsko magnetsko polje u smjeru osi z ova je dodatna energija kvantizirana s obzirom na tu os na nain

EB =

e B Lz , 2 me

(8)

r gdje je Lz projekcija vektora L na smjer osi z (vidi sliku 2).

r Projekcija Lz vektora L u smjeru osi z u vektorskom modelu atoma.

SLIKA 2.

Prema klasinoj fizici orbitalni bi moment koliine gibanja mogao poprimiti bilo koju vrijednost (projekciju Lz) od L do + L, dok je u kvantnoj je fizici ova vrijednost kvantizirana, tj.

L z = ml

h , 2

(9)

gdje je ml magnetski kvantni broj. Za odreeni l magnetski kvantni broj moe poprimiti samo 2 l + 1 cjelobrojnih vrijednosti izmeu l i + l, tj.

ml = 0, 1, 2, ..., l .

(10)

Najvea doputena vrijednost ml je l, pa je najvea doputena projekcija orbitalnog momenta h koliine gibanja L z = l. 2 Slikom 2 prikazan je orbitalni moment koliine gibanja atoma kao vektor iznoh koji precesira oko osi z u smjeru izvodnice stoca koja s osi z tvori kut . Kut sa l ( l + 1) 2 je kvantiziran i ovisi o projekciji Lz, odnosno o orbitalnom i magnetskom kvantnom broju l i ml. Slikom 3 prikazane su tri mogue orijentacije vektora orbitalnog momenta koliine gibanja za l = 1 i ml = 1, 0, 1 ( = 135o; 90o; 45o), kao i za l = 2 i ml = 2, 1, 0, 1, 2 ( = 150o; 120o; 90o; 60o; 30o).

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

SLIKA 3.
Mogue orijentacije vektora orbitalnog momenta koliine gibanja L za l = 1 i l = 2 u vektorskom modelu atoma.

1.2 Spin elektrona

Osim orbitalnog momenta koliine gibanja, eksperimenti su pokazali da elektron posjeduje i vlastiti moment koliine gibanja, spin. U zornoj predodbi elektron se zamilja kao kuglica koja se vrti oko svoje osi i oko jezgre, slino gibanju Zemlje oko svoje osi i oko Sunca. U ovoj naivnoj slici lako se predoava svojstvo spina koje nastaje zbog vrtnje elektrona oko svoje osi. Ovakva bi vrtnja uzrokovala i vlastiti (spinski) moment koliine gibanja r elektrona S . Ipak, treba uvijek imati na umu da je ova predodba spina samo naa zorna slika spin je unutarnje svojstvo elektrona koje se ne moe zorno predoiti. Iznos spina s elektrona, protona i neutrona je 1/2. estice spina 1/2 nazivaju se fermioni. Osim fermiona, postoje i estice spina 0 (bozoni) i 1 (fotoni). Slino kao i orbitalni moment koliine gibanja i spinski moment koliine gibanja kvantnih estica odreen je spinskim kvantnim brojem mS. S obzirom da je spinski moment koliine gibanja elektrona kvantizirana veliina i pripadni e magnetski moment elektrona koji nastaje zbog njegovog spina biti kvantiziran. Razmotrimo kvantizaciju spina elektrona du osi z u vektorskom modelu atoma. Projekcija Sz vektora spinskog momenta koliine gibanja elektrona kvantizirana je du osi z na nain

S z = mS

h . 2

(11)

Spinski kvantni broj mS moe poprimiti vrijednosti od S do + S (za sluaj elektrona vrijednosti 1/2 i 1/2), pa u vanjskom magnetskom polju projekcija Sz moe poprimiti samo dvije 1 h 1 h i (slika 4). vrijednosti: 2 2 2 2 Iznos vektora spinskog momenta koliine gibanja elektrona dan je izrazom

S=

s (s + 1)

h = 2

1 1 h 3 h . = + 1 2 2 2 2 2

(12)

Pritom je uvaena injenica da je spin s elektrona 1/2. Eksperimenti su pokazali sljedeu por vezanost izmeu spinskog magnetskog momenta elektrona S i spinskog momenta koliine r gibanja S : v e v e v S= S = 2 S. (13)

2 me

me

r Uvrtavanjem izraza (12) u izraz (13) za iznos vektora S dobiva se

S =

e me

s (s + 1)

h = 2 B 2 4

s (s + 1) .

(14)

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Kao to se vidi iz izraza (4) i (14), giromagnetski omjer dvaput je vei za spinsko nego za orbitalno gibanje elektrona. Vlastita "rotacija" elektrona (spin) dvaput je efektnija u magnetskim pojavama nego orbitalno gibanje elektrona.

SLIKA 4.
Mogue orijentacije vektora spinskog momenta koliine gibanja u vektorskom modelu atoma.

1.3 Ukupni moment koliine gibanja atoma

orbitalni L i spinski S moment koliine gibanja. Stanje svakog atoma odreeno je kvantnim brojevima n, l, ml i mS. Atomi se, meutim (osim vodikova), sastoje od vie elektrona. Elektroni u atomu meusobno meudjeluju, kao i s jezgrom, tako da energiju i moment koliine gibanja atoma rtreba razmatrati kao cjeline. Posebno je vaan ukupni moment koliine gibanja atoma J koji je rezultat orbitalnog i spinskog momenta koliine gibanja svih elektrona u atomu. Iznos J i projekcija Jz ukupnog momenta koliine gibanja atoma kvantizirani su du osi z na nain

Kao to je to rrazmotreno u prethodnom poglavlju, svaki elektron u atomu posjeduje r

J=
odnosno

j ( j + 1)

h , 2

(15)

Jz = m j

h , 2

(16)

gdje kvantni broj j moe poprimiti pozitivne vrijednosti l + s , l + s 1 , K, l s , a kvantni

broj mj vrijednosti m j = 0, 1, 2, ..., j . Ovi su izrazi analogni izrazima (3) i (9) za orbitalni r moment koliine gibanja L . Tako je npr. za l = 0 , j = 1/2 za elektron. Za l 0 , kvantni broj j 1 1 za elektron moe poprimiti dvije vrijednosti, j = l + i j = l . 2 2 Obino se orbitalni momenti svih elektrona u atomu zbrajaju u ukupni orbitalni moment koliine gibanja

r r Luk = Li .
i

(17)

Slino se ukupni spin atoma dobiva kao zbroj spinskih momenata koliine gibanja svih elektrona u atomu

r r Suk = Si .
i

(18)

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

r Ukupni moment koliine gibanja atoma J tada je jednak

r r r J = Luk + Suk .

(19)

Ovo je tzv. RussellSaundersovo vezanje momenata koliine gibanja elektrona. Meutim, mogue je i drukije vezanje momenata koliine gibanja elektrona u atomu u ukupni moment, tzv. jjvezanje. Ovakvo je vezanje openito prisutno u nekih teih atoma. r r Za svaki se elektron u takvom atomu zbraja njegov orbitalni moment Li i spinski moment Si r r r r u ukupni moment koliine gibanja elektrona Ji . Pritom vrijedi Ji = Li + Si . U jjvezanju mor ment koliine gibanja atoma jednak je zbroju ukupnih momenata koliine gibanja elektrona Ji

r r J = Ji .
i

(20)

U ovim je atomima meudjelovanje spinskog i orbitalnog momenta vrlo jako, pa je stanje svakog elektrona odreeno kvantnim brojevima n, l, ml i mj umjesto n, l, ml i mS, kao to je to sluaj u prvom nainu vezanja. U kvantnoj se fizici pokazuje da se spin elektrona u odnosu na orbitalni moment koliine gibanja moe orijentirati samo na dva naina: paralelno i antiparalelno. Spin se, dakle, zbraja ili oduzima od orbitalnog momenta koliine gibanja. Giromagnetski omjer (g) ukupnog magnetskog momenta J i ukupnog momenta koliine gibanja atoma J ovisi o L, S i J i nije kolinearan s J (ne lei na istom pravcu kao J), kao to je to bio sluaj za orbitalni i spinski magnetski moment koliine gibanja. U kvantnoj se fizici pokazuje da je

J = B g

j ( j + 1) = m j g B ,

(21)

gdje je g tzv. Landefaktor ili gvrijednost iznosa

g =1+

j ( j + 1) + s (s + 1) l ( l + 1) . 2 j ( j + 1)

(22)

Za s = 0 , j = l, pa je g = 1. Ako je l = 0 , j = s, pa je g = 2. Ipak, gvrijednost, koja je uvedena zbog korekcije (za faktor 2) izmeu vrijednosti orbitalnog i spinskog magnetskog momenta elektrona (izrazi (4) i (14)), odstupa od vrijednosti 2 zbog relativistikih efekata koji smanjuju vrijednost orbitalnog magnetskog momenta. Iz zakona relativistike kvantne fizike slijedi da je gvrijednost slobodnog elektrona neto vea od 2 i iznosi 2,0023.

