Mszeres analitikai technikk a gygyszerszi s bioanalitikai vizsglatokban

Mszeres analitikai technikk a gygyszerszi s bioanalitikai vizsglatokban Dr. Bak Istvn

Debreceni Egyetem Orvos- s Egszsgtudomnyi Centrum Gygyszersztudomnyi Kar Gygyszerhatstani Tanszk Gygyszerszi mszeres- s bioanalitikai rszleg

Kiad Budapest, 2011

Dr. Bak Istvn, 2011

Kzirat lezrva: 2011. oktber 31.

ISBN KIAD

A kiadsrt felel a: Felels szerkeszt: Mszaki szerkeszt: Terjedelem:

Debreceni Egyetem Orvos- s Egszsgtudomnyi Centrum Gygyszersztudomnyi Kar Gygyszerhatstani Tanszk Gygyszerszi mszeres- s bioanalitikai rszleg

Mszeres analitikai technikk a gygyszerszi s bioanalitikai vizsglatokban

egyetemi jegyzet

rta: Dr. Bak Istvn Egyetemi adjunktus

Debrecen 2011

Elsz Ez a jegyzet a Debreceni Egyetem gygyszerszhallgatinak a Gygyszerszi mszeres s bioanalitika tantrgy sikeres teljestst kvnja elsegteni. Mindeddig problma volt, hogy nem llt rendelkezsre egy egysges knyv vagy jegyzet a hallgatk szmra, gy az egyes tmakrkhz kln-kln kellett irodalmat keresni. Clom egy olyan jegyzet ltrehozsa volt, mely a legjabb s legmodernebb mdszereket tartalmazza, hogy a hallgatk olyan tuds birtokba kerljenek, melyekkel az egyetemrl kikerlve versenykpesek lehetnek a munkaerpiacon. Jelenleg a gygyszeriparban illetve a bioanalitika vizsglatokban az a fejldsi irny, hogy minl kisebb trfogat mintkbl kell egyre kisebb koncentrciban jelenlev vizsgland anyagokat kimutatni. A jegyzet, klnbz mszeres analitikai technikkat, minta-elksztsi mdszereket, in vitro s ex vivo rendszereket mutat be, melyeket a gygyszerkutats, gyrts, minsgellenrzs, valamint a gygyszerek metabolizmusnak, farmakokinetikjnak s toxicitsnak vizsglatban alkalmaznak. Ismertetsre kerlnek tbbek kztt a kismolekulj gygyszerhatanyagok azonostshoz szksges IR, UV-VIS s EI-MS technikk elmleti alapjai s gyakorlati felhasznlsa, klnbz mikroextrakcis technikk, melyeket egyre szlesebb krben alkalmaznak biolgiai mintkban tallhat gygyszerhatanyagok, illetve gygyszerksztmnyek szennyezinek extrakcijra. Szintn rsze a jegyzetnek a biolgiai mintkbl trtn meghatrozsokhoz alkalmazott elvlasztsi (GC, HPLC) s tmegspektrometris (MS) technikk, illetve ezek kapcsolsi lehetsgeinek (LC-MS, GC-MS, MS-MS) elmleti alapjainak s gyakorlati alkalmazsnak ismertetse. A tovbbi fejezetekben bemutatsra kerl a gygyszerek metabolizmusa a szervezetben, illetve ennek vizsglatra alkalmas in vitro s ex vivo rendszerek, tovbb a gygyszer metabolizmus vizsglatok elszrsi fzisban alkalmazhat kmiai s mszeres metdusok (EC-LC-MS, EC-Fenton-MS, stb.). Mivel a jegyzet keretei nem teszik lehetv az ismertetett technikk nagyon rszletes trgyalst, ezrt minden fejezet vgn feltntettem nhny olyan knyvet, amelyek az adott tmval rszletekbe menen foglalkoznak. Remlem, hogy sikerlt egy olyan jegyzet ltrehozsa, mely jelentsen megknnyti a hallgatk felkszlst a vizsgkra, valamint, hogy vgzs utn, a ksbbiekben is hasznt vehetik. Debrecen, 2011. oktber 31. Bak Istvn

Tartalomjegyzk

I. Bevezets II. Kismolekulj szerves vegyletek szerkezetazonostsa II.1. Ultraibolya-lthat (UV-VIS) spektrofotometria II.2. Infravrs (IR) spektroszkpia II.3. Kis molekulatmeg szerves vegyletek tmegspektrometriai vizsglata III. Mintaelksztsi mdszerek a gygyszervegyletek analzishez III.1. Extrakci szilrd mintkbl III.2. Extrakci folyadkokbl III.2.1. Szilrd fzis extrakci (SPE) III.2.2. Szilrd fzis mikroextrakci (SPME) III.2.3. Folyadk fzis mikroextrakci (LPME) III.2.4. Molekulrisan lenyomatolt polimerek (MIPs) III.2.5. Turbulens ramls kromatogrfia (TFC) IV. Kromatogrfis technikk IV.1. Gzkromatogrfia (GC) IV.1.1. Alkalmazott gzok IV.1.2. Mintabeviteli technikk IV.1.3. Gzkromatogrfis kolonnk IV.1.4. Gzkromatogrfis detektorok IV.1.5. A gzkromatogrfia alkalmazsa IV.2. Nagyhatkonysg folyadkkromatogrfia (HPLC) IV.2.1. Eluensek IV.2.2. Mintaadagols IV.2.3. HPLC-s kolonnk, kolonnavdelem IV.2.4. HPLC-s detektorok IV.2.5. A HPLC alkalmazsa IV.3. Szuperkritikus folyadkkromatogrfia (SFC) V. Tmegspektrometria s kapcsolt technikk V.1. Ionforrsok V.1.1. Gyors atom/ion bombzs (FAB/FIB) V.1.2. Mtrix segtett lzerdeszorpci ionizci (MALDI) V.1.3. Atmoszfrikus nyoms ionizci (API) V.2. Analiztorok V.2.1. Mgneses (B) s elektrosztatikus (ESA) analiztor V.2.2. Kvadrupol (Q) analiztor V.2.3. Replsi id (TOF) analiztor V.2.4. Ioncsapda (IT) analiztor V.2.5. Fourier transzformcis ion ciklotron rezonancia analiztor V.3. Kapcsolt technikk V.3.1. Gzkromatogrfia-tmegspektrometria (GC-MS) V.3.2. Folyadkkromatogrfia-tmegspektrometria (LC-MS) V.3.3. Tandem-tmegspektrometria (MS-MS)

1. 2. 2. 5. 9. 21. 21. 21. 23. 26. 28. 30. 33. 37. 43. 43. 44. 47. 49. 50. 50. 52. 53. 53. 55. 55. 56. 59. 59. 59. 60. 62. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 72. 73. 74. 75.

VI. A gygyszerek metabolizmusa VI.1. I. fzis metabolikus reakcik VI.1.1. A citkrm P450 (CYP) rendszer VI.1.2. Nem mikroszmlis oxidcik VI.1.3. Redukci VI.1.4. Hidrolzis VI.2. II. fzis biotranszformcis reakcik (konjugcis reakcik) VI.2.1. Glkuronid konjugci VI.2.2. Glutation konjugci VI.2.3. Acetilezs VI.2.4. Szulftkonjugci VI.2.5. Metilezs VI.2.6. Aminosavkonjugci

82. 83. 85. 92. 93. 93. 94. 95. 97. 98. 99. 100. 101.

VII. Biomimetikus modellrendszerek a gygyszerek metabolizmusnak vizsglatban 103. VII.1. Szintetikus porfirinek 103. VII.2. Fenton-reakci 106. VII.3. Elektrokmiai oxidci s kapcsolt techniki 108. VII.4. I. s II. fzis reakcik egyms utni vizsglatra alkalmas kszlkek 110. VIII. In vitro s ex vivo technikk a gygyszermetabolizmus vizsglatokban VIII.1. Humn CYP450-t s UGT-t expresszl szuperszmk VIII.2. Humn mj mikroszmlis, citoszlikus s S9 frakci (HLM, HLC, HLS9) VIII.3. Immobilizlt enzim reaktorok (IMER) VIII.4. Mj sejtvonalak VIII.5. Mj szeletek, izollt perfundlt mj VIII.6. Tbb szerv sejttenyszeteinek integrlt rendszere (IdMOC) 113. 114. 115. 117. 119. 122. 125.

I. Bevezets A mszeres analitika kifejezs egy rengeteg technikt magba foglal

tudomnyterletet takar. Ezeket a mdszereket szles krben alkalmazzk (1. bra), tbbek kztt komplex biolgiai mintkban tallhat anyagok meghatrozsra, minsgbiztostsi vizsglatokra, szerkezetazonostsra, diagnosztikra s mg szmos egyb alkalmazsra.

1. bra: mszeres analitikai technikk alkalmazsi terletei (FK: farmakokinetika; FD: farmakodinmia; TDM: Therapeutic Drug Monitoring)

A XXI. szzadban a mszeres analitika tudomnyterletnek egyre nagyobb s jabb kihvsokkal kellett szembenznie. A gygyszergyrts, kutats, fejleszts s gygyszeres terpia sorn megnvekedett az igny az egyre kisebb koncentrciban jelenlev meghatrozand komponensek pontos szerkezetnek azonostsra s koncentrcijnak meghatrozsra. Ehhez azonban szksg van a vizsgland anyagok tisztn trtn ellltsra, vagy a klnbz zavar komponensektl trtn elvlasztsra, illetve azok lehetsg szerinti eltvoltsra. gy napjainkban a mszeres analitika nem egyszeren magt a mrst jelenti, hanem egy komplex mveletsort, amely magba foglalja a mintavtelt, a minta elksztst, a mrst, valamint a kapott eredmnyek kirtkelst egyarnt. A piaci versenyfuts tovbbi ignye, hogy meghatrozott id alatt minl nagyobb szm minta elemzse trtnjen meg, gy nagyon jelents fejlds figyelhet meg az egyes mintatrfogatok cskkensben, a nagytereszt kpessg mdszerek kifejlesztsben, illetve az automatizlsban. Azonban ahhoz, hogy pontos s megbzhat eredmnyeket kapjunk szksges az alkalmazott technikk, valamint az ltaluk szolgltatott informcik alapos ismerete.

II. Kismolekulj szerves vegyletek szerkezetazonostsa A forgalomban lv, illetve forgalomba kerl gygyszerek tbbsge szintetikus, kisebb hnyaduk flszintetikus, vagy termszetes eredet vegylet. A gygyszerfejleszts egy hosszadalmas, akr 5-10 ves folyamat, mely sorn tbb ezer vagy mg tbb vegylet elzetes szrsre van szksg. Gyakran egy mr ismert hatsmechanizmus molekult vltoztatnak meg, de elfordul, hogy egy termszetes eredet molekuln hajtanak vgre kmiai mdostsokat (flszintetikus eljrs). Brmelyik eljrst is alkalmazzk, minden esetben szksges az adott molekula pontos s rszletes jellemzse. A molekulk fizikai tulajdonsgai mellett klnbz mszeres analitikai technikkkal meghatrozzk a szerkezett is. Az adott molekulrl rtkes informcikat kaphatunk, ha megvizsgljuk az ultraibolya-lthat (UV-VIS), infravrs (IR), tmeg (MS), valamint mgneses magrezonancia (NMR) spektrumt. II.1. UV-VIS spektrofotometria Br az UV-VIS spektrumok informcitartalma jval cseklyebb az emltetteknl, egy vegylet szerkezetnek jellemzsnl szksges felvenni UV-VIS sznkpt is, mivel fontos informcikat adhat a mellktermkek, intermedierek, vgtermkek szerkezetrl, mind a gygyszerkutats, mind pedig a gygyszer gyrts lpsei sorn. Abban az esetben, ha csak kvantitatv meghatrozsokra hasznljuk az UV-VIS spektrofotometrit, szintn fontos informcikat kaphatunk a szerkezet-spektrum sszefggsekbl, ugyanis ezen ismeretek birtokban megjsolhat, hogy az adott vegylet milyen hullmhosszon detektlhat, vannak e esetleges zavar hatsok az adott hullmhosszon, stb. Lthat teht, hogy br az UV-VIS spektrumok informcirtke viszonylag kicsi, de fontos kiegszt informcikat nyjtanak egy molekula pontos szerkezetnek feldertshez. Az elektromgneses sznkp 200-780 nm kztti tartomnya, mely a rntgen s az IR sugrzs kztt tallhat, az UV-VIS tartomny (2. bra). Az ebbe a tartomnyba es fny abszorpcija a molekulk elektronszerkezett vltoztatja meg, az elektronok az alacsonyabb energij plykrl magasabb energiaszintre kerlnek. Az UV-VIS spektroszkpia a molekulaplyk kztti elektrontmeneteket vizsglja, ezrt gyakran elektronspekroszkpinak, vagy elektrongerjesztsi spektroszkpinak is nevezik.

kozmikus

gamma

rtg.

UV

VIS

IR

mikrohullm

rdihullmok

sugrzs

(m)

2. bra: az elektromgneses sznkptartomny

Amikor kt atom kztt kts alakul ki, az atomplykbl kisebb energij kt, valamint nagyobb energij lazt molekulaplyk alakulnak ki. A nemkt elektronprral rendelkez atomokat tartalmaz molekulk nemkt molekulaplykat is tartalmaznak, melyek energija a kt- s laztplyk energija kztt tallhat (3. bra).

3. bra: molekulaplyk energiaszintjei s lehetsges elektrontmenetek

Fnyabszorpci kvetkeztben a ktplyn lev elektronok a nagyobb energij nemkt plykra kerlnek (3. bra). A legnagyobb gerjesztsi energia a * tmenethez szksges, amihez az un. vkuum-UV tartomnyba es sugrzs energija szksges. Kisebb energij sugrzssal hozhatk ltre a tmenetek, melyek teltetlen ktst tartalmaz, valamint aroms vegyletekre jellemzek. Ezen tmenetek gerjesztshez a rvidebb hullmhossz sugrzs szksges, mg a legkisebb energit ignyl n* tmenetekhez a hosszabb hullmhossz sugrzs is elegend. Az n-* tmenetek ltrehozshoz, melyek a heteroatomot tartalmaz, teltett vegyletekre jellemzek, a * tmenetekhez hasonl nagysg energij sugrzs szksges. Azokat a csoportokat, melyek abszorpcihoz vezetnek az UV-VIS tartomnyban, kromofroknak nevezzk. Ezek teht nllan is

rendelkeznek fnyabszorpcival. Azokat a csoportokat, amelyek nmagukban nem rendelkeznek abszorpcival, de kromofrokkal klcsnhatsba kerlve megvltoztatjk annak abszorpcijt, auxokrmoknak nevezzk. A molekulk abszorpcija fgg az alkalmazott fny hullmhossztl. Ha minden egyes hullmhosszon () felvesszk az abszorbancit (A) s a hullmhossz fggvnyben brzoljuk, akkor a vizsglt anyagra jellemz grbt, az abszorpcis spektrumot (4. bra) kapjuk meg. A spektrumokon abszorpcis svokat s maximumokat figyelhetnk meg. A svok alakja, helye s intenzitsa sszefggsben van a vizsglt molekulk szerkezetvel. A svok alakjt jelents mrtkben befolysolja az alkalmazott oldszer. Az oldott anyaggal klcsnhatsba nem lp oldszerek kedveznek a spektrumok n. finomszerkezetnek kialakulshoz, mivel az UV-VIS tartomnyba es fny energija a rezgsi s forgsi tmeneteket is gerjeszti, melyek kzl a forgsi finomszerkezet csak gz fzisban figyelhet meg. Polris oldszerek esetn a finomszerkezet gyakran teljesen beleolvad a svba. Az oldszerek azonban nem csak a spektrumok finomszerkezetben okoznak vltozsokat, hanem jelents sveltoldsokat is okozhatnak (4. bra). Ha a sv a hosszabb hullmhosszak irnyba toldik batokrm, ha a rvidebb hullmhosszak irnyba, akkor hipszokrm eltoldsrl beszlnk. Ha n a sv intenzitsa hiperkrm, ha cskken, akkor pedig hipokrm eltoldst tapasztalunk.

hiperkrm

hipszokrm

batokrm

hipokrm

4. bra: spektrlis eltoldsok

Az oldszerhatsbl ered sveltoldsok rtkes informcit szolgltatnak a svhoz tartoz elektrontmenetekrl. Apolris-polris oldszercsere kvetkeztben a * tmenetekhez tartoz svok, batokrm, mg az n* tmenethez rendelhet svok hipszokrm eltoldst szenvednek.

A fentebb lertak az UV-VIS spektrofotometria alapjait csak egyszerstve s nagyon rviden trgyaltk. A gyakorlatban ettl jval bonyolultabb esetekkel tallkozhatunk, mivel egy viszonylag egyszer molekula, tbb gerjeszthet elektront is tartalmazhat, aminek kvetkeztben szles, gyakran egymst tfed svok alakulhatnak ki, ami megnehezti az egyes hozzrendelseket. Jelen jegyzet keretei nem teszik lehetv az egyes vegyletcsoportok UV-VIS spektrofotometriai jellemzinek ismertetst. Azoknak, akik behatbban kvnnak foglalkozni az UV-VIS spektrofotometria elmleti alapjaival s gyakorlati alkalmazsval, figyelmbe ajnlom Grg Sndor: Spektrofotometris gygyszeranalzis: Az ultraibolya-lthat spektrofotometria gygyszeranalitikai alkalmazsai, s Dinya Zoltn: Elektronspektroszkpia, cm munkit. II.2. Infravrs (IR) spektroszkpia Az elektromgneses sznkp IR tartomnya (14000 cm-1-20 cm-1) kzvetlenl a lthat tartomny utn tallhat s a mikrohullm tartomnyig tart (2. bra), melyet tvoli, kzps s kzeli tartomnyokra oszthatunk. A szerkezet-meghatrozsokhoz a kzps vagy ms nven analitikai IR tartomnyt hasznljuk, mely a 4000-400 cm-1 kztti rszt jelenti. Az IR sugrzs energija a molekulk forgsi s rezgsi tmeneteinek gerjesztshez elegend, azonban csak abban az esetben kapunk IR spektrumot, ha a sugrzs kvetkeztben megvltozik a molekula diplusmomentuma. Ez azt jelenti, hogy a homonukleris ktatomos molekulk rezgsei, valamint lineris tbbatomos molekulk bizonyos rezgsei, IR inaktvak. Kt tpus rezgst klnbztethetnk meg, a vegyrtk () s a deformcis (, , ) rezgseket. Az els a ktsek mentn trtn elmozdulst, vagyis a kts meghosszabbodst, vagy rvidlst takarja, mg a msik esetben a ktsszgek vltoznak meg. Tbbatomos molekulk vagy csoportok esetn megklnbztetnk szimmetrikus s aszimmetrikus vegyrtkrezgst (5. bra).

aszimmetrikus vegyrtkrezgs

szimmetrikus vegyrtkrezgs

5. bra: vegyrtkrezgsek

Deformcis rezgsek esetn beszlhetnk skban s skra merleges deformcis rezgsekrl, melyeken bell pedig ollz, kaszl, blogat s torzis rezgsek klnthetek el (6. bra).

, ollz

, kaszl

, torzis

, blogat

6. bra: deformcis rezgsek (+ s - a skbl trtn mozgsokat szimbolizlja)

Ktatomos molekulknak csak vegyrtkrezgse lehetsges, mg tbbatomos molekulk esetn sokkal tbbfle rezgssel kell szmolni. Ebbl az kvetkezik, hogy a tbbatomos molekulk IR spektruma jval sszetettebb. Egy N szm atomot tartalmaz molekula 3N szm szabadsgi fokkal rendelkezik (a 3 trkoordinta irnyban). Ha az sszes szabadsgi fokbl kivonjuk a trkoordintk 3 irnyba trtn transzlcis s rotcis mozgsokhoz tartoz szabadsgi fokokat, gy nemlineris molekulk esetn 6-al, lineris molekulk esetben pedig 5-el (mivel ezeknek csak 2 rotcis szabadsgi foka van) cskken a rezgmozgsokhoz rendelhet szabadsgi fokok szma (1. tblzat). 1. tblzat: poliatomos molekulk szabadsgi fokai szabadsgi fokok transzlcis rotcis vibrcis sszesen nemlineris molekulk 3 3 3*n-6 3*n lineris molekulk 3 2 3*n-5 3*n

Ebbl a nagyon egyszer egyenletbl kiszmolhat, hogy egy tbbatomos molekulnak hny rezgse van, vagyis elviekben hny svot tallhatunk az IR spektrumban. Pl. a propnnak (C3H8) 27 rezgse van, azonban ez a gyakorlatban nem gy valsul meg. Ennek tbb oka is van. A tbbatomos molekulk bonyolult rezgsei visszavezethetek n. normlrezgsekre. Mindezeken tl a spektrumokban tallhat svok szmt s megjelenst befolysoljk mg

az n. felhangrezgsek s kombincis svok megjelense, a Fermi-rezonancia s klnbz csatolsok fellpse. Tovbbi problmt jelent az IR-spektrumok rtkelsben, hogy bizonyos rezgsek IR-inaktvak, mg vannak olyanok, melyek frekvencija azonos, ezek az n. degenerlt rezgsek. Egy egyszer plda ennek szemlltetsre a 3 atomos lineris CO2 molekula, melynek az egyenlet alapjn 4 db rezgst klnbztethetjk meg (7. bra).

7. bra: a CO2 molekula rezgsei

A gyakorlatban azonban a CO2 spektruma kt svot tartalmaz. Ennek a magyarzata az, hogy a szimmetrikus vegyrtkrezgs, mivel nem okoz diplusmomentum vltozst, IR-inaktv, tovbb a kt deformcis rezgs azonos mrtk vltozst okoz, vagyis azonos a frekvencija (degenerlt), gy egy svot ltunk. Az elzekbl jl lthat, hogy az IRspektrumok rtelmezse nem egyszer feladat. ltalnosan elmondhat, hogy a vegyrtkrezgsek magasabb, mg a deformcis rezgsek alacsonyabb frekvenciknl tallhatk. Ugyanez igaz a kts erssgre, vagyis az ersebb ktsekhez tartoz svok magasabb rezgsi frekvencival rendelkeznek. Ahogy a 8. brn is lthat, ellenttben az UV-VIS tartomnnyal, a gyakorlatban nem a hullmhossz rtkt, hanem a hullmszmot, vagy frekvencit adjuk meg (). Az infravrs spektrumokon pedig a transzmittancia %-ot (T%) brzoljuk a fggvnyben (8. bra).

8. bra: a benzoesav IR spektruma

Egy IR-spektrumot csoportfunkcis (~ 4000 cm-1-1000 cm-1) s ujjlenyomat (~ 1000 cm-1>) tartomnyra oszthatunk. Az elsben kevesebb, a msodikban jval tbb svot tallunk. Ha kt spektrum ujjlenyomat tartomnyban tallhat svok teljesen fedsbe hozhatak, az azt jelenti, hogy a kt anyag azonos. A csoportfunkcis tartomnyban, ahogy ezt a neve is mutatja a legfontosabb funkciscsoportokhoz, meghatrozott ktsekhez, illetve atomcsoportokhoz tartoz jellemz svok tallhatak, melyeket karakterisztikus ktsi-, illetve csoportfrekvenciknak neveznk. Ezek megjelenhetnek X-Y vgcsoportok esetn, abban az esetben, ha X s Y atomok tmege jelentsen eltr egymstl. Ilyenek pl. a klnbz X-H (X: O, N, C) vegyrtkrezgsek (9. bra).

X-Y X=Y XY X-H 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 cm
-1

9. bra: karakterisztikus ktsfrekvencik megjelensi tartomnyai

A legnagyobb frekvencija az O-H vegyrtkrezgsnek, a legkisebb a C-H rezgsnek van. A klnbz X-H svok egymstl jl megklnbztethetek, azonban figyelembe kell venni, hogy a klnbz inter- s intramolekulris hatsok jelentsen befolysolhatjk a svok helyt s alakjt. Karakterisztikus ktsi frekvencik jelenhetnek meg abban az esetben is, ha a vizsglt kts erllandja jelentsen eltr a szomszdos ktsektl, pl. tbbszrs ktsek esetn (C=C, C=O, C=N, CC, CN). Az X-Y ktsek tartomnya 500-1500 cm-1 tartomnyban tallhat. Azonostsuk gyakran nehzsgekbe tkzik, mivel szmos deformcis- s vzrezgs is ebben a tartomnyban tallhat. A ketts ktsek az 1500-2000 cm-1, mg a hrmas ktsek a 2000-2500 cm-1 kztti frekvencia tartomnyba esnek (9. bra). Az IR spektrumelemzst az teszi lehetv, hogy az egyes ktsekhez, atomcsoportokhoz tartoz rezgsi frekvencik a klnbz molekulkban, vagyis klnbz kmiai krnyezetben kzel azonosak. Mivel azonban az adott kts vagy atomcsoport csak rszben fggetlen a molekula tbbi rsztl az IR-spektroszkpiban nem konkrt hullmszm rtkekrl, hanem frekvenciatartomnyokrl beszlnk, amelyen bell a ktsre, vagy csoportra jellemz abszorpcis svok valsznleg megjelennek. Az IR-spektrumok rtkelse sorn egy kts vagy csoport jelenltt igazolja, ha a hozztartoz svok kzl tbbet is tudunk azonostani, azonban egy-egy sv hinya nem bizonytja ennek ellenkezjt, vagyis a kts vagy csoport hinyt. Ennek oka, hogy a spektrumban megjelen svok helyt s intenzitst nagyon sok hats, tbbek kztt intra- s intermolekulris effektusok, csatolsok, sztrikus s elektron-eltoldsi effektusok, kombincis s felhangsvok megjelense befolysolja. Az esetleges spektrumrtkelsi nehzsgek ellenre az IR-spektrumok tbb informcit szolgltatnak a szerkezetvizsglatok sorn, mint az UV-VIS spektrumok, mivel konkrt ktsek s szerkezeti egysgek jelenlte azonosthat. nmagukban ezek sem elegendek egy-egy szerkezet teljes azonostshoz, azonban kiegsztve egyb spektroszkpiai mdszerekkel (MS, NMR, UV-VIS) segtsgnkre lehetnek a lehetsges szerkezetek vzolsban, vagy az azonostsban. Jelen jegyzet keretei nem teszik lehetv az IR-spektroszkpia rszletesebb trgyalst, klnsen nem az egyes vegyletcsoportokra jellemz jellegzetes IR-spektrumok ismertetst. Aki rszletesebb informcit szeretne kapni, annak ajnlom Dinya Zoltn: Infravrs spektroszkpia cm jegyzett, mely rszletesen ismerteti az IR-spektroszkpia elmleti alapjait, majd rengeteg pldval illusztrlva trgyalja az IR-spektroszkpia alkalmazst a szerves vegyletek szerkezetvizsglatban.

II.3. Kis molekulatmeg szerves vegyletek tmegspektrometriai vizsglata A tmegspektrometria jellemz tulajdonsgai (egyedlll rzkenysg, gyorsasg, specificits, szleskr alkalmazhatsg) kvetkeztben kiemelkedik az analitikai technikk kzl. J. J. Thomson 1912-ben alkotta meg az els tmegspektromtert, ami azta tretlen s risi fejldsen ment keresztl. Kezdetben csak egykomponens tiszta anyagok vizsglatra alkalmaztk, azonban elvlasztstechnikai mdszerekkel kombinlva mg szlesebb kr alkalmazsa vlt lehetv, mivel gy sszetett mintk minsgi s mennyisgi elemzse is gyorsan kivitelezhet. Egy tmegspektromter ltalnos felptse a 10. brn lthat. A minta bejuttatsa trtnhet kzvetlenl vagy valamilyen elvlasztstechnikai egysg (GC, HPLC, CE, stb.) segtsgvel, majd a vizsgland anyag az ionforrsba kerl. Az ionforrs feladata tlttt rszecskk ellltsa s tovbbtsa a tmegspektromter kvetkez rszbe, az analiztorba, ahol a kpzdtt ionokat vlasztjuk szt fajlagos tmegk (tmeg/tlts: m/z) alapjn, majd pedig az elvlasztott ionokat s intenzitsukat detektlja a kszlk. Az ionram intenzitsokat a fajlagos tmeg fggvnyben brzolva kapjuk a tmegspektrumot, ami a minsgi informcit szolgltatja. Az ionforrs, analiztor s detektor nagyvkuumban tallhat. Kivtelt kpeznek az atmoszfrikus nyoms ionforrssal (API) mkd kszlkek, melyek ismertetse egy msik fejezetben trtnik.

Adatgyjt s vezrl rendszer

Mintabeviv rendszer

Ionforrs

Analiztor

Vkuumrendszer
10. bra: MS kszlkek ltalnos felptse

Az

ionok

ltrehozshoz

alkalmazott

energia

fggvnyben

Detektor
tbbfle

ionforrst

klnbztetnk meg, melyek kzl az egyik leggyakrabban alkalmazott az elektron vagy elektrontkzses (electron impact; EI) ionforrs (11. bra). A mintt beprologtatjuk az

10

ionizcis kamrba. Ez egyben azt is jelenti, hogy csak olyan anyagok vizsglatra alkalmas, amelyek bomls nlkl elprologtathatak. Ellenkez esetben egyb ionizcis technikt kell alkalmazni, amelyekrl egy msik fejezetben lesz sz.
and

minta

e-

analiztor

repeller elektrd

fttt filament

11. bra: EI inforrs felptse

A bejuttatott minta molekulinak ionizcijt nagy energij elektronok vgzik, amelyek egy fttt filamentbl lpnek ki s egy szemben lev and fel gyorsulva haladnak, mikzben beletkznek a beprologtatott minta molekuliba kitasztva azokbl egy elektront, gy hozva ltre tlttt rszecskket, amiket ebben az esetben molekulaionnak (M+ ) neveznk. A tlttt rszecskket az n. repeller, vagy ms nven taszt elektrd, mely azonos tlts a keletkezett tlttt rszecskkkel, kitasztja az ionizcis trbl, majd egy gyorst elektromos tr hatsra jutnak a rszecskk az analiztorba. Az ionizci folyamata sorn a molekulaion mellet kt lass elektront kapunk, melyeket a vizsgland molekulk befoghatnak negatv tlts molekulaiont kpezve:
.

M: + eM: + e-

M + . + 2 e. M-

A legtbb esetben a molekulaion n. fragmentcin megy keresztl. Mivel ez egy gykkation, pratlan szm elektronnal, a fragmentci sorn kpzdhet egy pros elektronszm (EE: Even Electron-pros elektron) ion s egy gyk (Radical: R.), vagy pedig egy semleges (Neutral: N) molekula kilpsvel egy negatv elektronszm (OE: Odd Electron-pratlan elektron) ion (12. bra).

