Cilj nastave:

1. Principi LDg PGI: dlake nokta koe sluzokoe oka uva identifikacije gljiva
2. Principi

LDg IGI: aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija

3. Metode

4.

Metode ispitivanja osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest

Epidemiologija GI Rizine grupe pacijenata Endemske GI (bifazne i subkutane mikoze) Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze

Metode identifikacije gljiva:

Identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva vri se na osnovu:
Makroskopskih kulturalnih karakteristika Mikroskopskih kulturelnih karakteristika (preparat sa SDA, HA, PDA, DTM, MSIA) Specifinosti rasta na diferencijalnim podlogama (GACA) Fiziolokih karakteristika (germinacija, produkcija ureaze, kapsule...) Biohemijske identifikacije (API, Candida Chrom Agar...) Odredjivanja antigenske gradje izolovanih gljiva (npr. LA) Odredjivanja DNK sekvenci karakteristinih za vrstu (npr. PCR)

Odredjivanja faktora virulencije (detekcija enzima, mikotoksina...)

Odredjivanja rezistencije na AM (rezistotipija)

Na osnovu specifinosti rasta na diferencijalnim podlogama

(GACA razlikovanje C. neoformans od Candida; kukuruzni agar hlamidospore formira samo C. albicans)

Na osnovu fiziolokih karakteristika

(germinacija karakterstika C. albicans; produkcija kapsule karakteristika C. neoformans)

Na osnovu biohemijskih karakteristika

(API sistemi za fermentaciju i asimilaciju; podloge sa hromogenim suptancama Chrom-agar)

Hrom agar IDENTIFIKACIJA kvasnica

C. tropicalis C. albicans

C. glabrata

C. krusei

Biohemijska karakterizacija IDENTIFIKACIJA kvasnica

Identifikacija i ispitivanje njihove osetljivosti Candida

Biohemijska identifikacija kvasnica

Biohemijska serija ID32 (bioMerieux, Paris)

UNI-YEAST-TEC PLATE

API ZYM - enzimska karakterizacija gljiva

C. parapsilosis

C. dubliniensis

ANTIMIKOGRAM I ANTIMIKOTICI

Zbog ega antimikogram?

Ozbiljan i esto lo kliniki tok i prognoza IGI, RVVK i sl. Promenjen empirijski koncept leenja gljivinih infekcija zasnivan na pretpostavci da su gljive generalno osetljive na antimikotike (AM) Toksinost i druga neeljena dejstva AM i ograniena primena Vei izbor AM, posebno za parenteralnu primenu

UPOTREBA AM: Profilaksa Empirujska th Pre-emptive th Specifina th

Metode ANTIMIKOGRAMA: Difuzija Dilucija Etest

Ciljne strukture gljiva i mehanizmi dejstva AM

Membrane function: Amphotericin B

Cellwall synthesis: Echinocandins

Ergosterol synthesis: Azoles

Razvoj AM

# broj lekova 14 12 10 8 6 4 2 0 1950 1960 1970 5-FC

L-AmB ABCD ABLC Terbinafine Itraconazole Fluconazole Ketoconazole Miconazole

1980

1990

2000

Metode antimikograma
Difuzioni metod
24-48 h

Dilucioni metod
48 - 72 h

Kombinovani metod (E test)

48 h

Automatski sistemi identifikacija i AM

> 24 h

Disk difuzija, Etest i mikrodilucioni metod

Bujon dilucioni metod

suspenzija
100 l

0,5

0,25

0,125

0,06

0,03

Bujon + AM (g/ml)

MIK: najmanja koncentracija AM koja inhibira porast gljiva (bujon ostaje bistar)

37C

24 h

MIK

MIK = 0,25 g/ml

37C

24 h

MFK: presejavanjem svih razblaenja koja inhibiraju porast gljiva

MFK = 0,5 g/ml

MFK

Kombinovani metod - E test

Zasniva se na principu difuzije AM kroz vrstu hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom kulturom Opadajui gradijent koncentracije AM na traci E testa
E
12 8 4 3 2 1.5 1 .75 .50 .35 .25 .10 .05 .02 .01

37C

24 h

12 8 4 3 2 1.5 1 .75 .50 .35 .25 .10 .05 .02 .01

Plastina traka impregnirana AM u gradijentu koncentracije

Zona inhibicije elipsa

MIK

REZISTENCIJA GLJIVA NA AM
REZISTENCIJA: odsustvo terapijskog efekta primenom odgovarajuih terapijskih doza AM

Klinika rezistencija Primarna (unutranja) prisutna i pre izlaganja tj. kontakta gljive sa AM (genetski predodredjena -spontatne mutacije) Sekundarna (steena) - razvila se u toku/ posle primene terapije - rezultat genotipskih i fenotipskih promena indukovanih antimikotikom Otpornost na doze hemioterapeutika koje se postiu pri optimalnim/ maksimalno dozvoljenim terapijskim dozama (toksinost!)

Za sve izolate gljiva iz primarno sterilnih regija OBAVEZAN je antimikogram

MEHANIZMI REZISTENCIJE GLJIVA

1. Prekomerna produkcija ciljnog enzima
2. Izmena ciljnog mesta 3. Efluksne pumpe 4. Spreen ulazak 5. Zaobilazni metaboliki putevi 6. Inhibicija enzima aktivatora leka 7. Degradacija leka EC enzimima

NAJEE VRSTE GLJIVA I OSETLJIVOST NA AM

> 75% senzitivnost, 50%, < 5%;
(O'Brien et al., ASH Edu 2003)

Vrste gljiva
C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata

AmB

Fluconazol

Itrakonazol

Vorikonazol

Caspofungin

5-FC

C. krusei
A. fumigatus

A. flavus
A. terreus Zygomycetes Fusarium spp.

Savremena terapija i znaaj laboratorijske dijagnoze

Terapija
Temperature (C)

Pro filakticka 4
1 40 39 38 37 36

Empirijska

Pre-emptive

Specificna

CT

PCR +
Granulocytes (log10x109/L) 10 0 1

Antigeni

Kultura + Tkivo +

Verovatnoa IGI

Rizik

Moguca

Verovatna

Dokazana

0.1 -14 -7 0 7 14 21 28 35 Dani posle transplantacije 42 49 56 63