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

2. Tvari u magnetskom polju

Gibanje elektrona po zatvorenoj krunoj putanji oko atomske jezgre (orbitalno gibanje) predstavlja elektrinu struju. Svaka kruna struja uzrokuje magnetska svojstva sistema koja se mogu opisati magnetskim momentom. Upravo odavde proizlaze istaknuta magnetska svojstva nekih atoma ili iona. Valja napomenuti da atomi s vie elektrona ne moraju posjedovati rezultantni magnetski moment. Ovo se zorno moe predoiti da dva sparena elektrona u istoj orbitali krue u suprotnim smjerovima, pa ne daju rezultantnu krunu struju. Zato istaknuta magnetska svojstva pokazuju samo ioni ili atomi s nesparenim elektronima. To se posebno dobro uoava kod iona prijelaznih elemenata. Ioni ili atomi koji imaju rezultantni magnetski moment (magnetski dipoli) zovu se paramagnetski, a tvari koje sadre takve ione nazivaju se paramagnetskim tvarima (paramagnetima). Kada se paramagnetska tvar nalazi u vanjskom magnetskom polju, ioni ili atomi te tvari preferirano se orijentiraju du smjera magnetskog polja jer je u ovoj orijentaciji potencijalna energija dipola minimalna. Iako nee ba svi magnetski dipoli biti orijentirani u smjeru magnetskog polja (termiko gibanje raspruje dipole u sve mogue orijentacije), postojat e preferirana orijentacija dipola du smjera vanjskog magnetskog polja. Ovako organizirano makroskopsko mnotvo dipola mijenja magnetsko polje u paramagnetskoj tvari i prostoru oko r nje na nain da magnetska indukcija u tvari B postaje vea od magnetske indukcije na istom r mjestu kad tu ne bi bilo tvari Bo , tj.

r v B = r Bo ,

(23)

gdje je r relativna permeabilnost tvari. Za paramagnetske je tvari r > 1 . Postoje tvari vrlo velike relativne permeabilnosti (oko 1000). To su feromagnetske tvari ili feromagneti (eljezo, kobalt, nikal i niz slitina ovih triju elemenata). U feromagnetskim je tvarima meudjelovanje paramagnetskih atoma toliko jako da su s njima povezani magnetski dipoli u cijelim makroskopskim domenama tvari strogo orijentirani u istom smjeru. Takvo makroskopsko mnotvo malih atomskih dipola ini veliki makroskopski magnetski moment. Preferirana orijentacija dipola ostaje manje vie sauvana u feromagnetskim tvarima i onda kada se tvar vie ne nalazi u vanjskom magnetskom polju. Tada je sama tvar izvor magnetskog polja. Ovo je magnetsko polje to ga stvaraju stalni magneti i na taj se nain objanjava magnetizam ipkastog magneta. Osim paramagneta i feromagneta postoji i trea vrsta tvari koje su praktino neosjetljive na vanjsko magnetsko polje. To su dijamagnetske tvari (dijamagneti). U tim je tvarima magnetska indukcija manja nego u prostoru bez tvari, tj. za dijamagnetske je tvari r < 1 . Valja spomenuti da je veina tvari u prirodi neosjetljiva na magnetsko polje, tj. veina tvari u prirodi su dijamagneti.

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

3. Spektroskopija elektronske paramagnetske rezonancije (EPR)

3.1 Osnovna naela EPR spektroskopije
Spektroskopija elektronske paramagnetske rezonancije (EPR) metoda je kojom se detektira apsorpcija energije mikrovalnog zraenja kada se paramagnetski sistem nalazi u vanjskom magnetskom polju. Ova se spektroskopska metoda zasniva na meudjelovanju spinskog magnetskog momenta nesparenog elektrona s vanjskim magnetskim poljem. Nespareni elektron posjeduje rezultantni magnetski moment koji je s njegovim spinom povezan prema izrazu

r r = B g S ,

(24)

gdje je B Bohrov magneton iznosa 9,261024 J/T, a g je gvrijednost koja za slobodni elektron iznosi 2,0023. Rjeavanjem vremenski nezavisne Schrdingerove jednadbe dobiva se energija meudjelovanja magnetskog dipola momenta s vanjskim magnetskim poljem indukcije B

E = ms g B B ,

(25)

gdje je ms spinski kvantni broj koji poprima vrijednosti od S do + S. Spin elektrona iznosi 1/2, pa postoje dvije mogue orijentacije elektronskih spinova u odnosu na smjer vanjskog magnetskog polja: onih koji su paralelni magnetskom polju (elektroni) i onih koji su antiparalelni magnetskom polju (elektroni). Pripadne su energije ovih elektrona

E = 1 g B B , 2 E = 1 g B B . 2

(26)

Ovim je izrazom opisan Zeemanov efekt, odnosno pojava razdvajanja energijskih razina elektrona i spina ( i elektrona) paramagnetskog sistema kada se on nalazi u vanjskom magnetskom polju. Razdvajanje energijskih razina razmjerno je indukciji vanjskog magnetskog polja B i gvrijednosti elektrona. Pritom je energija elektrona vea od energije elektrona. Zeemanov je efekt shematski prikazan slikom 5.
mS = 1 2

B=0

h = g B B

h = g B B

mS = 1 2

SLIKA 5.
Zeemanov efekt razdvajanje energijskih razina paramagnetskog sistema u vanjskom magnetskom polju.

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Razlika energija izmeu stanja i elektrona je

E

= E E = g B B .

(27)

Osnovna zamisao EPR spektroskopije jest da se paramagnetskom sistemu dovede energija promjenjivog magnetskog polja koja je upravo jednaka razlici energijskih razina i elektrona. Energija koja se dovodi paramagnetskom sistemu u EPR spektroskopiji jest energija elektromagnetskog zraenja mikrovalnog podruja jer je pripadna frekvencija ovoga zraenja takva da vrijedi uvjet rezonancije, tj.
E

= h = g B B .