11

12. bra: molekulaion fragmentcija (EE: even electron number, OE: odd electron number, R: radical, N: neutral molecule)

A fragmentci sorn a molekulaionbl, amelyet anyaionnak is neveznk, fragmensionok (leny ionok) keletkeznek, amelyek tovbb fragmentldhatnak (unoka ionok). A keletkezett ionokat az analiztor vlasztja szt m/z szerint s az elvlasztott ionok elfurdulst vagy intenzitst ennek fggvnyben brzolva kapjuk a tmegspektrumot (13. bra).

f ragmens ionok 100% EE1+ EE2+ R -N -R m/z bziscscs

13. bra: MS spektrum s fragmentci

Ionok intenzitsa

-R OE1 -N

A spektrum legintenzvebb (100%) cscst bziscscsnak nevezzk. A legnagyobb tmeg cscs a mlcscs, ami a molekulaionhoz tartozik. Ez adja meg a molekula relatv mltmegt. A gyakorlatban 70 eV ionizcis energit alkalmazunk, ami elegend a molekulaion s a fragmensionok kpzdshez egyarnt. ltalnosan elmondhat, hogy ennl az energinl kapjuk a leginformatvabb MS spektrumokat. Nagyon gyakran azonban nem kapunk molekulaiont. Ilyen esetekben segthet az ionizcis energia cskkentse, ami a molekulaion stabilitst eredmnyezi, azonban cskken a fragmens ionok szma. Msik lehetsg a

12

molekulatmeg meghatrozsra alternatv ionforrs hasznlata. Az EI ionforrst gyakran hard vagyis kemny ionizcinak is nevezik. Ennek kmletesebb mdja a kmiai ionizci (CI), ami a lgy ionizcis technikk kz tartozik. A CI ionforrsok felptse majdnem teljesen megegyezik az EI ionforrsval. Lnyeges klnbsg, hogy tartalmaz egy n. reagens gz bevezetsre alkalmas rszt. Az ionizcis trben az EI ionizcinak megfelelen elszr a feleslegben lv reagens gz molekuli ionizldnak, majd a kpzdtt ionok a minta molekulival tkzve ion-molekula tkzsek kvetkeztben ionizljk a vizsgland anyag molekulit. A leggyakrabban alkalmazott reagens gz a metn, de alkalmazhatunk izobutnt, vagy ammnit. Az ionizci felttelezett mechanizmust a metn pldjn bemutatva a kvetkez egyenletsor szemllteti (M: a vizsgland molekula):

CH4 + eCH4 + CH4+. CH3+ + CH4 CH5+ + M C2H5+ + M

CH4+. + 2 eCH3. + CH5+ C2H5+ + H2 CH4 + [M+H]+ [M+C2H5]+

Lthat, hogy ellenttben az EI ionizcival, itt nem valdi molekulaionokat, hanem n. kvzi-molekulaiont ([M+H]+) kapunk, ami leggyakrabban a molekula protonlt formja, de termszetesen egyb adduktok is kpzdhetnek. CI ionizci esetn a spektrum sokkal egyszerbb, kevesebb fragmens iont tartalmaz, azonban nagyon nagy elnye, hogy biztos mltmeg informcit kapunk. Ennek az ionforrsnak is htrnya, hogy csak a bomls nlkl gzfzisba vihet anyagok vizsglhatak vele, egyb esetekben ms mdszerek alkalmazsa vlik szksgess (FAB/FIB, MALDI, stb.), melyek ismertetsre az ionok elvlasztst vgz analiztor tpusokkal egytt a ksbbiekben kerl sor. A tmegspektrum legfontosabb rsze a molekulaion, mivel azonostsval megkapjuk a relatv mltmeget, tovbb nagyfelbonts kszlkek alkalmazsval meghatrozhat az elemi sszettel is. Tovbbi segtsget nyjt a vizsglt molekula azonostsban nhny egyszer szablyszersg. Az els a nitrogn szably, ami kimondja, hogy ha a molekula pratlan szm nitrogn atomot tartalmaz, akkor molekulatmege pratlan, ha viszont nem, vagy pros szm nitrogn atom tallhat benne, akkor a mltmeg pros szm. Ezt szelltetik a 14. brn lthat spektrumok.

13

M+.

m/z

M+.

m/z

M+.

m/z 14. bra: a benzoesav, a 3-amino-benzamid s a 3-amino-benzoesav EI-MS spektruma

14

A kvetkez a gyrk s tbbszrs ktsek szablya, amit teltelensgnek, vagy Hdeficitnek is neveznek. A molekula sszegkpletnek ismeretben a kvetkez egyenlet alapjn kiszmolhat az abban tallhat gyrk s teltetlen ktsek szma. Egy ltalnos molekula AyQnRzTx (A = H, Hlg; Q = O, S; R = N, P; T = C, Si) esetn: Teltetlensg (Unsaturation; US) = X - 1/2Y + 1/2Z + 1 A szmtott rtk pros elektron szm ionok (EE+) esetben 1/2-re vgzdik, amit elhagyva kapjuk a megfelel rtket. A harmadik segtsg egy MS spektrum rtkelsben az elemek termszetes izotpeloszlshoz kapcsoldik, mivel eltekintve nhny monoizotpos elemtl az elemek izotpok keverkei. Ez a termszetes izotpeloszls megjelenik a MS spektrumokban is s jl hasznosthat informcit szolgltathat bizonyos atomok jelenltrl s szmrl a molekulban. A 2. tblzatban nhny gyakori atom termszetes izotpjai s elfordulsi gyakorisguk van feltntetve. Az izotpok alapjn megklnbztetnk A, A+1 s A+2 elemeket. Az A elemek monoizotposak (19F, 127I, H). Br a H-nek van termszetes izotpja, de elfordulsi valsznsge annyira kicsi, hogy a H-t monoizotposnak tekintjk. Az A+1 elemeknek van egy olyan izotpjuk, melynek tmege 1 tmegegysggel (12C, 13C, 14N, 15N), mg az A+2 elemeknek szintn van egy msik izotpjuk melynek tmege 2 tmegegysggel (35Cl, 37Cl, 79Br, 81Br) nagyobb a legnagyobb termszetes elforduls izotpnl. 2. tblzat: atomok s termszetes izotpjaik gyakorisga
12 13 35

C C

98,802% 1,108% 75,7705% 24,2295% 50,686% 49,314% 99,9855% 0,0145%

16 18 14

O O N N S S S

99,7587% 0,2039% 99,6337% 0,3663% 95,018% 0,750% 4,215%

Cl Cl

37 79 81

15

Br Br H H

32 33 34

1 2

A legknnyebben a Cl s Br atomok jelenlte llapthat meg a MS spektrumok elemzse sorn. A Cl atom izotpjainak elfordulsa ~ 3:1, vagyis ha a molekula egy db Cl atomot

15

tartalmaz az M s M+2 cscsok arnya 3:1 lesz a tmegspektrumban. Ez abbl addik, hogy a tmegspektromter kt iont detektl, melyek kzl az egyik a 35-s (R-35Cl) mg a msik a 37s (R-37Cl) tmegszm Cl atomot tartalmazza. Brm atomok esetn az M s M+2 cscsok arnya ~ 1:1. Kt klr atom esetn mr megjelenik egy M+4 cscs is, mivel a detektlt rszecskk a kvetkezek: R-35Cl35Cl M R-35Cl37Cl M+2 R-37Cl37Cl M+4

Az szlelt cscsok intenzitsa egy egyszer kplettel kiszmthat: (a+b)n ahol a s b az izotpok gyakorisgt, mg az n a molekulban lev szmukat jelenti. Vagyis 2 db Cl atom esetn: (3+1)2 = 9+6+1, teht a cscsok intenzitsarnya M:M+1:M+2=9:6:1. Termszetesen tbb izotp, illetve klnbz atomkombincik esetn a kplet bonyoldik. Klnbz atomok esetn a megfelel polinomok szorzata adja az izotparnyoknak megfelel sszefggst (a+b)n x (c+d)m x ... A
13

C jelenltbl add M+1 cscs is fontos informcit adhat a molekulban jelenlev C

atomok szmrl, amit a kvetkez egyenlettel szmolhatunk:

nc =

I M +1 100 1,1I M

Ezt az egyenletet azonban mindig vatosan kell hasznlni, mivel az M+1 svok intenzitshoz egyb tnyezk (pl. az ion protonldsa) is hozzjrulhatnak. Ezek az egyszer vagy egyszernek ltsz szablyok segthetnek a tmegspektrumok rtelmezsben. Egy meghatrozott szerkezet azonostsra tbb lehetsg van. Egyrszt a mrt spektrumot sszehasonlthatjuk ismert vegyletek tmegspektrumval. Ehhez szksges megfelel adatbzisokkal (spektrumknyvtrakkal) rendelkezni, ami az adatbzis nagysgtl fggen tbb milli Ft is lehet. A szmtgp sszehasonltja a mrt spektrumot a spektrumknyvtrban tallhatkkal, amihez egy hasonlsgi indexet (Similarity Index, SI) rendel. Gyakran elfordulhat azonban, hogy a nagymrtk hasonlsg nem azonos vegyleteket takar, vagy pedig tbb spektrummal is elg nagy a hasonlsg, gy neknk kell eldnteni, hogy melyik a megfelel. Ehhez azonban szksges ismerni azokat a folyamatokat, melyek segtsgvel a molekula szerkezete azonosthat. Ezen jegyzet keretei csak a legalapvetbb folyamatok ismertetst teszi lehetv. Akik behatbban kvnnak foglalkozni a tmval, azoknak figyelmbe ajnlom Dinya Zoltn: Szerves tmegspektrometria cm

16

jegyzett, ami rszletesen bemutatja az ionkpzds folyamatait, a fragmentcis reakcikat s rengeteg pldval illusztrlva ismerteti az egyes vegyletcsoportok ltalnos EI-MS jellemzit is. A tovbbiakban nhny jellemz fragmentcis reakci kerl bemutatsra. A molekulaion bomlsa, fragmentcija nagyon gyorsan lejtszd, prhuzamosan fut reakcik sorozata, amely trtnhet a molekulaion hasadsa vagy pedig trendezdse tjn. A ktsek hasadsa lehet homolitikus, amikor a ktst kpez elektronok megoszlanak a keletkezett molekularszleteken, illetve heterolitikus, amikor mindkt elektron az egyik molekularszletre kerl. A legegyszerbb folyamat a -ktshasads (15. bra). Ekkor az ionizci utn a kts hasadsakor egy gyk s egy karbokation keletkezik. Azt, hogy melyik csoport tvozik el gykknt, a stabilitsi viszonyok hatrozzk meg.

R3-C:C-R3

e-

R3-C +. C-R3
15. bra: -ktshasads

R3-C. + +C-R3

A teltett karbokationok stabilitsa tercier, szekunder, primer sorrendben cskken. Elgaz sznlnc esetben a hasads az elgazs melletti ktsen preferlt. A folyamatban mindig a legnagyobb trkitlts csoport tvozik el gykknt (Stevenson-Audier szably). Termszetesen ez nem azt jelenti, hogy csak az a kts hasad fel az ionizci sorn. Megjelennek a tbbi kts hasadsa kvetkeztben keletkez fragmensek cscsai is, de az intenzitsuk sokkal kisebb lesz. A tltst vagy gykt hordoz atomhoz vagy ktshez kpest alfa helyzetben lev kts hasadst -hasadsnak (16. bra) nevezzk, ami nagyon jellemz heteroatomot (N, O, S) tartalmaz molekulkra. (A fragmentcis reakcik felrsakor a flszakll nyilak egy elektron, mg a teljes nyilak egy elektron pr elmozdulst szimbolizljk.)

16. bra: -hasads

17

A folyamat sorn homolitikus hasadssal egy gyk s egy pros elektronszm ion kpzdik. Az ionizci sorn a legknnyebben a nem kt elektronprokbl tvolthat el elektron, majd a -elektronok s vgl a -elektronok kvetkeznek. Hasonl hasadsi folyamatot indthat el a teltetlen kts is (17. bra), amelyet olefinek esetn allil-, mg aroms vegyletek esetn benzil-hasadsnak neveznk.

17. bra: allil-, benzil-hasads

A folyamatban az olefinbl keletkez ion ciklizldssal, mg a benzilion feltehetleg trendezdssel stabilizldik s egy kiugr stabilits, diagnosztikus jelentsg iont az n. troplium iont eredmnyezi (17. bra). Az elzekben bemutatott fragmentcis reakcik sorn a molekulaionokbl, egy kts hasadsa kvetkeztben gykk tvoztak el. A tovbbiakban nhny egyszerbb, de fontos trendezdsi reakci kerl bemutatsra. Ezek sorn kt kts hasadsa sorn semleges molekulk lpnek ki a molekulaionokbl. A legismertebb s leggyakoribb trendezdsi reakci a McLafferty-trendezds (18. bra). A folyamatban egy teltetlen csoporthoz viszonytva -helyzetben lev H atom, egy hattag tmeneti llapoton keresztl a teltetlen csoportra vndorol, mikzben egy gykkation alakul ki s egy semleges alkn eliminldik.

18

18. bra: McLafferty-trendezds

A tmegspektrumokban a McLafferty-trendezdssel keletkezett ionok ltalban jl felismerhetek s diagnosztikus rtkek, tbbek kztt karbonsavak, szterek, oximok, amidok, terek, stb. esetn. Alifs- s aroms-karbonsavszterek esetben pedig elfordul egy a McLafferty-trendezdssel prhuzamosan lejtszd fragmentcis reakci, ami 2 db Hatom vndorlssal jr s McLafferty+1 vagy McLafferty trendezds 2-H transzferrel elnevezst kapta (19. bra). Az trendezds egy rszletesen mg nem teljesen tisztzott ktlpses folyamat.

19. bra: McLafferty+1 trendezds

A karbonsav szterek spektrumaiban mind a McLafferty mind a 2-H-vndorlssal keletkez ionok cscsai azonosthatak. Szintn diagnosztikus jelentsg a nitro csoport trendezdse, melynek kt felttelezett mechanizmusa van (20. bra). Az trendezds kvetkeztben nitrogn-monoxid eliminldik, ezzel magyarzhat a 30-as tmegveszts, majd a keletkezett ion CO eliminci tjn fragmentldik tovbb.

19

20. bra: nitro-csoport trendezdsnek felttelezett mechanizmusai

Aroms gyrhz kapcsold szubsztituensek elhelyezkedsrl fontos informcit szolgltat az n. orto-eliminci (21. bra), vagy ms nven orto-effektus. Ez is H-vndorlsi reakci. Abban az esetben, ha a szubsztituensek valamelyike tartalmaz mozgkony H atomot (OH, NH2, SH), a msik pedig egy olyan tvoz csoportot, amely akceptora a H-nek, gy egy semleges molekula eliminldik:

21. bra: orto-effektus ltalnos mechanizmusa

A sztrikus viszonyok kvetkeztben meta, illetve para-helyzet szubsztituensek esetben ez a reakci nem jtszdik le. Meg kell jegyezni, hogy az elnevezs ugyan a gyr szubsztitcis

20

viszonyaibl ered, azonban nem csak gyrs vegyletek esetn jtszdhat le a folyamat. gy pl. 1,2-diszubsztitult olefinek esetben megklnbztethetek a cisz s transz izomerek.

Az elzekben a kismolekulj szerves vegyletek szerkezetvizsglatainak alapjai kerltek bemutatsra. Fontos megjegyezni, hogy az emltett fragmentcis folyamatok mellett egyb reakcik is lejtszdnak. Minl sszetettebb egy molekula annl bonyolultabb a tmegspektruma s annl nehezebb az azonostsa. Termszetesen nagyon ritka az olyan feladat, amikor teljesen ismeretlen, minden egyb informci nlkli (elemi sszettel, felttelezett szerkezet) anyagok azonostsa a feladat. Minden esetben clszer azonban a kvetkez lpsek betartsa a spektrumok elemzse sorn: 1. A molekulaion azonostsa 2. Elemi sszettel, teltetlensg (US) meghatrozsa 3. Ionszrik, jellemz ionok vizsglata 4. Neutrlis fragmensek lehetsges szerkezetnek vzolsa 5. Lehetsges trendezdsek megfontolsa 6. Lehetsges szerkezet vzolsa Jelen jegyzet keretei nem teszik lehetv az egyes vegyletcsoportok

tmegspektrometriai viselkedsnek rszletes taglalst. Akik behatbban kvnnak foglalkozni a terlettel, ajnlom Dinya Zoltn korbban mr emltett jegyzett, Jrgen H. Gross, Mass Spectrometry: A textbook, valamint, R. Martin Smith, Understanding Mass Spectra: A basic approach cm munkit.

21

III. Mintaelksztsi s mikroextrakcis mdszerek a gygyszervegyletek analzishez A mszeres analitikai vizsglatok sorn nagyon gyakran olyan mintt kapunk, amelyet nem lehet kzvetlenl elemezni, hanem valamilyen mintaelksztsi mveletet vagy mveletsort kell vgrehajtani. Az analitikai vizsglatok egyik sarkalatos pontja a mintaelkszts, mivel ha a folyamat sorn hibt kvetnk el, rendelkezhetnk a legrzkenyebb, legspecifikusabb s akr a legdrgbb kszlkkel a mrsi eredmny hamis lesz. Azt, hogy milyen technikt vlasszunk a vizsgland anyag tulajdonsgai, a minta mtrix, valamint a rendelkezsre ll mintamennyisg jelents mrtkben befolysolja. Vannak olyan technikk, amelyek a vizsgland anyagok teljes extrakcijt valstjk meg (folyadk-folyadk extraki-LLE, szilrd fzis extrakci-SPE), illetve olyanok, amelyek egy dinamikus egyensly bellsn alapulnak a minta s egy extrahl fzis kztt (szilrd s folyadk fzis mikroextrakci-SPME, LPME). Az extrakcis technikk az utbbi vtizedekben jelents fejldsen mentek keresztl. Fontos szempont, hogy a meghatrozott technika minl gyorsabb, pontosabb legyen, megfelel legyen a reproduklhatsga, s minl kisebb legyen az oldszerignye. A napjainkban leggyakrabban alkalmazott extrakcis mdszerek nagyon kis mennyisg (nhny ml), vagy szinte semennyi (n. oldszer mentes extrakci) szerves oldszert nem ignyelnek. III.1. Extrakci szilrd mintkbl Szilrd anyagokbl trtn extrakci legegyszerbb kivitelezsi mdja, ha a mintt egy lombikba helyezzk, megfelel oldszert ntnk hozz, majd az egszet felmelegtjk s kevertetjk. Az oldszerprolgst egy visszacsepeg htvel gtoljuk meg. Htrnya ennek a megoldsnak, hogy id s energiaignyes, az alkalmazott vegeszkzk knnyen trnek, de legnagyobb problma a viszonylag nagy mennyisgben alkalmazott szerves oldszer. Az esetlegesen visszamaradt szilrd maradkot ki kell szrni, majd a szrletet beprolni. Ezt a folyamatot gyorsthatjuk n. Soxhlet-extraktor alkalmazsval. Ennak legnagyobb elnye, hogy az extrakcit mindig friss oldszer vgzi. Htrnya, hogy tovbbra is id s energiaignyes, szintn vegeszkzket alkalmazunk, amelyek knnyen trnek, s szintn nagymennyisg oldszerfelhasznls van. Jelentsen gyorsthatjuk az extrakcit, ha valamilyen instrumentlis technikt vlasztunk. Ezek kz tartozik tbbek kztt a gyorstott oldszeres extrakci (Accelerated Solvent Extraction: ASE), a mikrohullm segtette extrakci (Microwawe Assisted Extraction: MAE), valamint a szuperkritikus 22

folyadk extrakci (Supercritical Fluid Extraction: SFE). Br ezek a technikk viszonylag nagy beruhzsi kltsggel rendelkeznek, de zemeltetsk vgeredmnyben kifizetdbb, mint a klasszikus technikk. Legnagyobb elnyk, hogy az extrakcihoz felhasznlt oldszer mennyisge jelentsen kevesebb sszehasonltva a klasszikus technikkkal, ami a gazdasgossgon tl fontos szempont a krnyezetvdelem tekintetben is. Mindhrom technika, a megemelt hmrsklet s nyoms kvetkeztben gyors extrakcit tesz lehetv. Tovbbi elnyk, hogy a kszlkek kialaktsa kvetkeztben tbb minta extrakcija elvgezhet rvid idn bell. A szksges oldszer mennyisg nhny ml-tl, nhny tz milliliterig terjed, st mg kevesebb is lehet gy elkerlhet a nagymennyisg oldszer szksges leprlsa, ami tovbb rvidti az extrakci idejt. A SFE-nak van egy tovbbi elnye, mgpedig, hogy a kritikus pont (22. bra) fltti gzt alkalmaz extrakcis oldszerknt. Jl ismert tny, hogy az anyagok kritikus nyoms s hmrskletk fltt szuperkritikus folyadk llapotba kerlnek (22. bra). A szuperkritikus folyadkok bizonyos tulajdonsgai a gzokhoz, ms tulajdonsgaik pedig a folyadkokhoz llnak kzelebb.

szilrd

folyadk

Szuperkritikus folyadk

HP
gz

KP

22. bra: tiszta anyag fzisdiagramja (HP: hrmas pont; KP: kritikus pont)

A leggyakrabban alkalmazott extrahl szer a CO2, mert a kritikus hmrsklete alacsony 31,1 oC, kritikus nyomsa pedig 72,9 atm. Mivel a szndioxid teljesen apolris, gy csak apolris anyagok extrakcijra alkalmazhat, azonban mdost anyagokkal nvelhet a polarits s az alkalmazsa kiterjeszthet. A legnagyobb elnye, hogy az extrakci utn a nyomst lgkri nyomsra cskkentve a CO2 gzz alakul s egy nagyon koncentrlt extraktum marad vissza, nincs szksg oldszer leprlsra, vagyis a minta kzvetlenl analizlhat, a levegbe pedig veszlytelen (az alkalmazott mennyisgben) CO2 kerl. 23

MAE esetn megklnbztetnk nyitott s zrt vltozatot. Mindkettre jellemz azonban, hogy a mikrohullm kzvetlenl a mintt melegti, mg egyb esetekben elszr a mintatart edny melegszik fel s az adja t a ht a mintnak. A nyitott rendszer esetn az oldszer elprolgst visszacsepeg htvel kell meggtolni. Ezt nevezik mikrohullm segtette Soxhlet extrakcinak is. Zrt rendszer esetn egy h s nyomsll ednybe helyezzk a mintt az extrahl szerrel egytt. Az edny nyomsa s hmrsklete szablyozhat, gy biztonsgosan szablyozhat a fts s ezzel az extrakci folyamata. ASE esetben a mintt egy kapszulba helyezzk, amit feltltnk oldszerrel, majd nyoms al helyezzk s felmelegtjk. Ezt kveten az oldszert kifvatjuk a kapszulbl, amit nhny ml friss oldszerrel mg kibltnk, s esetleges koncentrls utn a minta analzisre ksz. III.2. Extrakci folyadkokbl III.2.1. Szilrd fzis extrakci (Solid Phase Extraction: SPE) A meghatrozand anyagok folyadkokbl trtn kinyersnek legrgibb mdja a folyadk-folyadk extrakci (Liquid-Liquid Extraction: LLE), melynek legegyszerbb kivitelezsi mdja a rztlcsrben trtn szakaszos extrakci. Ennek sorn a vizsgland anyagot tartalmaz mintt egy vele nem elegyed oldszerrel rzzuk ssze, majd a fzisok sztvlsa utn a szmunkra szksges fzist koncentrljuk, s a mintt analizljuk. Htrnyai ennek a techniknak, hogy idignyes -mivel a gyakorlatban legalbb 3-szor szksges extrahlni- tovbb a nagy mennyisg oldszer-felhasznls, az emulzikpzds, valamint trkeny vegeszkzk hasznlata. A LLE-nak van folyamatos vltozata is (CLLE), amelyhez a minta tulajdonsgtl fgg kszlk szksges. Az oldszermennyisg cskkentse megoldhat, ha a LLE-t mikro lptkben valstjuk meg, termszetesen, ha a minta mennyisge ezt lehetv teszi, azonban sokkal elterjedtebb technika a szilrd fzis extrakci (SPE). SPE esetben a folykony, vagy gz halmazllapot minta, egy szilrd szorbensen halad keresztl, amin trtnik vgeredmnyben az extrakci. Tbbfle megvalstsi technika ismeretes, gy beszlhetnk szelektv ktdsrl, szelektv mossrl, valamint szelektv elcirl is attl fggen, hogy a minta felvitele utn mi ktdik a szorbenshez (extrahldik), illetve hogy a ktds utn oldszercservel, esetleg a pH vagy az ionerssg vltoztatsval mit tvoltunk el a tltetrl. Az SPE szorbensek klnbz kiszerelsi formban (fecskendtestes, cartridge, korong) kaphatak (23. bra), melyek tltettmege 24

viszonylag szles hatrok kztt vltozhat, tovbb nagyon sokfle tltet (norml s fordtott fzis, ioncserl, mretkizrsos, s specilisan meghatrozott feladatokra kifejlesztett) van forgalomban.

23. bra: SPE szorbens formk

Azt, hogy milyen tpus s mekkora tmeg SPE szorbenst vlasszunk, a minta mennyisge s a vizsgland anyagok fizikai-kmiai tulajdonsgai hatrozzk meg. A tltet kivlaszts egy egyszerstett smja a teljessg ignye nlkl a 24. brn lthat.
az extrahland anyag

ionos

nem ionos

polris

szemi-polris

polris

szemi-polris

apolris

IE-SPE ioncsers

RP-SPE C-18 pH bellts

NP-SPE SDB

RP-SPE C-18

RP-SPE C-8; C-18

24. bra: SPE tltet kivlasztsa

A SPE-nak tbbfle kivitelezsi mdja van, melyek kzl a legegyszerbb az n. 4 lpeses vltozat (25. bra). A folyamat els lpse a szorbens nedvestse megfelel oldszerrel, majd 25

a minta felvitele. Ezt kveti a zavar komponensek eltvoltsa, majd a vizsgland anyag elcija.

25. bra: SPE kivitelezse

A mintt a szorbensen ltalban nyoms, vagy vkuum segtsgvel, mg kisebb trfogat mintk esetben egyszeren a gravitci segtsgvel, vagy pedig centrifuglssal juttathatjuk t. A SPE kedvelt mintaelksztsi technika a diagnosztikai, gygyszeripari, s kutat laboratriumokban egyarnt. Legnagyobb elnye, hogy nincs szksg nagymennyisg oldszer alkalmazsra, gy koncentrlsra sem, tovbb, hogy viszonylag olcs, gyors s viszonylag knnyen automatizlhat. Napjainkban egyre nagyobb hangslyt kap a klnbz folyamatokban a gyorsasg. A SPE teresztkpessge nvelhet tbb frhelyes (ltalban 12 vagy 24) vkuumkd alkalmazsval (26. bra). ltalnosan elmondhat, hogy a SPE nagyon gyakran alkalmazott technika a bioanalitikai vizsglatokban, mivel ezen mrsekhez ltalban csak kis mintamennyisg ll rendelkezsre.

26. bra: tbbllsos vkuumkd SPE alkalmazshoz

26

Az elbbiekben bemutatott technikk kzs tulajdonsga, hogy viszonylag nagy a mintaignyk s az oldszerfelhasznlsuk. A tovbbiakban olyan technikk kerlnek bemutatsra, amelyek oldszerfelhasznlsa minimlis, vagy egyltaln nincs, illetve mintaignyk is nagyon kicsi. III.2.2. Szilrd fzis mikroextrakci (Solid Phase MicroExtraction: SPME) A SPME lnyegben oldszermentesnek tekinthet extrakcis eljrs, amely a minta s az extrakcis fzis kztti egyensly kialakulsn alapul. sszehasonltva a SPE-val, ahol az extrahlt mennyisg tbb mint 90%, itt ez csak 2-30%, azonban ez teljes mrtkben a mrmszerbe kerl. Az extrakcit egy vkony polimer rteggel bevont kvarcszl vgzi (27. bra). A vizsgland anyagok megktdnek ennek a felletn, majd onnan vagy h segtsgvel (GC) vagy pedig nhny l oldszerrel (HPLC) deszorbeldnak s kerlnek a mszerbe. A kvarcszl ~1 cm hosszsg s nagyon trkeny, ezrt azt az extrakci, illetve deszorpci utn egy acltbe visszahzva kell tartani s csak visszahzott llapotban szabad a mintatart veg illetve a GC kszlk szeptumt tszrni. A szl mozgatsa trtnhet manulis eszkzzel (27. bra) vagy autosampler-rel egyarnt. A leggyakoribb polimer fzisok a polidimetilsziloxn (PDMS), divinil-benzol (DVB), poliakrilt (PA) a carbowax (CW) s a carboxen (CAR), illetve ezek kombincii, melyeket sznkddal is jellnek. Az SPME szlak klnbz rtegvastagsgak lehetnek, s egy szl kb. 200 minta extrakcijra alkalmas.

Kvarcszl mozgat eszkz

Szeptumlyukaszt aclt

Fzissal elltott kvarcszl

27. bra: manulis SPME eszkz s SPME szlak

27

Attl fggen, hogy honnan vesszk a mintt, megklnbztetnk n. head-space-SPME-t (HS-SPME), illetve direct-immersion-SPME-t (DI-SPME). Az els esetben (28. bra) a mintt egy vegcsbe helyezzk, majd felmelegtjk, gy az abban lev illkony komponensek a gztrbe (head-space) diffundlnak. A gztr s a minta kztti egyensly kialakulst enyhe keverssel is segthetjk. A gztrbe juttatva a SPME szlat megtrtnik az adszorpci, melynek idtartam ltalban 5-30 perc kztt van. A msodik esetben (28. bra) a SPME szlat kzvetlenl a folyadkba mertjk, gy a folykony mintban oldott vizsgland anyagok adszorbeldnak. Az egyensly ebben az esetben sokkal lassabban ll be, sszehasonltva a HS-SPME-vel. Az 1989-ben bevezetett SPME technika jelenleg is dinamikusan fejldik. Ma mr kaphatak az n. szilrd-fzis dinamikus extrakcis fecskendk (solid phase dynamic extraction: SDME), ahol az extrakcis rteg egy gztmr mikrofecskend tjnek bels faln tallhat, vagy pedig egy kis kapszulba tltve helyezik el. De elvgezhet egy rvid, ~ 60 cm hossz, kapillrisban is (In-tube extraction). A SPME teresztkpessge is nvelhet, hasonlan a SPE-hez.

28. bra: HS-SPME s DI-SPME

Mr kifejlesztettek 96 lyuk plate-hez hasznlhat analitikai robotokat, melyekkel 96 mintbl trtnik egy idben a mintavtel, de megtallhat mr olyan MALDI MS kszlk mely target plate-je 16 db SPME szlat tartalmaz, illetve elkszltek az SPME szlat tartalmaz pipetta-hegyek (In-tip SPME) is. sszessgben a SPME egy viszonylag olcs, megbzhat technika, mely szleskren alkalmazhat mind a gygyszeriparban, mind pedig a bioanalitikai vizsglatokban.

