Seminarski rad iz forenzike hemije

Sadraj
1. Uvod............................................................................................................................................ 2 2. Uzorkovanje ................................................................................................................................ 3 3. Analiza ........................................................................................................................................ 6 3.1 Hemijska analiza .................................................................................................................. 6 3.2 Biohemijska analiza.............................................................................................................. 7 3.3 Instrumentalna analiza .......................................................................................................... 8 4. Obezbeivanje analitikog kvaliteta ......................................................................................... 12 5. Zakljuak .................................................................................................................................. 13 6. Literatura ................................................................................................................................... 14

www.BesplatniSeminarskiRadovi.com

1. Uvod
Odreivanje alkohola (etanola) u krvi oveka jedna je od osnovnih analitikih procedura u analitikim toksikolokim laboratorijama. Alkohol je jedna od najvie konzumiranih supstanci u zajednicama, a uglavnom se upotrebljava zbog njegovog delovanja na raspoloenje. Kada zbog njegove upotrebe pojedinac pretrpi tetne posledice, ili on sam uzrokuje nesrean sluaj, tada je potrebno precizno odrediti nivo alkohola u telu. To odreivanje omoguava procenu stanja alkoholisanosti, kao i procenu da li moe da upravlja kompleksnim mainama, kao to su motorna vozila. U teoriji, nivo alkohola bi se trebao meriti u mozgu, ali iz oiglednih razloga kod ivih bia to nije mogue. Koncentracija alkohola u mozgu direktno je srazmerna koncentraciji u arterijama. Ta koncentracija se moe meriti indirektno preko daha. Merenje nivoa alkohola preko daha postala je rasprostranjena metoda u primeni zakona o saobraaju, ali mere nje u krvi je i dalje rasprostranjeno. Poto uzimanje arterijske krvi od ivih bia predstavlja veliki rizik, alkohol se odreuje iz uzorka krvi uzete iz vene. Kapilarna krv predstavlja drugu alternativu, a prednost u odnosu na krv iz vene mu je to je rezultat blii koncentraciji alkohola u arterijama.

2. Uzorkovanje
Uzimanje uzorka venopunkturom iz kubitalne vene je standardna tehnika koja se kliniki koristi za ekstrakciju krvi. To je najpouzdaniji, a pored toga i relativno siguran nain za uzimanje krvi od ivog bia. Sadraj alkohola u ovim uzorcima predstavljae sistematsku koncentraciju alkohola u krvi, a merena vrednost se moe povezati sa stepenom alkoholisanosti. Kao alternativa venskoj krvi moe posluiti kapilarna, uzeta ubodom iz vrha prsta. Ta krv predstavlja prelazak arterijske krvi u vene. Tako, merena koncentracija alkohola daje bliu vrednost koncentraciji u arterijama. Veliki nedostatak ove metode je to se moe dobiti ograniena koliina uzorka. Uzete koliine su dovoljne uglavnom za neke osnovne analize, ali ne i za ponavljanje analize ukoliko je potrebno. Za forenzika ispitivanja uzorak krvi uzet iz vene je postao dominantan, jer se krv lako uzima, dobija se dovoljno uzorka za ponavljanje analiza, a rezultati se lako tumae. Krv nepouzdanog porekla (iz srca, vena, ili arterije) moe se sakupiti u grudnom kou i pomeati se sa interstitinalnim tenostima . Ta meavina tenosti se esto uzima za analize kao uzorak krvi". Analizom te tenosti dobijaju se rezultati ije tumaenje predstavlja potekoe jer se ne radi o istom uzorku. U forenzici, sakupljanje uzoraka krvi zahteva odreene predostronosti radi sauvanja integriteta i sigurnosti uzorka. To je izuzetno tako kada rezultati analize slue kao dokaz na sudu