(28)

Dakle, kada je ispunjen uvjet rezonancije, dolazit e do prijelaza elektrona izmeu energijskih razina elektrona i spina. Vjerojatnost ovakvih prijelaza jednaka je u oba smjera, tj. apsorpcija i emisija energije izazvane su s jednakom vjerojatnou. Prema tomu, apsorpcija energije bit e opaena samo u sluaju kada je naseljenost nieg energijskog stanja elektrona vea od naseljenosti vieg energijskog stanja elektrona. Zbog dovoenja energije mikrovalnog zraenja poetna se razlika u naseljenosti razina eksponencijalno smanjuje i s vremenom bi se naseljenosti razina izjednaile, to bi uzrokovalo prestanak apsorpcije energije i vie se ne bi opaao EPR signal. No, apsorpcija energije trajna je pojava to ukazuje na injenicu da postoji jo neki procesi koji odravaju razliku naseljenosti dva spinska stanja. Jedan od njih je proces relaksacije spinreetka koji predstavlja toplinsku izmjenu energije spinskog sistema s kristalnom reetkom ili molekulskim skeletom. Ovaj proces uzrokuje vraanje elektrona iz pobuenog stanja u osnovno stanje, pri emu se emitirana energija u obliku topline prenosi u energiju kristalne reetke. Relaksacija spinreetka opisuje se karakteristinim spinreetka relaksacijskim vremenom T1, koje se definira kao vrijeme potrebno da se uspostavi termika ravnotea spinskog sistema i njegove okoline. To je vrijeme u kojem se naseljenost vie razine smanji na svoj eti dio. Osim relaksacije spinreetka, postoji i drugi mehanizam relaksacije tzv. relaksacija spinspin. Ona se opisuje spinspin relaksacijskim vremenom T2, a posljedica je meudjelovanja elektronskih spinova u kojem dva elektrona istovremeno izmijene svoja spinska stanja pri emu naseljenost razina ostaje jednaka. U ovom procesu ne dolazi do prijenosa energije izvan spinskog sistema. U sluaju da je pobudno mikrovalno zraenje tolike jakosti da je u stanju nadvladati mehanizme spinskih relaksacija, naseljenosti se razina elektrona i spina vrlo brzo izjednaavaju, to uzrokuje pojavu zasienja (saturacije) paramagnetskog sistema jer on vie nije u stanju apsorbirati energiju.

3.2 EPR spektrometar

Iz dosadanjeg je razmatranja vidljivo da je za detekciju elektronske paramagnetske rezonancije potrebno statiko magnetsko polje indukcije B i promjenjivo elektromagnetsko polje mikrovalnog zraenja indukcije B1 i mikrovalne frekvencije . Ovo se promjenjivo magnetsko polje dovodi okomito na statiko polje, a izvor mu je ili klistron ili gundioda. Openito, uvjet rezonancije (28) vrijedi za bilo koju frekvenciju, no postoji nekoliko imbenika koji uvjetuju ogranienje izbora frekvencije. Osnovni je zahtjev bilo kojeg spektrometra to vea osjetljivost, a ona raste s kvadratom frekvencije. Ovaj je rast ogranien djelovanjem tri imbenika. Prvi je od njih veliina uzorka pri velikim frekvencijama mikrovalnog polja (40 GHz), za ispunjavanje uvjeta rezonancije (28) dimenzija rezonantne upljine treba iznositi svega nekoliko milimetara, pa je volumen uzorka ogranien na vrijednost oko 0,02 cm3, to oteava postupak mjerenja i manipulaciju s uzorkom. Drugi je imbenik injenica da velika frekvencija zahtijeva i veliku vrijednost indukcije magnetskog polja, koje mora biti homogeno u podruju gdje se nalazi uzorak, to je vrlo teko postii uobiajenim magnetima. I ko-

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

nano, trei ograniavajui imbenik jest injenica da porast frekvencije uzrokuje smanjenje osjetljivosti detekcije signala uzoraka vodenih otopina, to je posljedica njihove velike dielektrine apsorpcije. Zbog navedenih razloga EPR spektrometri obino rade pri frekvenciji 9,5 GHz (Xpodruje frekvencija) ili 35 GHz (Qpodruje frekvencija). Frekvencija izvora mikrovalnog zraenja, koji je valovodom povezan s rezonantnom upljinom, ugaa se na rezonantnu frekvenciju rezonantne upljine, ime se u njoj uspostavlja sustav stojnih valova, tj. u rezonantnoj upljini tada postoje mjesta trbuha i vorova magnetske komponente elektromagnetskog vala mikrovalnog podruja. Uzorak za mjerenje stavlja se u rezonantnu upljinu izmeu polova elektromagneta na mjesto maksimalne gustoe silnica promjenljivog magnetskog polja. Na taj se nain postie maksimalna apsorpcija elektromagnetskog zraenja. Oblik rezonantne upljine je takav da se smjer promjenjivog magnetskog polja moe lako postaviti okomito na smjer vanjskog statikog magnetskog polja. Odziv se rezonantnog sistema obino mjeri faktorom dobrote Q koji je razmjeran omjeru maksimalne pohranjene energije u rezonantnoj upljini i energije izgubljene pri jednom titraju promjenjivog elektromagnetskog polja. Slijedi da je faktor dobrote Q vei za vee rezonantne upljine i za manje gubitke uzrokovane parazitskim strujama du stijenki rezonantne upljine. Iznos se vanjskog magnetskog polja moe kontrolirano linearno mijenjati, to je vrlo teko postii s frekvencijom mikrovalnog zraenja. Stoga se uvjet rezonancije (28) u EPR spektroskopiji openito postie mijenjanjem iznosa indukcije vanjskog magnetskog polja dok se frekvencija mikrovalnog zraenja za vrijeme mjerenja odrava konstantnom. Mijenjanjem indukcije magnetskog polja mijenja se i iznos Zeemanovog cijepanja prema izrazu (27). Kada iznos Zeemanovog cijepanja dosegne vrijednost energije mikrovalnog zraenja, dolazi do promjene naseljenosti i elektrona, to se oituje kroz intenzivnu apsorpciju mikrovalnog zraenja. Energija mikrovalnog zraenja ulazi u rezonantnu upljinu kroz otvor na stijenci ija se veliina moe mijenjati vijkom (iris). U sistemu rezonantne upljine nalazi se i cirkulator koji usmjerava ulaznu energiju u upljinu, a izlaznu energiju prema detektoru, koja se detektira elektronikim putem. Detektor je kristalna dioda koja je takve karakteristike da najpovoljnije radi kada njome tee struja jakosti 0,25 mA. Signal, koji je mjera apsorbirane snage u uzorku, moe se znatno pojaati primjenom modulacijskog sistema detekcije ime se znatno smanjuje um koji je superponiran na izlazni signal. Na ovaj se nain detekcija signala obavlja samo pri jednoj frekvenciji, pa je prisutan i um samo pri toj frekvenciji. Obino se koristi modulacija iznosa 100 kHz jer je termiki um kristalnog detektora znatno manji pri toj nego pri manjim frekvencijama, a nije bitno vei pri veim, eksperimentalno tee ostvarivim frekvencijama. Izlazni signal iz kristalnog detektora dolazi u uskopojasno pojaalo koje pojaava samo visokofrekvencijske komponente. Signal se dalje dovodi u fazni detektor, u koji dolazi i referentni signal frekvencije 100 kHz iz oscilatora. Na izlazu detektora dobiva se signal koji ovisi o odnosu faza ovih dvaju izvora. Na taj se nain dobiva uobiajeni EPR spektar koji je zbog naina detekcije oblika prve derivacije apsorpcijske krivulje u ovisnosti o indukciji vanjskog magnetskog polja. Signal se konano upuuje na pisa, osciloskop ili raunalo.

SLIKA 6.
EPR spektrometar ELEXSYS E500 u Laboratoriju za slobodne radikale Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta.

10

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

3.3 Parametri EPR spektra

Postoje etiri glavna parametra koji obiljeavaju EPR spektar. To su gvrijednost, intenzitet, irina i hiperfino cijepanje rezonantne linije.