28

III.2.3. Folyadk fzis mikroextrakci (Liquid Phase MicroExtraction: LPME) A szilrd-fzis mikroextrakci mintjra kifejlesztettk a folyadk-fzis

mikroextracit is (Liquid-Phase Microextraction: LPME). Ennek is tbb tpusa van, kzs jellemzjk, hogy az extrahl fzis valamilyen folyadk, ellenttben a SPME-val. Ennek legels vltozata az n. Single-Drop Microextraction (SDME). Ez gy mkdik, hogy a vizsgland anyagot tartalmaz kzegbe egy mikrofecskendbl egy csepp oldszert juttatunk be gy, hogy a csepp ne szakadjon le a fecskend tjrl. Ez utn a vizsgland anyag megoszlik a minta s az oldszercsepp kztt, majd az egyensly bellsa utn a cseppet visszahzzuk a fecskendbe s azonnal injektlhat a megfelel mrmszerbe. Mintt vehetnk a gztrbl (head-space SDME), illetve kzvetlenl folykony mintbl (DISDME) egyarnt (29. bra). A SDME technika htrnya, hogy az oldszercsepp nem stabil, knnyen leszakadhat ami problmt okoz a tovbbi folyamatoknl. Ezrt jabb technikai megvalstsokat fejlesztettek ki. Ezek kz tartozik az n. hlszlas mikroextrakci (Hollow Fiber MicroExtraction: HFME).

mikrof ecskend

HS-SDME DI-SDME minta oldszer csepp keverbot

29. bra: HS- s DI-SDME

A HFME technika lnyege, hogy egy porzus polimeren egy folyadkfilmet hoznak ltre, gy, hogy egyszeren a megfelel folyadkba mertik, ami a kapillriserk hatsra kitlti a

29

prusokat. Ez lesz az extrakcis fzis. Ezt a polimert megfelelen rgztik egy fecskend tjre, vagy pipetta hegyre, vagy valamilyen alkalmas eszkzre gy, hogy egy reg kpzdik (30. bra). Ezt az reget feltltik egy msik folyadkkal, ez az n. akceptor fzis. Majd az egszet a vizsgland anyagot tartalmaz mintba helyezik. A vizsgland anyag a vizes alap mintbl az extrakcis fzison keresztl vgl az akceptor fzisba kerl. Az extrakci vgeztvel az akceptorfzis kzvetlenl injektlhat GC-be, HPLC-be, CE-be, vagy MS-be. Az akceptor oldszer lehet szerves (ami kompatibilis a GC kszlkekkel), ebben az esetben ktfzis extrakcirl (LLPME), s lehet vizes oldszer is (ami kompatibilis a HPLC s CE kszlkekkel), amikor is hromfzis extrakcirl (LLLPME) beszlnk. A minta trfogata szles tartomnyban vltozhat (50 l-1L), mg az akceptorfzis trfogata ltalban 2 s 30 l kztt vltozik. A nagyon nagy akceptor-minta trfogatarnyok kvetkeztben nagymrtkben koncentrldnak a vizsgland anyagok, gy nincs szksg plusz koncentrlsra a mrsek eltt. A folyadk film tlagosan 5-30 l szerves oldszert tartalmaz, ami mind gazdasgi, mind pedig krnyezet- s egszsgvdelmi szempontbl nagyon elnys.

mikrofecskend

a membrn f elf ggesztshez szksges eszkz polimer membrn extrakcis f olyadk filmmel akceptor fzis vizes alap minta
30. bra: kt- s hromfzis HFME vzlata

A HFME technika nagyon hatkony mintaelksztsi, tiszttsi mdszer, mely jelentsen cskkenti a mintamtrix okozta problmkat. A hromfzis technika klnsen hatkony komplex biolgiai mintkbl trtn extrakcira. Elnye mg ennek a techniknak, hogy 30

viszonylag knnyen automatizlhat, gy teljesen automata mintaelksztsi robotok alakthatak ki. sszefoglalva elmondhat, hogy az elzekben bemutatott mikroextrakcis technikk szles krben alkalmazhatak a gygyszer kutats-fejleszts, gyrts, minsg-ellenrzs terletein, illetve a diagnosztikban egyarnt. Ezen technikk fejldse tretlen, hiszen mikrolptkben, szinte oldszer felhasznls nlkl dolgozhatunk, valamint a legklnflbb mintk vizsglatra alkalmazhatak (3. tblzat). 3. tblzat: Mikroextrakcis technikk csoportostsa vizsgland anyag gz folyadk gz folyadk extrakcis fzis szilrd szilrd folyadk folyadk szorpci s megoszls szorpci s megoszls Megoszls Megoszls jellemz folyamatok egyensly kialakulsa gz-szilrd folyadk-szilrd gz-folyadk folyadk-folyadk technika megnevezse HS-SPME DI-SPME HS-LPME LPME

III.2.4. Molekulrisan lenyomatolt polimerek (Molecularly Imprinted Polymers: MIPs) A molekulris lenyomatot kpz technolgia olyan reges anyagok ellltsval foglalkozik, melyek kpesek adott molekulk szelektv felismersre mret, alak vagy kmiai funkcionalits alapjn. A nagyfok szelektivits rdekben a szintzis sorn az adott molekult templtknt hasznljk, majd a szintzis vgn eltvoltjk az anyagbl, gy egy hromdimenzis fizikai-kmiai lenyomata marad vissza a templtnak. Br a molekulris lenyomatol (MI: Molecularly Imprinting) technolgia mr a mlt szzad elejn kifejldtt, alkalmazsa a mintaelkszts tern csak az elz dekdban indult jelents fejldsnek. Napjainkban klnsen a biolgiai mintk esetben a legelterjedtebb mintaelksztsi technika a SPE. Br nagyon sokfle szorbens kifejlesztsre kerlt, a szelektivits nem mindig kielgt. Kivtelt kpeznek az immunoszorbensek, melyek antign-antitest klcsnhats kvetkeztben nagyon specifikusak, azonban kevsb stabilak, viszonylag nehezen elllthatak s drgk. Napjainkban egyre nagyobb figyelmet kapnak az n. molekulrisan lenyomatolt polimerek (MIPs), mivel nagyon stabilak, relatve knnyen s olcsn elllthatak, valamint nagyon szelektvek s szleskren alkalmazhatak. Ezek szintetikus polimerek, melyek 31

olyan regeket tartalmaznak, melyekkel kpesek nagyon szelektven ktni a vizsgland molekult, mg szerkezetileg nagyon hasonl egyb molekulk jelenltben is. A monomereket gy vlasztjk, hogy a templt molekula funkcis csoportjaival klcsnhatsba tudjanak lpni (31. bra). A polimerizci vgn a templtot valamilyen kmiai reakcival, vagy extrakci tjn eltvoltjk a polimerbl, amely ezutn jra meg tudja ktni a kvnt molekult.

templt

polimerizci

extrakci, vagy kmiai reakci

funkcionlis monomerek

templt-monomer komplex

MIP

31. bra: MIP-ek szintzisnek sematikus brzolsa

MIP-ek ellltsra 3 lehetsg van: kovalens, szemi-kovalens s nem kovalens szintzis. A kovalens technika esetben a polimerizci eltt a monomerek s a templt kztt reverzibilis kovalens ktsek alakulnak ki. Ezen ktsek felbontsval tvoltjk el a templtot, amely jrakpzdik a vizsgland molekula jelenltben. Legnagyobb elnye ezen MIP-eknek, hogy a monomer-templt komplex stabil s sztchiometrikus, valamint hogy a polimerizci krlmnyei szleskren vltoztathatak. Szmos htrnyuk is van azonban, melyek kzl a legfontosabb a templt lass ktse s kibocstsa. A szemi-kovalens mdszer sorn a templt kovalensen ktdik a funkcionlis monomerhez, de molekula jraktdse nem-kovalens klcsnhatsokon alapul, mg a nem kovalens techniknl a polimerizci eltt a templt s a monomer kztt csak gyenge nem-kovalens (hidrognkts, elektrosztatikus klcsnhats, van der Waals kts, stb.) kts jn ltre. A templt jraktdse pedig ugyanezen erkkel trtnik, gy ez sokkal gyorsabb, mint a kovalens technika esetben. Mindemellett elnye mg a nem-kovalens techniknak, hogy knnyen kivitelezhet s szleskr a lenyomatozhat templtok szma. Vannak azonban htrnyai is, tbbek kztt a templt-monomer komplex kevsb stabil, valamint a nem-specifikus kthelyek szmnak minimalizlsa rdekben a polimerizci krlmnyeit nagyon pontosan kell megvlasztani. A MIP-eket mintaelksztsre tbbfle technikai megvalstsban alkalmazzk. Az egyik legelterjedtebb a molekulrisan lenyomatolt szilrd fzis extrakci (MI-SPE). Ez nem 32

klnbzik jelentsen a hagyomnyos SPE-tl. ltalban egy 15-500 mg MIP-et tartalmaz fecskendtestes SPE oszlopot ksztenek. A lpsei megegyeznek a SPE-val (kondcionls, mintafelvitel, moss, eluls). A kondcionls sorn a MIP-et elulszerrel is kell mosni az esetleges szennyezdsek eltvoltsa vgett, majd pedig a loading oldszerrel kell a kondcionlst befejezni. A mintafelvitelt ltalban valamilyen alacsony polarits oldszerrel vgzik (CHCl3, CH2Cl2, CH3CN, toluol, stb.). A mossi lps clja a clmolekula s MIP kztti specifikus klcsnhatsok maximalizlsa, valamint a polimer mtrix ltal visszatartott zavar komponensek eltvoltsa. A mosshoz hasznlt oldszer ltalban szintn alacsony-polarits szerves oldszer (CHCl3, CH2Cl2, toluol, stb.), vagy ezek keverke. Az elcit pedig kis mennyisg acetonitrillel, metanollal, vagy ezek keverkvel vgzik. Vizes mintkat is felvihetnk az oszlopra, azonban ebben az esetben a MIP fordtottfzis szorbensknt viselkedik. Vagyis ilyen esetekben a mdszerfejleszts hosszabb idt vehet ignybe. A MISPE az elzekben bemutatott off-line kivitelezs mellett hasznlhat online mdban is, amikor egy kismret eltt oszlopot ptenek a rendszerbe, amely ltalban 50 mg MIP-t tartalmaz. A zavar komponensek eltvoltsa utn egy vltszelep segtsgvel a HPLC mozgfzisa az analitikai oszlopra mossa a mintt. A MISPE technika alkalmazsa szleskr, alkalmas tbbek kztt krnyezetanalitikai-, lelmiszeripari-, biolgiai- s gygyszermintk extrakcijra. Br biolgiai mintk (vizelet, vr, plazma, stb.) kzvetlenl is felvihetk a MIP-re, ltalban valamilyen szerves oldszerrel meg kell hgtani a mintt, ami egyrszt kicsapja a proteineket, msrszt segti a specifikus ktsek kialakulst. Az alkalmazsok kztt a biolgiai s gygyszermintk kzel 50%-ot tesznek ki. Ahogy a MISPE a SPE egy vltozatnak tekinthet, rtelemszeren elkezddtt a fejlesztse a molekulrisan lenyomatolt szilrd fzis mikroextrakcis (MI-SPME) techniknak is. Br a fejlds nem olyan gyors, mert a klnbz fzisok szintzisnek reproduklhatsga mg nem teljesen megoldott, a terlet folyamatos fejlds alatt van. A hagyomnyos SPME az extrakci sorn nem szelektv, mivel a szlak a vegyleteket polaritsuk fggvnyben adszorbeljk. MI-SPME esetben ktfle technika van. Az egyik a MIP-el bevont szlak ksztse, mg a msik MIP (monolit) szlak ellltsa. Az els esetben a kvarc szlat szililezssel aktivljk, majd polimerizcis oldatba mertik. A polimerizci 60 oC-on 6 rn keresztl trtnik, melynek sorn a kvarcszl felletn jn ltre a MIP. A msik technika esetn a MIP-et kvarc kapillris belsejben hozzk ltre. A kapillrist 30 cm hosszsg darabokra vgjk. Ezutn a kapillrist feltltik a polimerizcis eleggyel, a kt vgt lezrjk, s 60 oC-nl magasabb hmrskleten adott ideig polimerizljk, majd 33

feldaraboljk. A MIP monolitek vastagsga a kapillris bels tmrjtl fgg. Az gy ltrehozott MIP-SPME szlak ellenttben a hagyomnyos SPME szlakkal nagyon flexibilisek, nehezen trnek el. Az extrakci vgn a szlat kismennyisg alkalmas oldszerbe helyezve a vizsgland anyag deszorbeldik a szlrl. III.2.5. Turbulens ramls kromatogrfia (Turbulent Flow Chromatography: TFC) Az elz fejezetben bemutatott technikk alkalmazsval a mintaelkszts lnyegesen egyszersthet, kevesebb hibaforrs tallhat a folyamatokban, azonban az teresztkpessg nvelsnek ellenre mg mindig viszonylag hossz analzisidkkel kell szmolni, ami leginkbb a hossz extrakcis idkbl addik. HS-SPME esetn pl. meg kell vrni, mg bell az egyensly a minta s a gzfzis kztt, majd ezt kveten trtnik az adszorpci, vgl pedig a deszorpci a GC-kszlk injektorban, gy akr 30 percet is meghalad ideig is tarthat egy mrs a mintavteltl a mrs vgig. Egy nagyon j alternatva a mrsi idk cskkentsre az 1997-ben bevezetett turbulens ramls kromatogrfia alkalmazsa. A TFC lehetv teszi komplex biolgiai mintk kzvetlen injektlst, klnfle mintaelksztsi eljrsok alkalmazsa nlkl. A technika alapja, hogy egy arra alkalmas kolonnn elvlnak egymstl a kismret meghatrozand s biolgiai mtrix nagymret molekuli, a makromolekulk (proteinek) nagy diffzis koefficiense kvetkeztben. Ez a nagymrtk elvlasztsi hatkonysg a kolonnban kialakul turbulencia eredmnye, amely a mobil fzisban keletkez rvnyek miatt megnveli az anyagtranszport sebessgt. Az rvnyek keletkezse vgeredmnyben egy dugszer ramlsi profilt hoz ltre, cskkentve a svszlesedst, ellenttben a klasszikus laminris ramlsi profillal. A tlttt kolonnkban kialakul turbulens ramls fgg a szemcsemrettl, valamint a mozgfzis lineris ramlsi sebessgtl s fizikai-kmiai tulajdonsgaitl. Rvid, viszonylag vastag, nagy szemcsemret kolonnk (ltalban: 500 x 1 mm, 50-60 m) szksgesek a turbulens ramls kialakulshoz, valamint olyan pumpk, melyek kpesek ennek a fenntartsra. Az alkalmazott ramlsi sebessg ltalban 4-5 ml/perc. Az extrakcis oszlopon visszatartott vizsgland anyagokat a szerves mozgfzis egy oszlopvlt szelep segtsgvel juttatja az analitikai oszlopra, ahol megtrtnik az elvlaszts, majd pedig a detektls. A TFC-nak klnbz technikai megvalstsai vannak (32. bra). gy megklnbztetnk egy oszlopos egy szelepes, kt oszlopos egy szelepes, illetve ktszelepes megoldsokat egyarnt, valamint egy (32. bra fels panel, folytonos vonallal jellt) illetve kt pumpt (32. bra fels panel, 34

szaggatott vonallal jellt) hasznl megvalstsokat. Az egykolonns esetben mind a tisztts, mind pedig az elvlaszts a TFC kolonnn trtnik. Ennek az alapja, hogy a TFC kolonnnak, br jelentsen klnbznek az analitikai kolonnktl, van elvlasztsi kpessge is.

TFC-oszlop

TFC-oszlop

P-I H D D

P-I H

P-II

P-II

TFC-oszlop

TFC-oszlop

P-I H D HPLC-oszlop D HPLC-oszlop

P-I H

P-II

P-II

mintafelvitel s tisztts

elci

32. bra: egy szelepes, egy- illetve ktkolonns TFC konfigurcik P: pumpa; D: detektor; H: hulladkoldszer trol

A tisztts sorn turbulens krlmnyek kztt trtnik a minta felvitele, majd miutn a nemkvnatos komponensek elhagytk a kolonnt egy vlt szelep segtsgvel a mozgfzis ramlsi irnyt megvltoztatjk s a vizsgland anyagot gy juttatjk a detektorba. Mivel a TFC kolonna elvlasztsi hatkonysga jelentsen kisebb egy analitikai kolonnnl, ezrt ezt a megoldst leginkbb egy vagy nhny meghatrozand komponens esetben clszer

35

alkalmazni. A msik problma, hogy a turbulens ramls krlmnyeit (4-5 ml/perc ramlsi sebessg) a leggyakrabban detektorknt alkalmazott tmegspektromterek nem kpesek kezelni, ezrt szksg van az eluensram elosztsra, ami cskkenti a kimutathatsgot. A kisebb rzkenysg nem az MS kszlkbl ered problma, hanem az eluensram elosztsa kvetkeztben a MS-be bejutatott vizsgland anyag koncentrcijnak jelents lecskkense okozza. Erre a problmra jelenthet megoldst egy msik pumpa alkalmazsa (32. bra fels panel, szaggatott vonallal jellve). Ebben az esetben a minta injektlsa, illetve tiszttsa turbulens krlmnyek kztt trtnik, mg az elci egy msik pumpa alkalmazsval mr alacsonyabb ramlsi sebessggel. A msik pumpa alkalmazsnak tovbbi elnye, hogy az alapveten vizes alap TFC krlmnyeket megfelel oldszerre lehet cserlni. Az egy oszlopos megvalsts esetben a TFC oszlop alacsony tnyrszma s a nagy szemcsemret miatt, nagymrtkben kiszlesedett s tailing-es cscsokat detektlhatunk. ennek kikszblsre kivlan alkalmas a ktkolonns megvalsts (32. bra als panel), ahol egy hagyomnyos HPLC oszlopot ptenek a rendszerbe, lehetv tve egy megfelel analitikai elvlasztst. A mintt a TFC oszloprl olyan eluenssel juttatjk az analitikai kolonnra, mely alkalmas a TFC oszloprl val elulsra, de nem elg ers az analitikai kolonnrl trtn elcihoz, gy a minta az analitikai kolonna elejn sszegylik, majd a megfelel oldszerre trtn vlts utn megtrtnik az elvlaszts s a detektls. A hatkonysg nvelse rdekben tovbbi technikai megvalstsokat is (izokratikus fkuszls, tovbbfejlesztett izokratikus fkuszls) hasznlnak. A TFC alkalmazsa egyre nagyobb mrtk, leginkbb farmakokinetikai, ADME, metabolizmus vizsglatokban, metabolitok azonostsban alkalmazzk.

Ahogyan az mr emltsre kerlt, az analitikai mrsek egyik, ha nem a legkritikusabb pontja a mintaelkszts. A megfelel technika kivlasztsnl figyelembe kell venni tbbek kztt az idt, a szelektivitst, a lpsek szmt, az oldszer-felhasznlst, valamint az online kapcsols lehetsgt egyarnt. A bioanalitikai vizsglatokban, valamint a labordiagnosztikban jelenleg legelterjedtebben a SPE-t hasznljk, de egyre jobban teret hdtanak a klnbz mikroextrakcis technikk s egyb eljrsok is. Az 4. tblzatban sszefoglalt technikkon kvl termszetesen egyb lehetsgek is vannak, azonban a jegyzet keretei nem teszik lehetv minden mdszer ismertetst, illetve a bemutatsra kerlt tecnikk rszletekbe men lerst. Akik tovbbi illetve rszletes informcit kvnnak szerzni errl a tudomnyterletrl, azoknak ajnlom Janusz Pawliszyn s Heather L. Lord 36

szerkesztsben Handbook of Sample Preparation, valamint Roger M. Smith szerkesztsvel megjelent Bioanalytical Separtions cm knyveket. 4. tblzat: a bemutatott mintaelksztsi technikk sszehasonltsa megnevezs ASE (PLE) MAE SFE LLE SPE SPME LPME MEPS MIPs TFC extrakci ideje (perc) 10-15 5-15 5-15 15-20 15-25 10-60 10-60 1-5 15-20 <5 szelektivits kzepes kzepes kzepes kzepes kzepes kzepes kzepes kzepes nagy kzepes tbblpses folyamat extrakci/szrs + + adszorpci/deszorpci + + + oldszerigny kicsi kicsi kicsi nagy kicsi nincs nagyon kicsi nagyon kicsi kicsi nincs?

37

IV. Kromatogrfis technikk Az elz fejezetben bemutatott technikk segtsgvel a vizsgland anyagot kinyerhetjk a mintbl s elemezhetjk. Nagyon gyakran elfordul azonban, hogy az extrakci sorn nem csak a meghatrozand komponenst nyerjk ki, hanem egyb vegyleteket is, illetve, sokszor nem csak egy sszetevt kell meghatrozni. Ilyen esetekben szksg van az egyms mellett tallhat anyagok elvlasztsra, amit n. elvlasztstechnikai mdszerekkel vgezhetnk el. Ekkor az sszetett mintt bejuttatjuk a mszerbe, ahol az sztvlik komponenseire, majd ezt kveten az egyes komponensek kln-kln kerlnek detektlsra. A mdszercsoport alapjait Cvet orosz botanikus fektette le, aki klnfle nvnyi rszeket petrolterrel extrahlt, majd az extraktot egy kalcium-karbonttal tlttt csbe tlttte s sznes gyrk kialakulst figyelte meg. alkotta meg a kromatogrfia elnevezst, amelyet a grg chroma (szn) s graphia (rs) szavakbl eredeztetnek. A kromatogrfia egy nagyon sokrt mdszercsoportot foglal magba, mely technikkat szleskren alkalmazzk a kutats-fejleszts, gyrts, diagnosztika, minsgbiztosts, stb. sorn egyarnt. Kzs jellemzjk, hogy a minta komponensei egy ll s egy mozg fzis kztt oszlanak meg, s a klnbz mrtk klcsnhatsok kvetkeztben az egyes komponensek elvlnak egymstl. A kromatogrfis technikkat tbbflekpen csoportosthatjuk. Technikai megvalsts szerint megklnbztetnk sk s oszlopkromatogrfit. A kifejleszts mdja szerint beszlhetnk frontlis, kiszortsos s elcis mdszerrl, melyek kzl ma mr szinte kizrlag az elcis technikt alkalmazzuk. A mozgfzis halmazllapota alapjn (33. bra) megklnbztetnk gz-, folyadk-, s szuperkritikus-folyadkkromatogrfit, melyeket tovbb csoportosthatjuk az llfzis tpusa alapjn (33. bra).
mozg fzis gz GC ll fzis folyadk szilrd folyadk folyadk LC szilrd folyadk szuperkritikus folyadk SFC szilrd technika megnevezse GLC (gas-liquid chromatography) GSC (gas-solid chromatography) LLC (liquid-liquid chromatography) LSC (liquid-solid chromatography) SFLC (supercritical fluid-liquid chromatography) SFSC (supercritical fluid-solid chromatography)

33. bra: kromatogrfis technikk csoportostsa a fzisok halmazllapota alapjn

38

A negyedik lehetsg pedig az elvlaszts mechanizmusa alapjn trtn csoportosts. gy megklnbztetnk adszorpcis, abszorpcis (megoszlsos), affinits, ioncsers, mretkizrsos, stb. kromatogrfis technikkat. Az adszorpcis kromatogrfiban a sztvlasztand komponensek az llfzis felletn adszorbeldnak. Az abszorpcis vagy megoszlsos techniknl az llfzis egy hordoz felletre felvitt folyadk. A minta komponensei megoszlanak a folyadk llfzis s a mozgfzis kztt s gy kmiai tulajdonsgaik alapjn vlnak el egymstl. Affinits kromatogrfia esetn valamilyen specilis klcsnhats (antign-antitest, enzim-szubsztrt) biztostja az elvlasztst, mg mretkiszortsos kromatogrfinl adott prusmret glen trtn tbocsts sorn az egyes komponensek a molekulk mrete szerint vlnak szt. Ioncsere esetn pedig tltssel rendelkez ionokat vagy molekulkat vlaszthatunk szt az llfzis ellenttes tlts helyeivel trtn klcsnhats kvetkeztben. A kromatogrfis elvlaszts sorn az sszetett minta egyes komponensei eltr ideig tartzkodnak az llfzison ezltal biztostva az egyes sszetevk elvlst egymstl. A folyamat vgn az egyes komponensek kln-kln rkeznek a detektorba s adnak a koncentrcival arnyos jelet. A kapott jel-id fggvnyt nevezzk kromatogramnak (34. bra). A kromatogram legfontosabb paramterei a retencis id (tR), holtid (tM), svszlessg (w), flrtkszlessg (w1/2) s a cscsmagassg (h).

tR (i-PrOH)

tR (i-BuOH) tR (n-BuOH)

W1/2 h

tM w

34. bra: egy kromatogram s jellemz paramterei

39

A tR a mintabejuttatstl a vizsgland anyag maximlis koncentrcijnak megjelensig eltelt id. Ez az egyes mintaalkotk esetn eltr, gy a tR alkalmas minsgi azonostsra. A tR tartalmazza azt az idt is, amit az anyag az injektorban s a detektorban tlt. Ez az n. holtid, amit ha kivonunk a tR-bl, megkapjuk a reduklt retencis idt. A tM definilhat mg gy is, hogy egy olyan anyag retencis ideje, amely a kolonnn visszatarts nlkl thalad. A mr emltett paramterek segtsgvel meghatrozott egyenletekkel informcit kaphatunk a kolonna, illetve az elvlaszts hatkonysgrl. Meghatrozhatjuk az elmleti tnyrszmot (N), ami minl nagyobb rtk, annl hatkonyabb a kolonna. N = 16 (tR/w) N = 5,54 (tR/w1/2) H = L/N

A kolonna hossznak ismeretben pedig kiszmolhat az elmleti tnyr magassg (H: Height Equivalent of Theoretical Plate), ami minl kisebb, annl jobb az oszlop. Ezek az rtkek a desztillci tnyrelmletbl erednek, rszletes trgyalsukra nem trek ki. Az elvlaszts hatkonysgt a kromatogrfis cscs paramtereinek segtsgvel vizsglhatjuk. Gyakran elfordul, hogy a detektls sorn tfed cscsokat kapunk, vagyis a komponensek nem vlnak szt teljesen, ami a svszleseds kvetkezmnye. Az elvlaszts hatkonysgt a felbontssal (R: Resolution) jellemezzk, amely a kvetkez egyenlettel szmolhat: R = 2(tR2-tR1)/(w1+w2) Kt cscsot akkor tekintnk teljesen felbontottnak, ha az tfedsk <0,1%. Ehhez R 1,5 felttelnek kell teljeslni. A kromatogramok alkalmasak a minta minsgi s mennyisgi analzisre. A minsgi rtkels legegyszerbb mdja standard vegyletek retencis idejvel trtn sszehasonlts, ami a legtbb esetben elegend. Problma akkor lphet fel, ha teljesen ismeretlen mintt kell analizlni. Ilyen esetekben egyb technikkat lehet alkalmazni, vagy pedig on-line EI-MS detektlst, ahol a mintakomponensek karakterisztikus MS spektrumnak segtsgvel lehet az azonostst elvgezni. A mennyisgi rtkelshez a cscsmagassgot vagy a cscsterletet hasznljuk. Felttel, hogy a detektor a koncentrcival arnyos jelet szolgltasson. A legegyszerbb mdszer a terletszzalkos rtkels: koncentrci = 100 x (Ai/A) 40

Ebben az esetben a minta %-os sszettelt kapjuk meg. Leggyakrabban akkor alkalmazzk, amikor elzetes informci nyers a cl a kalibrcis grbk elksztshez. Megjegyzend, hogy ez a legkevsb pontos, csak szemikvantitatv meghatrozst tesz lehetv. A leggyakrabban alkalmazott mennyisgi meghatrozsi mdszer a kls standard mdszer (35. bra) vagy ms nven kalibrci. Itt a meghatrozand anyagbl standard oldatokat ksztnk, elvgezzk a mrst, majd a cscsok integrlsa utn elksztjk a kalibrcis grbt (35. bra), amin a koncentrci fggvnyben brzoljuk a cscsterleteket. Ezt kveten injektljuk az ismeretlent tartalmaz mintt, majd a cscsterlet meghatrozsa utn a grbrl leolvashat a koncentrci.
6 jel (Abs., mV, area, stb.) 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 koncentrci egysg
35. bra: kls standard mdszerben alkalmazott kalibrcis grbe

Abban az esetben, ha a minta tbb komponenst is tartalmaz, mindegyikre kln-kln el kell kszteni a kalibrcis grbt, mivel a detektorok ltal szolgltatott jel az egyes komponensekre eltr lehet. Hasonl technika a standard addci (36. bra), ahol az ismeretlent tartalmaz mintt sztosztjk azonos trfogatokra, majd egy kivtelvel, emelked koncentrciban standardot adnak hozz (36. bra), vgl az egszet azonos trfogatra egsztik ki, majd az gy kapott oldatokat megelemzik. Az ismeretlen koncentrcija, a kapott grbe extrapolcijval (36. bra), vagy a legkisebb ngyzetek mdszern alapul illeszts alkalmazsval meghatrozzuk a fggvny lineris egyenlett, majd az egyenlet alapjn kiszmtjuk a meghatrozand elem koncentrcijt a vizsglati oldatban.

41

7
jel (Abs., mV, cscsterlet, stb.)

6 5 4 3 2 1 0

-2

-1

hozzadott standard koncentrcija

36. bra: standard addcis mdszer

42

A bels standard mdszernl (37. bra) egy ismert anyagot (bels standard) adnak mind a referencia oldatokhoz, mind a mintaoldathoz. Fontos, hogy a bels standard kromatogrfis viselkedse hasonl legyen a vizsglt anyaghoz, de attl teljesen elvl cscsot adjon. A meghatrozand komponens koncentrcijt a bels standard s a vizsglt komponens cscsterlet arnynak a referencia oldatok megfelel cscsainak arnyval trtn sszehasonlts alapjn kapjuk meg.

St1

St2

i St3 ism

ism.

b.st.

1 t

1 t

1 t

1 t

3,5

cscsterletek arnya (A/A)

3 St3 2,5 2 St2

ism 1 St1
0,5 0

1,5

0,5

1,5

2,5

3,5

koncentrci arny (c/c)

37. bra: bels standard mdszer alkalmazsa

A gyakorlatban ksztnk egy standard sorozatot a meghatrozand komponensbl, majd mindegyik oldathoz ismert mennyisg bels standardot adunk (azonos legyen a vgkoncentrci). Ezt kveten elvgezzk a mrst s a kromatogramokon a cscsterletek meghatrozst, majd megszerkesztjk a kalibrcis grbt, amin a cscsterletek arnyt brzoljuk a koncentrcik arnynak fggvnyben (37. bra). Utols lpsknt a vizsglati minthoz ismert mennyisgben (mint a standard esetn) adunk bels standardot. Elvgezzk a

43

mrst s meghatrozzuk a cscsok terlett. A cscsterletek arnynak ismeretben a kalibrcis grbrl a koncentrcik arnya leolvashat s a bels standard koncentrcijnak ismeretben kiszmolhatjuk a vizsgland komponens koncentrcijt. A tovbbiakban a gygyszer kutats-fejleszts-gyrts-minsgbiztosts sorn elterjedten alkalmazott technikk a gzkromatogrfia (GC) s a nagyhatkonysg folyadkkromatogrfia (HPLC) kerl bemutatsra. IV.1. Gzkromatogrfia (Gas Chomatography: GC) A GC elnevezs onnan ered, hogy ebben az esetben a mozg fzis gz halmazllapot (33. bra). Az elvlasztst biztost llfzis halmazllapota lehet szilrd (adszorpcis kromatogrfia), vagy helyhez kttt folyadk (megoszlsos, vagy abszorpcis kromatogrfia). A mintt, ami leggyakrabban gz, vagy folyadk, klnbz mdokon juttatjk a kolonnra, kzs jellemzjk, hogy gzhalmazllapotba kell juttatni. Ez azt vonja maga utn, hogy a GC csak olyan anyagok vizsglatra alkalmas, amelyek elprologtathatak bomls nlkl, vagyis hstabilak. Ez valamelyest behatrolja a GC alkalmazst. A GC mrsek sorn a folyamatos eluensramba juttatjuk a mintt n. injektorokon keresztl. Innen kerl a minta a kolonnra, ahol megtrtnik az elvlaszts, majd pedig a detektor vgzi a jelkpzst (38. bra). Az egsz rendszert szmtgp vezrli.

injektor kolonna

szmtgp

eluensforrs

tisztt

Detektor

termosztt
38. bra: GC-kszlk felptsnek sematikus brja

IV.1.1. Alkalmazott gzok Az eluens (vivgz) forrsa nagynyoms palack, vagy gzgenertor lehet. A leggyakrabban alkalmazott gzok a He, Ar, N2, s a H2 (valamint a leveg, detektortpustl fggen). Mivel a 44

GC

nagyhatkonysg

analitikai

technika,

fontos,

hogy

az

alkalmazott

gzok

nagytisztasgak legyenek. Tisztasgi foktl (5. tblzat) fggen, mg szksg lehet klnbz gztisztt egysgekre is. 5. tblzat: gzok tisztasgi foka Tf %-os tisztasg, gztartalom 99,99 % 99,995 % 99,999 % 99,9995 % 99,9999% Minsgi fokozat 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 sszes szennyezds 100 ppm (v/v) 50 ppm (v/v) 10 ppm (v/v) 5 ppm (v/v) 1 ppm (v/v)

Azt, hogy melyik gz legyen az eluens tbb szempont hatrozza meg. Tltetes kolonnk esetn a N2, mg kapillris kolonnknl a He vagy a H2 a legalkalmasabb. Tovbbi tnyez az zembiztonsg, mivel H2 esetn gondoskodni kell a kiraml gz eltvoltsrl, nehogy felhalmozdjon s robbans kvetkezzen be. A klnbz detektorok is megszabhatjk az alkalmazand gz tpust. A hvezetkpessgi (TCD) detektorok esetben, ha a vizsgland anyag hvezetkpessge kicsi, akkor a nagy hvezetkpessg He vagy H2 a vlasztand, ellenkez esetben a N2. A lngionizcis (FID) detektorok brmelyik eluenssel mkdtethetek, ilyenkor maga az elvlaszts a szmottev tnyez a vivgz kivlasztsnl, mg tmegspektrometris (MS) detektls esetn a He, mivel nagy az ionizcis energija. A GC kszlkek bemeneti nyomsa nhny br, ezrt a nagynyoms palackok esetn ktlpcss reduktor alkalmazsa szksges, mg a gzgenertorok kimen nyomsa bellthat a megfelel rtkre. Fontos, hogy, a kszlkekben a gz ramlsi sebessge lland legyen, amit ma mr az n. automatikus nyomsszablyzkkal (Automatic Pressure Control: APC) rnek el. IV.1.2. Mintabeviteli technikk A minta bejuttatsa a GC-s mrsek kritikus pontja. Fontos, hogy a mintaadagols pillanatszeren trtnjen, tovbb, hogy a bejuttatott folyadk az injektls utn azonnal gzhalmazllapotba kerljn, amihez leggyakrabban az n. gyors elprologtatsos technikt alkalmazzk. Ilyen esetekben az injektort a megfelel hmrskletre ftik fel. GC esetn

45

lehetsg van gz, folyadk s szilrd mintk bejuttatsra, azonban a szilrd mintk problms s lass injektlsa miatt szinte kizrlag gz vagy folyadk mintkkal dolgozunk. Gzok bejuttatsra n. mintabemr csapokat hasznlunk (39. bra). Ezek kalibrlt, adott trfogat hurokkal elltott injektorok. Injektls sorn elszr feltltjk a hurkot gy, hogy az injektland minta 5-10-szerest eresztjk t a hurkon, gy biztostva, hogy biztosan a mintval tltsk azt fel. Ezt kveten egy szelep tfordtsval a vivgz a hurkon halad keresztl s juttatja a mintt a kolonnra (39. bra).

vivgz

vivgz

mintabemr hurok

kolonna minta

mintabemr hurok

kolonna

hurok feltltse

injektls

39. bra: hatg gzbemr csap mkdsnek vzlata

Folyadk mintkat preczis mikro-fecskendk segtsgvel juttatunk be az injektorba. A bejuttatott minta mennyisge fgg az alkalmazott kolonna paramtereitl. Leggyakrabban valamilyen gyors elprologtatsos injektort alkalmazunk, de hasznlhatak n. hideg technikk (cool-on-column, large volume injection: LVI), illetve programozhat fts injektor is (programmed temperature vaporizer: PTV). A gyors elprologtatson alapul technikknl az injektor hmrsklett a legmagasabb forrspont komponens forrspontja felett kel tartani (50-70 oC-al). Az injektlsnl figyelembe kell venni, hogy az injektor trfogata nagyon kicsi, gy az injektlt folyadkbl keletkez gznak ezt a teret kell kitltenie. Klnsen a kis bels tmrj, vkonyfilmes kolonnk esetben alkalmazzk az n. split/splitless injektorokat. Mivel ezeknek a kolonnknak a kapacitsa nagyon kicsi, gy ha nagy mennyisg mintt juttatunk rjuk knnyen elfordulhat, hogy az llfzis teltdik. Ezt megelzend a kszlkbe jutatott mintnak csak meghatrozott hnyadt (1/10; 1/100) engedjk a kolonnra. A tbbit az n. mintaram eloszt vagy splitter segtsgvel lefvatjuk a szabadba. A split techniknak van tbb htrnya is, tbbek kztt a minta komponensek kztti diszkriminci, illetve minl nagyobb split arnyt alkalmazunk, gy cskken a kolonnra juttatott minta mennyisge, gy a cscsterletek is. A diszkrimincit kikszblend, illetve nyomnyi mennyisg anyagok esetn hasznljuk a splitless technikt. Itt a bejuttatott minta teljes elprolgsig nincs lefvats (nincs diszkriminci), majd a 46

kolonna tlterhelst megelzend a felesleges mintarszletet a szabadba engedik. Az alkalmazott split/splitless injektorok mkdtethetek direkt mdban is, amikor a beinjektlt minta teljes mennyisge a kolonnra jut. Ebben az esetben termszetesen olyan kolonnt kell vlasztani, ami nem teltdik, illetve fontos, hogy az injektorban tallhat n. linert a megfelelre cserljk. Az liner (ms nven inzert vagy inlet) (40. bra), melynek nagyon sok tpusa van, egy deaktivlt fellet veg vagy kvarc bett. Feladata, hogy megakadlyozza a minta komponenseinek s az injektor forr fmfelletnek az rintkezst, meggtolva ezltal a mintaalkotk forr fmfelleteken fellp bomlst.