protiv individualca, kao to je na primer sluaj upravljanja motornim vozilom pod dejstvom alkohola. U klinikim ispitivanjima redovno se prebrie mesto uzimanja uzorka sa alkoholnim antiseptikim rastvorom. Brisanje alkoholom kontaminira uzorak krvi uzet za analizu i zato se nerado koristi u forenzike svrhe. Mikroorganizmi koji se nalaze na koi, a koji mogu biti i na povrini aparata ili suspendovani u vazduhu prostorije mogu isto kontaminirati uzorak. Ti mikroorganizmi mogu iz eera u krvi napraviti alkohol procesom ferment acije. Obrnuto, mikroorganizmi mogu koristiti alkohol prisutan u krvi (dospeo tamo pijenjem) kao izvor energije. Kako god, stvarna vrednost alkohola u krvi (AUK) osobe je kompromitovana, i teko je interpretirati.

Slika 1. Pribor za uzimanje krvi

Pribori za odreivanje AUK, kao to je prikazano na slici 1, brzo su se razvijali za forenzike potrebe. Te opreme su samostalne, ne zahtevaju dodatne aparature ija bi se istoa i sadraj alkohola mogli dovesti u pitanje. Ti pribori sadre sterilne tube koje sadre prezervative, kao to je natrijum-fluorid sa antikoagulansima. Tube sadre natrijum-fluorid da bi produkovali finalnu koncentraciju od 1% w/v i kalijum-oksalat kao antikoagulans da bi produkovao finalnu koncentraciju 0.2% w/v. Prezervativ stabilizuje uzorak krvi na period od nekoliko meseci, po potrebi. Antikoagulans spreava zgruavanje, nepoeljnu osobinu pri analizi krvi. Iako ne neophodno, antikoagulans pored toga i pojednostavljuje analizu eliminacijom koraka homogenizacije zgruenog uzorka. Ovaj korak bi inae zahtevao korienje aparata, prljavu i dosta zahtevnu proceduru u obradi celog uzorka krvi. Hlaenje uzoraka krvi na oko 4 C je preporueno za produeno odlaganje. Eksperimentalni podaci su pokazali da koncentracija krvi polako opada vremenom kada se skladiti na sobnoj temperaturi. Taan razlog smanjenja nije siguran ali se misli da moe biti od isparavanja alkohola oko epa, ili oksidacije do acetaldehida pomou kiseonika iz oksihemoglobina (crveni krvni pigment). Hlaenje stabilizuje AUK za vremenski period do est meseci. Prezervativ (natrijum-fluorid) i upotrebljeni antikoagulansi ne interferiraju sa analitikim procedurama koje se koriste.

Treba naglasiti da forenzike analize zahtevaju punu krv. Bolnike i klinike laboratorije rutinski razdvajaju tenost i plazmu iz krvi. Plazma se moe pouzdano analizirati na vie hemikalija, ukljuujui i alkohol, koristei automatizovanu opremu dizajniranu za tu potrebu. Forenzike ili toksikoloke laboratorije ipak radije ispituju punu krv na alkohol poto su zakonski odreene vrednosti za upravljanje motornim vozilom date u odnosu na punu krv, npr. 80 mg alkohola u 100 ml krvi. Vrednost koncentracije alkohola u plazmi treba se preraunati na ekvivalentnu koncentraciju u punoj krvi. Poto je ta konverzija direktno povezana sa sadrajem vode u krvi pojedinca, nastaje nesigurnost pri preraunavanju. Sadraj vode, ili vrednost hematokrita, varira ne samo izmeu dve osobe nego i kod jedne osobe. Tako ne moemo precizno dobiti koncentraciju u punoj krvi, samo priblinu vrednost koja se moe nai i izvan intervala poverenja.