3.3.1 gvrijednost
Poloaj rezonantne linije odreuje se prema gvrijednosti. Ta je vrijednost mjera lokalnog magnetskog polja koje "osjea" elektron, a moe se izraunati iz uvjeta rezonancije

g=

h , B B

(29)

gdje je B indukcija vanjskog magnetskog polja pri kojem je ispunjen uvjet rezonancije. Odreivanje gvrijednosti pomae pri identifikaciji paramagnetskog sistema koji uzrokuje EPR signal jer je njezina vrijednost karakteristina za pojedine paramagnetske sisteme. Naime, teorijska gvrijednost za slobodni elektron iznosi 2,0023 i posljedica je samo njegovog spinskog momenta koliine gibanja (uzrokovanog vrtnjom elektrona oko vlastite osi u jednom ili drugom smjeru). Za razliku od slobodnog elektrona, nespareni elektron u molekuli posjeduje i orbitalni moment koliine gibanja koji je posljedica "krunog" gibanja elektrona oko jezgre. Na taj nain, osim vanjskog magnetskog polja, na elektron djeluje i vrlo slabo magnetsko polje uzrokovano njegovim orbitalnim momentom koliine gibanja. Posljedica toga je vrlo malo poveanje gvrijednost elektrona vezanog u molekuli u odnosu na gvrijednost slobodnog elektrona. No, i takva se vrlo mala odstupanja mogu lako mjeriti, te mogu pomoi pri identifikaciji paramagnetskog sistema. S obzirom da gvrijednost ovisi o okolini nesparenog elektrona, takoer je mogue locirati dio paramagnetskog sistema (npr. atom molekule) na kojem se nalazi veina spina nesparenog elektrona u molekuli. Primjerice, gvrijednosti slobodnih radikala povezanih s atomima sumpora ili kisika vrlo su velike (2,042,09), dok su slobodni radikali povezani s atomima ugljika ili duika openito malih gvrijednosti (2,0032,010). Anizotropno kristalno polje u paramagnetskim uzorcima pripravljenim u obliku molekulskih kristala uzrokuje dodatni moment koliine gibanja nesparenog elektrona, pa on "osjea" dodatno magnetsko polje koje se openito mijenja promjenom orijentacije kristala u vanjskom magnetskom polju. Stoga je u ovakvim sistemima gvrijednost realni simetrini tenzor predstavljen realnom simetrinom (3 3) matricom. Izmjerene su gvrijednosti anizotropne, to znai da im se vrijednosti mijenjaju ovisno o orijentaciji kristala (a time i molekule) u vanjskom magnetskom polju. Nasuprot tomu, u tekuim ili prakastim uzorcima gibanje je molekula slobodnije i bre, pa se dodatno, lokalno magnetsko polje kontinuirano mijenja. Izmjerena je gvrijednost jedinstvena i predstavlja uprosjeenu vrijednost svih moguih orijentacija u vanjskom magnetskom polju.

3.3.2 Intenzitet rezonantnih linija

Integrirana vrijednost povrine ispod rezonantne linije razmjerna je koncentraciji nesparenih elektrona koji daju EPR spektar. Na taj je nain intenzitet rezonantne linije izravna mjera koncentracije paramagnetinih estica u uzorku.

3.3.3 irina rezonantnih linija

Dva imbenika doprinose irini linije u EPR spektru. Prvi je dio povezan sa spin reetka relaksacijskim vremenom T1. irina linije i relaksacijsko vrijeme T1 obrnuto su razmjerni, tj. to je relaksacijsko vrijeme T1 manje, to je rezonantna linija ira. Drugi se doprinos pojavljuje u uzorcima u kojima su paramagnetine molekule ili statine ili se gibaju vrlo spo-

11

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

ro. U ovakvim sistemima pojedina molekula moe ispunjavati uvjet rezonancije pri drugoj, vrlo malo razliitoj frekvenciji mikrovalnog polja, pa moe doi do irenja rezonantne linije. Uobiajeno je ovaj proces irenja karakterizirati relaksacijskim vremenom T2, koje se odnosi na prije opisano spinspin relaksacijsko vrijeme. Pri brem gibanju molekula dolazi do uprosjeenja, pa je uvjet rezonancije ispunjen pri jednoj, strogo odreenoj frekvenciji mikrovalnog polja, to u EPR spektru uzrokuje uu ("otriju") rezonantnu liniju.

3.3.4 Hiperfino cijepanje rezonantnih linija

Osim meudjelovanja s vanjskim magnetskim poljem (Zeemanovo meudjelovanje), spin nesparenog elektrona moe meudjelovati sa susjednim jezgrama rezultantnog spina I razliitog od nitice. Ovo se meudjelovanje naziva hiperfinim meudjelovanjem, a u EPR spektru uzrokuje cijepanje osnovne rezonantne linije na openito vie njih (hiperfino cijepanje). Broj linija i omjer njihovog intenziteta daje informaciju o broju i vrsti jezgara s kojim nespareni elektron meudjeluje. Uzrok cijepanju osnovne rezonantne linije jest dodatno magnetsko polje koje potjee od spina jezgre, a koje "osjea" nespareni elektron u njenoj blizini. Meudjelovanje spina elektrona i spina jezgre uzrokuje stvaranje 2 I + 1 orijentaciju jezgrinog spina u odnosu na vanjsko magnetsko polje, s 2 I + 1 projekcija spina jezgre na smjer vanjskog magnetskog polja. Svaka orijentacija (projekcija) odgovara drugoj energiji, to konano uzrokuje cijepanje osnovne rezonantne linije na 2 I + 1 liniju jednakog intenziteta. Ove se linije mogu meusobno preklapati, tako da EPR spektar openito moe biti vrlo sloen. U radikalima organskih molekula jezgre rezultantnog spina razliitog od nitice su jezgre vodika (I = 1/2) i duika (I = 1). Tako e hiperfino meudjelovanje spina elektrona sa spinom protona uzrokovati cijepanje osnovne rezonantne linije na dvije (dubletno cijepanje), jer je 21/2 + 1 = 2. Meudjelovanje nesparenog elektrona sa spinom jezgre duika uzrokovat e tripletno cijepanje osnovne rezonantne linije zbog 21 + 1 = 3. Za razliku od njih, rezultantni spin jezgri kisika i ugljika jednak je nitici, pa se u EPR spektrima ne opaa hiperfino meudjelovanje nesparenog elektrona s ovim jezgrama. Slikom 7 shematski je prikazano hiperfino cijepanje energijskih razina koje je posljedica meudjelovanja elektrona spina 1/2 i jezgre spina 1/2 (proton). U EPR spektroskopiji dozvoljeni su prijelazi za mS = 1 i mI = 0 (naznaeni strelicama na slici 7), to u EPR spektru uzrokuje cijepanje osnovne rezonantne linije na dvije. Slino, slikom 8 shematski je prikazano kvartetno hiperfino cijepanje energijskih razina kao posljedica meudjelovanja elektrona i jezgre spina 3/2 (npr. jezgre bakra).

E =

1 g B B 2

ms =

1 2

mI =

1 2

mI=3/2

( E) 1
mI =
1 2
1 2

E =

1 2

ms=1/2

g B B

mI=1/2 mI=-1/2 mI=-3/2

B=0

E = g B B

( E) 2
mI =

B=0
E =
1 2

E = g B B
mI=-3/2 mI=-1/2 ms=-1/2 mI=1/2 mI=3/2

E =

1 g B B 2

ms =

1 2

g B B

mI =

1 2

SLIKA 7.
Shematski prikaz dubletnog hiperfinog cijepanja energijskih razina koje je posljedica meudjelovanja elektrona spina 1/2 i protona spina 1/2.

SLIKA 8.
Shematski prikaz kvartetnog hiperfinog cijepanja energijskih razina koje je posljedica meudjelovanja elektrona spina 1/2 i jezgre spina 3/2 (63Cu ili 65Cu).