40. bra liner tpusok

A gyors elprologtats msik problmja, hogy az alkalmazott hmrsklet jelentsen meghaladja a legmagasabb forrspont alkot forrspontjt, amit sok anyag nem br el termikus bomls nlkl. Ilyen esetekben alkalmazhat a cool-on-column injektlsi technika. Ebben az esetben a mintt egy vastagabb, pr cm hossz kolonnarszletbe juttatjuk. Ezt a kolonna rszletet htjk, majd az eluens ram a mintt, a kolonnt is tartalmaz termosztlt trbe juttatja, ahol megkezddik a kolonna ftse, gy a minta illkonny ttele s a kromatogrfis elvlaszts.

47

Az elzekbl jl kitnik, hogy sokfle (az ismertetetteken tl is) mintabejuttatsi lehetsg van, azonban mindegyik techniknak megvan a maga elnye s htrnya egyarnt, gy mindig meg kell gondolni melyik technika alkalmazsa lehet a clravezetbb. IV.1.3. Gzkromatogrfis kolonnk A kolonna a GC-kszlkek lelke, mivel ezen trtnik az elvlaszts. A kolonnt egy termosztlhat trbe helyezzk, melynek hmrsklete nagyon pontosan szablyozhat s gyorsan felfthet, akr 400-500 oC-ra, illetve gyorsan lehthet a kiindulsi hmrskletre. A kolonnkat kt csoportra oszthatjuk (41. bra). Az n. tltetes kolonnk ltalban 1-5 m hosszsg s 2-6 mm bels tmrj csvek, melyek a megfelel llfzissal vannak tltve. Az elvlasztst biztost folyamat szerint lehetnek adszorpcis kolonnk, amikor az llfzis nagy fajlagos fellettel rendelkez anyag (aktv szn, Al2O3, szilikagl, molekulaszr, szerves polimerek), vagy megoszlsos, ahol a tltet egy inert hordozra felvitt folyadk.
GC kolonnk

tltetes

kapillris (nyitott cs-Open Tube) mikro tltet megoszlsos adszorpcis megoszlsos falnedvests Wall Coated OT WCOT adszorpcis Porous Layer OT: PLOT

makro tltet adszorpcis megoszlsos

hordoz nedvests Sorbent Coated OT SCOT

41. bra: GC kolonnk csoportostsa

A kapillris vagy ms nven nyitott cs (open tube) kolonnk (42. bra) 10-100 m hossz 0,20,5 mm bels tmrj kapillrisok, melyek bels faln tallhat az ll fzis. Az elvlaszts szintn lehet adszorpcin, illetve megoszlson alapul, gy megklnbztetnk PLOT (Porous Layer Open Tube), SCOT (Sorbent Coated Open Tube) s WCOT (Wall Coated Open Tube) oszlopokat (41. bra). A PLOT kolonnk esetn a bels falra egy porzus adszorpcis rteget visznek fel, gy ezek adszorpcis kolonnk, mg a msik kt tpus esetn az elvlaszts alapja a megoszls. A WCOT kolonnk bels fellett vonjk be a megosztfolyadkkal, mg a 48

SCOT kolonnk esetn elszr egy hordz rteggel, majd azt vonjk be a megosztfolyadkkal.

42. bra: kapillris kolonna

Az

egyes

kolonnk

kztt

jelents

klnbsgek vannak mind kapacits, mind

alkalmazhatsg tern. Legnagyobb a kapacitsa a tltetes kolonnknak, majd az n. widebore kolonnk kvetkeznek, vgl pedig a narrow bore oszlopok, de ezek kztt is lehet klnbsg, tbbek kztt a filmvastagsgban. Napjainkban meglehetsen nagyszm, klnbz fizikai-kmiai paramterekkel rendelkez kolonna kzl vlaszthatunk, melyet mindig az adott analitikai feladat hatroz meg. A megfelel kolonna kivlasztsa kulcsfontossg, mivel a GC-s elvlasztsok esetben, ellenttben a HPLC-vel, az eluens knlat sokkal kisebb. A GC-s elvlasztsokat befolysol fbb tnyezk a kvetkezk: 1. a kolonna hossza 2. a kolonna tmrje 3. az llfzis tpusa 4. az llfzis vastagsga 5. a vivgz tpusa 6. a vivgz ramlsi sebessge 7. a hmrsklet

49

A hmrsklet szempontjbl megklnbztetnk izotermikus s hfokprogramozs mrst. Az els esetben a kolonna a teljes mrs vgig azonos hmrskleten van, mg a msodik esetben egy vagy tbb lpcst iktatunk be a mrs sorn. Az izotermikus mrst leginkbb egykomponens mintk analzisnl, vagy olyan mintknl alkalmazzuk, ahol a meghatrozand komponensek hasonl tulajdonsgokkal rendelkeznek, mg sokkomponens mintk esetn hfokprogramozst alkalmazunk. IV.1.4. Gzkromatogrfis detektorok A kolonnn trtn sztvlaszts utn a minta egyes komponensei a detektorba kerlnek, ami a koncentrcival arnyos jelet kpez. A GC-ban leggyakrabban a hvezetkpessgi (Thermal Conductivity Detector: TCD), lngionizcis (Flame Ionization Detector: FID), elektronbefogsos (Electron Capture Detector: ECD) s tmegspektrometris (MS), valamint infravrs (IR) spektrofotometris detektorokat alkalmazzk, de vannak egyb specilis detektorok (Photoionization Detector: PID, Flame Photometric Detector: FPD, Pulsed Flame Photometric Detector: PFPD, Atomic Emission Detector: AED) is. A TCD mkdsnek alapja egy kis trfogat cellban elhelyezett elektromosan fttt volfram vagy grafit szl. Az egyenletesen raml vivgz kvetkeztben a helvezets a szlrl lland. Ha megvltozik a vivgz sszettele, vagyis megjelenik benne egy mintaalkot, akkor megvltozik a helvezets, vagyis a fttt szlat jobban vagy kevsb hti, gy megvltozik a hmrsklete s ezzel egytt az ellenllsa is. Az ellenlls vltozst megfelel kapcsolssal ramvltozss alaktjk, s ezt regisztrlja a kszlk. A kapott jel annl nagyobb, minl nagyobb a klnbsg a vivgz s a mrend komponens hvezetkpessge kztt. A legnagyobb hvezetkpessge a H2-nek s a He-nak van, gy ezeket alkalmazzuk leggyakrabban, de elfordulhat N2 is (pl. ha H2-t kell mrni). A TCD-k univerzlis detektorok, htrnyuk azonban, hogy az rzkenysgk a tbbi detektorhoz kpest rosszabb (10-6 g). A GC kszlkekben ltalnosan hasznlt nagy rzkenysg (10-11 g/s) detektor a FID. Ebben egy kicsi H2 lng g, mely fltt elektrdpr tallhat. A lngban ionok keletkeznek, melyek az elektrdok kztt lev feszltsgklnbsg hatsra egy lland ionramot hoznak ltre. Amikor a lngba szerves anyag kerl, az ionram jelentsen megn, ami ersts utn regisztrlhat. Htrnya ennek a detektortpusnak, hogy szervetlen, nem elgethet anyagok vizsglatra nem alkalmas, hacsak a meghatrozand anyagot valamilyen mdszerrel ghetv nem tesszk. 50

IV.1.5. A gzkromatogrfia alkalmazsa A GC alkalmazsa szleskr. Hasznljk a krnyezetvdelemben, lelmiszeriparban, laboratriumi diagnosztikban, az igazsggyi toxikolgiban s a gygyszergyrts klnbz fzisaiban egyarnt. Nagyon jl alkalmazhat a GC klnbz gygyszerek, metabolitok, biolgiai mintkbl (vr, plazma, szrum, vizelet, szvetek, stb) trtn extrakcijt kvet analitikai vizsglatokhoz. A klnbz gygyszerknyvek (Ph.Eur., Ph.Hg.) GC-s meghatrozst rnak el oldszerek vizsglatra, ami magba foglalja az oldszerek GC-s minstst rnak s el szennyezik illolajok meghatrozst, minsgi valamint hatanyagokban, zsrsavak segdanyagokban s gygyszerksztmnyekben az oldszernyomok meghatrozst. Szintn vizsglatot vizsglatra, valamint meghatrozsra metil-szter formban (Fatty Acid Methyl Esther: FAME). Br a szabad zsrsavak vizsglatra mr rendelkezsre ll megfelel kolonna, FAME formban is knnyen mrhetek, mivel a zsrsavak metil-szterei illkonyak. GC esetben alapvet dolog, hogy a mintnak illkonynak kell lennie. Ez gyakran nem teljesl, gy n. szrmazkkpzsi reakcikkal illkony szrmazkait lltjuk el a vizsgland anyagnak, ami mr injektlhat a kszlkben. A leggyakoribb reakcik az acilezs (savak), szililezs (cukrok, szteroidok, alkoholok, amidok, savak) s a trifluoracilezs (alkoholok, aminok, aminosavak). Ebbl a fejezetbl jl lthat, hogy a GC egy szleskren alkalmazhat, nagyhatkonysg analitikai technika. Mivel a jegyzet kereti behatroltak, ezrt nincs lehetsg a GC rszletekbe men trgyalsra, hiszen errl a technikrl kln knyvek szlettek. Akik mlyebb ismeretekre kvnnak szert tenni, azok szmra ajnlom Balla Jzsef, A gzkromatogrfia analitikai alkalmazsai cm knyvt. IV.2. Nagyhatkonysg folyadkkromatogrfia (High Performance Liquid Chromatography: HPLC) Az elz rszben bemutatott GC legnagyobb htrnya, hogy hrzkeny s nagy molekulatmeg (biomolekulk, polimerek) anyagok vizsglatra nem alkalmazhat. Ilyen esetekben nagyon jl alkalmazhat a HPLC. Ahogy az a nevbl is ltszik ennl a techniknl a mozgfzis folyadk, mg az llfzis lehet valamilyen adszorbens, vagy (sokkal gyakrabban) folyadk (megoszlsos kromatogrfia). GC esetben a mdszerfejleszts sorn az llfzis kivlasztsa a kulcsfontossg, mg HPLC esetn az optimlis mdszer kifejlesztshez mind az llfzis, mind pedig a mozgfzis vltoztatsa eredmnyre vezethet. 51

Tovbbi lehetsg, hogy a mozgfzis sszettele is vltoztathat egy mrs sorn. Ezek az elnyk azonban a mdszerfejlesztst megneheztik a GC-vel sszehasonltva. A HPLC oszlopok fizikai tulajdonsgai kvetkeztben a folyadkot csak nagy nyomssal lehet tjuttatni az elvlasztst vgz oszlopon (innen eredt korbbi elnevezse: nagy nyoms folyadkkromatogrfia). Az oldszer(ek) mozgatst specilis pumpk vgzik. Egy HPLC kszlk sematikus brja a 43. brn lthat. Az oldszereket megfelel tartlyok tartalmazzk, majd keresztlhalad az eluens egy gzmentest egysgen. Innen az n. solvent organizer-be kerl, ami szablyozza az eluens sszettelt, gy, hogy megadott pillanatokban klnbz szelepeket nyit s zr. Ha a mrs sorn az eluens sszettel lland izokratikus, ha pedig elre megrt program szerint vltozik, gradiens elcirl beszlnk. Az oldszerek egy keverfejben keverednek ssze.
eluens eluens eluens eluens

gzmentest

gzmentest

solvent organizer

solvent organizer

pumpa

pumpa

pumpa

oszlop

43. bra: alacsony s magas nyoms gradiens HPLC-k sematikus brja (K: kever; I: injektor; D: detektor)

Ha a keverfej a pumpa eltt van (az oldszerek keveredse lgkri nyomson trtnik) alacsony nyoms gradiens rendszerrl, ha pedig utna, magas nyoms (az oldszerek keveredse nagy nyomson trtnik) gradiens rendszerrl beszlnk (43. bra). A msodik 52

oszlop

megolds kltsgesebb, mivel annl az egyes oldszerek mozgatshoz kln pumpa szksges, gy elterjedtebbek az alacsony nyoms gradiens rendszerek. A pumpa utn tallhat az injektor, majd a kolonna, vgl pedig a detektor. Az egsz rendszer mkdst s az adatgyjtst termszetesen szmtgp vezrli. IV.2.1. Eluensek A HPLC kszlkek ltalban maximum 4 fle eluenst kpesek kezelni, ennl sszetettebb gradienst nem is clszer kszteni. Fontos, hogy az alkalmazott oldszerek nagy tisztasgak legyenek, de mg ilyen esetekben is clszer membrnszrvel megszrni azokat. Tovbbi kvetelmny, hogy az oldott gzok mennyisge minl kevesebb legyen ezrt, br van gzmentest a rendszerben, inert gz (He, N2) tbuborkoltatssal vagy ultrahangos vzfrd alkalmazsval cskkenthetjk a nemkvnatos gzok mennyisgt. A megfelel oldszer vagy oldszer elegy megvlaszts fontos a j HPLC-s eredmnyek elrshez. Az alkalmazott oldszereket jellemezhetjk az n. eluotrp erssgkkel (44. bra). Fontos megjegyezni, hogy az az oldszer, amely norml fzis (lsd ksbb) HPLC-ben ers, az fordtott fzis (lsd ksbb) HPLC esetn gyenge oldszer, ugyangy fordtva is igaz.

norml fzis oldszer erssg H2 O MeOH i-PrOH CH3CN aceton etil-acett di-Et-ter THF CH2Cl2 CHCl3 CCl4 isooktn hexn fordtott fzis oldszer erssg

44. bra: oldszerek eluotrp erssge

53

IV.2.2. Mintaadagols HPLC esetben a minta bejutattsa az eluensramba 6 furat bemrcsapok segtsgvel trtnik (45. bra). Mkdsi mechanizmus a GC-nl bemutatott gzbemr csappal (39. bra) egyezik meg. A klnbsg, hogy itt a mintt tartalmaz hurok 1-100 l kztti.

45.bra: manulis HPLC injektor

A hurkot ltalban preczis mikrofecskendkkel tltjk fel, majd a kar tfordtsval az eluens a hurkon keresztlhaladva jutattja a mintt a kolonnra. Gyakran a kar tfordtsa egyben a mrs indtsa is, ami jobb reproduklhatsgot eredmnyez, ellenttben a kzzel trtn mrsindtssal. A HPLC-s injektorok lehetnek manulisak, de abban az esetben, ha sok mintt kell feldolgozni clszer automata mintaadagol alkalmazsa. IV.2.3. HPLC-s kolonnk, kolonnavdelem Ahogyan a GC esetben, itt is, a kszlk lelke a kolonna, amin az elvlaszts trtnik. Az oszlopok 3-30 cm hossz s 2-5 mm bels tmrj csvek melybe a megfelel llfzist tltik (46. bra). A tltet nagyon apr szemcsj, leggyakrabban a 3 s 5 m-s szemcsj tlteteket tartalmaz oszlopokat alkalmazzk. A tltet alapjn megklnbztethetnk adszorpcis s megoszlsos kromatogrfit. LSC esetn az adszorbens 54

lehet szilikagl, Al2O3, vagy aktv szn. Mg LLC esetben valamilyen hordozra felvitt folyadk. Br a HPLC esetn nincs akkora jelentsge a hmrskletnek, mint a GC-nl, az jabb, gyors kromatogrfis technikk (UPLC), valamint specilis feladatoknl alkalmazhatunk kolonnatermoszttot, mely az oszlop lland hmrskleten tartst biztostja.

46. bra: klnbz mret HPLC-s kolonnk

Meg kell emlteni mg, hogy a klasszikus analitikai oszlopokon kvl vannak mg n. szemi-preparatv s preparatv oszlopok, melyeket nagy mennyisgben ellltott anyagok tiszttsra hasznlhatunk, illetve megtallhatak a kapillris HPLC kolonnk is, amiket leginkbb LC-MS kapcsolsok esetben alkalmazunk, mivel a MS kszlkekhez szksges alacsony (l-nl/perc) ramlsi sebessgeket ezeken knnyebb ltrehozni. Az analitikai oszlopokon ltalban 0,5-3 ml/perc ramlsi sebessggel dolgozunk. Meg kell mg emlteni, hogy fontos az analitikai kolonnk vdelme, hogy az esetleges szennyezdsek ne krostsk azt. Ezt megoldhatjuk n. eltt kolonna alkalmazsval, vagy ma mr inkbb n. guard-cartridge-ok hasznlatval. Napjainkban a megoszlsos kromatogrfia szinte kizrlagos a gygyszervegyletek analzisben. Az ll s mozg fzis polaritsa alapjn a HPLC-ben megklnbztethetnk n. norml-fzis (Normal-Phase: NP) s fordtott-fzis (Reversed-Phase: RP) elvlasztsokat. Az els esetben az oszlop polris, az alkalmazott oldszer vagy oldszer elegy kevsb, mg RP-HPLC estn az llfzis apolris a mozgfzis pedig ltalban polaritssal rendelkezik (lsd eluotrp erssg, 44. bra). A tltetek polaritsa a hordozn megkttt csoportoktl fgg. A leggyakrabban hasznlt oszlopokon klnbz hosszsg 55

alkil-csoportokat (C8, C18, C30) ktnek meg. A nitril, illetve ciano-alkil csoportokat tartalmaz oszlopok kzepes polaritsak, mg az aminoalkil-csoportot tartalmazak polris llfzisok. A kereskedelemben rengeteg, tbb-kevsb hasonl, oszlop megtallhat. Ezek klnbzhetnek egymstl a tltet rszecskinek mretben, mreteloszlsban, alakjban, az oszlop hosszban, tmrjben, de egyb tulajdonsgokban is. Ezrt nagyon fontos az analitikai feladatnak leginkbb megfelel oszlop kivlasztsa, majd pedig a mdszerfejleszts sorn a megfelel eluensek kivlasztsa s a kromatogrfis krlmnyek (ramlsi sebessg, oldszersszettel) meghatrozsa. Ez ltszlag egyszer feladat, azonban a gyakorlatban sokszor nagyon idignyes folyamat. IV.2.4. HPLC-s detektorok Mint minden analitikai mrsnl, az utols lps itt is a detektls. Tbbfle detektlsi lehetsg van, ezek kzl a legelterjedtebben az UV-VIS spektrofotometris, az elektrokmiai, fluoreszcens s MS detektorokat alkalmazzk, de megtallhatak mg a trsmutat mrsen, fnyszrs mrsen alapul, illetve egyb specilis (polarometris, IR) detektorok is. Az UV-VIS detektoroknak tbb tpusa van. Lehetnek fix hullmhosszon mrk (ma mr ritka), vltoztathat hullmhosszon mrk, melyek egy adott hullmhosszra llthatak be, de ha tbb anyagot mrnk, melyek elnyelsi maximuma tvol esik egymstl, akkor tbb mrst kell vgezni ugyanazzal a mintval. Ezrt a legjobb megolds az n. didasoros detektorok alkalmazsa, melyekkel egyszerre tbb hullmhosszon lehet mrni, gy minden komponens az elnyelsi maximumn, a legrzkenyebben mrhet. Az UV-VIS detektorok szleskren alkalmazhatak, htrnyuk a viszonylag nagy kimutatsi hatr (ng). Ha az UVVIS detektorok rzkenysge nem megfelel, akkor alkalmazhatunk fluoreszcens, elektrokmiai vagy MS detektorokat, melyek sokkal rzkenyebbek. Napjainkban a bioanalitikai mrsekben az LC-MS kszlkek egyre jobban elterjednek, megfelel rzkenysgk, kis mintaignyk s szelektivitsuk kvetkeztben. IV.2.5. A HPLC alkalmazsa A HPLC, s a kzelmltban tovbbfejlesztett (UPLC) vltozatai, alkalmazsa szlesebbkr, mint a gzkromatogrfi. Hasznlhatjuk az egszen kismrt molekulktl a bio- s szintetikuspolimerekig egyarnt. Tovbbi elnye, hogy hlabilis anyagok vizsglatra 56

is kivlan alkalmas. Gzok s olyan anyagok vizsglatra, melyekbl nem kszthet megfelel oldat, nem hasznlhat. A gygyszer kutats-fejleszts, gyrts, minsgellenrzs sorn valamint a diagnosztikai, toxikolgiai, kutat s egyb laboratriumokban mindenhol megtallhat. IV.3. Szuperkritikus Folyadkkromatogrfia (Supercritical Fluid Chromatography: SFC) Abban az esetben, ha a mozgfzis szuperkritikus folyadk, szuperkritikus folyadkkromatogrfirl (33. bra) beszlnk. Br korbban mg nem volt teljesen megbzhat a technika, napjainkban a technikai fejlesztseknek ksznheten jl alkalmazhat analitikai mdszerr ntte ki magt, ami klnsen jl alkalmazhat a gygyszervegyletek analzisben. Nagy elnye ennek a techniknak, hogy ugyanazt, vagy nagyon hasonl hardvert hasznl, mint a HPLC, azonban a mozgfzis nem hagyomnyos folyadk, hanem a kritikus hmrsklete s nyomsa felett, vagyis kritikus llapotban tartott folyadk. Az SFC kszlkek felptse hasonl a HPLC-hez (47. bra). A nagynyoms palackbl rkez gzt egy htegysg a megfelel hmrskletre lltja. Mivel a leggyakrabban alkalmazott eluens a CO2, ami teljesen apolris, szksg lehet mdost adalk bejutattsra, amit egy msuk pumpa juttat az eluensramba, gy nvelve a polaritst, kiterjesztve az alkalmazhatsgot.

ht

CO2 palack

pumpa

oszlop

BPR

mdost

pumpa

47. bra: SFC kszlk sematikus brzolsa (I: injektor; D: detektor; BPR: Back Pressure Regulator)

A gz s a mdost a keverben sszekeveredik, majd ebbe injektljk a mintt, ami az oszlopon vlik szt komponenseire. Az SFC techniknl ugyanolyan oszlopokat alkalmaznak, mint a HPLC esetben. Az elvlaszts utn kvetkezik a detektls, ami a HPLC-nl ismertetett detektorokkal trtnik, de opcionlisan GC-s detektorokat is lehet alkalmazni. A kszlkek fontos egysge a BPR, ugyanis az adott nyomst a kszlkben mindenhol fenn 57

kell tartani, mivel a nyomsvltozssal a fluid llapotban lev gz gzz alakulna s sztvlna a mdosttl. gy BPR alkalmazsval elrhet, hogy a mrs sorn az eluens vgig egy fzisban maradjon. A leggyakrabban alkalmazott CO2-n kvl alkalmaznak mg NH3-t, teltett sznhidrogneket, nitrogn-oxidot is, valamint ezek szerves mdostkkal alkotott elegyt. Az egyes vegyletcsoportok polaritst (a teljessg ignye nlkl) s az elvlasztsukhoz alkalmazhat eluenseket mutatja a 48. bra.
vegyletcsoportok polaritsa apolris terek szterek aldehidek s ketonok alkoholok fenolok hidroxi-savak benzilaminok szulfonamidok fenil-urek szulfonilurek triazinok karbamtok CO2 CO2 + MeOH CO2 + MeOH + egyb Alkalmazott eluens
48. bra: SFC-val elvlaszthat funkciscsoportok

polris

58

A SFC szmos elnnyel rendelkezik a HPLC-vel szemben. Gyorsabb mdszerfejlesztst tesz lehetv, olcsbb zemeltets jellemzi (alacsony eluens s oldszermaradk megsemmistsi kltsg), tovbb a toxikus szerves oldszerek hasznlata jelentsen cskkenthet, s br a CO2 az veghzhats gzok kz tartozik, az alkalmazott mennyisg elenysz az egyb CO2 forrsok mellett, gy krnyezetvdelmi s munkaegszsggyi szempontbl kiemelt jelentsge van. Htrnyaknt emlthet, hogy ltalban tbb nagynyoms pumpra van szksg, vagyis a beruhzsi kltsg magasabb, tovbb, hogy mg nem teljesen kiforrott technika, gy az alkalmazhatsga (reproduklhatsg, robosztussg) mg nehzkes lehet a szigor gygyszeripari s minsgbiztostsi kvetelmnyek miatt.

Ebben a fejezetben a kt leggyakrabban alkalmazott kromatogrfis technika a GC s a HPLC kerlt bemutatsra, tovbb rviden megemltettem a SFC-t is. Termszetesen nem csak ezek az elvlasztstechnikai lehetsgek llnak rendelkezsre. Nagy hatkonysga s nagyon kis mintaignye kvetkeztben viszonylag szleskren hasznlatosak a kapillris elektroforzis kszlkek is. A jegyzet keretei nem teszik lehetv a bemutatott technikk rszletekbe men trgyalst, valamint az egyb lehetsgek bemutatst. Akik tovbbi rszletekre kivncsiak azok szmra ajnlom Balla Jzsef mr emltett knyvt, valamint Fekete Jen: Folyadkkromatogrfia elmlete s gyakorlata cm tanknyvt, illetve kapillris elektroforzissel kapcsolatban Gspr Attila: Kapillris znaelektroforzis cm jegyzett.

