NV Bakteriologija MNE

Crna Gora
____________________________________________
Ministarstvo zdravlja
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse
Podgorica | 2012.
Crna Gora
_____________________________________
Ministarstvo zdravlja Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne Gore
Laboratorijska dijagnostika u klinikoj bakteriologiji

Podgorica, 2012. godine
Laboratorijska dijagnostika u klinikoj bakteriologiji

________________________________________________________________ Ministarstvo zdravlja Crne Gore Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne Gore Autori: Dr Ljubica Mugoa, Dr Danijela Rajkovi, Dr eljka Zekovi, Dr Slobodan Nanevski, Dr Gordana Mijovi, Dr Milena Lopici, Dr Rua Tomi, Dr Branka Perovi, Dr Gordana Zurovac, Dr arko Nikevi, Dr Ljubica Teri, Dr Tatjana Radunovi Recenzenti: Prof. dr Lazar Ranin Prof. dr Branislava Savi Urednik: Doc.dr Gordana Mijovi
________________________________________________________________
ISBN 0-000-00000-0
Izdava: Ministarstvo zdravlja Crne Gore 2012 Tehnika priprema i dizajn: Aleksandar Klimovi tampa: XXXXXXXXXXXXXXX Tira: XXX primjeraka
Predgovor
Ovaj vodi je rezultat potrebe za podizanjem i ujednaavanjem nivoa mikrobioloke dijagnostike na cijeloj teritoriji drave Crne Gore. Vodi kojim su definisane standardne operativne procedure rada u obradi klinikih uzoraka, identifikaciji kliniki najznaajnijih bakterija i ispitivanju osjetljivosti bakterija na antibiotike i hemioterapeutike, omoguava da rezultati dobijeni u razliitim laboratorijama budu uporedivi i da se njihova validnost ne dovodi u pitanje. Ministarstvo zdravlja i Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne Gore su udruili svoje snage u ostvarivanju jasnog krajnjeg cilja: da mikrobioloki rezultati budu jo vaniji i sigurniji oslonac kliniarima u postavljanju dijagnoza, a sve za dobrobit pacijenata. Standardne operativne procedure rada kojima se bavi ovaj dokument se baziraju na naunim injenicama i shodno tome podlijee periodinim revizijama, u skladu sa napretkom nauke. Namjera je bila da se napravi jednostavan i lako primjenljiv vodi koji e ujedno biti dobra osnova za dalje dopunjavanje, usavravanje i unapreivanje dobre laboratorijske prakse.
Autori
Izvod iz recenzije
Primena ovog prirunika e doprineti uvoenju jedinstvene laboratorijske metodologije u bakteriolokim laboratorijama Crne Gore. Takoe, ovaj prirunik e posluiti kao odlina osnova za pripremanje standardnih operativnih procedura to e omoguiti da mikrobioloke laboratorije Crne Gore uspeno prikupljaju i dokumentuju relevantne podatke o izazivaima zaraznih bolesti kao i da ostvare saradnju u razmeni tih podataka sa drugim bakteriolokim laboratorijama van zemlje..."
Prof.dr Lazar Ranin, specijalista mikrobiologije i parazitologije, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu Prof.dr Branislava Savi, specijalista mikrobiologije i parazitologije, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu
Sadraj
1Ispitivanje brisa grla ............................................................................. 1 2Ispitivanje brisa nosa ............................................................................ 3 3Ispitivanje brisa nazofarinksa............................................................... 5 4 Ispitivanje sputuma .............................................................................. 6
5Ispitivanje sadraja apscesa i dubokih rana ......................................... 9 6Ispitivanje brisa koe i povrinskih rana ............................................ 11 7Ispitivanje tkiva i biopsija .................................................................. 15 8Ispitivanje brisa iz unog kanala (bris uva) i sekreta iz srednjeg uva 23 9Ispitivanje brisa oka u sluaju conjunctivitis-a i blepharitis-a ........... 25 10 Ispitivanje brisa oka u sluaju drugih infekcija oka ........................... 27 11Ispitivanje likvora ............................................................................... 29 12Ispitivanje krvi (hemokultura) ............................................................ 32 13Ispitivanje intravaskularne kanile i slinih uzoraka ........................... 35 14Ispitivanje fecesa (koprokultura) ........................................................ 38 15 Koprokultura za izolaciju Vibrio cholerae ......................................... 39 16Ispitivanje urina (urinokultura) ........................................................... 41 17Ispitivanje vaginalnog brisa ................................................................ 47 18Ispitivanje cervikalnog brisa ............................................................... 50 19Ispitivanje uretralnog brisa ................................................................. 52 20Ispitivanje prisustva genitalnih mikoplazmi ....................................... 54 21Identifikacija Staphylococcus spp. ..................................................... 55 22Identifikacija Streptococcus spp. i Enterococcus spp. ....................... 59
23Identifikacija Neisseria spp. i morfoloki slinih organizama ........... 65 24Identifikacija enterobakterija .............................................................. 68 25Identifikacija gram negativnih nefermentujuih bacila ...................... 72 26Identifikacija Haemophilus spp. i HACEK grupe organizama ......... 74 27Identifikacija Bordetella spp. ............................................................. 79 28Identifikacija Campylobacter spp. ...................................................... 81 29Identifikacija Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis ...................................... 82 30 Identifikacija anaerobnih bakterija ..................................................... 86 31Ispitivanje osjetljivosti bakterija na antimikrobne supstance disk difuzionionim metodom ........................................................................... 88 32Identifikacija -laktamaza proirenog spektra.................................... 98 DODATAK: Nain pripremanja hranljivih podloga koje ne postoje u prakastom obliku kao gotove podloge .................................................. 102 Literatura ................................................................................................ 104
Ispitivanje brisa grla
1.1
Uzorkovanje
Uzorkovanje obaviti sa pojavom prvih simptoma, prije antibiotske terapije. Pacijenta zamoliti da iroko otvori usta i izgovori a. Koristei dobro osvjetljenje i pritiskajui patulom korijen jezika, osmotriti unutranjost usta traei znakove upale, prisustvo bilo kakvih membrana, eksudata ili gnoja. Uvesti bris do zadnjeg zida drijela. Polako rotirajui u ruci bris, energino prebrisati prostor iza uvule i izmeu tonzilarnih lukova. Prilikom ulaska i izlaska iz drijela paziti da se bris ne kontaminira salivom i odloiti ga u sterilan kontejner (epruvetu) ili transportnu podlogu. Pacijent ne smije osam asova prije uzimanja brisa koristiti bilo kakav antibiotik, niti ispirati usta bilo kakvim dezinficijensom.
1.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu: koristiti transportnu podlogu, ili na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati, jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije. Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
1.3
Zasijavanje
krvni agar sa razreenjem Dodatno kod sumnje na difteriju: Claubergova teluritna podloga (alternativa: Leflerov koagulisani serum, Hoyle's telurit agar) Dodatno kod sumnje na faringealnu gonoreju i meningokokno kliconotvo: VCN okoladni agar, GC selektivni agar
1.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24h Claubergova teluritna podloga (alternativa: Leflerov koagulisani
serum, Hoyle's telurit agar): aerobno, 35-37C, 48-72h (svakodnevno itanje) VCN okoladni agar, GC selektivni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 40-48h (svakodnevno itanje)
1.5
Tumaenje nalaza
nalaz Streptococcus haemolyticus gr. A, C i G su uobiajeni
patogeni. nalaz Staphylococcus aureus znaajan u ispitivanju kliconotva (MRSA, metilicin rezistentan Staphylococcus aureus, sojevi intrahospitalna sredina!)
1.6
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti: Izolovana fizioloka mikroflora.
Ispitivanje brisa nosa
2.1
Uzorkovanje
Uzima se brisom ispod i iznad donje nosne koljke. Prilikom uzimanja materijala paziti da se ne dotaknu brisom otvor i zidovi atrijuma, pa je najbolje uzeti bris kroz nosni spekulum.
2.2
Transportovanje
2.3
Zasijavanje
krvni agar sa razreenjem i stafilokoknom crtom. Dodatno, kod sumnje na nazalnu difteriju: Claubergova teluritna podloga (alternativa: Leflerov koagulisani serum, Hoyles telurit agar) Dodatno, kod sumnje na rinosklerom i ozenu: endo agar (CLED agar)
2.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24h Claubergova teluritna podloga (alternativa: Leflerov koagulisani
serum, Hoyles telurit agar): aerobno, 35-37C, 48-72h (svakodnevno itanje) Endo agar (CLED agar): aerobno, 35-37C, 16-24h
2.5
Tumaenje nalaza
Staphylococcus .aureus i Streptococcus haemolyticus gr. A: znaaj
u eradikaciji kliconotva (posebno MRSA-intrahospitalna sredina!).
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella

catarrhalis: izvjestiti uz napomenu da mogu imati znaaja u sklopu zapaljenja srednjeg uva, sinusa i donjih respiratornih puteva (ako se nau u istoj kulturi ili da dominiraju). Klebsiella rhinoscleromatis (rhinosclerom), Klebsiella ozaenae (ozena). Mycobacterium leprae (ispituje se po posebnom protokolu).
2.6
Izvjetavanje
Ispitivanje brisa nazofarinksa
3.1
Uzorkovanje
Uzima se specijalnim ianim lako savitljivim brisom. Najbolje da
bris uzima ljekar specijalista otorinolaringolog ili osoba sa iskustvom.
3.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue dva asa). Ako je brz transport nemogu: koristiti transportnu podlogu, ili na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati, jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije. Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
3.3
Zasijavanje
Bordet-Gengou-ova podloga (priprema se po potrebi); alternativa:
CCBA (charcoal cephalexin blood agar) kao selektivnija podloga.
3.4
Inkubacija
Aerobno, 35-37C, 2-7 dana (svakodnevno itanje)
3.5
Tumaenje nalaza
Ciljani uzronik: Bordetella pertussis
3.6
Izvjetavanje
Bordetella pertussis izolovana Bordetella pertussis nije izolovana
Ispitivanje sputuma
4.1
Uzorkovanje
Daje se prvi jutarnji ispljuvak odmah nakon buenja, a prije
obavljanja line higijene. Pacijenta savjetovati da ispere usta mlakom vodom (bez dezinficijensa) i da potom nekoliko puta duboko udahne (provokacija kalja), saeka nadraaj na kaalj, jako se nakalje i sadraj iz dubine plua ispljune u sterilnu posudu sa irokim otvorom. Rjei postupci uzorkovanja: u toku bronhoskopije, bronholavaom, transtrahealno, kod djece nazofaringealni aspirat. Dobra praksa - davanje pisanog uputstva pacijentima. Dobra praksa: uz sputum dostaviti bris grla na ispitivanje.
4.2
Transportovanje
Uzorak donijeti u laboratoriju unutar 2 h (mogunost transporta
transportni medijumi) Ako se sumnja na bronhopneumoniju ili pneumoniju, ne moe se odlagati transport i sputum se ne smije drati u friideru, jer bakterije, koje su najei uzronici ovih oboljenja (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae), brzo propadaju na temperaturi nioj od 35C.
4.3
4.3.1
Zasijavanje
Ispitivanje kvaliteta uzorka
Primarnu obradu uzoraka sputuma treba vriti u komori za bezbjedan rad klase II. Makroskopska evaluacija: opisati sputum (purulentan, mukopurulentan, mukoidan, krvav). Direktni mikroskopski preparat: Birati gnojave dijelove sputuma i napraviti preparat bojen po Gramu, mikroskopirati pod malim uvelianjem.
Kriterijum za trijau sputuma po Murray i Washington-u su prikazani u tabeli br.1. TABELA 1. Kriterijum za trijau sputuma po Murray i Washington-u
Grupa 1 2 3 4 5 Epitelne elije po vidnom polju >25 >25 >25 10-25 <10 Leukociti po vidnom polju <10 10-25 >25 >25 >25
Grupe od 1-4 su neprihvatljive za kultivaciju i izvjetavaju se: Uzorak je preteno saliva, te je neprihvatljiv za kultivaciju. Preporuuje se ponoviti analizu, ako postoji klinika indikacija. Ovi kriterijumi nisu odgovarajui za imunokompromitovane, neutropenine, intubirane pacijente, kod sumnje na Mycobacterium spp. i Legionela pneumophila, ili ako je nemogue ponoviti uzorkovanje. Nalaz cilindrinih epitelnih elija donjeg respiratornog trakta indikuje da je dobijen kvalitetan uzorak sputuma.
4.3.2
Kultivacija
krvni agar endo agar selektivni okoladni agar za Haemophilus
4.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24h endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24h okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 24-48 h
(svakodnevno itanje)
4.5
Tumaenje nalaza
Ciljani
uzronici su Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae (i rjee druge Gram negativne bakterije).
Kod
cistine fibroze i bronhiektazija: Pseudomonas spp., Burkholderia cepacia, enterobakterije, Staphylococcus aureus. Rijetki uzronici: Nocardia spp., Actinomyces spp. (ispituju se po posebnom protokolu).
4.6
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti: Izolovana fizioloka mikroflora usne duplje.
Ispitivanje sadraja apscesa i dubokih rana