12

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Meudjelovanje nesparenog elektrona paramagnetskog sistema s jezgrom spina razliitog od nitice uzrokovat e hiperfino cijepanje rezonantnih linija na prethodno opisani nain. Meutim, nespareni elektron openito moe meudjelovati s vie jezgara rezultantnog spina razliitog od nitice koje se nalaze u blizini nesparenog elektrona. Dodatna meudjelovanja uzrokuju dodatna, superhiperfina cijepanja rezonantnih linija. Na taj nain rezultantni EPR spektar openito moe biti vrlo sloen. Simulirani EPR spektri u kojima se opaa hiperfino cijepanje rezonantne linije koje je posljedica meudjelovanja nesparenog elektrona s protonom, s dva magnetski ekvivalentna protona, s dvije magnetski neekvivalentne jezgre duika, s tri magnetski ekvivalentna protona i s jednom duikovom jezgrom i protonom prikazani su slikama 10, 11, 12, 13 i 14. Meudjelovanje nesparenog elektrona s magnetski ekvivalentnim jezgrama uzrokuje hiperfino cijepanje jednake vrijednosti, a meudjelovanje s magnetski neekvivalentnim jezgrama hiperfino cijepanje razliite vrijednosti. Hiperfino se cijepanje mjeri u SI jedinicama indukcije magnetskog polja (uobiajeno se izraava u mT), iako se jo uvijek esto izraava u zastarjeloj mjernoj jedinici za indukciju magnetskog polja gaus (G). 1 G odgovara indukciji magnetskog polja od 0,1 mT, tj. vrijedi 1 G = 104 T. Konani EPR spektar paramagnetskog sistema prva je derivacija krivulje apsorpcije energije mikrovalnog zraenja zbog jednostavnijeg oitavanja poloaja rezonantnih linija u vanjskom magnetskom polju, a time i jednostavnijeg odreivanja gvrijednosti. Neki autori za EPR spektroskopiju rabe izraz ESR spektroskopija, tj. spektroskopija elektronske spinske rezonancije, s obzirom da se ova spektroskopska metoda temelji na elektronskim prijelazima izmeu kvantiziranih energijskih stanja ukupnog magnetskog momenta elektrona odreenih uglavnom kvantizacijom spinskog momenta koliine gibanja. Izraz EPR spektroskopija uvaava injenicu da i orbitalni moment koliine gibanja doprinosi kvantizaciji energijskih stanja ukupnog magnetskog momenta elektrona (to je sadrano u gvrijednosti paramagnetske tvari). U svakom sluaju, oba se izraza (i EPR i ESR) odnose na istu spektroskopsku metodu. Osim to je jedina metoda kojom se izravno mogu detektirati slobodni radikali, EPR spektroskopija iznimno je osjetljiva spektroskopska metoda. Naime, za detekciju EPR signala u uzorku je potrebna koliina od 1014 paramagnetskih estica, to odgovara nanomolarnoj koncentraciji estica u uzorku. S druge strane za opaanje signala u EPRu sestrinskoj spektroskopskoj metodi, NMRu (nuklearna magnetska rezonancija), potrebna je milimolarna koncentracija spinova u uzorku. Slijedi da je EPR oko milijun puta osjetljivija spektroskopska metoda od NMRa.

13

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

AH

AH AH

SLIKA 10.
Dubletno hiperfino cijepanje rezonantne linije (AH) koje je posljedica meudjelovanja nesparenog elektrona s protonom spina 1/2.

SLIKA 11.
Dvostruko dubletno hiperfino cijepanje rezonantne linije koje je posljedica meudjelovanja nesparenog elektrona s dva magnetski ekvivalentna protona spina 1/2, jednakog iznosa hiperfinog cijepanja (AH). Dijagramom ispod slike shematski je prikazano nastajanje tri ekvidistantne rezonantne linije omjera intenziteta 1:2:1.

SLIKA 12.
AN2 AN1 Dvostruko tripletno hiperfino cijepanje rezonantne linije koje je posljedica meudjelovanja nesparenog elektrona s dvije jezgre duika spina 1, razliitog iznosa hiperfinog cijepanja (AN1 i AN2). Dijagramom ispod slike shematski je prikazano nastajanje devet rezonantnih linija.

AH AH AH AH AN

SLIKA 14.
Hiperfino cijepanje rezonantne linije koje je posljedica meudjelovanja nesparenog elektrona s jezgrom duika spina 1 (triplet, AN) i protonom spina 1/2 (dublet, AH). Dijagramom ispod slike shematski je prikazano nastajanje est rezonantnih linija.

SLIKA 13. SLIKA 13.

Trostruko dubletno hiperfino cijepanje rezonanTrostruko hiperfino cijepanje rezonantne linije kao posljedica meudjelovanja nesparetne linije koje je posljedica meudjelovanja nog elektronaelektrona s tri magnetski ekvivanesparenog s tri magnetski ekvivalentna protona spina 1/2, jednakog iznosa hiperfinog cijepalentna protona spina 1/2, jednakog iznosa hinja (AH). cijepanja (AH). ispod slike shematski je perfinog Dijagramom Dijagramom ispod slike prikazano je prikazano etiri rezonantnerezoshematski nastajanje nastajanje etiri linije nantne linije omjera intenziteta 1:3:3:1.

14

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

4. Pomone tehnike EPR spektroskopije

4.1 Metoda spinskih zamki
Spektroskopija elektronske paramagnetske rezonancije (EPR) metoda je detekcije molekula s nesparenim elektronom (radikala) koja se temelji na mjerenju apsorpcije visokofrekventnih elektromagnetskih valova u mikrovalnom podruju koja nastaje za vrijeme prijelaza nesparenog elektrona izmeu dvije spinske energijske razine koje su razliite energije kada se paramagnetska tvar nalazi u vanjskom magnetskom polju indukcije B. Naalost, u veini biolokih sistema nespareni elektron slobodnog radikala vrlo brzo sparuje svoj spin reakcijom s drugim molekulama ili radikalima, to rezultira vrlo kratkim vremenom poluivota promatranih radikala (vrijeme potrebno da se poetna koncentracija radikala smanji na polovicu). U takvim je sistemima stacionarna koncentracija radikala vrlo malena, openito ispod donje granice osjetljivosti EPR spektroskopije. Jedna od najee koritenih metoda koja ipak omoguava detekciju kratkoivuih nestabilnih radikala jest metoda spinskih zamki (spin trapping technique). U metodi spinskih zamki reaktivni slobodni radikali kovalentno se veu na dvostruku vezu dijamagnetske molekule (spinska zamka) stvarajui stabilnije kovalentne paramagnetske molekule (spinske adukte). Njih je zbog relativno dugog poluivota mogue detektirati EPR spektroskopijom. Najee koritene spinske zamke su nitroni i nitrozo spojevi. Reakcijom ovih spojeva s nestabilnim radikalima nastaju stabilni produkti (spinski adukti) nitroksidi s nesparenim elektronom na atomu kisika (NO). Nitroni se kao spinske zamke najee koriste pri identifikaciji bioloki vanih slobodnih radikala, O2 , HO, kao i velikog broja slobodnih radikala sekundarno nastalih reakcijom HO s odreenim staninim strukturama. Nitroni mogu reagirati s velikim brojem razliitih radikala, dok su nitrozo zamke mnogo selektivnije. Nitroni u reakciji sa slobodnim radikalom X tvore stabilnije paramagnetske adukte u kojima je radikal vezan na ugljikov atom u neposrednoj blizini nitroksidne skupine (tzv. poloaj), kao to je to prikazano slikom 15.
O N R

H R C

O N +

SLIKA 15.

. R+X

C R

Reakcijom nestabilnog radikala X s nitronom nastaje nitroksid, stabilni paramagnetski spoj s nesparenim elektronom na atomu kisika.

Najpoznatije nitronske spinske zamke su Ntertbutilfenilnitron (PBN), (4piridil1oksi)Ntertbutilnitron (POBN) i 5,5dimetil1pirolinNoksid (DMPO). Slikom 16 prikazana je reakcija slobodnog radikala X s nitronskom spinskom zamkom PBN.
H C O N + C(CH3)3

R X

.
SLIKA 16.

H C

O N

.
C(CH3)3

Reakcija slobodnog radikala X s nitronskom spinskom zamkom PBN.