59

V. Tmegspektrometria s kapcsolt technikk Ahogy az els fejezetben emltsre kerlt, a tmegspektrometria egy nagyon dinamikusan fejld tudomnyg, amely a klnbz technikai megvalstsoknak ksznheten nagyon szertegaz terleteken kerl alkalmazsra. Korbban bemutatsra kerlt a kis molekulatmeg szerves vegyletek szerkezetvizsglatban leggyakrabban alkalmazott EI ionforrs ismertetse. Ennek az ionforrsnak a legnagyobb htrnya, hogy nagyobb, illetve hrzkeny molekulk esetn nem alkalmazhat. Ilyen esetekben egyb ionizcis technikkat kell alkalmazni. V.1. Ionforrsok V.1.1. Gyors atom/ion bombzs (Fast Atom/Ion Bombardment: FAB/FIB) Polros, hre rzkeny, 300-10000 Da molekulatmeg anyagok vizsglatra alkalmas a gyors atom/ion bombzsos technika, ahol az ionizcit szolgltat energit felgyorstott, tltssel nem rendelkez atomok vagy ionok szolgltatjk. Az energia tads trtnhet kzvetlenl, de sokkal jobb hatsfok, ha valamilyen energia tad mtrixot alkalmazunk. A gyakorlatban leggyakrabban alkalmazott mtrixvegylet a glicerin, de gyakran hasznljk mg a m-nitrobenzil alkoholt, di- s trietanolamint, illetve a tioglicerint, valamint a mgikus lvedk-nek (magic bullet) nevezett mtrixot (6. tblzat). 6. tblzat: alkalmazott mtrixok mtrix vegylet glicerin 3-nitro-benzilalkohol (NBA) 1-tioglicerin (TG) Trietanolamin (TEA) magic bullet (MB)
ditiotreitol:ditioeritritol = 5:2

relatv molekulatmeg 92,05 153,04 108,02 149,10 153,01

Alkalmazs ltalnos ltalnos Nitrogn vegyletek, peptidek zsrsavak, sznhidrtok ltalnos

A kb. 5 keV energij neutrlis atomnyalbot valamilyen nemesgz, leggyakrabban Ar vagy Xe ionizlsval hozzk ltre. A kpzd Ar+, Xe+ vagy He+ ionokat felgyorstjk, majd tkztetik semleges Ar, Xe vagy He atomokkal, amelyek tveszik a kinetikus energit:

60

Ar+. (gyors) + Ar (lass)

Ar+. (lass) + Ar (gyors)

A maradk ionokat elektrdok segtsgvel eltvoltjk a gzelegybl s a neutrlis atomnyalbot fokuszljk a minta elegyre. A FIB ionforrs hasonl a FAB-hoz. Ebben az esetben azonban egy nagyobb (~30 keV) energij Cs+ ionnyalbot hoznak ltre s ez vgzi az ionizlst. Az n. czium iongyban egy elektromosan fttt filament segtsgvel egy cziumsbl Cs+-ok lpnek ki, amelyeket felgyorstanak, majd fkuszlnak a minta s mtrix elegyre. A czium iongy alkalmazsa lehetv teszi nagy molekulatmeg vegyletek rzkeny analzist, mg a FABot ltalban 5-6000 Da molekulatmegig hasznljk. Mindkt technika esetben elny, hogy viszonylag hossz ideig tart mrsek is elvgezhetek, mivel a mtrix alkalmazsval egy llandan megjul folyadkfelsznt kapunk. A mtrix alkalmazsnak tovbbi elnye, hogy cskkenti a vizsgland minta molekulinak bomlst. Ez azonban azt is jelenti, hogy a fragmentci is kisebb, gy kevesebb szerkezeti informcit szolgltatnak, mint ms ionforrsok. Az ionizci sorn pszeudo molekulaionok keletkeznek. Problmt jelent az ionizci sorn, hogy a mtrixszal is kpzdnek n. cluster ionok, amelyek neheztik a spektrumok rtkelst, valamint alacsony molekulatmegek esetn nagyon ers lehet az ezektl ered httrzaj. Mindkt ionforrs jl kombinlhat folyadkkromatogrffal (HPLC-MS) is. V.1.2. Mtrix segtett lzerdeszorpci ionizci (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization: MALDI) A FAB ill. FIB ionforrsok kb. 10000 Da molekulatmegig jl hasznlhatk. A biolgiai (DNS, RNS, fehrjk) s szintetikus makromolekulk azonban ennl is nagyobb molekulatmeggel rendelkeznek. Ezek vizsglatra kivlan alkalmas a mtrix segtett lzerdeszorpci ionizci. Az ionizci sorn a mintt elszr feloldjuk egy olyan mtrixban, amely az alkalmazott lzer hullmhosszn ers elnyelssel rendelkezik, majd az oldatot egy megfelel mintatart lemez felletre szrtjuk. Nagyon fontos a megfelel mtrix kivlasztsa, illetve az optimlis minta:mtrix arny megvlasztsa. A leggyakrabban alkalmazott mtrix vegyletek a teljessg ignye nlkl az 7. tblzatban tallhatak. A mtrixnak fontos szerepe van az ionizci folyamatban. Az ionizcit rvid ideig tart lzer impulzussal vgzik, azonban ennek pontos mechanizmusa mg nem teljesen ismert. A besugrz lzer fny energijt a mtrix veszi t s kzvetti a vizsgland minta molekuli 61

fel. A hirtelen energiakzls kvetkeztben a minta-mtrix elegy felmelegszik s a felletrl molekulk szakadnak ki s kerlnek a gzfzisba. Itt trtnik az ionizci klnbz mechanizmusokon (gzfzis fotoionizci, tltscsere, ion-molekula reakcik, stb.) keresztl. A mtrix fontos szerepe, hogy tveszi a fls gerjesztsi energit, gy a molekulaion nem bomlik el, tovbb proton vagy kation transzfer ltal segti az ionizcit is. MALDI ionizci sorn ltalban egyszeresen tlttt kvzi molekulaionok kpzdnek, de elfordulhatnak tbbszrsen tlttt, illetve dimer formk is. 7. tblzat: alkalmazott mtrixok mtrix vegylet relatv molekulatmeg (Da) 154,1 alkalmazott lzer: hullmhossz (nm) N2 lzer: 337 Nd:YAG lzer: 355 N2 lzer: 337 Nd:YAG lzer: 355 N2 lzer: 337 Nd:YAG lzer: 355 Er:YAG lzer: 2,94 m CO2 lzer: 10,6 m N2 lzer: 337 Nd:YAG lzer: 355 Nd:YAG lzer: 266 alkalmazs szacharidok, oligoszacharidok, peptidek, oligonukleotidok peptidek, lipidek, nukleotidok, oligonukleotidok, proteinek, polimerek proteinek, peptidek, polimerek proteinek ltalnos proteinek

2,5dihidroxibenzoesav 4-hidroxi-cianofahjsav 3,5-dimetoxi-4hidroxifahjsav glicerin fahjsav nikotinsav

189,2 224,2 92,1 148,2 123,1

MALDI ionizci sorn nem szksges olyan hullmhosszon dolgozni, ahol a vizsgland anyagnak elnyelse van, mivel a mtrix abszorbelja a lzer fotonokat. Az ionizci folyamata fggetlen a vizsgland molekula abszorpcis tulajdonsgaitl s a mrettl, gy lehetv vlik nagyon nagy (>100 kDa) molekulk vizsglata is. A MALDI kszlkek leggyakrabban N2 lzert alkalmaznak s ltalban replsi id (TOF, lsd ksbb) analiztorokkal hasznljk. Az elzekben ismertetett ionforrsok (FAB/FIB, MALDI) n. vkuum ionforrsok, vagyis a tmegspektromter elvlaszthatatlan rszei. Ktezerben bevezetsre kerlt az atmoszfrikus nyomson mkd MALDI ionforrs (Atmospheric Pressure MALDI: APMALDI). Ez hasonlkppen mkdik, mint a hagyomnyos vkuum MALDI annak minden elnyvel, legnagyobb elnye mgis az, hogy az ionizci nem a vkuum alatt lev rgiban

62

trtnik, gy nem kell egybepteni az analiztorral, levlaszthat s lehetsg nylik egyb, atmoszfrikus nyoms interfszt tartalmaz kszlkekkel trtn sszekapcsolsra. V.1.3. Atmoszfrikus nyoms ionizci (Atmospheric Pressure Ionization: API) Az AP-MALDI mellett tovbbi gyakran alkalmazott atmoszfrikus nyoms ionforrsok, amelyeket kzs nven spray technikknak is neveznek, az elektrospray (ESI), az atmoszfrikus nyoms kmiai ionforrs (APCI) s az atmoszfrikus nyoms foto ionforrs (APPI). Ezeket az ionforrsokat leginkbb HPLC-vel kombinlt kszlkekben alkalmazzk, s egyben betltik, az n. illeszt egysg vagy ms nven interfsz szerept is (vannak olyan kapcsolt technikk, ahol kln illesztegysg van s EI, CI vagy FAB ionforrst alkalmaznak, amirl a ksbbiekben lesz sz). A spray technikk kz tartozik tbbek kztt a termo-spray (TSP). Ebben az esetben a HPLC-rl lejv folyadkot egy 0,1-0,15 mm-es furaton porlasztjk t egy elektromosan fttt fm kapillrisba, ahol az eluens elprolog a mintbl. Az ionizci elektron ionizci vagy korona kisls kvetkeztben trtnik, vagy az eleve ionos minta ionprolgsa rvn is bekvetkezhet. A TSP ionforrsok alkalmazsa egyre jobban httrbe szorul az egyb API (ESI, APCI, APPI) technikk fejldsvel. ESI esetn a kromatogrfrl lejv eluenst lgkri nyomson porlasztjk. Az ionizci ers elektromos ertr kvetkeztben jn ltre. Az ionizcit elsegtend, az ionforrsba mg forr, ltalban nitrogn gzt is vezetnek, ugyanis a kapillris vgrl tlttt cseppek szakadnak le (49. bra).
ellenelektrd kapillris

eluens

+ ++ + +++ + + + + + ++ + +

+ ++ + ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + +
analiztor

Nagyfeszltsg tpegysg

49. bra: ES ionizci sematikus brzolsa

63

A forr gz hatsra a cseppek deszolvatldnak, ennek kvetkeztben jelentsen megn a felleti tltssrsg. Amikor elrnek egy bizonyos kritikus mretet (a tltshez viszonytva) bekvetkezik az n. Coulomb robbans s a tlttt rszecskk a gzfzisba kerlnek, melyeket gyorsts utn tovbbt a kszlk az analiztor fel (49. bra). ESI esetn tbbszrs tlts rszecskk kpzdnek. Ennek htrnya, hogy megneheztik az MS spektrumok rtkelst, azonban nagyon nagy elnye, hogy nagy molekula tmeg vegyletek (Pl. proteinek, peptidek) is vizsglhatak olyan kszlkekkel, melyek analiztornak tmegtartomnya jelentsen kisebb a vizsgland anyag moltmegnl. Az ES ionforrs polris s szemi polris molekulk vizsglatra alkalmas leginkbb. Abban az esetben, ha a minta kevsb polris alkalmazhat az APCI (50. bra) mg teljesen apolris anyagok esetn az APPI (52. bra) ionizcis eljrs ad a legjobb eredmnyt.

HPLC

f ttt tr

analiztor

korona elektrd porlaszt gz

50. bra: APCI ionforrs

Az APCI a korbban ismertetett CI ionforrs analgja. Az ionizcit gzfzis, ion-molekula reakcik biztostjk. A folyamat sorn a HPLC-rl rkez mozgfzist elporlasztjk, ami egy deszolvatcis kamrba kerl. Ezt kveten a mr gzfzis mintban egy korona elektrd segtsgvel nhny kV-s koronakislssel ionizljk a molekulkat. A kisls kvetkeztben az oldszer-molekulk ionizldnak, majd ezek adjk t a tltst a vizsgland molekulknak pszeudo-molekulaionokat eredmnyezve (51. bra). APCI esetn nem jellemz tbbszrs tlts rszecskk keletkezse, kevsb polris, 1500 Da-nl kisebb tmeg molekulk vizsglatra alkalmazhatjuk.

64

51. bra APCI ionizci

Az APCI ionforrs mdostott vltozata az atmoszfrikus nyoms foto ionizcis (APPI) ionforrs (52. bra). Mkdse hasonl az APCI-hoz, a klnbsg, hogy a deszolvatcis kamra utn az ionizcit nem koronaelektrd, hanem UV-lmpa biztostja.

52. bra: APPI ionforrs

Az UV fnyt ltalban kripton kislses lmpval lltjk el, mely 10 eV ionizcis energival rendelkezik, de hasznlhatunk Xe vagy Ar lmpt egyarnt (53. bra).

65

alkalmazott lmpa

Xe: 8,4

Ar: 11,2 Kr: 10 eV

5 dopant oldszerek toluol: 8,83 aceton: 9,7

10

15

MeOH: 10,84

CH3CN: 12,2 H2O: 12,62

53. bra: APPI-ban alkalmazott dopant vegyletek s oldszerek ionizcis energii

APPI esetn ktfle mdon trtnhet az ionizci, hagyomnyos, msnven direkt, s dopant segtett ionizcival (54. bra). Az elbbi megoldsban az UV foton a vizsgland anyagot ionizlja, teht az ionizcis energijnak kisebbnek kell lennie, mint a besugrz fnynek. Az gy aktivldott mintt elektronveszts utn gykknt, vagy proton tadsra kpes oldszer jelenltben protonlt formban lehet detektlni. A dopant segtette APPI esetn egy segd vegyletet alkalmazunk. A dopant, vagy segdvegylet nem ms, mint valamilyen szerves oldszer, leggyakrabban aceton vagy toluol, melyet az eluensbe kevernek. Ezen molekulk ionizcis energija kicsi, gy nagyon jl ionizlhatak UV fotonok ltal, mely hasonlan a direkt ionizcihoz egy gyk dopant molekult fog eredmnyezni, ami proton-, vagy elektrontranszfer ltal fogja ionizlni a vizsgland molekulkat (54. bra). Az APPI alkalmazsa hasonl az APCI-hoz, azonban apolris molekulk esetn ez az elsknt vlasztand ionforrs.

66

prolgs

minta f olyadk f zis h

minta gz f zis h ionizci

direkt ionizci

dopant segtette ionizci

M + h M+ + SH

M+ + e [M+H]+ + S

D + h D+ + M D+ + M

D+ + e [M+H]+ + D M+ + D

vizsgland ionok

54. bra: APPI ionizci folyamata. h= Planck lland =frekvencia, M minta molekula, SH a proton tadsra kpes oldszer molekula, D=dopant molekula

Az elzekben csak a leggyakrabban alkalmazott ionforrsok kerltek bemutatsra. Termszetesen vannak tovbbi, specilis ionizcis technikk is. Mindezekbl jl ltszik, hogy a tmegspektrometria egy nagyon szleskren alkalmazott analitikai technika kezdve a kismret molekulk szerkezetazonoststl, egszen az risi biopolimerek vizsglatig. Azt, hogy milyen ionforrst vlasszunk, mindig a vizsgland anyag tulajdonsgai, illetve leggyakrabban a kromatogrfis krlmnyek hatrozzk meg. Az egyes ionforrsok alkalmazsi lehetsgeit a polarits s moltmeg fggvnyben az 55. bra mutatja be. Azt, hogy melyik ionizcis technikt vlasszuk, tbb tnyez hatrozza meg. Leginkbb a vizsgland anyag tulajdonsgai a mrvadak. Mindegyik techniknak van szmos elnye s htrnya egyarnt, belertve a kltsgeket is. A MALDI ionforrst alkalmaz kszlkeket ltalban TOF analiztorokkal, az APPI, APCI, ESI s FAB/FIB forrsokat mgneses, kvadrupol, ioncsapda, tripletkvadrupol, stb. analiztorokkal illetve ezek kombincijval hasznljuk. A leggyakrabban alkalmazott analiztorok a kvetkez fejezetben kerlnek bemutatsra.

67

300000

MALDI/AP-MALDI
100000

ESI
10000

1000

FAB/FIB APPI APCI

apolris polris

55. bra: Ionforrsok alkalmazhatsga a polarits s mltmeg fggvnyben

V.2. Analiztorok A tmegspektromterek analiztora az ionforrsban keletkezett tlttt rszecskket vlasztja szt tmeg/tlts (m/z) alapjn. Az elvlaszts trtnhet ion transzport, illetve ion trols alapjn. Az elbbiek kz tartoznak tbbek kztt a mgneses (B), elektrosztatikus (ESA), kvadrupol (Q), replsi id (TOF), mg a msodik csoportba az ioncsapda (IT), Fourier transzformcis ion ciklotron rezonancia (FT-ICR), valamint a Fourier transzformcis orbitrap analiztorok. Napjainkban egyre elterjedtebbek az olyan kszlkek, melyek klnbz analiztor kombincikat alkalmaznak (tandem tmegspektrometria; MS/MS lsd ksbb). Az analiztorok jellemzsre tbb paramter hasznlatos, melyek kzl a felbonts, a tmegtartomny, a transzmisszi s a kimutatsi hatr a legfontosabb. A transzmisszi a detektlt s a forrsban kpzdtt ionok hnyadosa, vagyis, annak a jellemzsre szolgl, hogy mennyi ion ri el a detektort. Ha ez az rtk kicsi, az az rzkenysg cskkenst, a kimutatsi hatr nvekedst vonja maga utn. A felbonts (R) azt fejezi ki, hogy az analiztor mekkora tmegklnbsggel tud sztvlasztani kt egyms melletti iont, amit a kvetkez egyenlettel fejezhetnk ki: R = m/m. A felbontst megadhatjuk az un. 10% vlgy (lt. mgneses s szektor kszlkeknl), illetve az 50% vlgy

68

(Q, IT, TOF, stb.) defincival, amelyek kimondjk, hogy kt cscsot akkor tekintjk feloldottnak, ha a kzttk lev vlgy a cscsmagassg 10, illetve 50%-a (56. bra).

50% 10%

FWHM

56. bra: analiztorok felbont kpessgnek megadsa

A felbontst meghatrozhatjuk egy izollt cscs esetn is, ami a cscsmagassg felnl mrt svszlessggel egyenl (Full Width at Half Maximum: FWHM) V.2.1. Mgneses (B) s Elektrosztatikus analiztor (ESA) A mgneses analiztorok mkdsnek alapja, hogy meghatrozott kinetikus energival rendelkez, v sebessggel halad tlttt rszecske, mgneses trbe kerlve krplyra knyszerl. Ha vltoztatjuk a mgneses tr erssgt (B), vagy a gyorst feszltsget (U), akkor minden egyes idpillanatban ms s ms m/z rtk ion fog a detektorba kerlni, amit a kvetkez egyenlettel rhatunk le: m/z = B2r2/2U
B: mgneses trer, r: sugr, U: gyorst feszltsg

A mgneses kszlkeknek szles a tmegtartomnyuk, s nagyon j az rzkenysgk, mkdtetsk azonban komoly szaktudst ignyel. Htrnyuk mg, hogy az azonos tmeg, de klnbz kinetikus energij rszecskk szrdnak, ami rontja a felbontst. Ahhoz, hogy minl pontosabb mrseket vgezznk, ezt a szrdst le kell cskkenteni, amit az n. elektrosztatikus analiztorral (ESA) rnek el. Ezek az n. ketts fkuszls kszlkek, ahol megklnbztetnk norml (E-B) s fordtott (B-E) geometrij kialaktst. Az ESA-t egy kondenztorknt kell elkpzelni, amely nem tmeg szerint szeparl, hanem energia alapjn,

69

vagyis mindig az azonos kinetikus energival rendelkez ionokat engedi tovbb a mgnesbe. Az ESA htrnya, hogy sok iont kiszr, de nagy elnye, hogy jelentsen megnveli a felbontst, gy ezekkel a ketts fkuszls szektor kszlkekkel nagyfelbonts mrsek elvgzsre is lehetsg van. Htrnyuk mg a nagy helyigny, s hogy elg drgk. V.2.2. Kvadrupol analiztor (Quadrupol) A kvadrupol (Q) analiztor (57. bra) esetben egy tglatest ngy sarkban 4 prhuzamos, 10-20 cm-s rd foglal helyet. A rudakra, melyek kzl a szemben levk azonos, mg az egyms melletiek ellenttes polaritsak, egyenramot s rdifrekvencis vltramot kapcsolnak, aminek hatsra egy vltakoz, kvadruplus elektromos tr alakul ki. Ez a vltoz elektromos tr oszcillcis mozgsra knyszerti az ionokat, amelyek eredetileg a kvadrupol tr kzepre vannak fokuszlva. Bizonyos ertr bizonyos idpillanatban csak egy bizonyos m/z rtk iont enged t.

+ +
57. bra: Q analiztor vzlata

Az analiztor mkdhet SCAN (psztz) s SIM (Selected Ion Monitoring) mdban egyarnt. SCAN mrs sorn folyamatosan vltoztatjuk a rudak ltal ltrehozott elektromos teret gy az oszcillcis mozgs profiljt, ami kvetkeztben folyamatosan ms-ms m/z rtk ion detektlsa kvetkezik be egy megadott tmegtartomnyon bell. SIM mrs sorn csak egy kivlasztott m/z rtk ion jut t az analiztoron, ami jelentsen megnveli a kszlk rzkenysgt. A kvadrupol analiztorok elnye, hogy viszonylag olcsk, kismretek, gyors mrseket tesznek lehetv, jl kombinlhatk elvlasztstechnikai mdszerekkel (GC, HPLC), gy komplex mintk vizsglatra is alkalmasak. Htrnyuk, hogy felbontsuk a teljes tmegtartomnyban egysgnyi, gy nincs lehetsg nagyfelbonts mrsekre, vagyis a pontos molekulatmeg meghatrozsra.

70

V.2.3. Replsi id analiztor (Time-Of-Flight: TOF) A TOF analiztor (58. bra) esetn az ionforrsban keletkezett ionokat gyorstjk, majd egy vkuumcsben reptetik a detektor fel s a becsapds idtartamt mrik. Minl nagyobb az ion tltse annl nagyobb taszt ert kap a kezdeti elektromos meztl, gy nagyobb kinetikus energival fog rendelkezni, ezrt hamarabb ri el a detektort. A tmeggel pedig pont fordtottan arnyos az ionok sebessge, minl nagyobb egy ion tmege annl nagyobb a tehetetlensge ezltal pedig a sebessge kisebb lesz. A lineris TOF kszlkek htrnya, hogy klnsen a magasabb tmegtartomnyokban jelentsen cskken a felbontsuk. Ez egyrszt abbl addik, hogy m s m+1 tmeg ionok replsi ideje kztti klnbsg egyre kisebb lesz a tmeg nvekedse miatt, s nehzkes a pontos idmrs megvalstsa. Msrszt jelents problma, hogy az azonos tmeg ionok, a gyorsts sorn eltr kinetikus energit kaphatnak, mely klnbsg a detektlsnl svszlesedst okoz. Ennek a problmnak a megoldsra fejlesztettk ki az gynevezett reflektront vagy ms nven ion-tkrt, aminek alkalmazsval jelentsen nvelhet a TOF kszlkek felbontsa (58. bra). A hagyomnyos TOF kszlkektl abban klnbzik, hogy tartalmaz egy elektrd sort, ami korriglja az eltr kinetikus energibl add replsi id klnbsgeket, mivel a nagyobb kinetikus energij ion mlyebbre hatol a reflektron ltal ltrehozott elektromos trbe, ezltal hosszabb utat tesz meg, gy a detektort az azonos tmeg, de eltr gyorstson tesett ionok azonos idben rik el.

detektor (lineris) detektor taszt elektrd reflektron

58. bra: TOF s Re-TOF analiztor sematikus brzolsa

Abban az esetben, ha a reflektron ki van kapcsolva a kszlk lineris mdban mkdik, s kis felbonts spektrumot kapunk. Reflektron-On mdban azonban az elbbiek rtelmben nagy felbontst rhetnk el. A TOF analiztorok gyorsak, a replsi idt mikro illetve nano szekundumokban mrik. Legnagyobb elnyk, hogy tmegtartomnyuk elmletileg korltlan, a fels hatrt az ionforrs szabja meg. A TOF kszlkeket leggyakrabban MALDI 71

ionforrssal

kombinlva

alkalmazzk

szleskren.

Egyszeren

karbantarthatak,

kismretek ezrt kedvelt kszlkek, klnsen a biokmiai, orvos-biolgiai kutatsok tern. V.2.4. Ioncsapda analiztor (Ion Trap) Az elzekben bemutatott analiztor tpusok az ionok transzportja alapjn vlasztjk szt az ionokat. Az IT (59. bra) ezzel szemben az ionok trolsn alapul analiztor, ami hrom elektrdbl ll (gy kpzelhet el, mintha egy lineris kvadrupolt krbehajltannk), melyek egy hiperbolikus bels teret hoznak ltre. Az ionforrsban kpzdtt ionok egyszerre kerlnek az analiztorba (az ionokat IT-ben is ltre lehet hozni), ahol az elektrdokra kapcsolt egyen- s vltfeszltsg hatsra egy 8-as alak plyra knyszerlnek. Ellenttben a Q analiztorral, ami egy adott pillanatban csak egy ionra stabil, itt az sszes ion stabil plyn mozog, majd az elektromos ertr vltozsval bizonyos m/z rtk ion plyja destabilizldik s kilkdik a detektorba a kilprsen keresztl.

ionforrs belp elektrda gyrelektrdk

kilp elektrda

detektor
59. bra: IT analiztor vzlata

Az IT analiztorok, melyet 3D ioncsapdnak is neveznek (2D ioncsapda lsd ksbb), nagy elnye a kis mret, knny kezelhetsg, nagy felbonts, nagy rzkenysg, tovbb, hogy relatve olcsk, s ami a legfontosabb, hogy alkalmasak MSn mrsekre, vagyis tandem tmegspektrometria kivitelezsre, mg a kombinlt kszlkek csak MS2, MS3 mrsekre alkalmasak.

72

V.2.5. Fourier Transzformcis Ion Ciklotron Rezonancia analiztor (FT-ICR) Ez is az ionok trolsn alapul analiztorok kz tartozik. Mkdsnek alapja, hogy az analiztor cellba, ami egy szupravezet mgnes belsejben van, bejuttatott ionok nagy mgneses trer kvetkeztben krplyra knyszerlnek, s az ezek ltal induklt ramot mri. Ezt Fourier transzformcival frekvenciv alaktjk, amely az ion m/z rtkvel hozhat kapcsolatba. Ezeknek az analiztoroknak a felbontsa risi, de nagy htrnyuk, hogy a kszlkek s zemeltetsk is nagyon drga s nagy szaktudst ignyel. V.3. Kapcsolt technikk A mszeres analitikai technikknak kiemelt szerepe van a gygyszerkutatsban, fejlesztsben s gyrtsban egyarnt. Ezek kz tartozik tbbek kztt az j potencilis gygyszervegyletek azonostsa, a gygyszer sorsnak kvalitatv s kvantitatv nyomon kvetse (ADME; ADMETox), a dzis hats kapcsolat meghatrozsa, interakcik feltrkpezse, farmakolgiailag aktv metabolitok kimutatsa, esetleges sztereoizomrik bizonytsa, gyrtskzi termkek, segdanyagok, alapanyagok, csomagolanyagok ksztermkek minsgi vizsglata, stb. Ezen mrsek mindegyike klnbz specilis mszert ignyel. A vizsglatokat nehezti, hogy a mai gygyszerek jelents rsze mr olyan plazmakoncentrci tartomnyba esik (pg/ml, ng/ml), amely mr klasszikus eljrsokkal (HPLC-UV; FLD; EC; GC-FID; TCD) nem, vagy pontatlanul vgezhetk el. Mindezek mellett tovbbi problmt jelent a mintk biolgiai mtrixa (plazma, nyl, szvet, vizelet, szklet stb.) is. A plazmakoncentrci ilyen mrtk cskkense, valamint az analizland mintk sszetettsge miatt egyre inkbb a kapcsolt technikk lptek eltrbe, ahol egy elvlaszts-technikai eszkzt kombinltak leggyakrabban tmegspektromterrel (GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS, CE-MS). A kromatogrf a komplex mintk komponenseinek sztvlasztst, mg az MS a szelektv s rzkeny detektlst biztostja, valamint tovbbi fontos informcikat (szerkezetazonosts, pontos molekulatmeg meghatrozs, stb.) is szolgltathat. A kromatogrfok sszekapcsolsa az MS kszlkekkel tbb nehzsgbe tkztt. A legnagyobb problmt a mozgfzisok eltvoltsa okozta. Az 8. tblzat jl mutatja, hogy lgkri nyomson kis gzramok az MS nagyvkuumban risi gzramokat eredmnyezhetnek, ennek kvetkeztben leromlik a vkuum, ami rontja, vagy esetenknt

73

lehetetlenn teszi a mrst. Ezrt a klnbz kszlkek sszekapcsolsra un. illesztegysgeket vagy ms nven interfszeket fejlesztettek ki. 8. tblzat: Klnbz GC s LC kolonnk s eluens ramok ltal keletkezett gzramok oszlop kapillris GC tlttt GC analitikai LC kapillris LC mozgfzis He He hexn MeOH H2O hexn H2O ramlsi sebessg (ml/perc) 1 20 1 1 1 0,01 0,01 gzram atmoszfrikus nyomson (ml/perc) 1 20 184 593 1240 1,8 12 gzram nagyvkuumban (x 1000 l/sec) 12,5 250 2300 7400 15500 23 155

V.3.1. Gzkromatogrfia-tmegspektrometria (GC-MS) A GC-s kolonnkat tltetes s kapillris kolonnkra osztjuk (41. bra). A tltetes kolonnk ramlsi sebessge kb. 20 ml/perc. Ezt a nagy gzramot az MS kszlk vkuumrendszere mr nem brja, ezrt el kell tvoltani, ami azzal az elnnyel is jr, hogy dsul a minta. Tltetes kolonnk esetn alkalmaznak n. jet szepartort, illetve membrn szepartort. Ezek legnagyobb htrnya, hogy a minta jelents rsze elvsz, vagyis csak kis mennyisg kerl a tmegspektromterbe, cskkentve ezltal az rzkenysget. Napjainkban a tltetes kolonnk alkalmazsa mr nem szmottev, helyettk a kapillris kolonnk alkalmazsa kerlt eltrbe. A kisebb tmrj (narrow-bore) kolonnk ramlsi sebessge elg alacsony, gy kzvetlenl bevezethetk az ionforrsba, mg a vastagabb kolonnk esetn az n. open-split interfszt alkalmazzk. A GC-MS technika illkony, vagy illkonny tehet, hstabil anyagok vizsglatra alkalmas. Ionforrsknt leggyakrabban EI vagy CI forrst alkalmaznak, a kszlkek analiztora pedig lineris kvadrupol, IT, ritkbban mgnes vagy TOF. A mrsek sorn a GC elvlasztja az sszetett minta komponenseit, majd az egyes komponenseket az MS detektlja s a kapott spektrumok alapjn vgezzk a minsgi azonostst (60. bra). A kszlkek legnagyobb elnye, hogy a mrsek sorn kapott tmegspektrumok jl reproduklhatak, valamint ennek ksznheten spektrumknytrbl jl kereshetek.

74

1. cscs MS spektruma TIC

2. cscs MS spektruma

min

60. bra: GC-MS meghatrozs sematikus brzolsa (TIC: Total Ion Chromatogram)

Tovbbi elnyk mg a kis helyigny, hogy a kszlkek s zemeltetsk viszonylag olcs, s a mkdtetsk sem tl bonyolult. Alkalmazsuk szleskr a gygyszeriparban oldszermaradvnyok vizsglatban, minsgi meghatrozsokban, farmakolgiai s egyb vizsglatokban egyarnt. Leginkbb apolris s szemipolris vegyletek vizsglatra alkalmasak kb. 1000-1200 Da molekulatmegig. V.3.2. Folyadkkromatogrfia-tmegspektrometria (LC-MS) Kevsb illkony, hrzkeny, nagyobb molekulatmeg vegyletek vizsglatra LCMS kszlkeket alkalmazhatunk. Az LC-MS a folyadkkromatogrf s a tmegspektromter sszekapcsolst jelenti. Ahogyan az korbban is ismertetsre kerlt a kt kszlk sszekapcsolsa komoly nehzsgekbe tkztt, mivel az eluens s a vkuumrendszer egyms ellen dolgozik (8. tblzat). LC-MS kapcsolsnl ktfajta interfszt klnbztetnk meg. Az atmoszfrikus nyomson trtn porlasztsos technikkat (lsd korbban), ahol az ionforrs egyben az interfsz szerept is betlti. A HPLC-s oszlopok klnbz tmrjek lehetnek, ebbl kvetkezen klnbz ramlsi sebessgeket alkalmazhatunk, amelyekhez ESI esetn ms-ms ionforrs tartozik (9. tblzat). Az APCI nagy ramlsi sebessgeket is tolerl s szles ramlsi sebessg tartomnyban (0,1-2 ml/min) is alkalmazhat, hasonlan az APPI-hoz (100 l-2 ml/min).

75

9. tblzat: ESI ionforrsok elnevezse az ramlsi sebessg alapjn ramlsi sebessg (l/min) 2-1000 2-200 0,05-1 0,02-0,05 ionforrs turbo-ionspray ionspray micro-ionspray nanospray

A msik csoport az n. dst tpus interfszek csoportja. Ezek kzs tulajdonsga, hogy az eluens mennyisgnek cskkentse utn valamelyik hagyomnyos ionizcis technikt alkalmazzk (EI, CI, FAB/FIB). A kzvetlen folyadk bevitel (Direct Liquid Introduction: DLI) a legegyszerbb megolds, ahol egy nagyon vkony kapillrison keresztl juttatjk a mintt az MS-be, ahol elszr egy elprologtat kamrba kerl, majd pedig az ionforrsba. A bejuttatott minta mennyisgtl fggen vagy EI ionizci trtnik, vagy pedig az oldszergzk reagens gzknt szerepelnek, s CI ionizci jtszdik le. A mozgszalagos illeszts (Moving Belt Interface) esetn pneumatikus porlasztssal viszik fel a mintt egy poliimid szalagra ahonnan az eluenst elprologtatjk h segtsgvel. A feldsult mintt pedig EI, CI, esetleg FAB/FIB ionizci utn juttatjk az analiztorba. Ma mr inkbb trtnelmi jelentsge van. A rszecskeram (Particle Beam Interface) illeszt egysgnl is porlasztsos technikval a HPLC-rl lejv elegyet egy fttt deszolvatcis kamrba juttatjk. Az elprolg eluenst vkuum segtsgvel elszvjk, majd a minta az ionforrsba (EI/CI) kerl. A folyamatos ramls FAB/FIB (CF-FAB/FIB) interfsz vagy gynevezett dinamikus LSIMS, a gyors atombombzsos technikt (FAB) alkalmazza. A CF-FAB/FIB esetben a mintt egy folyamatosan raml oldszerbe keverjk, amely tartalmazza a FAB mtrixot is, s egyenletes ramlsi sebessggel (5-10 l/perc) juttatjuk az ionforrsba. Technikailag kvarc kapillrisokat hasznlnak, ami lehet egyszeren nyitott vagy zsugorszrvel elltott kapillris. V.3.3. Tandem-tmegspektrometria (MS-MS) Az LC-MS kszlkek mkdhetnek off-line s on-line mdban. Utbbi sorn a minta a HPLC kszlkrl rkezik, mg az elbbi esetn egy fecskendpumpa segtsgvel juttathatjuk a vizsgland anyagot az ionforrsba. Ez a megolds egykomponens tiszta

76

anyagok vizsglatra alkalmas leginkbb, de abban az esetben, ha tbb analiztor van a kszlkben az els MS alkalmas az sszetett minta komponenseinek sztvlasztsra a msodik pedig az analizlsra. Ez az n. tandem-tmegspektrometria. Megjegyzend azonban, hogy sszetett mintk esetn clszer HPLC-s elvlasztst alkalmazni. A tandemtmegspektrometria clja elssorban szerkezeti informci nyerse, valamint az rzkenysg s a szelektivits nvelse. Az MS-MS kszlkek ltalban kt analiztorral, ami lehet azonos vagy klnbz, rendelkeznek, kzttk pedig egy n. tkzsi cella tallhat. A tandem tmegspektrometrit elvgezhetjk trben, ami egyms utn kapcsolt tmeg analiztorokat jelent, vagy alkalmazhatunk olyan kszlket ahol a spektrumok felvtele idben el van tolva (pl. IT analiztor esetn). Tbbfle kszlk kerlt kifejlesztsre TOF/TOF, elektromos/mgneses szektor kombincik, IT megvalsts s klnbz hibrid kombincik (Q-IT, Q-TOF QqTOF, IT-TOF, EBqQ, stb.). Termszetesen mindegyik kszlknek megvan az elnye s htrnya egyarnt. Azt, hogy milyen kszlket vlasszunk, mindig az adott feladat fogja meghatrozni. A gygyszerkutats-fejleszts sorn taln a leggyakrabban alkalmazott kszlkek a triplet kvadrupolok (TQ), a kvadrupol-TOF kombinci (Q-TOF), valamint a lineris ioncsapda vagy ms nven kvadrupol ioncsapda (LIT vagy Q-Trap). V.3.3.1. Triplet kvadrupol tmegspektrometria (TQ) A TQ (61. bra) elnye a szerkezeti informci nyers mellett a szelektivits nvekeds, de htrnya az rtkels bonyolultsga s az iontviteli hatsfok cskkense norml MS-mdhoz kpest. A TQ berendezsek rzkenysge kisebb tmegtartomnyban j (<600 Da). A TQ kszlkekben hrom egymst kvet Q analiztor tallhat (Q1-Q3), melyek kzl a q2 alkalmas tkzs induklt diszocicik (Collision Induced Dissociation: CID) kivltsra (61. bra). Ezek a kszlkek hasznlhatak norml MS mdban (full scan vagy SIM) (62. bra), illetve tandem MS mdban (product ion scan, precursor ion scan, neutral loss scan, multiple reaction monitoring) (62. bra). A full scan zemmd esetn az sszes iont tartalmazza a kromatogram a SIM-ben pedig csak egy kivlasztott iont. A product ion scan esetben az els analiztor SIM mdban van, gy az ionizcit kveten csak egy kivlasztott ion juthat t rajta. Ezutn kvetkezik a fragmentci az tkzsi cellban, CID kvetkeztben.