3. Analiza

3.1 Hemijska analiza

Analiza AUK je izvoena veim delom XXI veka. Za analizu kondenzata dobijenog predestilacijom krvi razvijene su hemijske metode koje su zasnovane na redoks reakcijama, a vre se mokrim putem. Jednu od najvie korienih metoda je razvio E.M.P. Widmark, vedski naunik koji je prouavao alkohol u telu oveka. Metoda se zasniva na inkubaciji uzoraka krvi iznad rastvora dihromat-kiselina na povienim temperaturama u zatvorenim posudama, i metoda se pokazala kao pouzdana. Sledeih godina je procedura modifikovana, najvie u ranim 1950 -im godinama. Ta modifikovana Widmarkova procedura i danas se primenjuje za verifikaciju sadraja alkohola u standardima krvi, i za proveru rezultata koji su dobijeni drugim procedurama. Hemijske analize koje se rade mokrim putem daju zadovoljavajuu preciznost i tanost, ali zbog prirode procedura, ukljuujui korozivne hemikalije, manje su pogodne za upotrebu. ta vie, ove procedure nisu specifine za etanol, a to se smatra potrebno za forenzike svrhe. Ovim procedurama ne moe se razlikovati etanol od ostalih estih alkohola kao to su metanol ili izopropanol. Metanol se primenjuje kao industrijski rastvara, obeleen kao metil-hidrat, a nalazi se i u proizvodima kao to su sredstva za pranje vetrobrana ili antifriz. On je i toksina supstanca koja se nekad moe nai u ilegalno destilovanim alkoholnim piima, u nekim sluajevima se ak dodaje kao jeftina zamena etanolu. Izopropanol je takoe industrijski rastvara a moe se koristiti i u farmaceutskoj proizvodnji. Kada dospe u veim koliinama u ljudski organizam, i on moe izazvati trovanje. Iz navedenih razloga, upotreba redoks metoda u irem forenzikom kontekstu je ograniena na uzorke uzetih od vozaa koji su konzumirali iskljuivo alkoholna pia. Alternativne metode se koriste kod onih koji su moda bili izloeni ostalim isparljivim supstancama, namerno ili sluajno. Poseban sluaj se javlja u post -mortem ispitivanjima, kada ve dolazi do mikrobioloke razgradnje tela. Mikroorganizmi ne samo da proizvode etanol nego mogu proizvesti i druge isparljive supstance koji mogu ometati analizu alkohola. Te supstance slue kao dokaz za proces razgradnje. Hemijske metode, kao to je modifikovana Widmarkova procedura, ne mogu razlikovati te isparljive supstance od etanola i tako ne mogu identifikovati moguu razgradnju dokaznog materijala.

3.2 Biohemijska analiza

Enzimska oksidacija je jedna druga metoda razvijena u 1950-im godinama za merenje alkohola. Razvijene su brojne metode, od kojih se najvie primenjuju Vitros i Aksim. Zasnivaju se na osnovnoj enzimskoj reakciji:

gde je ADH alkohol dehidrogenaza i NAD+je koenzim nikotinamid adenin dinukleotid. Proizvodi reakcije su acetaldehid i redukovani NADH. Acetaldehid je zarobljen puferom, tris(hidroksimetil)aminometanom (TRIS). Koncentracija alkohola odreuje se

spektrofotometrijski merenjem porasta koncentracije NADH, meri se apsorpcija u UV oblasti na 340 nm. Analiza ADH je razvijena u vidu pribora koji je naao iroku primenu u bolnikim i klinikim laboratorijama. Ti pribori su najpogodniji za laboratorije koje analize rade retko po potrebi, u tim situacijama upotreba skupih i temeljnih metoda nije isplativa. Poslednjih godina primenjuje se automatizova oprema koja omoguuje obradu vie uzoraka. Dodatno ADH procedure su predviene na merenje etanola iskljuivo, to ograniava njihovu upotrebu. U forenzikoj nauci, toksikoloke laboratorije moraju biti osposobljene za detekciju, potvrdu, i po potrebi kvantifikaciju bilo koje isparljive supstance koja je strana ljudskom telu.

3.3 Instrumentalna analiza

Pojava gasne hromatografije (GC) dobila je prednost u forenzikoj analizi alkohola. Iako su cene oprema visoke i koriste se komprimovani gasovi visoke istoe, princip operacije je relativno jednostavan, brz, taan i precizan, i visoko specifian. Osnovni princip GC je prikazan na slici 2. Uzorak se raspruje u injektoru pa se pomou struje inertnog gasa (obino azot ili helijum) nosi kroz dugaku i tanku kolonu koja je uglavnom izraena od nerajueg elika, stakla ili vlaknastog materijala. Kolona moe biti punjena sa nekim adsorbentom, ili otvorena tuba koja ima mali unutranji prenik. Noviji tipovi, poznati kao kapilarne kolone imaju unutranji prenik manji od 1mm. Unutranji zidovi kapilarnih kolona obloeni su adsorbujuim filmom.