X R

15

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Reakcijom nitrozo zamki sa slobodnim radikalom X nastaju adukti u kojima je radikal izravno vezan na atom duika nitroksidne skupine (tzv. poloaj), kao to je to prikazano slikom 17.

O +X

N R

SLIKA 17.

Reakcija nestabilnog radikala X s nitrozo spojem. Produkt reakcije je nitroksid, stabilni spinski adukt s nesparenim elektronom na atomu kisika.

Najpoznatije nitrozo spinske zamke su 3,5dibromo4nitrozobenzensulfat (DBNBS), kao i neki derivati ove molekule. Nespareni je elektron u oba sluaja djelimino lokaliziran i na vezanom radikalu. Da bi se odredila struktura "uhvaenog" radikala, u njegovom se EPR spektru moraju opaati hiperfina cijepanja rezonantnih linija, tj. u bliskoj okolini "uhvaenog" radikala moraju biti prisutne jezgre rezultantnog spina razliitog od nitice ( I 0 ), kao to su npr. jezgre 14N i 1H. Tako se EPR spektar adukta openito sastoji od vie rezonantnih linija, a njihovom je EPR analizom relativno jednostavno odrediti strukturu adukta, a time i uhvaenog radikala. Iako metoda spinskih zamki omoguuje detekciju slobodnih radikala, identifikacija "uhvaenog" radikala na temelju EPR spektra spinskog adukta zasniva se uglavnom na usporedbi tog spektra sa spektrima poznatih adukata s istom zamkom. Da bi se nedvojbeno odredila struktura "uhvaenog" slobodnog radikala nunom moe biti uporaba nekoliko razliitih spinskih zamki. Valja spomenuti da EPR spektri nitronskih adukata daju manje informacija o vezanom radikalu jer hiperfina cijepanja adukta uglavnom potjeu od kostura molekule spinske zamke, a ne "uhvaenog" radikala (vidi sliku 15). No u sluaju velike delokaliziranosti elektronskog spina, preciznom je EPR analizom mogue odrediti hiperfina cijepanja uzrokovana meudjelovanjem nesparenog elektrona s paramagnetskim jezgrama "uhvaenog" radikala. Lipidni radikali koji nastaju tijekom oksidacije lipoproteina u procesu aterogeneze vrlo su reaktivni, pa je njihova stacionarna koncentracija openito premalena za izravnu EPR detekciju. Stoga se za potrebu odreivanja strukture ovih radikala upotrebljava metoda spinskih zamki s nitronskom spinskom zamkom PBN (Ntertbutilfenilnitron).

4.2 Metoda spinskih oznaka

Spinska oznaka (spin label) je organska molekula s nesparenim elektronom (obino na duikovom atomu) koja se kao sonde uvode u promatrani sustav u svrhu dobivanja informacije o fizikokemijskoj okolini sonde. Spinska oznaka, kao stabilni radikal, vee se na specifinu funkcionalnu skupinu u molekuli ili se interkalira u odreeno podruje koje se istrauje, npr. bioloku membranu. Na taj se nain molekula koja prirodno nije paramagnetina paramagnetski oznai. Primjerice, mogue je paramagnetski oznaiti odreene supstrate ili ligande i tako osmisliti razliite tipove eksperimenata koji se temelje na EPR spektroskopiji, a u svrhu odreivanja informacija o molekulskoj ureenosti okoline oznake ili o brzini gibanja molekula oznake. S druge strane, mjerenjem poveanja irine rezonantne linije spinske oznake, uglavnom uzrokovanog sudarima molekule oznake s molekulama iz njene neposredne okoline (sudarima se smanjuje vrijeme poluivota pobuenog stanja nesparenog elektrona u molekuli spinske oznake) mogu se odrediti dinamike karakteristike molekula iz neposredne okoline spinske oznake, kao to je brzina njihovog gibanja ili viskoznost medija u kojem se one nalaze. Metoda spinskih oznaka uveliko se koristi pri istraivanju strukture i dinamike proteina i biolokih membrana, kao i pri odreivanju kinetike enzimskih reakcija. Pritom se kao spinske oznake koriste CTPO (3karbamoil2,2,5,5tetrametil3pirolin1iloksil), DTBN (di

16

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

tertbutil nitroksid, TPHIO1 (1,3,3tetrafenillizoindolin), TMIO (1,1,3,3tetrametillizoindolin) i TEIO (1,1,3,3tetraetillizoindolin). Ipak, najee koritena spinska oznaka pri istraivanju razb) a) liitih biokemijskih sustava je TEMPO (2,2,6,6tetrametil1 piperidinilnitroksid). U ovoj se molekuli nespareni elektron nalazi u porbitali atoma duika, to uzrokuje EPR spektar tripletne strukture, kao to je to prikazano SLIKA 18. slikama 18a a) Tipini EPR spektra spinske oznake TEMPO. i 18b.
b) Nespareni elektron u spinskoj oznaci TEMPO nalazi se u porbitali atoma duika.

Valja spomenuti da tri EPR rezonantne linije spinske oznake TEMPO nisu niti jednakog intenziteta, niti irine, kao to bi se to oekivalo na temelju dosadanjeg razmatranja hiperfinog cijepanja EPR linija. Glavni je razlog tomu rotacijsko gibanje molekule spinske oznake opisano rotacijskim korelacijskim vremenom, kao i utjecaj polarnosti medija u kojem se oznaka nalazi. Detaljniji se opis asimetrinosti rezonantnih linija spinske oznake isputa zbog svoje sloenosti koja ukljuuje dobro poznavanje zakonitosti kvantne mehanike i pripadnog matematikog aparata. Promjena hiperfinog cijepanja spinske oznake, nakon njenog vezivanja za specifinu funkcionalnu skupinu koja se istrauje moe dati informaciju o orijentaciji spinske oznake u odnosu na smjer primijenjenog vanjskog magnetskog polja, a poznavanjem geometrije veznog mjesta oznake mogue je dijelom ili u potpunosti razrijeiti strukturu istraivane okoline spinske oznake.

4.3 EPR oksometrija

EPR oksimetrija je metoda kojom se mjeri potronja paramagnetinih molekula kisika tijekom procesa oksidacije. U osnovnom stanju molekule kisika dva su nesparena elektrona paralelnih spinova, svaki u razliitoj molekulskoj orbitali. Relaksacijska su vremena ovih molekula vrlo kratka tako da su rezonantne linije u EPR spektru otopljenog kisika preiroke i ne mogu se opaati. Opaaju se neizravno reakcijom s drugim slobodnim radikalima, kao to su spinske oznake. Sudarima molekula kisika s molekulama spinskih oznaka smanjuje se vrijeme poluivota pobuenog stanja nesparenog elektrona u spinskoj oznaci, to uzrokuje irenje spektralnih linija spinske oznake. Opseg irenja linija ovisi o frekvenciji sudara, a ona je razmjerna koncentraciji kisika u uzorku, pa je mjerenjem irine rezonantne linije mogue odrediti apsolutnu koncentraciju kisika u uzorku. Mjerenje potronje kisika vrlo je bitno pri istraivanju procesa spore oksidacije lipoproteina. Potronja kisika odreuje se mjerenjem irine rezonantnih linija spinske oznake CTPO (3karbamoil2,2,5,5tetrametil3pirolin1iloksil). Openito se kao mjera irenja rezonantnih linija koristi empirijski parametar K. Apsolutna koncentracija kisika koja odgovara izmjerenom parametru K odreuje se badarnom krivuljom za CTPO. Zbog hidrofilnog karaktera CTPO izmjerene se vrijednosti mogu koristiti samo na mjerenje koncentracije kisika u uzorku koji je u vodenoj fazi. Slikama 19 i 20 prikazano je EPR oksometrijsko mjerenje potronje kisika u procesu spore oksidacije LDLa obogaenog tokoferolom. Oksidacija je inicirana in vitro reakcijom metalnog iona (bakar) u oksidiranom stanju s molekulom tokoferola u lipidnim esticama koje sadre lipidne hidroperokside. Na slici je dobro vidljivo da je smanjivanje koncentracije kisika cO2 popraeno poveanjem koncentracije slobodnih radikala cR i lipidnih hidroperoksida cLOOH.