Uzorkovanje
5.1
Uzorci koji se mogu ispitivati su: sadraj apscesa dobijen punkcijom ili poslije incizije bris rane eksudat rane Optimalno vrijeme uzimanja uzorka - prije sprovedene antimikrobne terapije. Optimalna koliina uzorka - minimum 1 ml gnojnog sadraja, ili dobro natopljen bris. Optimalno je uzeti 2 brisa: jedan za kultivaciju, drugi za pravljenje direktnog mikroskopskog preparata.
5.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue do pola sata). Ako je brz transport nemogu: za briseve koristiti transportnu podlogu prihvatljivo vrijeme transporta za sadraj apscesa zavisi od koliine uzetog materijala:
Volumen aspiriranog sadraja: < 1 ml 1 ml >2 ml Optimalno vrijeme za transport do laboratorije: < 10 min. < 30 min. <3h
5.3
5.3.1
Zasijavanje
Direktan mikroskopski preparat
Bris se priprema za direktnu mikroskopiju u vidu tankog razmaza na istom predmetnom staklu i potom boji po Gramu. Gnojni sadraj se sterilnom pipetom ili ezom nanese na isto predmetno staklo u koliini od jedne kapi, razmae i boji po Gramu. Izvjestiti o prisustvu leukocita i (opisno) mikroorganizama.
10
5.3.2
Kultivacija
krvni agar endo agar tioglikolat bujon podloga za anaerobne bakterije sa 5 g diskom metronidazola Dodatno, u sluaju primarnog peritonitisa kod ena i prostatinog apscesa: okoladni agar
5.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h tioglikolat bujon: aerobno, 16-24 h presijava se po potrebi, aerobno
(krvni agar i/ili endo agar) i/ili anaerobno (podloga za anaerobe)
podloga za anaerobne bakterije: anaerobno, 35-37C, 48 h (moe i do

5 dana)
okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 48 h

5.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Staphylococcus aureus Streptococcus haemolyticus Druge streptokoke Enterococcus Enterobakterije Pseudomonas spp. Anaerobi Actinomycetes Nocardia Neisseria gonorrhoeae
U gnoju i eksudatu rane bilo koji izolovani mikroorganizam moe biti znaajan.
11
Ispitivanje brisa koe i povrinskih rana
6.1
Uzorkovanje
ukoliko je prisutan sekret materijal uzeti suvim pamunim brisom ukoliko nema sekreta bris prethodno natopiti fiziolokim rastvorom ukoliko na koi postoje pustule, vezikule ili ulceracije sadraj iz ovih
promjena uzima se sterilnom iglom i brizgalicom.
sadraj iz ulkusa moe se uzeti irigaciono-aspiracionom metodom

pomou malog prica bez igle koji se smjesti ispod ivice ulkusa i njeno ispere sa najmanje 1 ml sterilnog fiziolokog rastvora. Poslije masae ivice ulcusa, ponavlja se irigacija sa jo 1 ml sterilnog fiziolokog rastvora. Ivica ulkusa se jo jednom izmasira, a onda aspirira 0.25 ml tenosti i smjesti u sterilan kontejner.
6.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za briseve: koristiti transportnu podlogu, ili na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati, jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije. Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi. Aspirirani sadraj iz pustula moe se transportovati u sterilnim plastinim kontejnerima.
6.3
6.3.1
Zasijavanje
Direktan mikroskopski preparat Radi se, ako je vidljiv gnoj na brisu.
12
6.3.2
Kultivacija
Svi brisevi:
krvni agar endo agar

Dodatno, u sluaju da se radi o ujedu ivotinje ili ovjeka, celulitisu, paronihiji, povrnoj povredi: podloga za anaerobe sa 5g diskom metronidazola Dodatno, u sluaju celulitisa kod djece i ljudskog ugriza: selektivni okoladni agar za Haemophilus Dodatno, kod sumnje na difteriju koe: cistein telurit krvni agar (alternativa Hoyle's teluritni ag,ar) Dodatno, kad se trai ispitivanje na gljivine infekcije: prema posebnom protokolu
6.4

Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h podloga za anaerobe: anaerobno, 35-37C, 48 h okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 48 h (svakodnevno itanje) cistein telurit krvni agar: aerobno, 35-37C, 48 h (svakodnevno itanje)
6.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Staphylococcus aureus Streptococcus haemolyticus gr. A, B, C i G Bacteroides spp. Clostridium spp. Anaerobne koke Koagulaza negativni stafilokoki Enterobakterije Pseudomonas species
Najei uzronici infekcija opekotina:

Staphylococcus aureus
13
Streptococcus haemolyticus Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Bacillus spp. Enterobakterije Koagulaza negativni stafilokok
Najei uzronici infekcija ulkusa i dekubitusa:

Staphylococcus aureus Streptokoke Anaerobni Gram - bacili Clostridium spp. Enterobakterije Corynebacterium spp. Pseudomonas spp. Koagulaza negativni stafilokok
Najei uzronici paronihije:

Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Anaerobi Haemophilus influenzae
Najei uzronici folikulitisa:

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Najei uzronici celulitisa:

Staphylococcus aureus Streptococcus haemolyticus Arcanobacterium haemolyticum Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Bacteroides spp. Anaerobne koke
Uzronici impetiga:
Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes
Najei uzronici infekcije ujeda:

Streptococcus haemolyticus
14
Pasteurella multocida Staphylococcus aureus Streptococcus haemolyticus Anaerobi Eikenella corrodens Haemophilus spp. Koagulaza negativni stafilokoki Streptobacillus moniliformis
Bakterije koje uzrokuju erysipelas:

Streptococcus haemolyticus gr. A i G Staphylococcus aureus
Bakterija koja uzrokuje erysipeloid:

Erysepelothrix rhusiopathiae
Bakterije koje uzrokuju ecthyma gangrenosum:

Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia
Uzronik erythrasma-e:
Corynebacterium minutissimum
6.6
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti: Izolovana fizioloka mikroflora koe. Ukoliko su izolovani u istoj kulturi ili kao dominantna flora mikroorganizmi koji su sastavni dio mikroflore koe, u zavisnosti od uputne dijagnoze, izvjestiti uz komentar: Izolovani soj porastao u istoj kulturi ili Izolovani soj porastao kao dominantna flora.
15
7
7.1
Ispitivanje tkiva i biopsija

Uzorkovanje
Optimalno vrijeme uzimanja uzorka je prije antimikrobne terapije. Uzorak treba da uzima ljekar ili iskusna osoba. Uzorak treba da bude u dovoljnoj koliini da bi mogle da se odrade sve dijagnostike procedure (koliina potrebnog uzorka zavisi od broja zahtijevanih ispitivanja). Uzorci tkiva mogu se dobiti na tri naina: kao zatvorena procedura perkutanom biopsijomu toku operacije (uklanjanjem devitalizovanog ili inficiranog tkiva) post mortem Pri uzorkovanju bilo kojim od navedenih naina mogu se javiti problemi. Kod perkutane biopsije nedovoljna koliina uzorka moe se promaiti infektivna lezija kontaminacija florom koe Kod uzorkovanja u toku operacije uzorkovanje se ne moe ponoviti, stoga treba voditi rauna u toku obrade ovih materijala Kod uzorkovanja tkiva post mortem kontaminacija enterinom florom, treba oprezno interpretirati rezultate Mjere bezbjednosti: izbjegavati akcidentalne povrede prilikom korienja igle koristiti sterilne kontejnere u zatvorenim plastinim kesama laboratorijske procedure koje daju infektivni aerosol, sjeckanje i homogenizacija uzoraka moraju se izvoditi u komorama za bezbjedan rad klase II, a ukoliko su u pitanju biohazardi grupe 3 kao to su Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., ili postoji sumnja na egzotine importovane mikoze, obrada i ispitivanje materijala mora biti izvoena u biolokom kabinetu nivoa 3. kad god je mogue koristiti sterilne makaze, preporuljivije u odnosu na skalpel. Napomena: Kod hroninih infekcija tkiva potrebno je vriti ispitivanje i na gljivice, mikobakterije i parazite.
7.2
Transportovanje
Uzorak transportovati do laboratorije to je prije mogue
16
Optimalno vrijeme transporta do laboratorije za tkiva i materijal

dobijen biopsijom je do 30 minuta. Ukoliko je koliina uzorka mala, staviti ga u sterilan fizioloki rastvor da se sprijei suenje. Ukoliko se obrada odlae uzorak uvati u friideru. Odlaganje due od 48h nije poeljno. (Volumen uzorka utie na prihvatljivo vrijeme transporta. U veim komadima tkiva vijabilnost anaeroba se odrava due vrijeme).
7.3
7.3.1
Zasijavanje
Homogenizovani uzorci: Staviti kap uzorka na isto predmetno staklo sa sterilnom pipetom. Razvui sterilnom ezom i napraviti tanak razmaz za bojenje po Gramu. Nehomogenizovani uzorci: Preparat se pravi otiskom - sterilnom pincetom uhvatiti dio uzorka i napraviti otisak jednom ili sa vie strana uzorka na isto predmetno staklo, bojiti po Gramu. Napomena: Za gljivice, Legionella spp., Helicobacter pylori i parazite postoje posebne tehnike Mycobacterium spp.,
7.3.2
Kultivacija
Napomena: Uzorak dobijen u formalinu nije prihvatljiv za kulturu. Primarna obrada uzorka mora biti izvoena u komori za bezbjedan rad klase II Usitniti ili homogenizovati uzorak sa odgovarajuim sterilnim priborom (grinder-brus Griffits tube ili alternativne nelomljive tube) ili sterilnim makazama u sterilnoj petrijevoj olji na parie. Kod homogenizacije dodati 0,5ml sterilne filtrirane vode, fiziolokog rastvora, peptona ili bujona da bi pomoglo homogenizaciju. Inokulisati svaku agar plou i obogaeni bujon sa homogenizovanim uzorkom. Kod nehomogenizovanih uzoraka inokulisati agar plou sa isjeckanim komadom tkiva. Za dobijanje pojedinanih kolonija, rairiti inokulum sa sterilnom ezom.
17
7.4
Inkubacija
Hranljive podloge i uslovi inkubacije dati su u tabeli br.2
TABELA 2. Hranljive podloge, uslovi inkubacije i ciljni mikroorganizmi Za sve uzorke:

Klinika slika/ uslovi - Gangrena Myonecrosis - Nekrotizirajui fasciitis - Sve druge udruene infekcije Standardni medijum krvni agar ENDO agar Podloga za anaerobe sa diskom 5 g metronidazola bujon za zahtjevne anaerobe koji se presijava nakon 40h na krvni agar i podlogu za anaerobe sa diskom 5g metronidazola Inkubacija Temp. 35-37 35-37 Atmosfera 5-10% CO2 aerobno Vrijeme 40-48h 16-24h itanje kulture svakodnevno 16h Ciljni organizmi bilo koji mikroorganizam
35-37
anaerobno
5 dana
40h i petog dana
35-37
aerobno
40-48h
N/A*
35-37 35-37
5-10% CO2 anaerobno
40-48h 5 dana
svakodnevno 40h i petog dana
*N-negativna A-pozitivna
U sledeim situacijama dodati:

Klinika slika/ uslovi Ukoliko preparat sugerie na mijeanu infekciju Actinomycosis Standardni medijum Neomycin fastidius anaerobni agar sa 5 g diskom metronidazola Krvni agar sa dodatkom metronidazola i nalidiksne kiseline Inkubacija Temp. 35-37 Atmosfera anaerobno Vrijeme 5 dana itanje kulture 40h i petog dana Ciljni organizmi Anaerobi
35-37
anaerobno
10 dana
40h, sedmog i desetog dana
Actinomyces species
18
Inkubacija Temp. 35-37 i 25-30 Atmosfera aerobno Vrijeme 40-48h*
Klinika slika/ uslovi Imunokompromitovani, ili suspektne invazivne gljivine infekcije Mycetoma Nocardiosis Ukoliko preparat sugerie na mijeanu infekciju ili je mjesto uzorkovanja jako prljavo
Standardni medijum Sabouraud agar
itanje kulture 40h i nakon osam nedelja
Ciljni organizmi Fungi
LowensteinJensen-ov medijum Staph/strep selektivni agar
35-37
aerobno
Nakon 28 dana 40-48h*
Svaka 3-4 dana dnevno
Aerobne Actinomycetes Staphylococcus aureus Streptococcus
35-37
aerobno
* inkubacija se moe produiti do 5 dana, u tom sluaju ploe treba itati nakon 40h i produiti do 5 dana
Napomena: Ukoliko je uzorak nedovoljan za sva ispitivanja, prioritet se daje klinikim indikacijama nakon konsultacije sa klinikim mikrobiologom. Odabrati reprezentativni dio uzorka za odreene procedure kao to su kultura na gljivice, Legionella, Mycobacterium spp., ili pregled na parazite, u zavisnosti od klinike slike.
7.5
Tumaenje nalaza
Bilo koji organizam izolovan iz uzoraka tkiva moe biti znaajan.
Najei izolati ukljuuju: Staphylococcus aureus Streptococci Bacteroides spp. Clostridium spp. Mycobacterium spp. Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Aerobne aktinomicete Fungi Actinomyces spp.
19
7.6
Izvjetavanje
Opisati direktni mikroskopski preparat bojen po Gram-u: izvjetava se nalaz upalnih celularnih elemenata i prisustvo mikroorganizama. Izvjestiti svaki porast uz odgovarajui komentar. U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su sterilne.
7.7
Komentar
Vrsta infekcije
Infekcije mekih tkiva Detekcija uzronika je teka. Povrina lezija je obino kolonizovana polimikrobnom florom neodreene patogenosti. Dezinfekcija povrine rane da bi se uklonila ova flora, moe dati lano negativne rezultate ili selektovati organizam kao to je Pseudomonas aeruginosa. Da bi se izolovao uzronik infekcije nekad je potrebno uzorkovanje dubljeg tkiva, naroito u sluajevima infekcije opekotina. Infekcije mekih tkiva sa nekrozom Termin se moe odnositi na vrstu patogena, vrstu zahvaenog tkiva, prisustva ili odsustva gasa u tkivu. Primjeri: streptokokna gangrena udruena gangrena klostridijalna i neklostridijalna gangrena Myonecrosis nekrotizirajui fascitis Odgovarajui uzorci su: krv za hemokulturu, tenost iz bule i biopsija tkiva. Ne treba uzimati bris sa povrine lezije, jer e dati mijeanu kulturu koja je najee kontaminacija. Nekrotizirajui fasciitis Infekcija potkonog masnog tkiva i tkiva izmeu povrne i duboke fascije miia. Brzo se iri, zbog odsustva unutranjih barijera. Neki autori smatraju da postoje dva tipa. Tip I nastaje infekcijom najmanje jednom anaerobnom vrstom (Bacteroides i Peptostreptococcus spp.) i jednom ili vie fakultativnih anaerobnih vrsta (non grupa A streptokoke i lanovi Enterobacteriaceae). Obligatni aerobi su rijetko implicirani. TipII (haemolyticus streptococcal gangrena) uzrokovana sa streptokokom grupe A sam ili udruen sa drugim vrstama npr. S. aureus.
20
Udruena gangrena Javlja se nakon operacija u abdomenu i rezultat je mijeane infekcije (Staphylococcus aureus, streptokoke, enterobakterije, Pseudomonas species i anaerobne vrste). Gasna gangrena Nekroza tkiva, krvavo-serozna sekrecija i prisustvo gasa u tkivu, praena znacima toksemije. Javlja se nakon trauma ili penetrirajuih povreda tkiva. Uzronici su Clostridium species, naroito Clostridium perfringens. Nekad ove bakterije kolonizuju ranu bez izazivanja infekcije, mogu da izazovu celulitis ili mionekrozu. Infekcije nesporogenim anaerobima Znaajni uzronici infekcija u pelvinoj i skrotalnoj regiji. esto se javljaju u polimikrobnim infekcijama sa enterobakterijama, streptokokama i vrstama klostridijuma. Spontana gangrena Javlja se nakon blagih trauma tkiva ili bez vidljive povrede kod oboljelih od karcinoma kolona, leukemije ili neutropenije. Glavni uzronici C. perfringens i C. septicum. Pyomiositis Gnojna infekcija skeletnih miia, ea je u tropskim zemljama. Obino se javlja pojedinani apsces, ali se deavaju i multipli apscesi. Oboljeli uglavnom nemaju predisponirajue faktore, a samo kod 25% se desila povreda. Najei uzronik je S.aureus, jako rijetko kod imunokompromitovanih infekciju mogu izazvati gljivice i virusi. Actinomycosis Hronina supurativna infekcija, koju karakterie formiranje apscesa sa produkcijom sulfurnih granula. One se uglavnom sastoje od mikro-kolonija Actinomyces species. Uobiajena mjesta su u okolini donje vilice, grudi i abdomena. Biopsijom promjena otkriva se uzronik, najee je to A. israelii. Aktinomicetama slini organizmi i Actinomycetes se obino nalaze u cervikalnim razmazima, ali je kliniki znaaj sumnjiv.
21
Traumatska inokulacija Sa zemljom ili biljkama moe da dovede do infekcija sa Nocardia species ili nekim gljivama kao npr Sporothrix schenkii. Nocardia vrste rastu na jednostavnim podlogama na 35-37C, ali je potrebno due vrijeme inkubacije 2-4 nedelje. Mycetoma Javlja se u tropskim i subtropskim krajevima, obino nakon punktiformnih rana. Hronini destruktivni proces zahvata kou, potkono tkivo, miie i kosti. Stvaraju se granulacije u tkivu sa hroninom inflamacijom i fibrozom. Micetomi mogu da se jave bilo gdje u organizmu. Na osnovu uzronika dijele se u dvije kategorije: 1. Eumycetoma: Acremonium species, Leptospheria senegalensis, Madurela species, Scedosporium apiospermum 2. Actinomycetoma: Actinomadura species, Nocardia species, Streptomyces species. Mikroorganizmi se nalaze u drenirajuim sinusima tkiva kao agregati filamenata, koji se zovu granule. One se razlikuju od sulfurnih granulakod aktinomikoze, jer nemaju karakteristini vorast rub. esto su organizmi u ovim sinusima mrtvi ili se javlja kontaminacija drugim bakterijama, pa se bolji rezultati kulture dobijaju biopsijom tkiva. Duboke ili diseminovane gljivine infekcije Dijagnoza se moe postaviti biopsijom tkiva.
7.7.1
Specifine vrste tkiva koje zahtijevaju dodatna ispitivanja
Srane valvule - kod sumnje na endokarditis. Rezultati kultivacije treba da su u korelaciji sa rezultatima hemokulture ili serologijom. Uzorci kosti kod sumnje na osteomijelitis, hemokultura moe pomoi dijagnozi. Biopsija sluznice eluca za ispitivanje na Helicobacter pylori. Biopsije rektalne sluznice za ispitivanje na parazite: Entameba hystolytica, Shistosoma mansoni i Shistosoma japonicum. Biopsije sluznice tankog crijeva za ispitivanje na prisustvo Giardia lamblia i mikrosporidija. Biopsije koe za ispitivanje na Mycobacterium spp. i parazita Onchocerca volvulus, Mansonella streptocerca i Leishmania spp. Bioptati plunog tkiva (perkutano, bronhoskopski,u toku operacija ili post mortem) kod sumnje na Legionella spp., Mycobacterium spp., gljivice, posebno
22
Aspergillus spp., Nocardia spp. i Pneumocystis jiroveci. Pneumocystis carini kod imunokompromitovanih. PCP moe da se dijagnostikuje manje invazivnim metodama, ali su metode manje osjetljive npr. indukovani sputum ili bronhoalveolarni lavati. Limfni vorovi kod limfadenitisa. Sumnja na Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-intracellulare, Bartonella henselae, Toxoplasma gondii, Chlamydia trachomatis. Dijagnoza se postavlja u kombinaciji sa histolokim i serolokim ispitivanjima.
23
Ispitivanje brisa iz unog kanala (bris uva) i sekreta iz srednjeg uva

Uzorkovanje
Bris uva uzima se tankim brisom koji se uvlai u uni kanal kroz
sterilan uni lijevak. Una koljka se povlai nagore i unazad kod odraslih, a kod djece dole i naprijed. Kod sumnje na otitis media bris se uzima jedino ako postoji supuracija t.j. perforacija bubne opne. U protivnom se moe uzeti nazofaringealni bris. Timpanocenteza se rijetko koristi. Materijal je najbolje uzeti prije uvoenja antibiotske terapije.
8.1
8.2
Transportovanje
8.3
Zasijavanje
Preporuka je da se primarna obrada uzoraka vri u komori za bezbjedan rad klase II.
8.3.1 8.3.2
Direktni preparat bojen po Gram-u za sekret iz srednjeg uva Kultivacija

selektivni okoladni agar za Haemophilus krvni agar endo agar (CLED agar) podloga za anaerobe sa neomycinom i 5 g diskom metronidazola
24
8.4
Inkubacija
okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 40-48 h,
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h podloga za anaerobe: anaerobno, 35 37 C, 40 48 h (do5 dana).
8.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Streptococcus haemolyticus gr. A, C, G Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Moraxella catarrhalis Pseudomonas spp. Haemophilus influenzae Enterobakterije Anaerobne bakterije (gram -) Candida spp. Aspergillus spp.
Vrlo rijetki uzronici:

Aloicoccus otitidis Korineformne vrste Scedosporium apiospermum.
Mogui kontaminenti iz spoljanjeg unog kanala:

Alfa hemolitine streptokoke Bacillus spp. Koagulaza negativni stafilokok Enterobakterije
8.6
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti: Izolovana fizioloka mikroflora spoljnjeg unog kanala.
25
Ispitivanje brisa oka u sluaju conjunctivitis-a i blepharitis-a

Uzorkovanje

odstraniti suvian sekret sterilnom gazom preostali sekret uzeti sterilnim brisom ukoliko nema sekreta bris se uzima sa unutranje strane donjeg kapka kod sumnje na hlamidijalnu ili virusnu infekciju oka, materijal se uzima skrepingom konjunktive (oftalmolog!!!) materijal sa ronjae uzima ljekar oftalmolog u specijalistikoj ambulanti posebno uzeti materijal iz desnog i lijevog oka
9.1
9.2
Transportovanje
9.3
9.3.1
Zasijavanje
i od kanalikularnog gnoja
u sluaju ozbiljnih infekcija oka, kod neonatusa sa ljepljivim oima na istim neupotrebljavanim staklima bojiti po Gram-u preparat se ne pravi kod blepharitis-a i conjunctivitis-a 9.3.2 Kultivacija
krvni agar (sa stafilokoknom crtom na razrijeenom dijelu) selektivni okoladni agar za Haemophilus endo agar
26
Dodatno: ako je u pitanju novoroene i na podlogu za izolaciju Neisseria gonorrhoeae (VCN okoladni agar)
9.4
Inkubacija
krvni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35- 37 C, 40-48 h
(svakodnevno itanje) selektivni okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37 C, 40-48 h (svakodnevno itanje) endo agar- aerobno, 35- 37C, 16- 24 h Dodatno: VCN okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37 C, 40-48 h (svakodnevno itanje)
9.5
Tumaenje nalaza
U sluaju conjunctivitis-a i blepharitis-a patogenima se smatraju:
Haemophilus influenzae hemolitini streptokok gr. A, B, C i G Moraxella spp. Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Clamydia trachomatis (obraeno u protokolu za virusoloke i seroloke procedure) Drugi mikroorganizmi
9.6
Izvjetavanje
27
10