77

Q1

q2
CID gz

Q3

ionok

vkuum szivatty tkzsi cella

61. bra: triplet kvadrupol kszlk felptse

A CID collision induced dissociation vagy collisionally activated dissociation (CAD) sorn a gzfzis molekulaiont semleges atommal vagy molekulval tkztetik, aminek kvetkeztben fragmentldik.
Q1 Full scan q2 Q3

SIM

Product ion scan

CID

Precursor ion scan

CID

CID MRM

CID Neutral loss scan

62. bra: triplet kvadrupol kszlk mrsi mdjai

78

A fragmentci utn az anyaionbl keletkez lenyionokat a harmadik Q szeparlja ami SCAN zemmdban mkdik. A precursor ion scan (anyaion detektls) esetben a Q1 SCAN zemmdban van, mg a Q3 SIM-ben. Konstans neutrlis veszts (neutral loss scan) esetn a Q1 s a Q3 lland meghatrozott m/z klnbsggel psztzik, gy megkaphatk azok a tltssel nem rendelkez molekulk, amik a fragmentci sorn az anyaionbl vltak ki. A kt tmegspektrum tmegklnbsge fogja megadni a hinyz molekult, mivel a neutrlis anyagok az MS szmra lthatatlanok. Multiple reaction monitoring (MRM) pedig adott reakci vizsglatra alkalmas. Mind a kt analiztor Q1 s Q3 is adott m/z rtken (SIM zemmdban) van. Ilyenkor csak akkor kapunk jelet, ha a kivlasztott ionbl a CID sorn a Q3 belltott ion keletkezik. V.3.3.2. Lineris ioncsapda tmegspektrometria (LIT) A LIT vagy Q-trap kszlkek felptse hasonlt a TQ kszlkekhez. Hrom kvadrupolt tartalmaz, melyek kzl a harmadik, a megfelel technikai megoldsok kvetkeztben, alkalmas az ionok csapdzsra. gy triplet kadrupol kszlkknt s ioncsapds kszlkknt is hasznlhat. Termszetesen a LIT kszlkek egyestik a TQ s az IT analiztorok elnyeit, tovbb jabb funkciik is vannak. sszehasonltva a TQ kszlkekkel ezeknek sokkal jobb a felbontsa s nagyobb az rzkenysge. Iontrol kapacitsuk pedig jelentsen meghaladja az 3D-IT kszlkekt. Elny mg az IT-vel szemben, hogy mg ott a fragmentci alacsony energij, addig itt a nagynyoms tkzsi cella kvetkeztben nagy energij tkzsek is kivlthatak, intenzvebb fragmentcit eredmnyezve. Htrnyknt emlthet a viszonylag magas ruk. sszessgben a TQ s LIT kszlkek nagyon jl alkalmazhatk a gygyszer kutats-fejleszts fzisaiban s kiemelked a szerepk a gygyszerek metabolizmusnak vizsglatban. V.3.3.3. Kvadrupol-TOF tmegspektrometria (Q-TOF) A Q-TOF kszlkeket (63. bra) gy kell elkpzelni, hogy a TQ-ban a Q3-t TOF analiztorra cserljk. Jellemzjk a nagy rzkenysg, nagy felbonts s tmegpontossg. A kszlkek hasznlhatk norml MS mdban, ilyenkor a kvadrupolok csak tovbbt s fkuszl funkcit ltnak el, azonban jelentsen javtjk a TOF felbontst, sszehasonltva egy olyan kszlkkel, ahol az ionforrs utn kzvetlenl a TOF analiztor tallhat. MS-MS

79

mdban a Q1-el kivlasztunk egy iont (anyaion), ami az tkzsi cellba kerl, ahol neutrlis gzmolekulkkal (CID gz) tkzve fragmentcin megy keresztl.

Q1

q2
CID gz

TOF

ionok

vkuum szivatty tkzsi cella vkuum szivatty

63. bra: Q-TOF MS kszlk vzlata

A fragmens ionok s az anyaion is tovbbi tkzseken megy keresztl mieltt a TOF analiztorba kerlnek. Ennek kvetkeztben viszont cskken a kinetikus energijuk, vagyis a kvadrupolok nem csak fkuszljk az ionokat, hanem szablyozzk a kinetikus energijukat is, gy cskkentve a kinetikus energik klnbsgbl bekvetkez szrst, vagyis javtjk a felbontst. A Q-TOF kszlkeket nagyon gyakran proteomikai feladatokra alkalmazzk, de gygyszerek metabolizmusnak vizsglatban is nagyon jl alkalmazhatak.

Ebben a fejezetben a tmegspektrometris mdszerek kerltek bemutatsra. Lthat, hogy egy nagyon szleskren alkalmazhat technikrl van sz, ahol a fejlds risi tem s tretlen. Fontos hangslyozni, hogy az itt lertak csak egy tfog kpet nyjtanak az egyes technikkrl, tbb-kevsb rszletesen trgyalva. A jegyzet keretei nem teszik lehetv a

80

rszletekbe men lersokat. Akik behatbban kvnnak foglalkozni a tmegspektrometria technikai megoldsaival, valamint alkalmazsval, azoknak figyelmbe ajnlom Edmond de Hoffmann s Vincent Stroobant, Mass Spectrometry: Principles s Application cm knyvt. Akik pedig a tmegspektrometria gygyszerkutats-fejlesztsben betlttt szereprl szeretnnek tbb informcit, azoknak Ragu Ramanathan szerkesztsvel megjelent Mass Spectrometry in Drug Metabolism and Pharmacokinetics cm knyvet ajnlom.

81

VI. A gygyszerek metabolizmusa Szervezetnkbe naponta nagy mennyisgben kerlnek klnbz testidegen anyagok a krnyezetbl, melyeket msnven xenobiotikumoknak neveznk. Ezek kz tartoznak a gygyszerek is. A szervezetbe bekerl anyagok egy rszbl energit nyernk, mg amit a szervezet nem tud hasznostani, azokat klnbz mechanizmusokon keresztl, leggyakrabban enzimatikus ton, talaktja, majd kivlasztja. Ezt a mregtelentsi folyamatot nevezzk biotranszformcinak. Termszetesen a biotranszformci folyamatai nem korltozdnak kizrlagosan a xenobiotikumokra, szmos endogn molekula kpzdik, talakul, aktivldik vagy inaktivldik, esetleg lebomlik s kirl a szervezetnkbl ezen reakcik segtsgvel, mivel ezek nem vegyletspecifikusak, hanem meghatrozott kmiai szerkezetekhez ktttek. Ez alapjn a biotranszformci egy olyan folyamat, amely szablyozza a szervezetben kpzd, vagy oda bekerl biolgiai hats, ms sejtek mkdst befolysol molekulk anyagcserjt. Ezrt testidegen anyagok (gygyszerek) kmiai mdostst ms szval metabolizmusnak is nevezzk. A gygyszerek metabolizmusa sorn polrosabb, knnyebben kirthet termkk alakulnak, amely ltalban egytt jr a hatkonysg cskkensvel, az inaktivldssal, azonban vannak olyan esetek is, amikor az adott gygyszer a metabolizmus sorn aktivldik, amit a gygyszeres terpiban ki is hasznlhatunk, mg egyb esetekben elfordulhat, hogy az eredeti vegyletnl hatkonyabb, folyamatai, esetleg ahogyan toxikus az mr metabolit emltsre keletkezik. kerlt, A nem gygyszermetabolizmus

gygyszerspecifikusak, hanem bizonyos kmiai struktrkhoz ktttek, s az adott funkciscsoporttal, vagy szerkezettel rendelkez molekulk mindegyikn megtrtnhet a mdosts. Ez azrt fontos, mert csak gy lehetsges, hogy a szervezet kpes a legklnflbb bekerl anyagokat metabolizlni (nhny kivteltl eltekintve). A f mregtelent szervnk a mj, e mellett azonban a bl, vese s egyb szervek is hozzjrulnak a xenobiotikumok biotranszformcijhoz. A metabolizmus folyamata kt (egy msik llspont szerint hrom) fzisra oszthat. Az els lps sorn a gygyszerek oxidci, redukci, vagy hidrolzis rvn polrosabb vegylett alakulnak. Ezeket a reakcikat nevezzk I. fzis reakciknak (64. bra). A folyamat sorn kpzdtt metabolitok, polaritstl fggen kirlhetnek kzvetlenl a vesn t, vagy ha szksges tovbbi talakulson mennek keresztl az n. II. fzis reakcikban, melyek sorn endogn szubsztrtokkal konjugldnak, ezrt ezeket a folyamatokat konjugcis reakciknak is nevezzk (64. bra). (Az emltett III. fzis sorn a konjuglt 82

vegyletek transzporterek segtsgvel kijutnak a sejtekbl, majd ezt kveten a vzoldkony vegylet a vrrel a vesbe kerl, s a vizelettel kirl vagy a hepatocitkbl az epeutakba szekretldik az epvel a blbe, onnan pedig a szkletbe jut). A vegyletek azonban nem minden esetben mennek vgig minden fzison s nem mindig ebben a sorrendben. Egyes gygyszerek vltozatlan formban, talakuls nlkl, msok kzvetlenl konjugldnak s gy rlnek (64. bra).
gygyszer

abszorpci nem specifikus ktds plazma kttt frakci szabad frakci disztribci ktds a receptorhoz

I. fzis talakuls METABOLIZMUS

HATS II. fzis talakuls (konjugci) ELIMINCI

64. bra: a gygyszerek sorsa a szervezetben s a metabolizmus folyamatnak sematikus brja

Legtbb sejtnk rendelkezik metabolizl enzimekkel, azonban a biotranszformci folyamatainak legfontosabb helye a mj. Emellett mg ms szervekben is lejtszdnak metabolikus folyamatok (td, br, bl, vese). Nha spontn vgbemegy, de leginkbb enzimek ltal katalizlt folyamat. A folyamatokban rsztvev enzimek egy rsze sejten bell, mg msok azon kvl tallhatak meg. VI.1. I. fzis metabolikus talakulsok A gygyszerek metabolizmusban kiemelked szerepet jtszik a mj mikroszomlis enzimrendszere, melynek enzimjei a mjsejtek endoplazmatikus retikulumban (ER) 83

szintetizldnak s lokalizldnak. A mjsejtek homogenizlsa s centrifuglsa sorn az ER hlzata feltredezik s az gy keletkezett finom szemcsk alkotjk az n. mikroszomlis frakcit, melyet gyakran alkalmazunk a gygyszermetabolizmus vizsglatok sorn (lsd 8. fejezet). A mikroszmlis frakciban a membrn kttt enzimek, az I. s a II. fzis enzimjei kzl az UGT-k (lsd ksbb) tallhatak meg. A vegyletek dnt tbbsge (kb. 90%) az I. fzis reakcik sorn oxidldik. Az oxidcis reakcikat kt nagy csoportba, mikroszmlis s nem mikroszmlis oxidcira oszthatjuk. Mindezek mellett elfordul mg redukci, valamint hidrolzis is. A mikroszmlis oxidci tpusai tbbek kztt az aroms s alifs hidroxilci, dealkilci, heteroatomok oxidcija, epoxidci, stb. (65. bra). Ezen reakcik kzs jellemzje, hogy a folyamatok sorn egy, az eredeti molekulnl polrisabb termk keletkezik.

65. bra. az I. fzis metabolikus reakcik fbb tpusai

Az I. fzis reakcikat katalizl enzimek, a mikroszmlis oxidciban rsztvev, gynevezett kevert funkcij oxidzok (MFOmixed function oxidase), melyek a legklnflbb kmiai szerkezet vegyleteket kpesek talaktani, fleg a nagy lipid-vz megoszlsi hnyadossal rendelkez xenobiotikumokat. A folyamat egyszerstett mechanizmusa a kvetkez egyenlettel szemlltethet: 84

(szubsztrt)

RH + O2 + NADPH + H+

(termk)

ROH + H2O + NADP+

Az oxign a levegbl szrmazik, melynek egyik atomja a gygyszermolekulra kerl, mg a msik egy vzmolekulba pl be. Az oxignatom vzz trtn redukcijhoz kofaktorknt, azaz elektrondonorknt nikotinadenin-dinukleotid-foszft reduklt formja (NADPH) szksges. A NADPH s az oxign molekula egytt csak az ER foszfolipidmembrnjban tallhat meg, ahol a mikroszmlis enzimrendszer elektrontranszportlncot alkot. VI.1.1. A citokrm P450 (CYP) enzimrendszer A biotranszformci legfontosabb s legjobban tanulmnyozott enzimrendszere a CYP, melyek egyarnt fontos szerepet jtszanak endogn molekulk (koleszterin, szteroidok, prosztaciklinek, tromboxn A2) s a xenobiotikumok metabolizmusban. Elnevezsk alapja, hogy az enzim sejten bell, membrnhoz kttten helyezkedik el, erre utal a cito rsz, tovbb az enzim reduklt, vas-II, formja kpes megktni sznmonoxidot s az enzim-CO komplex 450 nm-en jellegzetes abszorpcis maximumal rendelkezik, valamint a 450 nm hullmhosszsg fnyt elnyel, sznmonoxidot kttt hempigmentetre utal a krm (szn) s a P megjells. A CYP-ek membrnhoz kttt enzimek, melyek egy elektrontranszportlnc rszeknt, az endoplazmatikus retikulumban, valamint a legtbb llny mitokondriumban, legnagyobb mennyisgben a mjban, de egyb szervekben is megtallhatak. Jelenleg tbb mint 8000 klnbz aminosavszekvencival rendelkez izoenzim ismeretes, amely 781 P450 gncsald produktuma, s szmuk folyamatosan n. A CYP enzimcsald szmos eltr szubsztrtspecifits izoenzimet tartalmaz, melyben sok tfeds van. Osztlyozsuk az aminosavszekvenciban tallt azonossguk alapjn trtnik. ltalban 40%-os hasonlsg szksges ahhoz, hogy egy csaldba, s 60%-os hasonlsg ahhoz, hogy egy alcsaldba soroljuk az izoenzimeket. Elnevezsk sorn a gncsaldot arab szmmal jelljk (1, 2, 3) azon bell a fcsoportot az abc nagybetivel (A, B, C), valamint ezen bell az alcsoportot (az izoenzimet jell adott gnt) ismtelten szmmal (1, 2, 3). Pl.: CYP3A4: CytochromeP450 3-as gncsald, A fcsoport, 4. alcsoport. A CYP enzimek nem egyforma mrtkben vesznek rszt a gygyszermetabolizmusban (66. bra). Ezen enzimek kzl 7 metabolizlja a gygyszerek 90%-t. A legfontosabbak CYP1, CYP2 s CYP3 csald enzimei, melyek kzl a CYP3A fcsoport s a CYP2D6 izoenzim hozzjrulsa a legszmottevbb. 85

6%

2% 10% CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A 31%

42%

4%

5%

66. bra: a humn mj gygyszermetabolizmusban szerepet jtsz CYP enzimek megoszlsa

A CYP1 csald szubsztrtjai kztt szmos mutagn hats policiklusos aroms sznhidrogn s sok gygyszer tallhat, mint pldul benzpirn, teofillin, fenacetin stb. Az ide tartoz izoenzimek jelents rsze extrahepatikus, melyek tbbfle mdon induklhatak. Induklhatsgk meglehetsen nagy, akr szzszoros is lehet. Legfontosabb a CYP1A alcsald, melynek 2 tagja van: CYP1A1 s a CYP1A2, melyek kzl az utbbi tlt be fontos szerepet a gygyszermetabolizmusban. Szubsztrtjai tbbek kztt a koffein, clozapin, imipramin, teofillin, mexiletin, propranolol, verapamil (10. tblzat). A CYP2 gncsald szubsztrtjai kztt szmos gygyszer (vrnyomscskkentk, antiepileptikumok, fjdalomcsillaptk stb.) s egyb vegylet (szteroid hormonok, D3 vitamin, aceton, etanol stb) is megtallhat. A legfontosabb alcsaldok a CYP2C, CYP2D s a CYP2E. A CYP2C alcsald jelentsebb tagjai a CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, s a CYP2C19. Ezek kzl a legnagyobb mennyisgben a CYP2C9 fordul el, mely nagyszm gyengn savas molekult metabolizl. Jelents szerepet jtszik a savas termszet nem szteroid gyulladsgtlk, valamint kis terpis indexszel rendelkez gygyszermolekulk (pl. warfarin, phenytoin, tolbutamid) metabolizmusban. A CYP2C8 szubsztrtjai kz tartozik tbbek kztt a paclitaxel, retinoinsav, tolbutamid, carbamazepin. A CYP2C18-nak nincs jelents gygyszermetabolizl aktivitsa, mg a CYP2C19 metabolizlja a diazepamot, omeprazolt s a proguanilt is.

86

A CYP2D fcsoportnak egyetlen fontos tagja a CYP2D6, mely legnagyobb mennyisgben a mjban, kissebb mennyisgben pedig az agyban, tdben, s a gyomor-bl traktusban is megtallhat. A mj CYP enzimeknek csak kb. 2%-t teszi ki (67. bra), mgis igen jelents gygyszermetabolizl szerepe van. Szubsztrtjai kz tartoznak antipszichotikumok, antiarrhythmis szerek, antidepressznsok, neuroleptikumok, opoidok, valamint a szelektvszerotonon-reuptake bntk (SSRIs), tumorellenes szerek, s amphetaminok is. Fontos kln megemlteni a kodein szrmazkokat, melyek az enzim segtsgvel demetilldnak, s gy vlnak aktv metabolitt, vagyis cskkent enzimaktivits vagy az enzim hinya esetn a kodeinnek nincs, vagy csak gyenge az analgetikus hatsa.

13% 26% 4% CYP1A2 CYP2A6 CYP2C 18% CYP2D6 CYP2E1 CYP3A Egyb 2% 30% 7%

67. bra: a humn mj CYP enzimeinek relative mennyisge

A CYP2E fcsoportnak fontos tagja a CYP2E1, mely az alkoholt metabolizl induklhat CYP enzim. A mj mellett megtallhat a vesben, tdben, placentban, s a limfocitkban, is. Az alkoholok mellett szerepet jtszik mg az aldehidek, zsrsavak, terek, halognezett sznhidrognek biotranszformcijban, valamint a gygyszerek kzl a paracetamol, koffein, tamoxifen, s diszulfirm metabolizmusban. Tovbb fontos jellemzje, hogy sok anyagbl szabadgykket kpez, ami oxidatv stresszhez, fehrje s DNS krosodshoz vezethet. A CYP3 gncsald tbb antibiotikum, szteroid s ms gygyszer biotranszformcis talaktsrt felels. A CYP3A fcsoport nagyszm, szerkezetileg klnbz gygyszermolekult metabolizl. A gygyszermetabolizmus taln legfontosabb enzime, mivel a gygyszerek kzel 50%-t metabolizlja (66. bra). A mj CYP enzimek, mintegy 30%-t 87

teszi ki (67. bra), de viszonylag nagy mennyisgben megtallhat mg a bl nylkahrtyjban is. Termeldse nagy valsznsggel jelents mrtkben fgg az elzetes gygyszer/vegyszer expozcitl. Az enzimnek sokfle inhibitora van, melyek klnbz mechanizmussal s klnbz mrtkben gtolhatjk. A tbbi csald tagjai endogn folyamatokat katalizlnak (CYP4: Zsrsav hidroxilci s oxidci; CYP5: Tromboxn bioszintzis; CYP7: Szteroidok bioszintzise; CYP8: Prosztaciklinek bioszintzise; CYP11, 17, 19, 21: Szteroidok bioszintzise; CYP24: D vitamin metabolizmus; CYP26: retinoidok metabolizmusa; CYP27: Epesavak bioszintzise). VI.1.1.1. A CYP450 enzimek szerkezete A CYP-ek a hem-tiolt enzimek kz tartoznak. A hem (Fe(II)protoporfirin IX komplex) klnbz fehrjkhez ktdve megtallhat tbbek kztt a hemoglobin, mioglobin, peroxidz s katalz enzimek, valamint citokrmok alkotjaknt is. A porfirin vz 4 db pirrolgyrbl ll, melyeket metenil hidak (=CH-) ktnek ssze, a porfiringyr kzepn tallhat a kzponti vasion. Eltrs a tbbi hem tartalm fehrjtl, hogy a CYP enzimek esetn a vas protoporfirin IX komplex, a hisztidin N atomja helyett egy cisztein kn atomjn keresztl, tiolt ktssel kapcsoldik a fehrjhez (68. bra).

68. bra: a citokrm P450 aktvhelyn tallhat protoporfirin IX egysg

88

VI.1.1.2. A CYP ciklus A CYP enzimek f funkcija a monooxigenci, azaz egy oxign atom bevitele a szubsztrt molekulba. A katalitikus ciklus lpseit a 69. bra mutatja be. A citokrom P450 enzim hem egysge ferri(III) llapotban tartalmazza a vasat. A szubsztrt bektdse az aktv helyre, konformci vltozst eredmnyez, s kiszortja a vz molekult. A kvetkez lpsben NADPH-rl szrmaz elektron transzfer rvn a ferri(III) vas ferrov(II) redukldik, majd a komplex molekulris oxignt fog ktni.

69. bra: a CYP enzimek katalitikus ciklusa

89

Ezt kveten egy jabb elektron felhasznlsval egy nagyon rvid letidej intermedier peroxo-komplex alakul ki. Kt proton tovbbi felvtelvel a peroxo csoport egyik oxignje vzknt tvozik, s kialakul a nagyon reakcikpes IV-es oxidcis llapot oxo-vas komplex. Az utols lpsben a szubsztrt oxidcis termkknt levlik s az enzim vzfelvtelt kveten visszaalakul a kiindulsi llapotba. Fontos megjegyezni, hogy egy alternatv tvonalon, az n. peroxid-sntn keresztl is vgbemehet az oxidci folyamata. Ebben az esetben a szubsztrt oxidlshoz klnbz peroxidokat (alkil-hidrognperoxid, hidrognperoxid, peroxosavak, stb.) hasznl az enzim oxign s elektron donorknt, nem pedig az O2-t s NADPH-t. Ez a folyamat a lipid peroxidc esetn jtszik jelents szerepet, mivel az gy keletkezett lipid peroxidok szolglnak szubsztrtknt az alternatv tvonalnak. A peroxid-snt tvonalat 7. fejezet). VI.1.1.3. Enzim indukci s inhibci Mivel a CYP enzimek jelentsen befolysoljk a gygyszerek koncentrcijt a szervezetben, fontos megemlteni az enzim indukci s inhibci jelensgt. Indukci esetn az enzimek mennyisge s katalitikus aktivitsa bizonyos xenobiotikumok hatsra megnvekszik. Klnbz enziminduktorok klnbz enzimeket eltr mechanizmussal induklnak. Napokra, gyakran hetekre van szksg a kialakulshoz, valamint a kivlt gens adsnak megszntetse utn hosszabb ideig is fennmaradhat az emelkedett enzimexpresszi s aktivits. Az enzimindukci farmakolgiai hatsa az, hogy az emelkedett enzimaktivits kvetkeztben bizonyos gygyszerek metabolizmusa fokozdhat, gy a terpis dzisban alkalmazva elfordulhat hatkonysg cskkens vagy a farmakolgiai hats megsznse is. A xenobiotikumok nem csak induklhatjk, hanem gtolhatjk is az enzimek expresszijt vagy aktivitst, ezltal gtolhatjk bizonyos gygyszerek metabolizmust. A lecskkent metabolizmus kvetkeztben megn az adott gygyszer koncentrcija a szervezetben, ezltal nemkvnatos mellk-, esetenknt toxikus hatsok lphetnek fel. A gtls mrtke fgg az inhibitor gygyszermolekula adagolstl s az enzimhez val ktdsnek mrtktl (gyenge s ers induktorok). Az inhibci jelensge gyorsan jn ltre, s hamarabb is sznik meg, mint az indukci. hasznljuk ki a gygyszerek metabolizmusnak vizsglatban hasznlt biomimetikus modellek kz tartoz mestersges metalloporfirinek alkalmazsa sorn is (lsd

90

A legfontosabb CYP enzimeket, szubsztrtjaikat, induktoraikat s gtlszereiket a teljessg ignye nlkl a 10. tblzat tartalmazza. 10. tblzat: a jelentsebb CYP enzimek, valamint szubsztrtjaik, gtlszereik s induktoraik CYP enzim CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 szubsztrtok imipramin, koffein, teofillin mexiletin, clozapin, propranolol, verapamin kumarinok, aflatoxinok NSAIDs, fenitoin, tamoxifen, szulfonil-urek barbiturtok, omeprazol, fenitoin, R-warfarin antipszichotikumok, antiarrhythmis szerek, opitok, SSRIs etanol, paracetamol, halotn CYP2E1 klciumcsatorna-blokkolk, opitok, makrolid antibiotikumok, kannabinoidok, protez inhibitorok, statinok (kivve pravastanin), taxol, tacrolimus inhibitorok amiodaron, cimetidin, fluvoximin grapefruit-l, metoxaln fluvastatin, fluvoxamin, isoniazid cimetidin, fluoxetin, ketoconazol amiodaron, cimetidin, SSRIs, hisztamin H1 receptor antagonistk szulfidok (diszulfiram, diallil szulfidok) amiodaron, fluconazol, cimetidin, grapefruitl, szteroidok, protez inhibitorok induktorok meggett telek, dohnyzs, kelbimb, inzulin rifampicin, fenobarbitl rifampicin, fenobarbitl carbazepin, prednison, rifampicin nincs ismert

etanol, aceton, isoniazid barbiturtok, carbamazepin, glkokortikoidok, fenitoin, rifampicin

CYP3A

VI.1.1.4. A CYP enzimek polimorfizmusa A CYP enzimekkel kapcsolatban meg kell emlteni mg egy fogalmat, a polimorfizmust. A mikroszmlis oxidcis rendszer gygyszermetabolizl aktivitsa, ezltal a gygyszerek hatsa egynenknt jelents eltrst mutathat, melynek egyik oka az enzimek genetikai variabilitsa, ms nven polimorfizmusa. A gygyszerfejlesztsek sorn a polimorfizmust figyelembe kell venni, mivel abban az esetben, ha a gygyszerjellt molekula nagymrtkben polimorf metabolizmuson megy t, a farmakokinetikai (ADME) paramterei nagy variabilitst mutatnak. A gyengn metabolizl egyedekben az emelkedett gygyszer koncentrci toxikolgiai problmkat eredmnyezhet, tovbb ha tl gyors a metabolizmus, a gygyszerszint esetleg el sem ri a terpis koncentrcit. Ez mr a klinikai kiprbls sorn 91

megnehezti a gygyszeradagolst, ezrt a sikeres klinikai vizsglatokhoz elzetesen genotipizlt populcit kell bevlogatni, valamint szksges lehet a terpis gygyszermonitorozs is. VI.1.2. Nem mikroszmlis oxidcik A mikroszmlis oxidci mellett tovbbi oxidcis talakulsok is elfordulnak, melyeket nem a citokrmok katalizljk. Ilyen enzimek az alkohol dehidrogenz (ADH), az aldehid dehidrogenz (ALDH), a molibdn-hidroxilzok, valamint a mono- di- s poliamin oxidzok. Az ADH az alkoholokat aldehidd oxidlja NAD+ kofaktor felhasznlsval (pl. etilalkoholt acetaldehidd), majd az aldehidek tovbb oxidldnak karbonsavv, amit az ALDH katalizl szintn NAD+ kofaktor segtsgvel. A folyamat egyszerstett mechanizmusa a kvetkez:
ADH

R-CH2-OH + NAD+ R-CH2-CHO + NAD+ + H2O

R-CHO + NADH + H+

ALDH

R-COOH + NADH + H+

A molibdn hidroxilzok molibdn tartalm flavoproteinek, melyek kt legfontossab kpviselje az aldehid oxidz s a xantin oxidz. A xantin oxidz-enzimrendszer jelentsen hozzjrul a szervezet szabadgyktermelshez, amelyek a klnbz stresszllapotokban slyos sejtkrostst okoznak. Tovbbi fontos szerepe a purinbzisok hgysavv trtn lebontsa is. A harmadik emltett csoport a monoamin, diamin s poliamin oxidzok (MAO, DAO, PAO), melyek kzl a legfontosabb a MAO. Ezek az enzimek a neurotranszmitterek egy fontos csoportjnak lebontsban jtszanak kiemelked szerepet. A MAO-enzimek a szervezet szmos szvetben megtallhatak, legnagyobb mennyisgben a mjban, a vesben, a gyomorban, a blfalban s az agyban. Jelenleg kt alcsoportja ismert: a MAO A s a B. Fontos megemlteni, hogy a kt izoenzim egyidej bnitsa hypertnis krzist okozhat. A blhmsejtekben lv MAO A s B enzimek blokkolsakor a tiraminban gazdag telekbl (sajt, mj, halak, bann vrsbor) felszvdik a tiramin hypertnis krzist okozva.

92

VI.1.3. Redukci Az oxidcis folyamatokon tl a gygyszerek s egyb xenobiotikumok egyb folyamatokban is talakulhatnak. Ezek kz tartoznak a redukcis s hidrolitikus reakcik. A redukcis folyamatok mindig egytt zajlanak le az oxidcival, ezrt oxidoredukcinak is nevezik. A blflra baktriumai, nhny P450 mikroszmlis enzim s az aldehid oxidz katalizlhatja ezt a reakcitpust. Redukcit leggyakrabban a nitro-, azo, karbonil-, szulfoxid-csoportot tartalmaz vegyletek szenvednek, de ide tartozik a reduktv dehalognezs is (70. bra). Az azo-redukci sorn az azo-csoportbl kt primer-amin keletkezik. A nitro-redukci sorn a nitro-csoport, amino-csoportt redukldik, mg a karbonil-redukci esetn egyes aldehidek illetve ketonok, primer illetve szekunder alkoholl alakulnak t. A szulfoxid redukciban szulfoxid tartalm vegyletek redukldnak, mg reduktv dehalognezs sorn a halogn atom egy hidrognnel cserldik ki. A reakci sorn szabadgykk kpzdhetnek, amelyek vagy tovbb redukldnak stabil vegylett vagy pedig fehrjkhez vagy egyb molekulkhoz ktdve sejtkrost hatst fejthetnek ki.

70. bra: redukcis talakulsok

VI.1.4. Hidrolzis Az I. fzis reakcik kz tartoznak a hidrolitikus reakcik. Hidrolzissel ltalban az szterek, amidok, tioszterek s foszforsavszterek metabolizldnak, de epoxidok is talakulhatnak hidrolitikusan (71. bra). A katalizl enzimek a karboxilszterzok, pszeudokolinszterz, s az epoxid hidrolzok. Az epoxidok ltalban a mikroszmlis
oxidciban kpzdnek. Mivel knnyen ktdnek a biomolekulkhoz (fehrjk, nukleinsavak), ezrt fontos szerepet jtszanak a detoxifiklsban.