Slika 2. ematski prikaz GC ureaja

Raspreni uzorak prolazi kroz kolonu gde komponente dolaze u kontakt sa detektorom. Isparljive komponente uzorka mogu se vizualno pokazati i pomou kompjutera i na papiru (pisa). Razdvajanje i napredak komponenti iz uzorka krvi odreeni su brzinom protoka gasa nosioca, temperaturom kolone i vrste adsorbenta. Protok gasa i temperatura pei mogu se podesiti tako da se postignu optimalni uslovi za odvajanje isparljivih komponenti jednih od drugih. Adsorbent e zadrati isparljivu komponentu do razliitih stepena na osnovu jaine molekularne privlanosti izmeu komponente i adsorbensa. Prolaz komponenti moe potrajati 15 -20 minuta. Kapilarne kolone sa druge strane, ne samo da omoguuju brz veoma prolaz, 5 minuta ili manje, ali i efikasnije razdvajanju komponente. One se zato najee koriste u GC analizi. Kao detektor najee se koristi plameno-jonizacioni detektor (FID). On ne registruje vodu pa je taj detektor est izbor za analizu uzoraka na bazi vode kao to je i krv. Iako se dobije analogni signal, elektrini impulsi mogu se digitalizovati. Tu konverziju vri AD konvertor (analog-digital) pa se digitalni signali mogu kvantifikovati. Merenjem broja impulsa poznate koncentracije alkohola i izradom kalibracione krive moemo odrediti koliinu alkohola u nepoznatom uzorku. Iako je je ta kvatifikacija jednostavan proces, u velikom zavisi od zapremine uzorka proputenog kroz GC kolonu. Laboratorije zato koriste metodu internog standarda, to je pouzdanije. Uzorak krvi se pomea sa rastvorom koji sadri neku drugu isparljivu komponentu kao to je n-propanol da bi se dobio razblaen uzorak. Razblaenim uzorkom se lake rukuje od iste krvi a zapremina koja se injektuje u kolonu nije kritina. Interni standard mora biti isparljiv i mora se lako odvojiti od alkohola koji se meri. Ukupan odnos izmeu internog standarda i alkohola je konstantan bez obzira na varijacije u pomeanim zapreminama ili zapremini razblaenog uzorka proputenog kroz GC kolonu.

Slika 3. Aparat za automatsko razblaivanje uzorka sa internim standardom

Na slici 3. prikazan je tipian aparat, poznat kao automatski razblaiva, koji e prvo ekstrahovati alikvot krvi iz erlenmajera prikazanog u pozadini, a zatim e ispustiti taj alikvot nakon to ga automatsi pomea sa alikvotom internog standarda. Odnos izmeu krvi i internog standarda je obino 1:10 da bi dobili dovoljno razblaen vodeni rastvor krvi i tako smanjili efekat matriksa koji moe uticati na rezultate. Razblaeni uzorak se moe runo uneti, ali to zahteva veliku panju i puno vremena. Zato je runo unoenje zamenjeno automatskim injektorskim sistemima. Ti sistemi se nalaze na vrhu GC instrumenta i automatski uzimaju male alikvote razblaenih uzoraka i injektuju ih u GC kolonu. ak i pri automatskom unosu uzoraka postoji nedostatak, proteini iz krvi mogu zaepiti GC kolonu i sistem za injektovanje. Ti proteini skrauju mogunost upotrebe GC kolona i lako zaepe male tube i igle u sistemu. Iz tog razloga, tehnika poznata kao headspace (HS) uzorkovanje, a koja je predstavljena u 1960-im godinama, postala je glavna komponenta za GC analizu uzoraka krvi. Umesto da se unese alikvot razblaenog uzorka krvi, u GC kolonu unosi se porcija pare koja se nalazi iznad uzorka na bazi vode. GC kolone time traju due, injekcioni sistemi se ne zaepe od proteina krvi, i vie hiljada unosa se moe uraditi u istoj koloni. Pouzdane analize primenom HS-GC zahtevaju da razblaeni uzorci budu temperirani u zatvorenim posudama. Taj period inkubacije omoguuje potpuno izjednaavanje koliine pare iznad tenog uzorka. Na slici 4. se vidi tipina postava HS-GC aparature.