Ispitivanje brisa oka u sluaju drugih infekcija oka

Canaliculitis Celulitis orbitae Dacriocystitis Dacrioadenitis Keratitis Endophtalmitis Hypopyon Infekcije poslije operacije ili traume
10.1
Uzorkovanje
Bris oka - uzorak ograniene vrijednosti Pravi uzorak - aspirat iz tkiva zahvaenog infekcijom
10.2
Transportovanje
to prije poslati do laboratorije (anaerobi!) Ako je brz transport nemogu: koristiti transportnu podlogu
10.3

Zasijavanje
krvni agar sa stafilokoknom crtom endo agar selektivni okoladni agar za Haemophilus podloga za anaerobne bakterije sa 5g diskom metronidazola
10.4
Inkubacija
krvni agar i okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 4048 h (svakodnevno itanje)
28
endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h podloga za anaerobne bakterije: anaerobno, 35-37C, 40-48 h (do 5
dana)
10.5
Tumaenje nalaza
U sluaju dubokih infekcija oka, u brisu oka ili aspiratu, patogenim se
smatraju sve naene bakterije.
29
11
11.1
Ispitivanje likvora
Uzorkovanje
Uzorak likvora se uzima pod najstroijim uslovima asepse Koa se prvo dezinfikuje alkoholom, a potom jodom i ostavi da se
osui i ponovo obrie alkoholom. Struno lice koje obavlja punkciju mora imati na rukama sterilne hirurke rukavice. Za bakterioloki pregled likvor se skuplja u sterilnu epruvetu u koliini 1-2 ml (za novoroenad moe i bilo koji manji volumen). Najbolje je zasijati likvor odmah kraj bolesnikog kreveta. lumbalnom punkcijom izmeu 3. i 4. lumbalnog prljena.
11.2
Transportovanje
ako je neophodan transport, on ne smije biti dui od 2 sata, pri tome
se epruveta sa likvorom dri stisnuta u ruci, a po potrebi se ruka sa epruvetom stavlja pod pazuh da bi se obezbjedila potrebna temperatura za preivljavanje bakterija; preporuuje se transportni termostat ukoliko likvor mora da saeka transport uva se u termostatu na 3537 C (nikako u friideru)
11.3
Zasijavanje
upotrebiti nova, nekoriena stakla, koja se dre u alkoholu, a prije
upotrebe isperu destilovanom vodom, osue i provuku kroz plamen. praviti dva preparata: jedan se boji po Gramu, a drugi metilenom za pravljenje preparata koristiti sediment sa dna epruvete nakon centrifugiranja (ne razvlaiti kap nanesenu na staklo) nakon suenja na vazduhu, preparate fiksirati prelivanjem 95-100% metil alkoholom koji se ostavi na preparatu 1 minut, odlije, a preparat se ponovo sui na vazduhu. Alternativa je brzo provlaenje preparata 3 puta kroz plamen (nakon toga kada se dodirne rukom poleina stakla treba da je blago zagrijana - ne vrua)
11.3.1 Direktan mikroskopski preparat
30
Kod sumnje na Cryptococcus neoformans, uzeti jednu kap likvora sa

dna epruvete i dodati jednu kap 50% indijskog tua i pokriti pokrovnim staklom. Likvor centrifugirati 5 minuta na 3000 obrtaja/min. Supernatant odliti sterilnom Pasterovom pipetom u drugu sterilnu epruvetu, a sediment lagano izmjeati na vorteks aparatu ili vrtei epruvetu u ruci i koristiti za pravljenje preparata i zasijavanje (po jedna kap sedimenta na dva predmetna stakla za preparat i po jedna kap za zasijavanje podloga).
11.3.2 Kultivacija modanosrani infuzioni krvni agar sa stafilokoknom crtom obogaeni okoladni agar teni Muller-Hinton sa X i V faktorima rasta ili modano-srani
infuzioni bujon sa X i V faktorima rasta - presijava se nakon inkubacije na modano-srani infuzioni krvni agar sa stafilokoknom crtom i obogaeni okoladni agar Prije zasijavanja likvor i podloge se dre u termostatu na 37 C pola sata. Zasijavanje se obavlja tako to se sterilnom pipetom ili ezom sa dna epruvete uzme po jedna kap taloga i nanese na svaku od podloga. Podloge staviti u termostat da se kap osui, a potom razvui materijal ezom po podlozi.
11.4
Inkubacija
sve zasijane podloge: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37 C, 40-48h
11.5
Tumaenje nalaza
patogenim se smatraju sve naene bakterije Za detekciju solubilnih antigena u likvoru bakterija koje su najei uzronici meningitisa (Neisseria meningitidis A, B, C, Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae) radi se komercijalni lateks aglutinacioni test. Test se izvodi prema uputstvu proizvoaa, a koristi se u sljedeim sluajevima: kod pacijenata sa imunodeficijencijom kod kojih leukociti mogu nedostajati u likvoru, uprkos postojanju infekcije pacijenti tretirani antibioticima prije nego je uzet likvor na ispitivanje
31
U izvjetaju sa negativnim rezultatom staviti napomenu: Postoji mogunost lano negativnog rezultata.
11.6
Izvjetavanje
U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su sterilne
32
12
Ispitivanje krvi (hemokultura)
12.1
Uzorkovanje
krv se uzima iz kubitalne vene pod uslovima najstroe asepse (kod
odojadi i male djece iz temporalne vene) prije venepunkcije kou dezinfikovati alkoholom, pa jodom koji se ostavi da se osui, pa ponovo obrie alkoholom venepunkciju obavezno obavljati koristei sterilne rukavice uzima se 10-30 ml za odrasle, 1-5 ml za djecu (prema tjelesnoj masi) Idealno je uzimanje uzorka krvi 30 minuta pred oekivani skok temperature to esto nije mogue primijeniti zbog nepredvidljivih skokova temperature. Zavisno od razliitih uslova i situacija treba se pridravati sljedeih preporuka: u akutnim febrilnim bolestima kao to su meningitis ili bakterijska pneumonija, gdje moe biti neophodno odmah ukljuiti empirijsku antibiotsku terapiju, ili ako se radi o pacijentima sa infekcijama kao to su osteomijelitis ili supurativni artritis koji su bili podvrgnuti hitnoj hirurkoj intervenciji, uzimaju se dva odvojena uzorka iz dvije ruke, istovremeno, tj. neposredno jedan za drugim. ako je nepoznat uzrok febriciranju, uzimaju se dva uzorka krvi u razmaku od 45 do 60 minuta. Na ovaj nain se moe pokuati razluiti da li postoji kontinuirano ili povremeno rasijavanje mikroorganizama u krvotok. Nova dva uzorka krvi na isti nain mogu biti uzeta nakon 24 do 48 h poslije prvog uzorkovanja, ukoliko se za tim ukae potreba. u sluajevima akutnog infektivnog endokarditisa, uzimaju se tri uzorka iz tri odvojene venepunkcije u prvih 1 do 2 sata od postavljanja dijagnoze, a potom se zapoinje terapija. Kod sumnje na subakutni bakterijski endokarditis prvog dana se uzimaju tri odvojena uzorka krvi sa razmakom od najmanje 30 minuta. Ukoliko se dobije negativan nalaz, uzimaju se dva nova uzorka narednih dana. Kada su rezultati hemokultura negativni, uprkos postojanju jasnih klinikih znakova i simptoma bolesti, kliniar treba da mikrobiologu na to skrene panju, kako bi se u ispitivanju naredne hemokulture primjenile obogaene podloge. Uobiajena je praksa da se pri svakoj venepunkciji uzme krvi dovoljno za dvije hemokulture: jednu koja e se inkubirati aerobno i drugu koja e se
33
inkubirati anaerobno. Preporuka je za odrasle da minimalni volumen po jednoj hemokulturi bude 10 ml krvi.
12.2
Transportovanje
krv zasijati uz postelju bolesnika, a ako je to nemogue, dodati u
epruvetu sa krvlju sterilan antikoagulans odmah po uzimanju i transportovati bez odlaganja zasijane podloge drati u termostatu do transporta (nikako u frideru)
12.3
Zasijavanje
Krv za hemokulture se dodaje podlozi u razmjeri 1:5 ili 1:10 kako bi se razblaili postojei antibiotici i druge antibakterijske supstance u uzorku. Koristiti komercijalne gotove podloge za hemokulture. Mogue je korienje i podloge za automatizovane sisteme za ispitivanje hemokultura uz odgovarajuu aparaturu i prema uputstvu proizvoaa.
12.4
Supkultivacija
Pozitivnost hemokulture registrovati prema uputstvu proizvoaa gotove komercijalne podloge. Pozitivnu hemokulturu presijati na: Krvni agar sa stafilokoknom crtom Podloga za anaerobe sa diskom 5 g metronidazola (na ovu podlogu presijava se pozitivna boica za anaerobnu hemokulturu)
12.5
Inkubacija
Krvni agar sa stafilokoknom crtom: u uslovima sa 5-10% CO2, 35 Podloga za anaerobe: anaerobno, 35-37C, 40-48 h (do 5 dana)
37C, 40-48h (svakodnevno itanje)
12.6
Tumaenje nalaza
Izvjetava se bilo koji izolovani organizam uz komentar o klinikom
znaaju kada postoji sumnja Sumnja u kliniki znaaj izolata postoji kada su izolovani razliiti mikroorganizmi u parnom uzorku hemokulture, ili ako je jedan uzorak iz para sterilan u takvim sluajevima se u napomeni sugerie kliniarima da ponove analizu
34
Kad se iz jedne hemokulture izoluju 2 ili vie bakterijskih vrsta koje

su mikroflora koe, preporuuje se ponavljanje analize uz naznaku da je hemokultura kontaminirana
12.7
Izvjetavanje
U sluaju negativnog rezultata, izvjestiti: Zasijane podloge ostale su sterilne nakon ... dana inkubacije.
35
13
Ispitivanje intravaskularne kanile i slinih uzoraka
13.1
Uzorkovanje
vrh kanile: dezinfikovati kou oko mjesta insercije kanile, odstraniti
kanilu na aseptian nain, i odsjei sterilnim makazama vrh kanile duine 4 cm u sterilnu posudu (ovaj uzorak daje validne informacije, ali zahtijeva uklanjanje kanile to moe ponekad dovesti do gubljenja prilaza veni) brisevi-mogu se koristiti brisevi sa mjesta insercije kao alternativni uzorci, ali rutinsko ispitivanje kod asimptomatskih pacijenata moe imati sumnjivu vrijednost. Korisno je jedino kad postoji kliniki dokazana lokalna infekcija. Bris koe oko CVK ili vora (HUB) kanile moe se koristiti za prognoziranje infekcije na mjestu insercije kanile.
13.2
Transportovanje
to je prije mogue (najdue za dva asa). Ako je brz transport nemogu za briseve: koristiti transportnu podlogu, ili na dno epruvete ukapati jednu do dvije kapi sterilnog fiziolokog rastvora, a bris sa materijalom potisnuti do dna da apsorbuje ukapanu tenost. Na ovaj nain transport moe biti odloen i za nekoliko sati, jer je sprijeeno isuivanje bakterija na ta su one najosjetljivije. Ovako pripremljen materijal se uva na sobnoj temperaturi.
13.3
Zasijavanje
Tehnike koje se koriste za dijagnozu lokalne ili sistemske infekcije povezane sa kanilom ukljuuju: semikvantitativnu i kvantitativnu kultivaciju segmenata kanile bujon kultivacija segmenata kanile, posebno vrha
36
bojenje kanile kultura krvi aspirirana kroz i.v. kanilu kultura vora (eng. hub) kanile kultura mjesta insercije kanile ultarsonikacija kanile
13.3.1 Semikvantitativna metoda Krvni agar

Kultura spoljne povrine kanile primjenjuje se za predvianje koji kateteri su zaista inficirani i mogu da uzrokuju infekciju krvi. Krajnih 4 cm segmenta kanile (uzetih pod strogo aseptinim uslovima) kotrlja se preko itave povrine agar ploe 5 puta i broje se izrasle kolonije. Cut off preko 15 kolonija bilo kog organizma je najee prihvatljiv za prognoziranje pojave sepse uzrokovane kanilom. (Meutim, u praksi ovaj cut off moe biti suvie nizak ako se ne primjenjuju stroge mjere opreza pri uklanjanju kanile, gdje cut off vei od 100 kolonija moe biti vie odgovarajui).
13.3.2 Kvantitativna metoda