93

71. bra: hidrolitikus reakcik

VI.2. II. fzis biotranszformcis reakcik (konjugcis reakcik) A biotranszformci msodik szakaszban a vegyletek klnbz endogn molekulkkal konjugldnak egy vagy tbb funkcis csoporton keresztl, amelyek vagy az eredeti molekuln is megvoltak, vagy pedig a biotranszformci I. fzisban jttek ltre. A konjugci jellemzje, hogy a folyamat sorn hidroxil, amino, karboxil, stb. csoport H-atomja cserldik ki a konjugld molekulval. A keletkezett konjugtumok ltalban farmakolgiailag inaktvak (kivtelt kpez a morfin-6-glkoronid), valamint jl olddnak vzben s gyorsan kirlnek a szervezetbl. A leggyakoribb endogn szubsztrtok a glkuronsav, glutation, aminosav (fleg glicin), valamint metil-, szulft- s acetil-csoportok (11. tblzat), a folyamatokat pedig transzferz enzimek katalizljk, melyek a mikroszmban s a citoszlban fordulnak el leginkbb.

94

11. tblzat. A II. fzis metabolikus reakcik konjugci megnevezse glkuronid acetil glutation aminosav szulft metil konjugld molekula UDP-glkuronsav Acetil-CoA (Ac-CoA) glutation (GSH) aminosav 3-foszfoadenozin-5foszfoszulft (PAPS) S-adenozil-metionin (SAM) transzferz enzim (lokalizci) UDP-glkuronil transzferz-UDPGT (mikroszma) N-acetil-transzferz-NAT (citoszol) GSH-S-transzferz-GST (citoszol, mikroszma) Acil-CoA-AS- transzferz (mitokondrium) Szulfotranszferz-ST (citoszol) Metiltranszferz-MT (citoszol) szubsztrt fenol, alkohol, karbonsav, szulfonamid aminok, hidrazinok, epoxid, hidroxilamin, nitrocsoport karbonsav, acil-CoAszrmazk fenol, alkohol, aroms amin aminok, fenolok, alkohol

A konjugci nagymrtkben cskkenti a gygyszer szervezetbeni tartzkodsnak idejt, nincs id az jabb metabolit vagy konjugtum kialakulshoz, gy a konjugci megakadlyozza a tovbbi metabolizcit. A gyors rls mellett azonban van olyan eset is, amikor a konjugtum tovbb metabolizldik. Ilyen pldul a glutationkonjugtum rszleges hidrolzise, amikor a 3 aminosavbl ll glutationbl 2 lehasad. VI.2.1. Glkuronidkonjugci A leggyakoribb s egyben a legfontosabb konjugcis reakci. A szubsztrton lv szabad COOH-, SH-, OH-, NH2- csoportokon egyarnt lehetsges. A kapcsold glkuronsav uridin-difoszfo-glkzbl (UDPG) keletkezik (72. bra). A konjugcit klnbz uridindifoszfo-glkuronozil-transzferz (UDPGT) izoenzmek katalizljk. Szubsztrtspecifitsuk eltr, de szmos tfeds van. Elssorban a mjban expresszldnak, de emellett megtallhatak a tdben, brben, vkonyblben, szaglhmban egyarnt. Az endoplazmatikus retikulum membrnjhoz kttten fordulnak el. A konjugci folyamatt a 72. bra, mg a leggyakoribb funkciscsoportokat, melyeken glkunorid konjugci trtnik, a 73. bra szemllteti.

95

ku l g PUD

il oz n ro

tr

z r fe z s an

il or f sz fo

72. bra: a glkuronidkonjugci folyamata

73. bra: a glkuronid konjugci egyszerstett mechanizmusa a leggyakrabban glkunorid konjugcin tes funkciscsoportokon szemlltetve.

96

A xenobiotikumok mellett fontos szubsztrtok kz tartoznak mg endogn vegyletek is, melyek kzl a legfontosabb a bilirubin, mely a glkuronsavas konjugcija hinyban nem tud kirlni a szervezetbl, gy extrm esetekben slyos idegrendszeri krosodst okozhat. Egyes molekulk tbb konjugldsra alkalmas csoporttal rendelkeznek. Ekkor tbbszrs glkuronidkonjugci is ltrejhet. Ilyen esetekben, ha a molekulamret tlsgosan megn, a konjugtum mr nem tud a vesben filtrldni, hanem az epvel a blcsatornba jut, s a szklettel rl ki. Fontos megemlteni az n. enterohepatikus krforgst. A bl baktriumflrja a konjugtumokat bont bta-glkuronidz enzimet termel, gy a konjugtumot hidrolizlni kpes. A hidrolzist kveten az eredeti molekula alakul vissza, ami jbl felszvdhat. VI.2.2. Glutationkonjugci A glutation (GSH), glutamt, cisztein s glicin aminosavakbl ll tripeptid (74. bra), mely fontos szerepet jtszik toxikus, ersen elektrofil vegyletek (epoxidok, halogn, nitro s szulft csoportot tartalmaz vegyletek) detoxifiklsban. GSH konjugtum kevs gygyszerrel alakul ki, inkbb a metabolikus folyamatok reaktv kztitermkeivel trtnik GSH konjugci (75. bra), ami a mikroszmban s a citoplazmban egyarnt lejtszdik.

74. bra: a glutation szerkezete

A folyamat 2 rszbl ll. Az els lps a glutationnal val kapcsolds, a cisztein SHcsoportjn keresztl, melyet a glutation-S-transzferz (GST) enzim katalizl. A msodik rszben a konjugtum tovbb metabolizldik, a glutaminsav lehasad a -glutamiltranszpeptidz (-GT) hatsra, majd a glicin is egy msik peptidz enzim segtsgvel, gy az

97

eredeti molekula cisztein konjugtum marad, ami a tovbbiakban acetilldik. Kevs gygyszerrel alakul ki glutationkonjugtum.

75. bra: a GSH konjugci egyszerstett mechanizmusa

GSH konjugtumok kpzdse korltozott. Amikor a sejtek glutation kszlete kimerl, sejtkrosods jn ltre, amely slyos esetekben hallhoz is vezethet. VI.2.3. Acetilezs Ez a reakci vgeredmnyben acettkpzs acetilkoenzim-A (acetil-Co-A) kofaktor felhasznlsval. A reakcit az N-acetil-transzferz (NAT) enzim katalizlja (76. bra). Acetilezs leginkbb amino csoportot tartalmaz vegyletek esetben trtnik, de egyb molekulk (szulfonamidok, hidrazinok, aminosavak) esetn is elfordulhat. A folyamat sorn, a tbbi konjugcis reakcival ellenttben, cskken a kpzd metabolitok vzoldkonysga, aminek toxikolgiai jelentsge van (pl. szulfonamidok vesetoxicitsa).

98

R N R' H

NAT Ac-CoA

R N R'

O C CH3 O

NH2 NAT Ac-CoA R R R R

H N

CH3

NAT Ac-CoA O SO2NH2 SO2NH C CH3

76. bra: acetilezs egyszerstett mechanizmusa

VI.2.4. Szulftkonjugci A msodik leggyakoribb konjugcis reakci, mely ellenttben a glkuronidkonjugcival, telthet folyamat. A katalizl enzim a mjsejtek citoszoljban tallhat szulfotranszferz, melynek jelenleg 10 humn izoenzimje ismeretes. Ez a f konjugcis reakci fenolok esetn, de hozzjrul az alkoholok, aminok (pl. szteroidok, thyroidok) s kisebb mrtkben tiolok biotranszformcijhoz is. A folyamat egyszerstett mechanizmusa a kvetkez egyenlettel szemlltethet:

A szulftdonor a reakciban a PAPS (3-foszfo-adenozin-5-foszfoszulft) (77. bra). A PAPS keletkezst a lenti egyenlet szemllteti. A szulft csoportot fknt a kntartalm cisztein s metionin aminosavak oxidcija biztostja.

99

77. bra: PAPS szintzise s szerkezete (APS: adenozin-5-foszfoszulft)

VI.2.5. Metilezs A konjugcis reakcik ritkbb formja, leginkbb endogn vegyletek metilezse trtnik, br nhny xenobiotikum is metilezdik, szabad SH-, OH- s fknt NH2csoportokon. A metildonor az S-adenozil-metionon (SAM), a folyamatot pedig a metiltanszferz katalizlja (78. bra), mely leginkbb a mj, td, valamint a vese ER-ban fordul el, de megtallhat a sejtplazmban is. Ezen enzimek fontos szerepet jtszanak a katekolaminok bioszintzisben (feniletanolamin-N-metiltranszferz, mely a noradrenalinadrenalin talakulst katalizlja) s inaktivlsban (katekol-O-metiltranszferz, ami a katekolgyr 3-OH csoportjnak metillst vgzi). Tovbb szerepet jtszik a normorfinmorfin, valamint morfin-kodein talakulsban is. A metilezs egyszerstett mechanizmust a 78. bra szemllteti.

100

78. bra: A metilezsi reakci ltalnos mechanizmusa

VI.2.6. Aminosavkonjugci Aminosavkonjugci ltalban glicinnel trtnik, de elfordulhat glutaminnal, ornitinnel, valamint taurinnal is. Alkohol vagy karboxil-csoportot tartalmaz vegyletekre jellemz konjugcis reakci. A folyamat egy specilis acilezsi reakci, mely sorn nem az endogn szubsztrt, hanem a gygyszermolekula aktivldik (79. bra), majd endogn amincsoportot tartalmaz vegyletekkel konjugldhatnak. Az aminosavakkal trtn konjugci fontos metabolikus talakuls a karbonsavak elimincija sorn. A kpzdtt termkek vzoldkonyak, ltalban kevsb toxikusak, mint az eredeti molekula s gyorsan kirlnek vagy a vizelettel, vagy pedig az epvel.

79. bra: karbonsavak konjugcija glicinnel

101

Br ez a fejezet nem a mszeres s bioanalitika trgykrhez tartozik, fontosnak tartottam a jegyzetbe trtn beptst, mivel a tovbbiakban olyan technikk kerlnek bemutatsra, amelyeket a gygyszerek metabolizmusnak vizsglatban lehet alkalmazni. Ahhoz viszont, hogy azok alkalmazhatsgt megrtsk, fontos ismerni a mkdsi mechanizmusuk alapjul szolgl folyamatokat. Mivel a jegyzetnek nem konkrt trgya az elz fejezet, tovbb a keretek nem teszik lehetv a rszletes trgyalst, azok szmra, akik mlyrehatbb ismereteket kvnnak szerezni a gygyszerek metabolizmusrl, ajnlom a kvetkez knyveket: Paul G. Pearson s Larry C. Wienkers (szerk.), Handbook of Drug Metabolism, valamint Corina Ionescu s Mino R. Caira (szerk.), Drug Metabolism, Current Concepts.

102

VII. Biomimetikus modellrendszerek a gygyszerek metabolizmusnak vizsglatban A bio eltag az letfolyamatokkal megegyez, a mimetikus pedig utnzson alapul, utnzssal kapcsolatos jelentsre vezethet vissza. Vagyis ezek az in vitro rendszerek a szervezetben lejtszd folyamatokat modellezik. Ez azrt jelents, mivel segtsgkkel a preklinikai kutatsok sorn a sok potencilis hatanyagbl knnyen kiszrhet az alkalmatlan, gy a farmakokinetikai s toxikolgiai llatksrletes vizsglatokra, valamint a klinikai fzisba mr kevesebb jellt kerl, jelentsen cskkentve az llatfelhasznlst s a klinikai kltsgeket egyarnt. Ezekkel a modellrendszerekkel tanulmnyozhat, hogy a vizsglt molekulbl oxidci utn milyen termk(ek) s milyen mennyisgben lesz(nek) jelen, ami informcit nyjthat a vegylet toxicitsrl s az esetleges mellkhatsokrl egyarnt. Tovbbi elnye az in vivo vizsglatokhoz kpest, hogy megfelel mdon validlhat, gy az eredmnyek jl reproduklhatak, ellenttben az in vivo rendszerekkel, mivel a ksrleti llatok vltozatos metabolizcis enzimrendszerrel rendelkeznek (ugyanazon faj ms-ms egyedei eltr metabolizcis profilt mutathatnak, csak gy mint az emberek is). Legnagyobb htrnya ezen technikknak, hogy legkevsb korrellnak a valdi in vivo szitucival. A biomimetikus modellrendszerek a gygyszerek biotranszformcijnak I. fzist, azon bell pedig a mikroszmlis oxidcis folyamatokat modellezik. Az oxidcit vgezhetik szintetikus porfirint tartalmaz rendszerekkel, Fenton reakcival, vagy pedig elektrokmiai cella alkalmazsval off-line vagy on-line tmegspektrometris detektlssal (EC-MS, EC-LC-MS). A kszlkek bizonyos mdostsaival azonban a gygyszer metabolizmus I. s II. fzisa is vizsglhat.

VII.1. Szintetikus porfirinek A szintetikus metalloporfirinek alkalmazsa napjainkban igen sokrt. Biolgiai alkalmazsa az oxidatv folyamatokban val rszvtelre vezethet vissza, gy sikeresen hasznljk tbbek kztt a citokrm-P450 enzimek ltal katalizlt oxidcis folyamatok tanulmnyozsra. A biomimetikus vizsglatokban alkalmazott mestersges metalloporfirinekbl (80. bra) hrom nagy csoportot klnbztetnk meg, ami a szintzisk sorn ltrejtt elnyk szerinti csoportostst is magban foglalja.

103

Az n. els genercis modellmolekulkkal tbb problma is volt. A legnagyobb, hogy az oxidci sorn knnyen kpeznek dimereket, ennek kvetkeztben katalitikus tulajdonsguk elveszik, gy oxidcis ciklusba nem tudnak lpni. Tovbbi problma oxidcira trtn rzkenysgk, vagyis, hogy oxidatv krnyezetben knnyen degradldnak, tovbb hidrofb tulajdonsgaik rvn vzben nem jl olddnak.

X X X

R R X X

R R X X

N X N X X R R X M

N X N X R X R X

X X

80. bra: Szintetikus metalloporfirinek szerkezete: M: Fe, Mn, Cr, Ru I. genercis metalloporfirinek: R; X: H II. genercis metalloporfirinek: R: H; X: Hlg, alkil, SO3H III. genercis metalloporfirinek: R: Hlg; X: Hlg, alkil, SO3H

A msodik generciba tartoz vegyleteket a fenilcsoport szubsztitulsval kaptk (halogn, alkil, O-alkil, -SO3H). Ezekben a szrmazkokban a dimerek kpzdse sztrikusan gtolt, tovbb a fenil-csoporton tallhat elektronvonz szubsztituensek kvetkeztben a kzponti fmatom elektronhinyos llapotba kerl, ezltal katalitikus hatkonysga n. Tovbbi elnyk, hogy a szulfonsavval szubsztitult szrmazkok, ellenttben az I. genercis metalloporfirinekkel, vzben jl olddnak, gy a fiziolgis krlmnyeket jobban kzelt modellel dolgozhatunk. A harmadik generci a msodik tovbbfejlesztse, amit a makrociklusban tallhat pirrol gyr halognekkel trtn szubsztitcijval lltottak el. Ezltal az oxo-fm elektrofil jellege, gy katalitikus kpessge is tovbb ntt. Ezen

104

csoportostson tl a kzponti fmatom alapjn is csoportosthatjuk ezeket a vegyleteket, gy vannak Fe, Mn, Cr s Ru kzponti atomot tartalmaz mestersges metalloporfirinek is. A biomimetikus ksrletekben kt tpus metalloporfirint tartalmaz rendszert hasznlhatunk. Az egyik a CYP-450 katalitikus ciklusnak n. peroxid-sntn keresztl vgbemen folyamatt modellezi (81. bra), a msik pedig az egsz katalitikus ciklust. Az elbbi esetben oxign donorknt valamilyen oxidlszert, H2O2-t, m-klrperbenzoesavat, jodozilbenzolt, NaOCl-t vagy perklortokat alkalmazunk. Ezek a peroxidok szolgltatjk a folyamatban mind az oxignt, mind pedig az elektronokat.

H2O N FeIII N S H2O ROH H2O N N RH

RH N

O N FeIV N

RH N FeIII N N S

N S

oxign donorok Peroxid-snt

81. bra: a peroxid snt

A reakci sorn az oxidlszer hatsra az alapllapot metalloporfirin magas oxidcis llapot oxo-komplex alakul, majd ez a reaktv komplex oxidlja a vizsgland molekult, mikzben visszaalakul alapllapot metalloporfirinn (82. bra) kihagyva az egsz ciklus kzte lv lpseit, ami azt is jelenti, hogy ez a folyamat jval gyorsabb.

105

82. bra: a porfirinek peroxid snt modellez katalitikus lpsei

A msodik esetben a teljes ciklus modellezshez molekulris oxignt s valamilyen redukl szert hasznlnak (NaBH4, aszkorbinsav, Zn(Hg), kolloidlis Pt/H2). Ezekkel a rendszerekkel leginkbb modellezhet reakcik az epoxidls, alifs- s aroms-hidroxills s a heteroatomok oxidcija.

VII.2. Fenton reakci

Azokat a reaktv szabad gykket, melyek oxign atomot tartalmaznak reaktv oxign szrmazkoknak (reactive oxygen species- ROS) nevezik. Nagy reakcikpessgk abban rejlik, hogy a legkls le nem zrt elektronhjukon prostatlan elektront tartalmaznak, melyek mindenkppen elektront prblnak keresni s gy kisebb energetikai rtkre bellni. Fiziolgis esetben termelsk normlis, hiszen szmos jeltviteli folyamatban is rszt vesznek (pl. az endothelium ltal termelt NO, ami L-argininbl keletkezik nitrogn oxid szintetz (NOS) segtsgvel s vasodilatcit okoz), de felszaporodsuk slyos egszsgkrost hats is lehet. Az egyik legreaktvabb oxign gyk a hidroxilgyk, ami szmos betegsg kialakulsban (iszkmia vagy keringsi rendellenessgek) is szerepet jtszik. Fiziolgis krlmnyek kztt a hidroxilgykk legjelentsebb forrsa a Haber-

106

Weiss reakci, ahol a szuperoxid anion reduklja a Fe3+-t Fe2+-v s gy induklja a Fenton reakcit a Fe2+ s a H2O2 kztt (83. bra).

Fe3+ + O2 Fe2+ + H2O2

Fe2+ + O2 Fe3+ + OH- + OH

83. bra: a Fenton reakci egyszerstett mechanizmusa

Az oxidatv gygyszermetabolizmus vizsglatra a msodik reakciban termeld reaktv OH-t hasznljuk, mely szmos vegylettel reakciba lp s oxidlja azt. A reakciban a kettes-oxidcis llapot vas hrmas llapotba kerl, ami a Fenton reakci lellst eredmnyezheti, gy a folyamat sorn a Fe3+-t vissza kell reduklni Fe2+-v. Ezt a folyamatot ktfle mdszerrel vgezhetjk el. Az egyik valamilyen redukl szer (pl. aszkorbinsav) alkalmazsa a reakci elegyben, vagy pedig elektro-kmiai cellban (EC) trtn redukci (84. bra). A msodik megolds elnysebb, mivel egybl kapcsolhat LC-MS kszlkkel (EC-Fenton-(LC)-MS), gy rgtn elvlaszthatjuk s analizlhatjuk a keletkez lehetsges metabolitokat.

pumpa

pumpa

potenciosztt

pumpa

EC cella

HPLC oszlop

MS

fecskend pumpa

84. bra: EC(Fenton)-LC-MS kszlk vzlata

Az EC segtett fenton reakci esetben az EC cellban a munkaelektrdon nem a vegylet oxidcija folyik, hanem a vasion redukcija (elektron tadssal a ferro vas ferriv 107

redukldik). Ellenttben a klasszikus Fenton reakcival, itt nincs szksg redukl szer alkalmazsra. Ez a rendszer sokkal gyorsabb elemzst tesz lehetv, sokkal gyorsabb a vas visszaalakulsa, mint hagyomnyos redukcis reakcival, s a kapcsolt technika (on-line) miatt a feldolgozs is sokkal gyorsabb. A Fenton reakcival leginkbb modellezhet reakcik a dealkilezs, a heteroatomok oxidcija s a hidroxilci, de megfelel krlmnyek kztt egyb reakcik is vizsglhatak mind a klasszikus, mind pedig a mszeres Fenton reakci segtsgvel.

VII.3. Elektrokmiai oxidci s kapcsolt techniki

Az elektrokmiai oxidci (EC) volt az els klasszikus mszeres mdszer a gygyszerek metabolizmusnak modellezsre irnyul vizsglatok kivitelezsre. Kezdetben elssorban off-line technikkat alkalmaztak, majd ksbb az gynevezett electrocemical flow-thought cell bevezetse rvn a kapcsolt rendszerek kerltek eltrbe, melyek olyan EC cellk, amelyeken folyamatos folyadktramls van, s gy az oxidcis talakts is folyamatos. Sokkal gyorsabb s pontosabb analizlst biztostanak, mint az offline mdszerek, de gondos optimalizlst kvetel meg (pl. ramlsi sebessg, nyoms, stb). Az els ilyen metabolizcis vizsglatok az 1980-as vekre nylnak vissza. Az on-line technikk igazi elrelpst jelentettek, itt mr az oxidci befejeztvel egybl mrhet a termk, ami nagyon fontos tnyez, hiszen sok metabolit flletideje nagyon rvid. Ezek az intermedier metabolitok a legreakcikpesebbek, ppen ezrt a legveszlyesebbek is. Az EC cellt alkalmaz kszlk ltalnos felptse a 85. brn lthat. Abban az esetben, ha a kszlk nem tartalmaz LC kolonnt EC-MS-rl, ha igen EC-LC-MS-rl beszlnk. A kszlk kzponti rsze az EC-cella, ahol az oxidci trtnik. Ezek hagyomnyos elektrokmiai cellk, melyek tartalmazzk a munka, a referencia s az ellenelektrdokat egyarnt.

108

pumpa

potenciosztt

EC cella

kolonna

MS

pumpa
85. bra: elektrokmiai vizsgl rendszer sematikus brja

Geometriai szempontbl kt megvalstsi forma ltezik, az un. vkony rteg (thin-layer), illetve a porzus elektrdok (86. bra). Az elbbit amperometris, az utbbit pedig coulometris cellnak is nevezik. A sk, vagy vkonyrteges kialaktsban a munka elektrd egy lapos tnyrra emlkeztet. Ez a megolds kevsb j, mivel itt az oxidci csak az elektrd felletn trtnik,amibl az sszes htrnya is szrmazik.

ramls irnya ramls irnya

X X X X X X X X X Y X Y Y X X X Y X X X X X X X X X Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y

a
munkaelektrd

86. bra: Flow-throught cella megvalstsi formi vkony rteges (a); porzus (b)

A karbantartsi idszakok sokkal srbbek, hiszen ha a fellet beszennyezdik az oxidcis talakuls nem biztostott. sszekapcsolsa a tovbbi egysgekkel is nehzkesebb, mint a porzus kialaktsnl, mivel itt csak felszni oxidci trtnik, ami miatt az ramlsi sebessg

109

nem lehet tl magas (mert ha az, akkor az talakulsi arny igen kicsi), ha viszont tl alacsony, akkor a tbbi egysg (HPLC, MS interfszek) hatkonysga cskken. A porzus elektrd viszont sokkal hatkonyabb, ebben az esetben sokkal nagyobb az oxidcis fellet (a vizsgland elegy az elektrdon t ramlik), gy mg ha a fellet 10%-a szennyezett is, akkor is biztostott a megfelel talakulsi arny tovbb a karbantartsok kztti idszakok sokkal hosszabbak. Az EC cella potenciljnak belltsa kulcsfontossg a vizsglatok sorn, mivel a klnbz cellafeszltsgeken ms s ms oxidcis termkek kpzdhetnek. Az EC-LC-MS kszlkekkel kapott eredmnyek jl korrellnak patkny, egr, s emberi mj mikroszma inkubcijval nyert termkekkel. Az EC cellval mkd kszlkekkel leginkbb N-dealkilezs, S-, P-oxidci, alkohol oxidci, s

dehidrogenizcis reakcik modellezhetek.

VII.4. I. s II. fzis reakcik egyms utni vizsglatra alkalmas kszlkek Az elzekben emltett megoldsok csak a biotranszformci I. fzis reakciinak vizsglatt teszik lehetv. Mivel nagyon gyakran azonban nem maga a metabolit, hanem annak konjugtuma toxikus, fontos, hogy a kt fzist egy mrs sorn tudjuk vizsglni, gy a komplett metabolikus folyamatot modellezni. Az ilyen vizsglatok kivitelezsre alkalmas kszlkek ltalnos felptse a 87. brn lthat. Kzs jellemzjk, hogy az EC cella utn tallhat egy reakci hurok, ahol a konjugcis reakci lejtszdik. Fontos, hogy a konjugcis reakci az EC celln trtn thalads, vagyis az oxidcis lps lejtszdsa utn trtnjen, mert ha mr a kiindulsi reakcielegy is tartalmazza a konjugcihoz szksges szubsztrtot s enzimet, akkor azok is oxidcis talakulson mennek keresztl. Az oxidland vegyletet, valamint a konjugcis reakci lejtszdshoz szksges szubsztrtot, enzimet s kofaktorokat fecskend pumpk segtsgvel juttathatjuk a rendszerbe. A reakcihurokban lejtszd reakcit kveten vagy kzvetlenl jut a minta az MS-be (EC-MS) vagy egy oszlopvlt szelep beiktatsval elszr egy LC oszlopon elvlasztjk, majd detektljk a termket (EC-LC-MS) (87. bra).

110

pumpa

pumpa

potenciosztt

fecskend pumpa

EC cella

HPLC oszlop

MS

fecskend pumpa

reakci hurok

potenciosztt

fecskend pumpa

EC cella

MS

fecskend pumpa

reakci hurok

87. bra: fzis I. s II. tpus reakcik vizsglatra alkalmas EC-LC-MS s EC-MS berendezs sematikus brja

A konjugtum kpzs nemcsak az eredeti folyamatok vizsglatra alkalmas, hanem az oxidci sorn keletkezett kztitermkek vizsglatban is fontos szerepet jtszhat, mivel a konjugci sok esetben sokkal stabilisabb vgtermket eredmnyez, ami segti a vizsglatot s a kimutatst, az l szervezetben pedig a kirlst s az rtalmatlantst.

Ebben a fejezetben a gygyszer K+F sorn alkalmazhat metabolizmus-modell rendszerek kerltek bemutatsra. Napjainkban risi mennyisg j, potencilis gygyszervegyletet lltanak el nap, mint nap. Ezen tbb ezer molekula kzl csak nhny jut el a fejleszts humn fzis I-III. vizsglatba. Eltte szksges a tbb ezres nagysgrendet jelentsen lecskkenteni, amelynek a kltsgek cskkentsn tl, etikai vonzata is van. A humn fzis vizsglatok eltt ugyanis szksges in vivo ksrletek elvgzse. A klnbz

111

llatksrletekben azonban nem lehet tbb ezer molekult megvizsglni, ezrt ezen technikk segtsgvel ki lehet szrni azon molekulkat, melyek klnbz okok miatt nem alkalmasak a tovbbi fejlesztsre, jelentsen lecskkentve a vizsgland molekulk szmt, cskkentve ezltal az llatfelhasznlst. Az ebben a fejezetben bemutatott technikk alapjai korbbi fizikai-kmiai s biokmiai tanulmnyok sorn rszletesen trgyalsra kerlt. Sajnos rszletekbe men knyv mg nem kszlt, de akiket jobban rdekel ez a tmakr, hasznos ismereteket szerezhetnek a kvetkez publikcikbl: Wiebke Lohmann, Uwe Karst: Biomimetic modeling of oxidative drug metabolism, strategies, advantages and limitations. Anal Bioanal Chem (2008) 391: 7996.; Tove Johansson, Lars Weidolf, Ulrik Jurva: Mimicry of phase I drug metabolism novel methods for metabolite characterization and synthesis. Rapid Commun Mass Spectrom (2007); 21: 23232331.