Slika 4. HS-GC instrument

Idealni GC sistem, naroito HS-GC, razdvojie lako isparljive supstance i odredie ih sigurno i precizno u forenzike svrhe. Slike 5. i 6. pokazuju primer razdvajanja smee 4 supstance i internog standarda (n-propanol). Korienje dve razliite kolone na razliitim GC ureajima rezultuje razliito retenciono vreme (vreme potrebno da bi komponenta prola kroz kolonu) i

razliit redosled prolaenja.

Slika 5. FID#1 Kolona: DB-1 0.32 mm x 30 m, 5.0 um film; 1) metanol 2) etanol 3) aceton 4) izopropanol 5) n-propanol (interni standard) Slika 6. FID#2 Kolona: DB Wax x 0.32 mm x 10 m, 0.5 um film; dodat DB-1 0.32 mm x 20 m, 5.0 um film 1) metanol 2) aceton 3) etanol 4) izopropanol 5) n-propanol (interni standard)

4. Obezbeivanje analitikog kvaliteta

Laboratorija koja se bavi forenzikim ispitivanjem alkohola u telesnim tenostima treba da ima dokumentovane i akreditovane procedure. Te procedure sainjavaju metode analize, proces kontrole kvaliteta, i treba da postave kriterijum za tanost, preciznost i specifinost pri ispitivanju. Laboratorije koje rade forenziku analizu alkohola treba da uvaju svu dokumentaciju koja se odnosi na izvoenje analize zbog mogueg svadoenja na sudu. Sav ispitivani materijal treba se tretirati kao dokaz sa odgovarajuom sigurnou, odgovarajuom dokumentacijom, uvanjem i skladitenjem beleki i predmeta. Laboratorije treba da raspolau sa bar jednim strunjakom za forenzike nauke, koji je specijalizovan za analizu alkohola u telesnim tenostima. Kvalifikovani forenziar je osoba, koja na osnovu znanja, vetine i iskustva, preuzima na sebe jedan ili vie od sledeih zadataka: analizu dokaznog materijala, interpretaciju rezultata, svedoenje na sudu. Laboratorije bi trebalo na godinjem nivou da proveravaju svoje testove na alkohol u odnosu na eksterne priznate razvijene testove. Korekcija se treba izvriti kad god se otkrije neki nedostatak metode. Analiza dokaznog materijala se treba obustaviti dok se ne izvri korekcija.

5. Zakljuak
Odreivanje alkohola u krvi danas predstavlja osnovnu analizu u forenzikim laboratorijama. Metode koje se koriste se stalno razvijaju, kako bi se analiza uradila za to krae vreme, a da se pri tome dobiju pouzdani rezultati. Instrumentalne metode su najpogodnije, ali i one imaju svoje mane i nedostatke. Posao forenziara je upravo obrada uzorka i odabir najpogodnije metode za analizu, da bi rezultati bili tani i pouzdan i, a po potrebi da se mogu iskoristiti na sudu kao dokazni materijal.

6. Literatura
1. bs.wikipedia.org/wiki/Datoteka:Gasni_hromatograf_shema.png (2010.12.16) 2. Hodgson, B., Alcohol", u: Siegel, J., Knupfer, G., Saukko, P. (Ed.), Encyclopedia of Forensic Sciences. London: Academic Press, 2000; strana: 74-80. 3. www.forensic-lab.com/publications/hospital.html (2010.12.15)

www.BesplatniSeminarskiRadovi.com