Ova metoda daje informacije i o unutranjoj i o spoljanjoj povrini kanile. Cut off od 1000 cfu/ml se koristi kao indikator sepse. Ova metoda je veoma zahtjevna i ne preporuuje se njena rutinska primjena u ovom SOP-u. Ove metode su podjednako efikasne u predvianju odsustva infekcije.
13.3.3 Obogaena metoda

Krajnji segment kanile se stavlja u obogaeni bujon. Ova metoda ne razlikuje kolonizaciju, infekciju ili kontaminaciju kanile i ne proporuuje se u ovom protokolu.
13.3.4 Metoda endoluminal brush

Smatra se preciznom metodom za detektovanje sepse povezane sa kateterom bez potrebe uklanjanja katetera.
13.3.5 Brza dijaganostika metoda

Bojenje kanile (ili uzimanje otiska kanile) po Gramu ili sa Acridine orange.
37
13.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h
13.5
Tumaenje nalaza (za semikvantitativnu metodu)

Mikroorganizmi koji se najee izoluju:
Koagulaza negativni stafilokoki Staphylococcus aureus ukljuujui MRSA Enterobacteriaceae Pseudomonas Enterococcocus Corynebacterium spp. Streptococcus Bacillus spp. Mogu se izolovati i gljivice: Candida albicans i dr. kvasnice, Aspergillus spp., Fusarium spp.
13.6
Izvjetavanje
Izvjestiti broj CFU izolovanog mikroorganizma uz napomenu: npr.
porast 15 CFU moe biti povezan sa sistemskom infekcijom u vezi sa kanilom ili moe biti povrinska kolonizacija ili kontaminacija treba uzeti u obzir rezultat hemokulture.
13.6.1 Kanila
13.6.2 Brisevi Izvjestiti kakav je intenzitet porasta (masovan, umjeren ili oskudan)
uz napomenu koja e uzeti u obzir da li postoji ili ne lokalna infekcija.
38
14
Ispitivanje fecesa (koprokultura)
14.1
Uzorkovanje
Feces se uzima neposredno poslije defekacije. Pacijenta savjetovati
da defekaciju obavi u nonu posudu, opranu deterdentom i dobro ispranu (ne mora biti sterilna). Iz none posude prebaciti u kontejner sa poklopcem, 1-2 g fecesa (veliina ljenika), pri emu treba birati sluzave, gnojave i krvave djelove, ako ih ima. Kod odojadi feces se uzima sa pelene na isti nain kao kod odraslih. Rektalni bris treba uzimati samo u izuzetnim sluajevima, tj. kada je nemogue dobiti feces. Dobra praksa davanje pisanog uputstva pacijentima.
14.2
Transportovanje
Transport do laboratorije treba obaviti u roku od 2 sata, a u protivnom
uzorak se konzervie puferisanim glicerolom (pomijeati jednake dijelove 0,033 M natrijum ili kalijum fosfatnog pufera i glicerola). U sluaju negativnog nalaza analizu treba ponoviti jo 2 puta, da bi se mogao iskljuiti eventualni patogen.
14.3

Zasijavanje
2 SS agara (Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica) selenit F bujon (Salmonella, Shigella) sorbitol agar (EPEC O:157 H:7) selektivna podloga za kampilobakter
14.4
Inkubacija
SS agar: aerobno, 35 - 37 C, 16-24 h SS agar: aerobno, sobna temperatura, 16-24 h
39
Selenit F bujon: aerobno, 35 - 37C, 8-12 h, a potom presijati na SS

agar koji se inkubira aerobno, 35 - 37C, 16-24 h sorbitol agar: aerobno, 35 - 37C, 16-24 h selektivna podloga za kampilobakter: mikroaerofilni uslovi, 42-43C, 40-48 h.
14.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Salmonella spp. Campylobacter spp. Shigella spp. Yersinia enterocolitica Escherichia coli O:157; H:7 Clostridium difficile (ispituje se po posebnom protokolu) Vibrio cholerae (vidi protokol 13.1)
14.6
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti: Kulturom nisu izolovane Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Escherichia coli O:157; H:7, Yersinia enterocolitica.
15
Koprokultura za izolaciju Vibrio cholerae
Ne radi se u rutinskoj dijagnostici ve prema epidemiolokim indikacijama!
15.1
Zasijavanje
alkalna peptonska voda (APV) TCBS
40
15.2
Inkubacija
APV: aerobno, 35-37C, 8 h, nakon ega presijati APV na TCBS TCBS: aerobno, 35-37C, 16-24 h
15.3
Izvjetavanje
Vibrio cholerae nije naen. Vibrio cholerae je naen.
41
16
Ispitivanje urina (urinokultura)
16.1
Uzorkovanje
Optimalno vrijeme je prije primjene antimikrobne terapije.
16.1.1 Metodi uzimanja: srednji mlaz urina (MSU) preporueni metod za rutinsku praksu.
Nakon pranja anogenitalne regije sa dosta vode (bez upotrebe dezinficijensa), prvi dio istog urina se odbaci i bez prekidanja mlaza, oko 10 ml se sakupi u sterilnu posudu. Ako se koristi borna kisjelina posuda se puni do oznake i sadraj dobro promuka clean - catch urin (CCU) dobra alternativa MSU. Preporuuje se potpuno pranje periuretralnog predjela. Cijeli uzorak se sakuplja u sterilnu posudu i alje na ispitivanje suprapubini aspirat (SPA) urin se uzima aseptino, direktno iz beike, aspiriranjem iglom i pricem urin iz katetera (CSU) moe se dobiti jednom kateterizacijom / in and out/, ili iz stalnog katetera urin iz kese sterilna kesa se privrsti preko svjee opranih i osuenih genitalija, a sakupljeni urin se prenosi u sterilnu posudu sa poklopcem filter papir poslije detaljnog pranja genitalija i okolne koe, filter papir se stavlja u pelenu. im se ovlai, vrhom prica se izvue urin i prebaci u sterilnu posudu urin iz urostome dobija se preko sterilnog katetera koji aseptino ulazi kroz urostomu urin uzet cistoskopijom urin iz uretera uzet u toku cistoskopije pomou ureternog katetera uzorci za dijagnozu prostatitisa su sljedei: prvih 5 - 8 ml urina (uretralni urin) srednji mlaz urina (iz beike) sekret prostate poslije masae prostate prvih 2 - 3ml urina poslije masae prostate
42
urin za Salmonella typhi i Salmonella paratyphi - uzima se bilo koji

urin suspektnih sluajeva ili kontakta rani jutarnji urin (EMU) - tri cijela, prvoizluena prva jutarnja urina su potrebna za kultivisanje Mycobacterium tuberculosis
16.2
Koliina uzorka
najmanje 1 ml uzorka u sterilnu posudu sa poklopcem napuniti do linije oznaene na posudi sa bornom kisjelinom
16.3
Transportovanje
Vrijeme izmeu uzimanja i obrade uzorka: do 4 h - ako je mogue do 48 h - propadanje uzorka se izbjegava hlaenjem do 96 h - uzorak se uzima u sterilan, zatvoren kontejner sa 1-2% bornom kisjelinom
16.4
Zasijavanje
Preporuene podloge i vrijeme inkubacije dati su u tabeli br.5 Runi metod - kalibrisanom ezom, zasijavanje povrinskim linijama. paljivo promukati urin da se izbjegne pjenuanje uroniti kraj sterilne, kalibrisane eze (1l, 2l, 10l) u urin odmah ispod povrine i izvui vertikalno vodei rauna da ne bude urina van ome inokulisati podlogu i razvui, najvie 2 uzorka na ploi prenika 9 cm, ezom od 10 l Broj bakterija u 1 ml urina (cfu, engl. colonies forming units) se odreuje prema tabeli br.3 TABELA 3. Vodi za odreivanje broja bakterija u 1 ml urina runim metodom / kalibrisanom ezom / i multipoint metodom /
cfu/ml 1000 10 000 100 000 0.3 l 3 30 Broj cfu koristei inokulum od 1 l 2 l 10 100 20 200 5 l 5 50 500 10 l 10 100 1000
43
Filter papir metod ovaj metod je senzitivan za ispitivanje urina sa vie od 10 000 cfu/ml uroniti komercijalno pripremljen sterilan filter papir u urin do oznake odstraniti suvini urin prevlaenjem ivice filter papira uz stranu posude sa urinom i pustiti da se preostali urin apsorbuje u papir prije inokulacije podloge pritisnuti papir na agar nekoliko sekundi Broj bakterija u 1 ml urina se odreuje prema tabeli br.4.
TABELA 4. Vodi za odreivanje broja bakterija u 1 ml urina filter papir metodom
Broj poraslih kolonija Bacili 05 5 - 25 25 Koke 08 8 30 30 Odgovarajui cfu/ml 10 000 10 000 100 000 100 000
Multipoint metod - SPA, drugi hirurki uzeti urini i urini u kojima se oekuje manje od 100 cfu/ml inokulisati 100 l (0.1 ml) uzorka aseptino na cijelu Endo agar (CLED agar) plou za izolaciju pojedinanih kolonija, razvui inokulum sterilnom ezom ili tapiem po cijeloj povrini ploe cfu/ml = broj poraslih kolonija x10 Broj bakterija u 1 ml urina se odreuje prema tabeli br.3
16.5
Posebne situacije
Sumnja na crijevne groznice paljivo dodati jednaku koliinu (5 - 10 ml) necentrifugiranog urina u
5 - 10 ml dvostruke koncentracije manitol selenita.
Odreivanje antimikrobnih supstanci plou sa Bacillus subtilis, Escherichia coli ili Staphylococcus aureus
inokulisati ispitivanim urinom (Bacillus subtilis je pogodniji zbog svoje osjetljivosti na iri spektar antibiotika. Ovu plou zasijati poslednju, da se izbjegne zagaenje Bacillus subtilis-om)
44
16.6
Inkubacija
TABELA 5. Podloga, uslovi i oekivani organizmi

Kliniki detalji Standardna podloga Inkubacija C atmos. Vrijeme itanje Oekivani organizam Enterobacteriaceae Enterococci Lancfield Group B. streptokoka Pseudomonas Staphylococcus saprophyticus Druge koagulaza neg. staf Staphylococcus aureus
IUT
CLED agar /endo agar / krvni agar
35-37
aerobno
1624 h
16 h
Crijevne groznice
Dvostruka konc. manitol selenit bujona subkultura na SS
35-37
aerobno
1624
16 Salmonella typhi Salmonella paratyphi
35-37
aerobno
1624
16
Za situacije:
Susp. gljivina infekcija Ispitivanje prisustva antimikrobnih supstanci Sabouraud agar MH agar sa Bacillus subtilis (vie uzoraka na jednoj ploi) Podloga za anaerobe 35-37 aerobno 40-48 40 Gljivice
35-37
aerobno
16-24
16
Antimikrobne supstance
Sterilna piuria Nema antimikr. sredstava
35-37
aerobno
40-48
40
Anaerobi
okoladni agar
35-37
510 % CO2
40-48
40
Osjetljivi organizmi
45
16.7
Tumaenje nalaza
Tumaenje nalaza dato je u tabeli br.6.