112

VIII. In vitro technikk a gygyszermetabolizmus vizsglatokban

A farmakokinetika az l szervezetbe jutott vagy juttatott gygyszermolekula szervezeten belli sorsnak jellemzsvel foglalkozik, amely magba foglalja az Abszorpcitfelszvdst, Disztribcit-megoszlst, Metabolizcit-lebomlst, Elimincit/exkrcitkirlst, s a Toxicitst (ADMET). A gygyszerkutats s fejleszts sorn a gygyszerjelltek ADMET tulajdonsgait clszer a lehet leghamarabb felderteni, mivel fontos informcit szolgltatnak a molekulrl, s ezltal a gygyszerjellt molekulk hatkony szrse valsthat meg, mellyel idt s pnzt lehet megtakartani. Jl bizonytja ezt az a tny, hogy a klinikai kiprbls sorn sikertelennek bizonyul molekulk kb. 30%-a rossz ADMET, illetve egyb biofarmciai tulajdonsgok miatt esik ki a tovbbi fejlesztsbl. A preklinikai vizsglati fzisban in vitro modelleken, majd pedig klnbz llatfajokon (egr, patkny, nyl, kutya) vgzett ksrletekben in vivo krlmnyek kztt vizsgljk a gygyszerjellt fbb farmakokinetikai, farmakodinmiai tulajdonsgait s toxicitst. Az egyik legfontosabb tnyez, ami befolysolja a gygyszermolekula toxicitst s terpis hatst a gygyszermetabolizmus, ami ezrt egy sarkalatos pontja az j hatanyagok korai fejlesztsi szakasznak. Az in vitro metabolizmus vizsglatoknak tbb elnye is van az in vivo ksrletekkel szemben. Munka- s kltsghatkonyabbak, valamint etikai szemszgbl is elnysebbek, mivel kevesebb l llatra van szksg, tovbb humn sejteken s sejtfrakcikon is vgezhetk ksrletek (humn toxikolgiai vizsglatok nem elfogadottak!). A humn eredet sejteken illetve sejtfrakcikon vgzett ksrletek adataibl megfelel kiterjesztsi (scaling) mdszerek alkalmazsval - kzvetlenl megjsolhatk a klinikai trtnsek, br bizonyos terleteken a kutatk megosztottak az elrejelzsek hasznlhatsgt illeten. A gygyszermetabolizmus vizsglatok egyik kulcskrdse, hogyan lehetsges az in vitro vagy in vivo llatksrletes modellekbl megbzhat extrapolcikat kszteni a klinikai gyakorlat szmra. Emiatt a kutatsok clja az, hogy komoly becslkpessg modellrendszert lltson fel az emberi biotranszformci vizsglatra. Korbban mr tbb modellt is kidolgoztak, a rekombinns izollt enzimektl egszen az intakt perfundlt mjig (88. bra), melyek felhasznlsval a gygyszerfejleszts sorn mr viszonylag korn informcit szerezhetnk a vizsglt vegylet biotranszformcijrl, illetve, hogy felbecsljk a gygyszerklcsnhatsokat a metabolizci szintjn. A tovbbiakban rszletezett, klnbz in vitro mdszerek prepartumaihoz felhasznlt emberi mj minsge

113

meghatroz tnyez az in vitro vizsglatok eredmnyei vonatkozsban, klnsen a preczisan vgott mjszeletek s az izollt hepatocitk esetben. A preparlshoz a transzplantcira alkalmatlan mjakat, vagy biopszibl szrmaz mjrszeket hasznljk fel, s annak rdekben, hogy egy letkpes sejt lehetleg magas, vagy a sejtfrakcik esetben a legmagasabb enzimaktivitst mutasson, a mjat vagy a mj rszletet a kimetszs utn minl hamarabb fel kell dolgozni. Azt, hogy egy adott szituciban melyik modellrendszer tekinthet optimlisnak, tbb tnyez is befolysolja, tbbek kztt a humn in vivo megfelelsg, a kltsg, a modell hozzfrhetsge, s nem utolssorban klnbz etikai megfontolsok. Az elmlt nhny vtizedben szmos in vitro humn mj modellt fejlesztettek ki (88. bra). Ezen modellek ltalnos elnye, hogy a ksrletek sszetettsge cskkent. Msrszrl, szmos, tbb-kevsb slyos htrnyokkal jrnak az egyes technikk, amelyek megakadlyozzk ezek szleskr hasznlatt s elfogadst, mint alternatv in vivo szrsi mdszereket.
izollt perfundlt mj in vivo llatksrletek primer hepatocitk

szuperszmk

HLM +HLC

Knny alkalmazhatsg

Etikai elfogadhatsg

In vivo megfelelsg

88. bra: A gygyszerfejleszts sorn alkalmazott in vitro s in vivo modellek (HLM: Human Liver Microsomes; HLC: Human Liver Cytosol; S9: Supernatant 9000g)

VIII.1. Humn CYP450-t s UGT-t expresszl szuperszmk A szuperszmk rekombinns enzimeket tartalmaz prepartumok, melyeket gy lltanak el, hogy az adott enzimet kdol gn szekvencit klnozzk s cDNS-knt beptik

114

mjszeletek

sejtvonalak

HL S9

egy vektorba (baculovrus), ami a gazdasejtbe (rovarsejt) jutva a hordozott szekvencit bepti a gazdasejt genomjba, ahonnan az kifejezdik. Ezek a transzfektlt sejtek kpesek expresszlni az sszes CYP enzimet, ezrt meghatrozhat, hogy melyik specifikus izoenzim jtszik kzponti szerepet a vizsgland vegylet biotranszformcijban. Jelenleg mr minden humn CYP enzimet expresszl szuperszmt kifejlesztettek, amelyek a CYP-ek mellet az enzim mkdshez nlklzhetetlen NADPH citokrm P450 reduktzt, valamint opcionlisan citokrm b5-t, tovbb UGT-ket is expresszlnak. Az UGT aktivits vizsglathoz kofaktorknt uridinil-difoszfo-glkuronsavat (UDPGA) szksges adni a rendszerhez, mg a CYP-ek energiaignyt NADPH regenerl rendszer (-NADP, glkz 6foszft, s glkz 6-foszft dehidrogenz), vagy NADPH szolgltatja. A szuperszmkkal vgzett vizsglatok sorn, mindig szksges kontrol vizsglat vgzse nem transzfektlt szuperszmk alkalmazsval. Nagy elnyk e modelleknek, hogy nem csak izoenzim specifikus biotranszformci, hanem a gygyszer-gygyszer klcsnhatsok (interakcik) is vizsglhatk az alkalmazsukkal. Egyszer, rekombinns enzimekkel vgzett vizsglatok csak azt adjk meg, hogy rszt vesz-e a krdses enzim a metabolizmusban, arra nem ad vlaszt, hogy milyen mrtkben oxidlja az adott enzim a vegyletet, tovbb, hogy az enzimek egymshoz viszonytott kapacitsa tnylegesen milyen. Htrnyuk, hogy az UGT szuperszmk esetn az UGT aktv centruma rnykolt egy hidrofb gt ltal, ami a glkuronidls ksst eredmnyezi, azonban ez kikszblhet prus-kpz szerek (pl. alamethicin) segtsgvel. VIII.2. Humn mj mikroszmlis (HLM), citoszlikus (HLC), s S9 frakci A mjbl preparlhat mindhrom szubcellullris frakci kereskedelmi forgalomban van, azonban n. differencil centrifuglssal viszonylag egyszeren preparlhatk mj homogeniztumbl. A S9 frakci tartalmaz citoszlikus, s membrnhoz kttt enzimeket egyarnt. Az S9 frakcit 9000 g-n trtn centrifuglssal lehet preparlni, ami eltvoltja a homogenizls sorn keletkez sejttrmelket, sejtmagot s mitokondriumokat. Ez vgeredmnyben egy durva szvetprepartum, amelynek alkalmazsa sorn tbb nehzsg is felmerlhet. Ebbl a durva prepartumbl tovbbi centrifuglssal kapjuk meg a mikroszmlis frakcit. Az endoplazmatikus retikulum darabjai vezikulkat kpeznek, amelyeket mikroszmknak neveznk. A mikroszmlis pelletet az S9 frakci 100 000 g-n trtn centrifuglsa eredmnyezi. A preparlst kveten az egyes frakcikat -80 oC-on kell

115

trolni felhasznlsig. Az egyes ksrletek eltt meg kell hatrozni az egyes frakcik proteinkoncentrcijt. A HLM-t egyszer hasznlat s viszonylag alacsony kltsg jellemzi, az egyik legkedveltebb in vitro modell, mely ahogy az elbbiekben emltsre kerlt, mjsejtekbl differencil centrifuglssal preparlt, ER membrnt tartalmaz vezikulk sszessge. Htrnya, hogy nem teljes modellrendszer, mivel csak az ER membrnjt tartalmazza, s gy csak a membrn lokalizlt enzimek (CYP, UGT) vizsglhatak. Kofaktorknt szksges hozzadni a rendszerhez UDPGA-t, valamint a CYP-ek szmra szksges energit szolgltat NADPH regenerl rendszert, vagy NADPH-t. Az egyes izoenzimek aktivitsa egynenknt vltozik. Ezen problma megoldsra gyakran hasznlnak tbb donorbl szrmaz n. mikroszma pool-okat, ami ltal az egyedi klnbsgek kiegyenltdnek. A kell szm egyedbl sszegyjttt mikroszma prepartum esetn jl reprezentlhat a populci tlagra jellemz metabolizci. Tovbb definilhat a nemek (frfi/n) kztti klnbsg s a vizsglt vegyletet metabolizl n. kritikus CYP-ek is azonosthatak. A mikroszmlis frakci elnye a knny preparlhatsg mellett, hogy az enzimek -80 C-on trolva hossz ideig megtartjk aktivitsukat, ezltal egyszerre nagyobb mennyisg kszthet, s gy lehetsg van egy hosszabb vizsglatsorozat elvgzsre is ugyanazzal az enzimkszlettel. Htrnyknt megemltend, hogy kvantitatv (mennyisgi) meghatrozsra nem alkalmas. Kevsb elterjedtek, de emltst rdemelnek a tiszttott, rekonstitult enzimek, amelyek egyszeren hasznlhatk, s knnyen kezelhetk. A tiszttott CYP enzimeket megfelel arnyban keverik a NADPH citokrm P450 reduktzzal s a citokrm b5-tel. Azonban tiszttott formban nem minden enzim hozzfrhet, s a rekonstituls sem mindig reproduklhatan trtnik. A mjsejtek citoplazmja tartalmazza a II. fzis enzimjei kzl a szolubilisakat, mint pl. N-acetil-transzferz (NAT), glutation-S-transzferz (GST), s szulfotranszferz (ST) (kivtel az UGT, mert az membrnhoz kttt transzferz enzim). Az enzimek katalitikus aktivitshoz szksgesek kls kofaktorok is, pldul acetil-koenzim-A (acetil-CoA), dithiothreitol (DTT) s az acetil-CoA-regenerl rendszer a NAT mkdshez; az 3-foszfoadenozin-5foszfoszulft (PAPS) a ST, s glutation (GT) a GST mkdshez. A hrom enzim magas koncentrciban van jelen, s ezek kln-kln vagy egytt is vizsglhatak. Htrnya a citoszlikus frakcinak, hogy csak a metabolizmus II. fzist lehet vele vizsglni, s azok kzl is kivtel a legfontosabb, s leggyakoribb glkuronid konjugci (az elbb emltett okok miatt). 116

Az S9 frakci, ahogy az elbbiekben mr emltsre kerlt, nevt onnan kapta, hogy 9000g-n 20 percig trtn centrifuglssal kapjuk meg a tbb lpses preparls sorn. A mj S9 frakci egyarnt tartalmaz mikroszmlis s a citoplazmatikus frakcit, ezrt a biotranszformci I. s II. fzisa egy lpsben vizsglhat. Megjegyzend azonban, hogy az enzimek aktivitsa kisebb, mint az elzekben emltett esetekben (HLM, HLC). Hasonlan a szuperszmkhoz s mikroszmkhoz, NADPH-regenerl rendszerre vagy NADPH-ra itt is szksg van. A II. fzis enzimeinek katalitikus aktivitshoz szksges kofaktorok az UDPGA s a pruskpz alamethicin az UGT enzim esetn, tovbb a humn mj citoszolikus frakcinl felsorolt kls kofaktorok szksgesek a vizsglatok kivitelezshez. VIII.3. Immobilizlt enzim reaktorok (IMER) Az elzekben emltett technikk igen elterjedtek a klnbz

gygyszermetabolizmus vizsglatokban. Kedveltek, mert knnyen hozzfrhetek, viszonylag olcsk, knny a hasznlatuk, s gyorsak. Hasznlatuk sorn azonban tbb problma is felmerl. A mr emltettek mellett problmt jelent tbbek kztt, hogy a reakci utn a vizsgland anyagokat ki kell nyerni valamilyen mintaelksztsi technikval, ami egy plusz lpst s egyben hibaforrst is jelent, valamint a ksrletek utn az enzimeket, illetve a frakcikat nem kapjuk vissza, vagyis a kvetkez ksrlethez egy jabb adag frakcit kell felhasznlni. Ezek kikszblst jelentheti az immobilizlt enzimreaktorok alkalmazsa, ahol egy llfzishoz rgztik a megfelel enzimet, gy az sokszor hasznlhat a klnbz vizsglatok sorn. Az enzimek immobilizlsa trtnhet kmiai ktsek kialaktsval (89. bra 1-2.), ami lehet nem-polimerizl, illetve keresztktses, vagy fizikai erk felhasznlsval (89. bra 3-5.), ami az adszorpcit, mikrokapszulzst, s csapdzst foglalja magba. A nem polimerizl technika esetben kovalens kts csak az enzim s a hordoz kztt alakul ki, mg a keresztktses mdszernl az enzim molekulk kztt is kialakulnak kovalens ktsek. A fizikai immobilizlsi technikk kzl a legegyszerbb az adszorpci, ami alapveten egy reverzibilis folyamat, de a hordoz s az immobilizlsi krlmnyek megfelel megvlasztsval a deszorpci folyamatt a minimlisra lehet cskkenteni. Az entrapment vagy csapdzs sorn egy erteljesen keresztktses polimer hlzatot kpeznek az enzim jelenltben, ami gy csapdba esik a polimer intersticilis terben, gy nem kpes a rendszeren keresztlhaladni, mg a kis molekulk kpesek keresztldiffundlni ezen a polimer rendszeren.

117

1.

2.

3.

4.

5.

89. bra: enzim immobilizlsi technikk

A mikrokapszula-kpzs sorn az enzimet immobilizlhatjk permanens (pl. nylon) vagy nem-permanens (pl. liposzmk) mikrokapszulkban, ami egy szemipermebilis membrnt kpez, amelyen keresztl a nagy molekulk, gy az enzimek sem kpesek keresztldiffundlni, mg a kismolekulk (szubsztrt, termk) szmra a membrn tjrhat. Biokmiai kutatsokhoz a nem-permanens mikrokapszulk megfelelek, azonban konkrt analitikai vizsglatokhoz a permanens tpus javasolt, mert ezek mechanikailag sokkal stabilabbak. Enzimek immobilizlsra nincs idelis mdszer s hordoz. Ezeket az enzim s a hordoz fizikai-kmiai tulajdonsgai hatrozzk meg, egyb nem rszletezett, de fontos tnyezk mellett. Br napjainkban mr megtallhatk a CYP-ket tartalmaz IMER-ek, illetve egyb, a gygyszermetabolizmusban fontos szerepet jtsz enzimeket (pl. MAO) tartalmaz kolonnk is kifejlesztsre kerltek, az IMER-ek alkalmazsa jelenleg nem rutinszer a gygyszermetabolizmus vizsglatokban. Nagy htrnyuk, hogy csak egy vagy esetleg nhny CYP enzim rgztse trtnhet egyszerre, gy csak meghatrozott enzimek szerepe vizsglhat az adott vegylet metabolizmusban. Elterjedsket elsegtheti azonban, hogy HPLC-hez hasonl kszlkekkel hasznlhatak (90. bra). A mrsek sorn a szubsztrtot, esetleg a szksges kofaktorokat a mozgfzisba keverik. Az talakuls a mozgfzisban trtnik, amikor az keresztlhalad az immobilizlt enzimet tartalmaz kolonnn (IMER). A keletkezett termkeket s a kiindulsi anyagot vagy kzvetlenl detektljk egy arra alkalmas detektorral, vagy elszr egy analitikai kolonnn sztvlasztjk, majd leggyakrabban MS kszlkkel detektljk (90. bra). Termszetesen, ha a metabolizmus II. fzisba tartoz enzimeket immobilizlnak megfelel mdon, gy a II. fzis reakcik vizsglhatak, mg ha kt (I. s II. fzis) IMER-t alkalmazunk gy a biotranszformci mindkt lpse vizsglhat

118

egy mrs sorn. Ebben az esetben egy jabb infzis fecskend, vagy HPLC pumpa alkalmazsra is szksg lehet a konjugcis reakcihoz szksges kofaktorok, szubsztrt s az enzimmkdshez szksges egyb vegyletek rendszerbe juttatshoz. Gyakran egy n. trap oszlopot is alkalmaznak a rendszerben, ami sszegyjti a mrend anyagokat s egy msik HPLC pumpa segtsgvel mossk az analitikai oszlopra a vizsgland reakcielegyet (90. bra).
pumpa pumpa

pumpa

IMER

HPLC oszlop

MS

trap-column

90. bra: immobilizlt enzimreaktort tartalmaz kszlk sematikus brja

Az eddig emltett enzim alap modellek mellett a vizsglatok msik nagy csoportjt a sejt s szvet alap modellek alkotjk. Ezek egyik legnagyobb elnye, hogy a teljes metabolikus enzimkszlettel rendelkeznek, htrnyuk viszont, hogy az enzimaktivitsok jelentsen vltozhatnak a sejtkultra krlmnyeitl fggen, s egyb tnyezktl, mint pl. a vizsgland vegylet s a szksges kofaktorok sejtekbe val bekerlstl, melyek jelentsen befolysolhatja egy adott molekula enzimkinetikai tulajdonsgait. Leginkbb enzimindukcis vizsglatokban alkalmazzk ezeket, ahol a sejt teljes transzkripcistranszlcis appartusra szksg van, gy csak l mjsejteken vgezhetek ezek a vizsglatok. VIII.4. Mj-sejtvonalak Mj-sejtvonalak, mint in vitro modellek kevsb npszerek sszehasonltva ms ismertetett rendszerekkel. Ez elssorban nem differencilt cellulris tulajdonsguknak s a metabolizl enzimek inkomplett expresszijnak ksznhet. A humn mj-sejtvonalak

119

izollhatak primer mj parenchimasejt tumorokbl, melyek krnikus hepatitisz vagy cirrzis utn lthatak. Hatkonysguk abban rejlik, hogy kpesek a biotranszformci mindkt fzisnak (I. s II.) enzimeit expresszlni. A jelenleg rendelkezsre ll emberi mj sejtvonalak a 12. tblzatban tallhatak, amelyek mellett megtallhatak klnfle llati hepatoma sejtvonalak is, azonban ezek kevsb npszerek a humn gygyszerek biotranszformcijnak kutatsaiban. 12. tblzat: a gygyszermetabolizmus vizsglatokban alkalmazott humn mj-sejtvonalak jells Hep G2 BC2 Hep 3B C3A PLC/PRF/5 eredet Hepatocellulris karcinma Hepatma Hepatocellulris karcinma Hepatoblastma Hepatma aktv enzim(ek) CYP 1A, 3A s UGT CYP 1A1/2, 2A6, 2B6, 2C9, 2E1, 3A4 s GST, UGT CYP 1A1 CYP 3A GST

VIII.4.1. Hep G2 sejtvonal A leggyakrabban hasznlt s a legjobban karakterizlt sejtvonal tpus. Norml tenysztsi krlmnyek kztt szinte nem mutat a sejtvonal funkcionl CYP enzimet, azaz nincs detektlhat enzimaktivitsa. Azonban a klnfle izoenzimek induklhatak megfelel induktorok hozzadsval. sszehasonltva frissen izollt humn mjsejtek enzimaktivitsval, a teljes CYP aktivits mgis csekly marad. Tovbb a Hep G2 sejtvonalban lv sejtek metabolikus enzimaktivitsa jelents mrtkben fgg a tpoldat sszetteltl. sszehasonltva a frissen izollt primer hepatocitkkal ezen sejtvonalak legnagyobb elnye a knnyebb tenyszthetsg s a viszonylag stabil enzim szint, mg legjelentsebb htrnyaknt a legfontosabb I. s II. fzis metabolizl enzimek alacsony expresszija vagy teljes hinya emltend meg.

120

VIII.4.2. Transzgnikus sejtvonalak Ezeket a sejtvonalakat rekombinns teknikval hozzk ltre. Az sszes CYP s UGT izoenzim is expresszlhat, ami nagyobb mrtk, mint a nem transzfektlt sejtvonalak esetn, valamint elg nagymrtk a biotranszformcis vizsglatok elvgzshez is. Nagy elnye ezeknek a sejtvonalaknak, hogy gyakran olyan egyszer tenyszteni, mint a nem transzfektlt sejtvonalakat, azonban azokkal ellenttben, magasabb a CYP s UGT izoenzimek expresszija. Knnyen beszerezhetek, de elg drga in vitro modellek. Nagy elnyk mg, hogy hasonlan a szuperszmkhoz, az adott gygyszermolekula metabolizmusban szerepet jtsz izoenzimek kln s egyttesen is vizsglhatak. Gyakran alkalmazzk klnbz metabolitok nagyobb mennyisgben trtn ellltsra szerkezet-, valamint farmakolgiai vizsglatokhoz. VIII.4.3. Hepatocitk VIII.4.3.1. Primer hepatocitk A mjbl kollagenz mdszerrel izollhatak. Kzkedvelt in vitro modell a gygyszermetabolizmus kutatsban mivel nagyon jl kzelti az in vivo szitucikat. A klasszikus kollagenzos mdszer egy intakt mjat ignyel, ezrt annak jelents htrnya, hogy humn mjat nem lehetett hasznlni. A mdszer megfelel talaktsa azonban lehetv tette a sejtek izollst mj rszletekbl is, gy olyan humn mj rszekbl is izollhatak, melyek pl. mjmetasztzisos pciensekbl kerltek eltvoltsra. Fontos, hogy az izolls a kimetszst kveten azonnal megtrtnjen. Ha ez nem lehetsges, akkor a szvet 4 oC-on, kb. 48 rn keresztl a viabilits jelents cskkense nlkl trolhat n. University of Wisconsin (UW) oldatban. VIII.4.3.2. Tenysztett hepatocitk Izollst kveten a hepatocitkat szuszpenzis vagy egyrteg (monolayer) formban tarthatjuk. A szuszpenzis forma nhny rig letkpes, mg a msik formban a sejtek egszen 4 htig is letkpesek maradhatnak. A sikeres fagyasztsi techniknak ksznheten, mr kereskedelmi forgalomban vannak. Mindkt formrl bebizonyosodott, hogy hatkony mdszer lehet specifikus metabolizcis profil vizsglatokban, nagyon j in vitro-in vivo korrelcival. A legnagyobb elnye ennek a techniknak a korbban ismertetekkel szemben, 121

hogy az p sejteknek ksznheten nem csak a metabolikus folyamatok, hanem pl. transzportfolyamatok is vizsglhatak, mivel a gygyszertranszporterek is jelen vannak s funkcionlnak. A htrnyok kztt megemltend a kompliklt izolls, ami meglehetsen idignyes folyamat, valamint a mj egyb sejtjeinek hinya, illetve az individulis klnbsgek kizrsnak nehzsge. VIII.5. Mjszeletek, izollt perfundlt mj A preczisan vgott mjszeletek, egy nagyon hatkony technika, az in vivo trtnseket jl reprezentlja. A teljes keresztmetszetet vizsglva ktdimenzis szerkezetek is vizsglhatak, pl. egyb transzportfolyamatok. Nagyon nagy elnye ennek a techniknak, hogy egy llati mjbl tbb vizsglat is elvgezhet, br sajnos a lemetszett szeletek trolsa mg nem megoldott, valamint a CYP enzimek aktivitsa rvid ideg tart. Tovbbi problmt jelent, hogy a metszetek ksztse sorn srlnek a szeletek szlein lv sejtek, ami kvetkeztben romlik a perfzi, a sejtek oxignnel s tpanyagokkal trtn elltsa, ennek kvetkeztben pedig a mjszelet letkpessgi ideje cskken. A mdszer legnagyobb elnye, hogy nincs szksg emsztenzimek alkalmazsra, ami esetleg tnkreteheti a sejteket. Tovbbi elnyt jelent, hogy lehetsges CYP izoenzimek indukcijnak vizsglata j gygyszerek ltal. A legnagyobb problmt a mr emltett szleken trtn srlsek, a limitlt (~5 nap) letkpessgi peridus, valamint a preczis szeletek metszshez szksges kszlkek magas ra jelenti. Az izollt perfundlt mj, ami inkbb ex vivo, mint in vitro technika, reprezentlja leginkbb az in vivo trtnseket. Mivel intakt mjrl van sz, gy a mj hromdimenzis szerkezetben ll rendelkezsre. Ennek kvetkeztben minden folyamat vizsglhat, pldul epe is gyjthet, s gy vizsglhat az epesavakkal trtn konjugci is. Htrnya azonban, hogy elgg knyes modell, nehezen kezelhet, s csak 3-4 rig letkpes, tovbb mg nem megoldott a fagyasztva trols sem. Ellenttben a mjszeletekkel, ahol a szeletek vastagsgtl fgg a vizsglatok szma, perfundlt mj esetn egy vizsglat egy llatot ignyel, gy ebben az esetben a ksrletek reproduklhatsga nagyon kicsi. Etikai okok miatt pedig emberi mj nem hasznlhat ilyen tpus vizsglatokhoz! A 13. tblzat foglalja ssze a klnbz in vitro technikk f elnyeit s htrnyait. Ugyan az izollt perfundlt mj kivlan reprezentlja az in vivo szitucit, a gyakorlati nehzsgek, a problms reproduklhatsg, s a kb. hrom rs idkorlt megakadlyozza ezen mdszer szlesebb krben val hasznlatt. A mjszeleteknek az izollt perfundlt 122

mjhoz kpest elenyszek a htrnyai s ezrt a perfundlt mj modellhez kpest a ksrletek sorn a mjszeleteket nagyobb gyakorisggal hasznljk fel. Ebbl kvetkezen a perfundlt llati mj csupn azon biotranszformcis tanulmnyokban javasolt ksrleti modell, ahol epekivlasztsra van szksg. A mjszeletek s a primer hepatocita szuszpenzik egyarnt j kpet adnak az in vivo metabolikus profilrl, s sokkal hatkonyabb felhasznlst jelentik a szvetnek. Ezen modellek htrnya azonban az letkpessg s a metabolikus kapacits hirtelen cskkense mindssze nhny rval az izollst kveten. A primer hepatocitk tenyszetei hosszabb letkpessgi idvel rendelkeznek, de nhny enzim szintjnek lecskkense gy is tlsgosan gyors. A mjszeletek s a tenysztett primer hepatocitk szmra klnbz mdszereket fejlesztettek ki az letkpessg idtartamnak hepatospecifikus funkcik fenntartsa mellett trtn meghosszabbtsa rdekben, ami ugyanakkor a kapott adatok elemzst s rtelmezst jelentsen megneheztheti. A primer hepatocitkat mjszeletekkel sszehasonltva htrnyknt kell megemlteni a mj normlis integritsnak hinyt. Ugyanakkor a tenysztett primer hepatocitk elnyeknt llapthat meg, hogy az enzimek szintjnek visszaesse cskkenthet az ltal, ha a tenyszt mdiumba az enzimek induktorait adjuk, ami a mjszeletek esetben nem lehetsges. A kialaktott sejtvonalak viszonylagosan stabil fenotpust mutatnak a tenyszet szintjn a primer hepatocitkhoz, mjszeletekhez s perfundlt mjhoz viszonytva, de igen gyakran vagy tl alacsony, vagy tl magas szinten tartalmaznak a mjra jellemz esszencilis enzimeket, ami korltozza a hasznlhatsgukat. A transzgenikus sejtvonalak jobb vlasztsnak tnnek, mint az elzek, de jelenleg nincs olyan transzgenikus sejtvonal, ami hen reprezentlja az in vivo humn hepatocitkat. A klnbz transzgenikus s nem transzgenikus sejtvonalak j vlaszts a biotranszformci s citotoxicits kombincijnak egyttes vizsglatra, a gygyszer s annak metabolitjai vonatkozsban egyarnt. A szubcellulris mjfrakcik szles krben hasznlhatak az jonnan kifejlesztett gygyszervegyletek metabolikus profiljnak meghatrozsra. A mikroszmk lehetv teszik az informciszerzst a CYP- s UGT-medilt biotranszformcirl, mg a citoszlikus frakci lehetsget ad a II. fzis szolubilis enzimeknek (NAT, GST, s ST) a biotranszformci II. fzisban jtszott szerepnek trtn tanulmnyozsra. A CYP s UGT szuperszmk s a citoszolikus NAT informcit szolgltatnak a CYP, UGT vagy NAT izoenzimekrl. Az S9 frakci egyarnt hasznlhat az I. fzis s II. fzis biotranszformci egyidej tanulmnyozsra. A szuperszmk s a rekombinns humn citokrmok egyb forrsai igen rtkesek az j metabolitok azonostsban s az egyes CYP-ek, UGT-k s NAT-ok kzremkdsnek tisztzsban a vizsglt vegylet biotranszformcija sorn. 123

Ezzel egytt a szubcellulris frakci htrnya, hogy a gygyszermetabolizcit nem befolysoljk a gygyszertranszporterek, ami egybknt az p sejtekben s szervekben normlisan jellemz. 13. tblzat: A klnbz in vitro modellek ttekintse, azok elnyei, htrnyai In vitro technika Elnyk humn CYP s csak egy enzimet termel UGT szuperszmk klnbz genotpus magas enzimaktivits megfizethet HLM individulis, nemenknti s fajspecifikus biotranszformcis vizsglatok NAT, ST s GST aktivitsa kofaktor jelenlttl fgg HLC magas enzimaktivits individulis, nemenknti s fajspecifikus biotranszformcis vizsglatok mindkt fzis enzimeit tartalmazza HLS9 individulis, nemenknti s fajspecifikus biotranszformcis vizsglatok knnyen tenyszthet humn mjsejt enzimszint viszonylag stabil vonalak expresszija induklhat CYP-ek knnyen tenyszthet transzgn magasabb enzim expresszi sejtvonalak egy izoenzim vagy CYPek kombincija is vizsglhat kofaktort (meditor) s enziminduktor szksges primer hepatocitk tanulmnyozhatak klnbz meditorok s induktorok gygyszertranszporterek jelen vannak s funkcionlnakk p cellulris kapcsolatok mjszeletek lehetsges morfolgiai vizsglat egynek kztti klnbsgek vizsglhatak epekpzds izollt perfundlt 3D struktra mj Htrnyok nehz extrapollni az eredmnyeket az in vivo vagy HLM eredmnyekhez alkalmatlan kvantitatv (mennyisgi) mrsre csak CYP s UGT enzimeket tartalmaz csak NAT, ST s GST enzimeket tartalmaz

alacsonyabb az enzimaktivits, mint a mikroszmk s a citoszlikus frakcik

alacsony szint az enzim expresszi

nem teljesen reprezentlja az in vivo krlmnyeket csak nhny izoenzimet fejez ki idignyes s bonyolult az izolls, megsrlhet a sejt csak elre kivlasztott sejteket lehet tanulmnyozni

szleken krosodnak a sejtek nem megfelel penetrci korltozott letkpessg drga berendezs rzkeny/knyes modell korltozott letkpessg alacsony reproduklhatsg nincs humn mj

124

Egy j gygyszer biotranszformcijnak vizsglata megkezdhet egy egyszerbb modell hasznlatval, mg a kutats ksbbi fzisaiban a modell egyre sszetettebb vlhat. A legjobb sorrend taln az, ha HLM s HLC hasznlatval kezdnk, majd CYP-t s UGT-t szuperszmkkal folytatjuk, amit a citoszlikus NAT kvet, a kvetkez az S9 frakci, amelyet (transzfektlt) sejtvonalak s primer hepatocitk kvetnek, majd a sort a mjszeletek zrjk. A perfundlt mj csak az epekivlasztst ignyl vizsglatok sorn hasznland, s nem igazn j ksrleti modell a biotranszformcis kutatsokhoz. A humn gygyszerfejleszts jelenlegi szablyai az altmaszt tanulmnyokban engedlyezik in vitro rendszerek hasznlatt, ennek megfelelen az in vitro adatokat fleg minsgileg javasolt felhasznlni. Pldul, ha az in vitro adatok a gygyszerklcsnhats hinyra utalnak, nem szksges in vivo ksrletet vgezni, azonban ha gygyszerklcsnhats merl fel, ktelez az in vivo ksrlet elvgzse. Az in vitro technikk alkalmazhatsgt a gygyszer kutats s fejleszts egyes fzisaiban a teljessg ignye nlkl a 91. bra szemllteti.
Rekombinns CYP modellek Polimorfizmus vizsglata HLM, HLC, S9 Metabolikus stabilits Metabolit profil In vivo farmakokinetikai tulajdonsgok elrejelzse Hepatocitk, mjszeletek Enzimindukci gygyszerklcsnhatsok Enzim gtls

Gygyszer toxicits

91. bra: in vitro technikk a gygyszerek kutatsa s fejlesztse sorn

VIII.6. Tbb szerv sejttenyszeteinek integrlt rendszere (IdMOC) Az eddig ismertetett technikk mind mj alapak voltak, mivel a gygyszerek metabolizmusnak legjelentsebb hnyada ebben a szervben trtnik. Megjegyzend azonban, hogy egyb szervek (vese, bl) is hozzjrulnak kisebb-nagyobb mrtkben a gygyszerek biotranszformcijhoz. Ennek a hozzjrulsnak a vizsglatra fejlesztettk ki a 125

tbb szerv sejttenyszeteinek integrlt rendszert (independent discrete multiple organ cell coculture (IdMOC)). A rendszer lehetv teszi klnbz szervek sejtjeinek egyidej tenysztst, ahol a sejttenyszetek fizikailag el vannak klntve egymstl (92. bra). A tenyszetek kztti sszekttetst pedig, ami a szervek kztti vrkeringst modellezi, egy fellsz mdium eredmnyezi.

kzs mdium

sejttenyszetek
92. bra: IdMOC rendszer sematikus brzolsa

Br a fejezetbl nem tnik ki, de az itt bemutatott technikk szorosan kapcsoldnak a mszeres analitikhoz, mivel a ksrletek vgn a vizsgland anyago(ka)t ki kell nyerni a rendszerbl (lsd 3. fejezet) s valamilyen mszeres analitikai technikval, napjainkban leggyakrabban LC-MS-el, kell azonostani s a koncentrcijt meghatrozni. Lthat, hogy az ebben a fejezetben ismertetett in vitro technikk nagyon hasznosak, s nagyon fontos informcikat szolgltatnak a gygyszer kutats s fejleszts egyes szakaszaiban. Br az llatksrletek in vitro modellekkel val teljes kivltsa a kzeljvre nzve nem tnik elkpzelhetnek, azonban alkalmazsukkal az l llat felhasznls jelents mrtkben cskkenthet. Valszn, hogy ezen technikk alkalmazsa, az izollt perfundlt mj kivtelvel, a jvben nvekedni fog, leginkbb a gygyszerfejleszts korai fzisban az in vivo tesztek eltt, elsegtve, hogy csak a legalkalmasabb potencilis vegyletek kerljenek a fejleszts tovbbi szakaszaiba, nvelve a hatkonysgot, jelentsen cskkentve a kltsgeket s ami jra hangslyozand, cskkentve az llatfelhasznlst. Akik tovbbi ismeretekre kvnnak szert tenni ezen a terleten, azoknak ajnlom Gary Evans (szerk.) a A HANDBOOK OF BIOANALYSIS AND DRUG METABOLISM cm knyv 15. fejezett: In 126

vitro techniques for investigating drug metabolism, valamint Esther F.A. Brandon, Christiaan D. Raap, Irma Meijerman, Jos H. Beijnen, Jan H.M. Schellens ltal rt, An update on in vitro test methods in human hepatic drug biotransformation research: pros and cons. cm reviewt (Toxicology and Applied Pharmacology 189 (2003) 233246), tovbb Lee Jia, Xiaodong Liu, The Conduct of Drug Metabolism Studies Considered Good Practice (II): In Vitro Experiments. (Curr Drug Metab. 2007; 8(8): 822829), cm munkjt.

127