17

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

SLIKA 19.
EPR spektri sonde CTPO snimljeni nakon 5 sati (spektar a) i 24 sata (spektar b) od poetka procesa oksidacije uzorka LDL.

SLIKA 20.
Izraunana vremenska ovisnost potronje kisika, stvaranja lipidnih hidroperoksida i slobodnih radikala tijekom procesa oksidacije LDLa razliitih koncentracija.

5. Primjena EPR spektroskopije

iroki je spektar primjene EPR spektroskopije u mnogim znanstvenim podrujima. U fizici se primjena EPR spektroskopije ponajprije odnosi na istraivanja povrinskih, poluvodikih i supravodikih svojstava razliitih materijala, a znaajna je uloga EPR spektroskopije i u fizici polimera i dozimetriji. EPR spektroskopijom u kemiji se uglavnom istrauju kinetike kemijskih reakcija, kao i strukture paramagnetskih molekula i razliitih kemijskih kompleksa. Takoer, intenzivna je primjena EPR spektroskopije zajedno s metodom spinskih zamki u analizi vrlo nestabilnih, kratkoivuih NO i OH radikala koji su esti produkti brojnih kemijskih reakcija. U farmaceutskim znanostima EPR spektroskopija najee se rabi u istraivanju termike stabilnosti lijekova i antioksidacijskih svojstava ljekovitih bilja. Osim toga, upotreba EPR spektroskopije dijelom moe doprinijeti razrjeenju sloenog mehanizma prijenosa lijekova do stanica tumora s obzirom da je ultrazvuna kavitacija staninih membrana i micela popraena stvaranjem mnotva slobodnih radikala. Takoer, nemali je broj istraivanja slobodnih radikala i s njima povezanih antioksidacijskih svojstava kozmetikih preparata. Primjenjivost EPR spektroskopije u medicini ogleda se u izuavanju brojnih vrsta radikala u stanicama i tkivima, od kojih su najvie istraivani slobodni radikali koji nastaju oksidacijom lipoproteina, a povezani su s poetkom procesa ateroskleroze krvnih ila. Posljedica otrovanja cijanidom ili nitritima, kao i uzimanje nekih narkotikih sredstava, stvaranje je dugoivuih slobodnih radikala u krvi i urinu koje je relativno jednostavno opaziti EPR spektroskopijom, to ini ovu spektroskopsku metodu korisnim alatom u podruju forenzike medicine i medicine dopinga. I u prehrambenoj industriji postoji primjena EPR spektroskopije jer su starenje prehrambenih namirnica, kao i njihova sterilizacija zraenjem popraeni stvaranjem relativno stabilnih EPRom opaljivih slobodnih radikala. Takoer, mjerenjem dugoivuih stabilnih radikala u zubima umrlog organizma mogue je datirati njegovu starost. Time je EPR spektroskopija primjenjiva ak i u znanstvenom podruju arheologije.

18

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Ipak, najvea je primjena EPR spektroskopije u biologiji i biokemiji. S obzirom da je EPR spektroskopija izrazito fizika metoda, moe se rei da njena primjena u istraivanju biolokih i biokemijskih sistema pripada interdisciplinarnom podruju biofizike. Veliki broj metalnih iona je paramagnetian, pa je upotreba EPR spektroskopije mogue istraivanje kemijskih struktura nastalih vezivanjem metalnih iona za molekule proteina u tzv. metaloproteinskim kompleksima. Proces spore oksidacije lipoproteina male gustoe (LDL) popraen je stvaranjem lipidnih hidroperoksida i stabilnih slobodnih radikala za koje se smatra da su okida procesa aterogeneze. Osim koncentracije, brzine nastajanja i strukture ovih radikala, EPR spektroskopijom mogue je mjeriti i potronju kisika u procesu oksidacije LDLa (EPR oksometrija). Ozraivanjem visokoenergijskim zrakama kristalnih uzoraka baza nukleinskih kiselina, pa i cijele molekule DNA, pri razliitim temperaturama nastaju stabilni radikali ije se nastajanje, pretvorba i struktura najuspjenije odreuje EPR spektroskopijom. EPR spektroskopijom takoer je mogue analizirati strukturu kompleksa nastalih vezivanjem paramagnetskih metalnih iona za baze nukleinskih kiselina. Danas je vrlo intenzivna primjena EPR spektroskopije u istraivanju antioksidacijskih uinaka razliitih vrsta flavonoida iz propolisa, groa, ajeva i vina. Osim flavonoida, istrauju se i antioksidacijska svojstva vitamina E i vitamina C. Primjenjivanje EPR spektroskopije u istraivanju izrazito dijamagnetinih biolokih sistema ini se nemoguim. Ipak, paramagnetskim oznaavanjem dijamagnetskih biolokih molekula metodom spinskog oznaavanja omoguava istraivanje fizikokemijskih svojstava nekih biolokih sistema, kao to su struktura membranskih proteina, struktura i dinamika lipidnog dvosloja staninih membrana, pa ak i kinetika odreenih enzimskih reakcija. Iako se svi navedeni primjeri odnose na primjenu EPR spektroskopije u istraivanju biolokih i biokemijskih sistema in vitro, valja spomenuti da je od poetka 21. stoljea arite velikog broja EPR istraivanja u izuavanju biolokih sistema in vivo, najee na eksperimentalnim ivotinjama.

6. Pitanja
PITANJE 1. Bohrov magneton je: A) spinski moment koliine gibanja slobodnog elektrona; B) orbitalni moment koliine gibanja slobodnog elektrona; C) spinski moment koliine gibanja elektrona u atomu; D) orbitalni moment koliine gibanja elektrona u atomu; E) ukupni magnetski moment slobodnog elektrona. PITANJE 2. gvrijednost slobodnog elektrona iznosi: A) 2; B) 2,0032; C) 2,0023; D) 2,023; E) 2,032. PITANJE 3. Magnetski moment elektrona paramagnetske tvari povezan s njegovim spinom dan je izrazom A) mSgBB; B) mSgBS; C) BgS; D) BgB; E) mSgBL.

19

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

PITANJE 4. EPR spektar nekog slobodnog radikala snimljen je pri frekvenciji mikrovalnog zraenja 9,493 GHz. g vrijednost rezonantne linije radikala koja se opaa pri indukciji vanjskog magnetskog polja 331,8 mT iznosi A) 2,0032; B) 2,0023; C) 2,0472; D) 2,0047; E) nita od navedenog nije tono. (h = 6,6261034 Js; B = 9,261024 JT1) PITANJE 5. gvrijednost rezonantne linije koja se opaa u EPR spektru nekog slobodnog radikala, snimljenog pri frekvenciji mikrovalnog zraenja 9,262 GHz, iznosi 2,0255. Indukcija vanjskog magnetskog polja pri kojoj se opaa ova rezonantna linija iznosi A) 3272 G; B) 327,2 G; C) 305,6 mT; D) 3056 G; E) 3272 mT. (h = 6,6261034 Js; B = 9,261024 JT1) PITANJE 6. Indukcija vanjskog magnetskog polja pri kojoj se opaa rezonantna linija nekog slobodnog radikala g vrijednosti 2,0095 iznosi 330 mT. Frekvencija mikrovalnog zraenja pri kojoj je snimljen EPR spektar radikala iznosi A) 9,5 GHz; B) 9,267 GHz; C) 10,79 kHz; D) 10,79 GHz; E) nita od navedenog nije tono. (h = 6,6261034 Js; B = 9,261024 JT1) PITANJE 7. Razlika energijskih razina i elektrona paramagnetskog sistema u vanjskom magnetskom polju 1) razmjerna je indukciji magnetskog polja i Bohrovom magnetonu, a obrnuto je razmjerna g vrijednosti; 2) razmjerna je indukciji magnetskog polja i gvrijednosti, a obrnuto je razmjerna Bohrovom magnetonu; 3) razmjerna je gvrijednosti i Bohrovom magnetonu, a obrnuto je razmjerna indukciji magnetskog polja. A) tona je tvrdnja 1; B) tona je tvrdnja 2; C) tona je tvrdnja 3; D) tone su tvrdnje 1 i 2; E) niti jedna tvrdnja nije tona. PITANJE 8. Apsorpcija energije elektromagnetskog zraenja u EPR spektroskopiji bit e opaena samo u sluaju kada je naseljenost: A) energijskog stanja elektrona vea od naseljenosti energijskog stanja elektrona; B) energijskog stanja elektrona manja od naseljenosti energijskog stanja elektrona; C) energijskog stanja elektrona vea ili jednaka naseljenosti energijskog stanja elektrona; D) energijskog stanja elektrona jednaka naseljenosti energijskog stanja elektrona; E) energijskog stanja elektrona manja ili jednaka naseljenosti energijskog stanja elektrona.