TABELA 6. Tumaenje nalaza urinokulture
Porast cfu/ml Broj izolovanih vrsta mikroorganizama Tip uzorka Kliniki detalji Tumaenje rezultata
Potreban test osjetljivosti
Sugestije Ponoviti ako je uzorak star ili nema piurije. Ako je iz kese predloiti SPA, CCU. Ponoviti zbog potvrde Razmotriti ako pacijent ima stalni kateter ili zahtijeva terapiju Ponoviti ako je uzorak star ili nema piurije Ako je iz kese predloiti SPA, CCU Ponoviti ako ima simptome Ponoviti zbog potvrde
Svi
Nema
Vjerovatna IUT
Da
2 >100.000
Bilo koji organizam u broju 100.000 ili >10.000
MSU, CCU, SCU, BAG,
Le Simptomi
- Mogua IUT - kolonizacija ako je loe uzimanje ili transport
Da
CSU
Stalni kateter Neuroloka beika
Vjerovatna kolonizacija
Ne - uvati plou 5 dana ako pacijent postane septian
2 ili 3
1 organizam predominira u broju >100.000 ili >10.000
Svi
Nema
Mogua IUT
Da, predominantan organizam
Mijeani rast nema dominantnog soja
Svi
Nema
Nepravilno uzimanje ili transport Vjerovatno IUT Vjerovatno IUT predominantnom vrstom Drugi izolat vjerovatno kontamin-acija
Ne
Svi
Le Simptomi
Da
10.000 100.000 2
1 predominantan u 10.000
Svi
Le Simptomi Djeca
Da, predominantni organizam
Ponoviti ili SPA / CCU
46
Porast cfu/ml Broj izolovanih vrsta mikroorganizama 1 u <10.000 ili u 10.000100.000 ali ne dominira Tip uzorka Kliniki detalji Tumaenje rezultata
Potreban test osjetljivosti
Sugestije Mijeana kultura, vjerovatno kontaminacija Mijeana kultura ponoviti ako ima simptome Razmotriti ako je potrebna terapija
Nema
Vjerovatna kontamin-acija
Ne
1 predominira u 10.000 3 Sve kombinacije
Svi
Le Simptomi
Vjerovatno IUT dominantnim sojem
Ne uvati ploe do 5 dana
Kateter
Stalni kateter Neuroloka beika
Kolonizacija
Ne uvati ploe do 5 dana
1 1.000 10.000 2
MSU, CCU, CSU, IL Svaka vrsta 1000 ukljucujuci E. coli ili S. saproph
Svi
ene sa simptomima Prostatitis Le
Vjerovatna IUT potrebna klinika ispitivanja Vjerovatna IUT potrebna klinika ispitivanja Vjerovatno IUT Vjerovatno IUT Vjerovatno IUT
Da
Ponoviti da se potvrdi
Da
Ponoviti da se potvrdi
1 Svaki organizam 100 1 organizam 1000 SPA, CYS, SCU
Nema
Da
100 10.000
Le
Da Da, predominantan organizam Mijeani rast, ponoviti
Le Nema ili je pacijent asimptomatian Svi Simptomatski perzistentna piurija
Nema IUT Pacijent na antibioticima ? Mogua Chlamydia Osjetljivi organizmi
Nema porasta
< 1000 ezom od 1 l < 100 ezom od 10 l
Preporuiti dalje ispitivanje
MSU Srednji mlaz, CCU clean catch, BAG urin iz kese, SPA suprapubicni aspirat, CSU kateter, SCU jedna kateterizacija CYS cistoskopski urin, Le leukociti, IUT infekcija urinarnog trakta
47
17
17.1
Ispitivanje vaginalnog brisa

Uzorkovanje
Uz pomo spekuluma brisom se uzima sekret zadnjeg forniksa
vagine.
17.2
Transportovanje
17.3
Zasijavanje
dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko
od dodatnih bojenja, po potrebi izvjestiti o postojanju blastospora, leukocita i eventualnom prisustvu intracelularnih Gram - diplokoka izvjestiti opisno uoene mikroorganizme izvjestiti o postojanju clue elija izvjestiti da li mikroskopski preparat sugerie bakterijsku vaginozu (BV) na osnovu jedne od dvije eme:
BROJ GARDNERELLA * PO VIDNOM POLJU BROJ MOBILUNCUS PO VIDNOM POLJU
ema po Nugentovim kriterijumima:

BROJ LAKTOBACILA PO VIDNOM POLJU REZULTAT REZULTAT REZULTAT
> 30 5 30 24 1 Nijedan
0 1 2 3 4
> 30 5 30 24 1 Nijedna
4 3 2 1 0
> 30 5 30 24 1 Nijedan
4 3 2 1 0
48
Zbir sva 3 rezultat 0 3 Zbir sva 3 rezultat 4 6 Zbir sva 3 rezultat 6 10 fizioloka mikroflora djelimino izmjenjena mikroflora: ukazuje na moguu BV; na osnovu klinikih kriterijuma ponovo poslati na analizu radi potvrde BV izmjenjena mikroflora: indikovana bakterijska vaginoza
Lactobacillus - veliki gram pozitivni bacili *Gardnerella vaginalis - mali gram labilni bacili Mobiluncus - savijeni gram negativni ili gram labilni bacili clue elije su epitelijalne elije prekrivene Gram varijabilnim kokobacilima i bacilima (slika br.1)
SLIKA 1. Preparat bojen po Gram-u: clue elija (Izvor: http://pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplines/sti/biotechn/frottisvaginal.htm) ema po Hejsovim kriterijumima:
I stepen Fizioloka mikroflora Djelimino izmijenjena mikroflora Izmjenjena mikroflora preovladava Lactobacillus (Gram pozitivni tapii) mijeani laktobacili sa drugim morfotipovima bakterija; na osnovu klinikih kriterijuma ponovo poslati na analizu radi potvrde BV malobrojni ili potuno odsutni laktobacili, ali veliki broj Gram labilnih kokobacila tipa Gardnerella vaginalis i drugih morfotipova bakterija; ukazuje na BV
II stepen
III stepen
49
17.3.2 Kultivacija krvni agar endo agar
17.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35 - 37C, 16-24 h endo agar: aerobno, 35 - 37C, 16-24 h
17.5
Tumaenje nalaza
Fizioloka mikroflora: Lactobacillus ne referie se Oportunistika flora:
Gardnerella vaginalis kultivie se po potrebi, samo kod trudnica Streptococcus agalactiae Anaerobne gram negativne bakterije ne kultiviu se rutinski Candida spp. Staphylococcus aureus Enterococcus spp. Enterobakterije Mogui patogeni: Trichomonas vaginalis ispitivanje posebno opisano u ovom poglavlju Candida spp. Neisseria gonorrhoeae Streptococcus haemolyticus grupa A, C i G
17.6
Izvjetavanje
50
18
Ispitivanje cervikalnog brisa
18.1
Uzorkovanje
Cervikalni bris se uzima iz endocervikalnog kanala nakon uklanjanja
sluzi sa povrine grlia materice tupferom ili veim brisom. Vrh manjeg dakronskog brisa se uvue nekoliko milimetara u cervikalni kanal, zarotira kako bi se dobile cervikalne elije i eksudat i paljivo izvue van, vodei rauna da se pri tome ne dodirnu zidovi vagine Ukoliko se istovremeno ispituje na prisustvo mikoplazmi i hlamidija redosljed je sljedei: Prvi bris za kulturelno ispitivanje bakterija (osim mikoplazmi i hlamidija) Drugi bris za kulturelno ispitivanje mikoplazmi Trei bris za ispitivanje prisustva hlamidijalnih antigena (DIF ili ELISA)
18.2
Transportovanje
Ukoliko se ne zasijava odmah, transportuje se u transportnoj podlozi.
18.3
Zasijavanje
dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko izvjestiti o postojanju blastospora, leukocita i eventualnom prisustvu
intraceularnih Gram - diplokoka izvjestiti opisno uoene mikroorganizme od dodatnih bojenja, po potrebi
18.3.2 Kultivacija krvni agar endo agar VCN okoladni agar
51
18.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h VCN okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 40-72 h
18.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Neiserria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis (obraeno u protokolu za virusoloke i seroloke analize) Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Streptococcus haemolyticus Druge streptokoke Enterococcus spp. Enterobakterije Haemophilus spp. Listeria spp. Pseudomonas spp. Staphylococcus aureus Gljivice.
Drugi mikroorganizmi koji mogu biti znaajni:
Mogui patogeni kod ena sa puerperalnom sepsom, sepsom poslije

abortusa, kod pelvine upalne bolesti i kod trudnica. Staphylococcus aureus Streptococcus haemolyticus Enterococcus spp. Enterobakterije Anaerobne Gram negativne bakterije Clostridium spp. Listeria monocytogenes
18.6
Izvjetavanje
Ukoliko nije uoen porast mikroorganizama izvjestiti: Zasijane podloge ostale su sterilne.
52
19
Ispitivanje uretralnog brisa
19.1
Uzorkovanje
Pacijentu se savjetuje da najmanje 2 h prije uzimanja uretralnog brisa
ne urinira. Kod sumnje na gonoreju, moe biti od koristi uzimanje uzorka prije prvog jutarnjeg uriniranja. Ukoliko postoji spontana sekrecija, uzima se kap sekreta pomou brisa. Ako nema vidljive sekrecije, treba obrisati okolinu uretralnog otvora brisom natopljenim sterilnim fiziolokim rastvorom, a potom malim urogenitalnim dakronskim brisom ui u uretralni kanal 2-4 cm i ostaviti ga par sekundi kako bi se natopio eksudatom. Kod sumnje na hlamidijalnu infekciju sterilan bris se uvlai u uretru 2-4 cm i rotira 10-tak sekundi kako bi se dobilo to vie epitelnih elija iz uretralnog kanala. Ukoliko se istovremeno ispituje na prisustvo mikoplazmi i hlamidija redosljed je sljedei: Prvi bris za kulturelno ispitivanje bakterija (osim mikoplazmi i hlamidija) Drugi bris za kulturelno ispitivanje mikoplazmi Trei bris za ispitivanje prisustva hlamidijalnih antigena (DIF ili ELISA) obraeno u protokolu za virusoloke i seroloke analize
19.2
Transportovanje
Ukoliko se ne zasijava odmah, bris se transportuje u transportnoj
podlozi
19.3
Zasijavanje
dva mikroskopska preparata jedan bojen po Gram-u; drugi za neko
od dodatnih bojenja, po potrebi
53
izvjestiti o postojanju blastospora, leukocita i eventualnom prisustvu

intraleukocitarnih Gram - diplokoka izvjestiti opisno uoene mikroorganizme
19.3.2 Kultivacija krvni agar endo agar VCN okoladni agar
19.4
Inkubacija
krvni agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h endo agar: aerobno, 35-37C, 16-24 h VCN okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 40-72 h
19.5
Tumaenje nalaza
Mogui patogeni:
Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis obraeno u protokolu za virusoloke i seroloke analize Streptococcus pyogenes Trichomonas vaginalis Ureaplasma urealyticum Mycoplasma hominis Drugi mikroorganizmi koji mogu biti znaajni: Streptococcus haemolyticus Druge streptokoke Enterococcus spp. Enterobakterije Haemophilus spp. Listeria spp. Pseudomonas spp. Staphylococcus aureus, gljivice.
19.6
Izvjetavanje
U sluaju da nisu izolovani kliniki znaajni mikroorganizmi, izvjestiti: Izolovana samo fizioloka mikroflora.
54
20
Ispitivanje prisustva genitalnih mikoplazmi
20.1
Uzorkovanje
Moe se koristiti vaginalni, cervikalni ili uretralni bris
20.2
Zasijavanje
Gotove komercijalne podloge za izolaciju mikoplazmi transport,
inkubacija i tumaenje rezultata prema uputstvu proizvoaa
55
21
21.1
Identifikacija Staphylococcus spp.

Uvod
Rod Staphylococcus obuhvata vie od 30 vrsta, a stafilokoki koji su
najee povezani sa infekcijama kod ovjeka su: Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus species koje mogu izazvati infekcije kod ljudi: Staphylococcus capitis Staphylococcus hominis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus saccharolyticus Staphylococcus warneri Staphylococcus caprae Staphylococcus hyicus Staphylococcus intermedius Staphylococcus schleiferi Staphylococcus simulans Druge vrste bliske ovom rodu koje mogu izazvati infekcije kod ovjeka: Micrococcus luteus Rothia mucilaginosus (ranije Micrococcus mucilaginosus)
21.2
Izolacija
21.3
Identifikacija
21.3.1 Kulturelne osobine

Kolonije su okrugle, glatke, sjajne povrine, ravnih ivica, blago konveksne, pigmentisane, bijele ili krem boje, ponekad ute pa i narandaste, promjera 1-2 mm, mogu pokazivati hemolizu. Ezom se razmazuju po podlozi (kao maslac).
56
21.3.2 Mikroskopske osobine u preparatu sa kulture

Gram-pozitivne koke pojedinano, u parovima, tetradama i grozdovima (slika br.2).
SLIKA 2. Staphylococcus aureus bojenje po Gram-u

Izvor: http://www.geocities.com/capecana veral/3504/gallery.htm from Neal Chamberlain: Photo Gallery of Bacterial Pathogens
21.3.3 Ispitivanje fizioloko-biohemijskih osobina

Modifikovani oksidaza test Test se izvodi sa 6% rastvorom tetra-metil-fenilen-diamina u dimetil sulfoksidu i diferencira stafilokoke (oksidaza negativne) od mikrokoka (oksidaza pozitivni). Katalaza test Stafilokoki su katalaza pozitivni, a streptokoke katalaza negativne. Test se izvodi sa odabranim bakterijskim kolonijama poraslim na vrstoj podlozi. Ne treba raditi sa kolonijama poraslim na podlogama koje sadre intaktne eritrocite (krvni agar). Kolonije sa okoladnog agara mogu se upotrebiti za testiranje. Reagens je 3-5% hidrogen peroksid. On je nestabilan i treba ga uvati u friideru. Izbjegavati svako nepotrebno izlaganje svjetlosti. Izvoenje: staviti jednu kap hidrogen peroksida na predmetno staklo mali dio suspektne kolonije nanijeti na centar pokrovnog stakalceta obrnuti pokrovno stakalce i staviti na kap hidrogen peroksida na ploici posmatrati stvaranje mjehuria unutar 10 sek. Koristiti lupu ako je potrebno za gledanje vrlo slabe produkcije katalaze.
57
Koagulaza test Vrste roda Staphylococcus se diferenciraju prema sposobnosti da koaguliu plazmu pomou enzima koagulaze. Staphylococcus aureus je koagulaza pozitivan. Vezana koagulaza se odreuje testom na ploici, a slobodna testom u epruveti. Reagensi i oprema: test rastvor komercijalna plazma (sa EDTA) za test na ploici, odnosno za test u epruveti, bakterioloka oma i Pasterove pipete. Pozitivna kontrola: Staphylococcus aureus NCTC 6751 Negativna kontrola: Staphylococcus epidermidis NCTC 4276 Izvoenje koagulaza testa na ploici: Staviti kap destilovane vode na ploicu. Napraviti suspenziju ispitivanog soja da bude homogena i gusta. (Lano negativna reakcija se moe dobiti ako suspenzija nije dovoljno gusta. Pogledati da nema autoaglutinacije. Sojevi koji pokazuju autoaglutinaciju moraju biti testirani drugim metodama.) Uzeti ezom plazmu i izmijeati je lagano sa homogenom suspenzijom. Pozitivan rezultat vidljivo stvaranje grudvica unutar 10 sek. Negativan rezultat nema vidljivog stvaranja grudvica. Postoje komercijalni kitovi koji sadre npr. lateks estice senzibilisane sa IgG (monoklonsko anti-Staph. aureus antitijelo) i eritrocite obloene humanim fibrinogenom. Staphylococcus aureus u ovoj suspenziji se proteinom A vezuje za Fc fragment IgG na povrini lateks estica, a clumping faktorom reaguje sa fibrinogenom na povrini eritrocita. Ovo dovodi do pojave grudvica, odnosno aglutinacije. Test je zbog navedenog osjetljiviji od klasinog koagulaza testa na ploici. Izvoenje koagulaza testa u epruveti: Staviti u epruvetu oko 1 ml komercijalne plazme pogodne za ovaj test. Suspendovati ispitivanu koloniju u plazmi. Inkubirati na 35-37C i oitavati nakon 4 h. Uoiti koagulum koji zahvata itav sadraj epruvete ili formira slobodnu opnu fibrina. Ako je negativan, inkubirati preko noi na 2225C. Pozitivan rezultat: stvaranje koaguluma unutar 4h na 37C ili nakon inkubacije preko noi na 22-25C. Negativan rezultat: nema koaguluma nakon 4h odnosno 24h. Kod negativnog koagulaza testa na ploici obavezno uraditi test u epruveti!
58
Novobiocin test Koristi se u diferenciranju Staphylococcus saprophyticus (novobiocin rezistentan) od ostalih koagulaza negativnih stafilokoka (novobiocin senzitivni). Komercijalni testovi za biohemijsko ispitivanje stafilokoka Identifikacija koagulaza negativnih stafilokoka pomou ovih kitova vri se samo ako je to kliniki indikovano. Izolovani soj se moe poslati u referentnu laboratoriju zasijan na krvni agar ili kosi hranljivi agar.
SHEMA 1. Redosljed postupaka u identifikaciji Staphylococcus spp.
59
22

Identifikacija Streptococcus spp. i Enterococcus spp.

Uvod
22.1
Rod Streptococcus obuhvata heterogenu grupu Gram pozitivnih, katalaza negativnih koka koje su odgovorne za brojne infekcije kod ovjeka, a takoe su i dio fizioloke mikroflore. Najznaajnije vrste izazivai oboljenja kod ovjeka: Streptococcus haemolyticus (BHS) gr. A, B, C, G Streptococcus pneumoniae Streptococcus anginosus grupa: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus i Streptococcus intermedius Streptococcus bovis Viridans streptokoki (Streptococcus mutans, Streptococcuas sanguis, Streptococcus mitis i dr.) Enterococcus faecalis (od 1984. izdvojen iz streptokoka u poseban rod Enterococcus zajedno sa Enterococcus faecium)
22.2
Izolacija
22.3
Identifikacija

Kolonije su sitne, sivkaste ili prozrane, konveksne i kompaktne. Kolonije Streptococcus pneumoniae imaju centralno udubljenje (zbog aktivacije autolizina). Neki sojevi zahtijevaju za rast prisustvo ugljen dioksida. Na krvnom agaru streptokoki pokazuju jedan od tri tipa hemolize: Alfa zelenkasta zona hemolize oko kolonija zbog djelimine destrukcije eritrocita i redukcije hemoglobina u eritrocitima (Streptococcus pneumoniae i veina viridans streptokoka, Enterococcus spp.)
60
Beta - prozirna zona oko kolonija zbog potpune destrukcije eritrocita (Streptococcus haemolyticus gr.A, B, C,G). Streptococcus agalactiae (streptokok gr.B) ima usku zonu hemolize oko kolonije, kolonije su neto sjajnije i nisu kompaktne. Gama nema hemolize (Enterococcus spp.) Kolonije Enterococcus spp. mogu imati zonu hemolize ili biti bez hemolize, sivkaste su, sjajne i nisu kompaktne (razmazuju se ezom).

Streptokoki su Gram-pozitivni koki, okrugli ili ovoidni, dijametra 0,61m, rasporeeni u parovima i lancima razliite duine, posebno u tenim podlogama (slika br.3). Dijagnostiki je znaajan direktni preparat od materijala iz primarno sterilnih regija, briseva rana, piodermija i sl., ali ne i sa mjesta gdje se streptokoke nalaze kao dio fizioloke mikroflore.
SLIKA 3. Streptokoke grupisane u vidu dugih lanaca bojenje po Gram-u

(Izvor: http://www.geocities.com/capecanaveral/3504/gallery.htm from Neal Chamberlain: Photo Gallery of Bacterial Pathogens)
Streptococcus pneumoniae je diplokok sa jednim otrijim polom (oblik plamena svijee), ili je u kraim lancima, sa kapsulom u direktnom preparatu. Direktni preparat sputuma kod sumnje na pneumokoknu pneumoniju sa leukocitima i streptokokima pomenutog izgleda zato ima dijagnostiku vrijednost (slika br.4).
61
Starija kultura streptokoka (koja je prela logaritamsku fazu rasta) gubi Gram pozitivnost.
SLIKA 4. Streptococcus pneumoniae u direktnom preparatu sputuma

(Izvor: http://www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/S.pneumoniae1.jpg)
22.3.3 Ispitivanje fizioloko-biohemijskih osobina

Katalaza test Negativan za sve streptokoke. Bacitracin test Osnovni je dijagnostiki test za identifikaciju Streptococcus pyogenes-a. Radi se samo sa beta-hemolitikim streptokokama (i Streptococcus pneumoniae moe biti osjetljiv na bacitracin), a koristi se test disk bacitracina od 0,04 U. Pikira se nekoliko kolonija beta-hemolitikog streptokoka i ezom zasijava krvni agar da se dobije gust, konfluentan rast. Postavlja se test disk ili test tableta bacitracina i inkubira preko noi. Zatim se mjeri prenik zone inhibicije. Ako je vei od 15 mm test je pozitivan. Treba imati u vidu da su odreeni sojevi streptokoka gr. A (do 10% ) rezistentni na bacitracin i da su neki streptokoki gr. C i G osjetljivi na bacitracin (3-5%). Osjetljivost na trimethoprim/sulfamethoxasol Moe se izvoditi zajedno sa bacitracinskim testom jer je vaan za diferenciranje grupa beta-hemolitikog streptokoka C, F i G (senzitivne) od A i B (rezistentne). Prenik zone inhibicije vei od 18 mm smatra se pozitivnim.
62
CAMP test (Christie, Atkins, Munch-Petersen) Ovim testom se otkriva prisustvo CAMP faktora difuzibilnog proteina koji pojaava beta hemolizu Staphylococcus aureus-a. Pozitivan je kod Streptococcus agalactiae (gr.B). Na krvnu plou zasijava se najprije Staphylococcus aureus u vidu crte, a zatim okomito na nju zasijava se ispitivani soj streptokoka u vidu crte poevi od kraja ploe do blizu stafilokokne crte. Za izvoenje ovog testa potreban je soj Staphylococcus aureus-a sa dvostrukom zonom hemolize (slika br.5).
SLIKA 5. CAMP test koji se izvodi sa sojem Staphylococcus aureus-a sa dvostrukom zonom hemolize Nakon inkubacije preko noi posmatra se da li je u blizini stafilokokne crte dolo do kopljastog pojaanja hemolize streptokoka. Komercijalni testovi za seroloku identifikaciju grupe Koriste se za beta-hemolitine streptokoke koje su bacitracin rezistentne, trimethoprim/sulfamethoxasol osjetljive (Streptococcus haemolyticus gr.C, G i F) radi identifikacije grupe. Optohin test Osnovni je test za diferenciranje Streptococcus pneumoniae od ostalih alfa-hemolitikih streptokoka. Izvodi se za alfa-hemolitike streptokoke zasijavanjem na krvnu plou pomou eze tako da se dobije konfluentan rast, a zatim se postavlja test disk ili test tableta sa optohinom (5g) i inkubira preko noi na 37C, u atmosferi sa 510 % CO2. Optohin = etilhidrokuprein hidrohlorid (derivat kinina). Test je pozitivan ako je zona inhibicije rasta vea od one koju je proizvoa test diska ili tablete u uputstvu naznaio, negativan ako je manja.
63
Hidroliza eskulina u 40 % ui Zasijava se kosi eskulin-uni agar ispitivanim sojem i inkubira preko noi. Ukoliko doe do hidrolize eskulina podloga mijenja boju u crnu (reakcija nastalog eskuletina sa feri-citratom u podlozi). Pozitivan je kod enterokoka i beta-hemolitikog streptokoka grupe D. Rast u prisustvu 6,5% NaCl Ispitivani soj se zasijava u epruvetu sa podlogom koja sadri visoku koncentraciju NaCl (6,5%) i inkubira preko noi. Zamuenost podloge nakon inkubacije znak je pozitivnog rezultata, a ako podloga ostane bistra rezultat je negativan. Test je pozitivan kod enterokoka. Komercijalni testovi za biohemijsku identifikaciju Koriste se za identifikaciju ostalih hemolitinih streptokoka (optohin rezistentnih, eskulin negativnih) do nivoa vrste ukoliko ta identifikacija ima klinikog znaaja. U protivnom se mogu identifikovati kao Streptococcus haemolyticus spp. TABELA 7. Redosljed postupaka u identifikaciji streptokoka i enterokoka*
Dijagnostiki kriterijum-test Hemoliza Osjetljivost na bacitracin Osjetljivost na STX Osjetljivost na optohin CAMP test Hidroliza eskulina u 40% ui Rast u prisustvu 6.5% NaCl Grupa po Lancfield-ovoj Streptococcus pyogenes S R / / BHS Streptococcus gr.C, G, Enterococcus agalactiae F R R / + / R S / / , R R R + BHS gr.D , / / R + Streptococcus pneumoniae / / S Viridans streptokoke / / R -
C, G, F
Nema grupnog Nema grupnog antigena antigena
* Objanjenje tabele:
Uoiti suspektne kolonije na hranljivim podlogama i definisati tip hemolize. Napraviti preparat sa kulture (Gram-pozitivni koki) i katalaza test (negativan).
64
U sluaju beta-hemolitikih streptokoka, ukoliko raspolaemo sa komercijalnim testovima za seroloku identifikaciju, uraditi seroloku identifikaciju grupe i identifikovati kao Streptococcus pyogenes (grupa A), Streptococcus agalactiae (grupa B) ili beta hemolitiki streptokok grupe C, F ili G.
Ukoliko ne raspolaemo ovim testovima uraditi: bacitracinski test, test osjetljivosti na trimethoprim/sulfamethoxasol (SXT) i CAMP test. Identifikovati: Streptococcus pyogenes (bacitracin pozitivan, SXT negativan) Streptococcus agalactiae (bacitracin negativan, SXT negativan, CAMP pozitivan). Streptococcus haemolyticus non A non B (bacitracin negativan, SXT pozitivan, CAMP negativan). U sluaju alfa-hemolitikih streptokoka suspektnih kolonija uraditi optohinski test i ako je pozitivan identifikovati kao Streptococcus pneumoniae. U sluaju optohin negativnih alfa-hemolitikih kolonija ili nehemolitikih kolonija uraditi test hidrolize eskulina. Ako je test hidrolize eskulina pozitivan, kao i test rasta u prisustvu 6.5% NaCl, identifikovati kao Enterococcus spp. Ako je test hidrolize eskulina pozitivan, a test rasta negativan identifikovati kao Streptococcus bovis, ukoliko se komercijalnim testovima za seroloku identifikaciju potvrdi grupa D. Ukoliko se seroloki ne potvrdi identifikovati Streptococcus spp. ukoliko je soj vankomicin osjetljiv. Vankomicin rezistentne sojeve identifikovati kao Leuoconostoc spp. Optohin negativni i eskulin negativni alfa-hemolitiki sojevi streptokoka mogu se identifikovati kao Streptococcus spp. (grupa viridans).
22.4
Komentar
Seroloka klasifikacija streptokoka je zasnovana na antigenim razlikama polisaharidnog antigena elijskog zida (C supstanca ili grupni karbohidratni antigen) i dijeli streptokoke na grupe. Od medicinskog znaaja su grupe: A, B, C, D, F i G. Streptococcus pneumoniae nema grupni antigen. Viridans streptokoki je termin za alfa-hemolitike streptokoke koji su takoe bez grupnih antigena.
65
23
Identifikacija Neisseria spp. i morfoloki slinih organizama
23.1
Uvod
Neisseria spp. koje izazivaju oboljenja kod ljudi:
Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis I druge najserije mogu biti povezane sa oboljenjima kod ljudi.
Najserijama sline vrste od kojih neke izazivaju oboljenja kod ljudi