20

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

PITANJE 9. Apsorpcija energije elektromagnetskog zraenja mikrovalnog podruja u EPR spektroskopiji trajna je pojava zbog: 1) spinspin relaksacijskog procesa; 2) spinreetka relaksacijskog procesa; 3) reetkareetka relaksacijskog procesa. A) tona je tvrdnja 1; B) tona je tvrdnja 2; C) tona je tvrdnja 3; D) tone su tvrdnje 1 i 2; E) niti jedna tvrdnja nije tona. PITANJE 10. Frekvencija mikrovalnog zraenja pri kojoj rade EPR spektrometri u Xpodruju iznosi A) 35 GHz; B) 9,5 MHz; C) 35 MHz; D) 9,5 kHz; E) 9,5 GHz. PITANJE 11. gvrijednost elektrona u atomu ili molekuli vea je od gvrijednosti slobodnog elektrona zbog toga to na elektron u atomu ili molekuli djeluje A) vanjsko magnetsko polje; B) magnetsko polje mikrovalnog zraenja; C) magnetsko polje uzrokovano spinom elektrona; D) magnetsko polje uzrokovano orbitalnim gibanjem elektrona; E) magnetsko polje jezgara rezultantnog spina razliitog od nule. PITANJE 12. irina EPR rezonantne linije to je vea to je A) vee relaksacijsko vrijeme spinreetka; B) manje relaksacijsko vrijeme spinreetka; C) vee relaksacijsko vrijeme spinspin; D) vee relaksacijsko vrijeme reetkareetka; E) gibanje molekula paramagnetske tvari bre. PITANJE 13. Hiperfino cijepanje rezonantnih linija u EPR spektru nekog slobodnog radikala uzrokuje meudjelovanje nesparenog elektrona radikala s A) jezgrama rezultantnog spina razliitog od nule; B) vanjskim magnetskim poljem; C) orbitalnim magnetskim momentom elektrona; D) spinskim magnetskim momentom elektrona; E) magnetskim poljem elektromagnetskih valova u mikrovalnom podruju. PITANJE 14. U EPR spektru nekog slobodnog radikala u kojem postoji meudjelovanje nesparenog elektrona radikala s jezgrom vanadija VV rezultantnog spina 7/2 opaat e se A) 7; B) 2; C) 1; D) 6; E) 8 rezonantnih linija.

21

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

PITANJE 15. Tri rezonantne linije omjera intenziteta 1:2:1, opaene u EPR spektru nekog slobodnog radikala, posljedica su meudjelovanja nesparenog elektrona radikala s A) jednom duikovom i dvije magnetski ekvivalentne vodikove jezgre; B) dvije magnetski ekvivalentne vodikove jezgre; C) dvije magnetski ekvivalentne duikove jezgre; D) jednom duikovom i jednom vodikovom jezgrom; E) dvije magnetski neekvivalentne vodikove jezgre. PITANJE 16. Tipini EPR spektar spinske oznake tetrametilpiperidin1oksil (TEMPO) sastoji se od A) singletne; B) dubletne; C) tripletne; D) kvartetne; E) kvintetne rezonantne linije. PITANJE 17. Maksimalno hiperfino cijepanje u EPR spektru spinske oznake tetrametilpiperidin1oksil (TEMPO) bit e opaeno ako je njena pzorbitala usmjerena A) okomito na smjer vanjskog magnetskog polja; B) paralelno smjeru vanjskog magnetskog polja; C) pod kutom 45o u odnosu na smjer vanjskog magnetskog polja; D) okomito na magnetsko polje koje potjee od spina jezgre duika; E) paralelno magnetskom polju koje potjee od spina jezgre duika. PITANJE 18. Reakcijom nitrozo spinske zamke s nestabilnim slobodnim radikalom nastaje A) nitron; B) nitrozo spoj; C) nitroksid; D) molekula PBN; E) nita od navedenog nije tono. PITANJE 19. Reakcijom nitronske spinske zamke s nestabilnim slobodnim radikalom nastaje stabilni paramagnetski adukt u kojemu je "uhvaeni" radikal vezan na atomu A) kisika; B) vodika; C) duika; D) ugljika; E) molekulski skelet R. PITANJE 20. Smanjenjem koncentracije kisika u uzorku neke spinski oznaene paramagnetske tvari u EPR spektru spinske oznake dolazit e do A) irenja rezonantnih linija; B) suavanja rezonantnih linija; C) poveanja intenziteta rezonantnih linija; D) poveanja gvrijednosti; E) poveanja hiperfinog cijepanja.

TONI ODGOVORI
1) D; 2) C; 3) C; 4) C; 5) A; 6) E; 7) E; 8) B; 9) D; 10) E; 11) D; 12) B; 13) B; 14) E; 15) B; 16) C; 17) B; 18) C; 19) D; 20) B.

22

SPEKTROSKOPIJA ELEKTRONSKE PARAMAGNETSKE REZONANCIJE (EPR)

Literatura
1. Erim Bei: EPR SPEKTROSKOPIJA OZRAENIH KRISTALA 2TIOTIMINA S PRIMJESAMA BAKRA Doktorska disertacija, Prirodoslovnomatematiki fakultet Sveuilita u Zagrebu, 2005. 2. Alan Carrington, Andrew D. McLachlan: INTRODUCTION TO MAGNETIC RESONANCE (with Applications to Chemistry and Chemical Studies)
Harper & Row, New York, Evanston and London, 1967.

3. John A. Weil, James R. Bolton, John E. Wertz: ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE (Elementary Theory and Practical Applications)
John Wiley & Sons, New York, 1994.

4. Charles P. Slichter: PRINCIPLES OF MAGNETIC RESONANCE

Harper and Row, New York, 1965.

5. Charles P. Poole Jr, Horacio A. Farach: THEORY OF MAGNETIC RESONANCES

WileyInterscience, New York, 1972.

6. Charles P. Poole Jr: ELECTRON SPIN RESONANCE

Interscience Publishers, New York, 1967.

7. John E. Wertz, James R. Bolton: ELECTRON SPIN RESONANCE (Elementary Theory and Practical Applications)
McGraw-Hill, New York, 1972.

8. Walter Gordy: THEORY AND APPLICATIONS OF ELECTRON SPIN RESONANCE

John Wiley & Sons, New York, 1980.

9. Gerald M. Rosen, Bradley E. Britigan, Howard J. Halpern, Sovitj Pou: FREE RADICALS (Biology and Detection by Spin Trapping)
Oxford University Press, Oxford, 1999.

10. Lawrence J. Berliner: SPIN LABELING

(Theory and Applications) Academic Press, New York, London, 1976.

23