(imena su im ispisana pojaanim slovima) Moraxella catarrhalis Moraxella lacunata Moraxella atlantae Moraxella nonliquefaciens Moraxella osloensis Kingella dentrificans Kingella kingae Gemella haemolysans Gemella morbillorum Veillonella dispar Veillonella parvula
23.2
Izolacija
Obogaeni okoladni agar: u uslovima sa 5 10 % CO2, 3537 C,
40-48 h (svakodnevno itanje) VCN okoladni agar (za N.gonorrhoeae iz primarno nesterilnih uzoraka): u uslovima sa 5 10 % CO2, 3537 C, 40-48 h (svakodnevno itanje) krvni agar: u uslovima sa 5 10 % CO2, 3537, 1648 h inkubacije (svakodnevno itanje)
66
23.3
Identifikacija

Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis formiraju glatke, okrugle, vlane, sivobraon kolonije sa zelenkastim odsjajem na primarnom izolatu Neisseria gonorrhoeae ne raste na krvnom agaru. Moraxella catarrhalis i Moraxella lacunata formiraju jako konveksne glatke, okrugle kolonije sa roskastim odsjajem, kompaktne (ezom povuene klizaju po podlozi)

Neisseria spp. su Gram negativne koke, poreane u parovima, sa paralelnim duim osovinama (slika br.6)
SLIKA 6. Neisseria meningitidis, preparat sa kulture - bojenje po Gram-u

(Izvor: http://biomarker.cdc.go.kr:8080/pathogen/pathogen_vi...)
Moraxella spp. su Gram - diplokoke (slika br.7)
67
SLIKA 7. Moraxella spp. preparat sa kulture bojen po Gram-u

(Izvor: http://www.buddycom.com/bacteria/gnr/acinetc1259.jpg)
23.3.3 Ispitivanje fizioloko-biohemijskih osobina Oksidaza test pozitivan:

Neisseria spp. Kingella spp. Moraxella catarrhalis Oksidaza test negativan: Gemella spp. Veillonella spp.
23.4
Konana identifikacija
komercijalni testovi za biohemijsku identifikaciju
68
24
Identifikacija enterobakterija
24.1
Uvod
Familija Enterobacteriaceae ini veliku grupu razliitih mikroorganizama. Opisano je 32 roda sa preko 130 vrsta. Glavne osobine lanova ove familije: Gram negativni bacili, asporogeni, fakultativni anaerobi Fermentuju glukozu, Redukuju nitrate do nitrita Ne produkuju citohrom oksidazu Svi lanovi su pokretni, osim bakterija iz rodova Klebsiella i Shigella. Yersinia spp. su pokretne na 18-25oC, ali ne i na 37oC.
24.2
Izolacija
Endo agar/MacConkey agar - diferencijalne podloge za izolaciju
gram negativnih bakterija: aerobno, 35-37oC, 16-24h MacConkey-sorbitol agar/endo agar sa sorbitolom - za izolaciju Escherichia coli 0157;H7: aerobno, 35-37oC, 16-24h SS agar selektivna podloga za Salmonella i Shigella vrste iz uzoraka stolice: aerobno, 35-37oC, 16-24h Selenit F bujon obogaena podloga, koristi se za izolaciju Salmonella i nekih sojeva Sigella iz stolice i drugih uzoraka koji sadre mijeanu floru u velikom broju: aerobno, 35-37oC, 16-24h. Supkultivaciju treba vriti nakon 8-12h
Izolacija Yersinia enterocolitica iz uzoraka stolice: SS agar: aerobno, 25oC, 40 - 48h.
24.3
Identifikacija

Endo agar / MacConkey agar - sadre laktozu kao izvor ugljenih hidrata, organizmi koji fermentuju laktozu stvaraju kolonije roze do crvene boje (laktoza
69
pozitivne), dok bakterije koje ne fermentuju laktozu stvaraju bezbojne ili transparentne kolonije (laktoza negativne). MacConkey-sorbitol agar sorbitol negativne kolonije se pojavljuju kao bezbojne; suspektne su na E.coli 0157:H7 i dalje ih treba testirati, veina drugih klinikih izolata Escherichia coli stvaraju pink do crvene kolonije. SS agar na ovoj podlozi takoe se mogu razlikovati laktoza pozitivne od laktoza negativnih (sadri laktozu kao izvor ugljenih hidrata), a moe se detektovati produkcija vodonik sulfida -kolonije sa crnim centrom. Prozirne, laktoza negativne, kolonije sa crnim centrom su suspektne na Salmonella vrste i dalje se ispituju Sitne, prozirne, laktoza negativne kolonije suspektne su na Shigella i Yersinia vrste.

Enterobakterije su gram negativni bacili ili kokobacili, tako da mikroskopske osobine ne mogu da se koriste kao pouzdan kriterijum za identifikaciju.
24.3.3 Ispitivanje biohemijskih osobina

Identifikacija enterobakterija primarno se zasniva na ispitivanju biohemijskih osobina. U rutinskoj dijagnostici koristi se klasini biohemijski niz za ispitivanje biohemijskih osobina: Kliglerov dvostruki ili trostruki eer peptonska voda za dokazivanje indola metil red Voges Proskauer Simons citrat urea manitol Inkubacija: aerobno, 35-37oC, 16-24h Prikaz biohemijskih osobina nekih rodova enterobakterija dat je u tabeli br. 8. Za preciznu biohemijsku identifikaciju, kada je kliniki opravdano, koriste se komercijalni biohemijski testovi. Izolate: Yersinia enterocolitica, Shigella spp. i vrste Salmonella koje pripadaju grupama od F-60 i 61-67 potrebno je potvrditi komercijalnim biohemijskim testom. Salmonella vrste koje pripadaju grupama od A-E moraju biti seroloki potvrene, pa iz tog razloga nije neophodna biohemijska potvrda komercijalnim testom.
70
24.3.4 Ispitivanje antigenske grae

Test aglutinacije na ploici Za ispitivanje antigene grae koristi se test aglutinacije na ploici. Izvoenje: Od iste bakterijske kulture, najbolje sa neselektivnog medijuma kao to je krvni agar, moe i sa medijuma kao to su Kliglerov dvostruki ili trostruki eer ili MacConkey agar, pripremi se suspenzija bakterija u fiziolokom rastvoru. Na ploici se nanese kap seruma, zatim se doda kap suspenzije i laganim mijeanjem prati se pojava vidljivih aglutinata. Salmonella Salmonella vrste imaju tri glavna antigena: 1. Somatski O antigeni 2. Flagelarni H antigeni 3. Kapsularni Vi antigen - imaju ga inkapsulirane bakterije roda Salmonella (Salmonella typhi) Na osnovu antigenih osobina somatskih O antigena, Salmonella vrste se dijele u grupe od A-60 i od 61-67. 98% humanih izolata pripadaju grupama od A do G. Prvo se vri dokazivanje somatskih antigena primjenom polivalentnih, a zatim monovalentnih antiseruma. Zatim se dokazuju flagelarni antigeni obje faze. Ukoliko dolazi do aglutinacije sa Vi antiserumom, da bi se dokazali drugi antigeni, suspenzija se zagrijava10 minuta na 100oC, da se inaktivira kapsularni antigen. Nakon hlaenja suspenzija se retestira sa antiserumima od A-E. Ukoliko aglutinira sa antiserumom za grupu D moe se izvjestiti kao Salmonella typhi. Minimum seroloke potvrde za svaku laboratoriju je identifikacija somatskog antigena monovalentnim serumom, odnosno odreivanje grupe za tipove Salmonella koje pripadaju grupama od A-E. Vrste koje pripadaju grupama od F-60 i 61-67, treba potvrditi biohemijski komercijalnim testom i izvriti testiranje polivalentnim antiserumom. Izolati se mogu poslati u referentnu laboratoriju na dalju serotipizaciju. Obzirom da je S.enteritidis, na naim prostorima, najei uzronik infekcija izazvanih bakterijama iz roda Salmonella, vano je da svaka laboratorija, osim seruma za dokazivanje somatskog O antigena, ima antiserume za dokazivanje flagelarnog H antigena za ovu vrstu.
71
Ukoliko su izolati suspektni na jedan od sledea tri serotipa Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis ili Salmonella paratyphi, zbog klinikog i epidemiolokog znaaja, moraju biti biohemijski identifikovani i seroloki potvreni. Shigella Na osnovu O antigena Shigella vrste pripadaju jednoj od etiri serogrupe: A,B,C i D. Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei odgovaraju ovim serogrupama. Postoji nekoliko serotipova unutar svake serogrupe, izuzev grupe D koja sadri samo jedan serotip. testom aglutinacije na ploici sa polivalentnim O antiserumima utvruje se serogrupa Zatim se monovalentnim serumima odreuje serotip unutar grupe. Minimum seroloke potvrde je odreivanje serogrupe, osim kad je u pitanju Shigella dysenteriae tip 1, kada se mora odrediti serotip. Prema preporukama svjetske zdravstvene organizacije prvo se testira sa monovalentnim A1 antiserumom, zatim polivalentnim B antiserumom i na kraju polivalentnim D antiserumom. Serogrupa C, Shigella boydii je vrlo rijetka i prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji i CDC (Centar za kontrolu i prevenciju bolesti u Atlanti, engl. Centers for Disease Control and Prevetion) nije rentabilno izvoditi rutinsko testiranje. Ukoliko je aglutinacija neuspjena, suspenzija bakterija se zagrijava da bi se uklonio kapsularni antigen koji moe biti prisutan, a zatim se test aglutinacije ponavlja. Escherichia coli O157:H7 Sorbitol negativne kolonije sa sorbitol-MacConkey agara se subkultiviu, za serotipizaciju sa Escherichia coli O157:H7 antiserumom. Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica podijeljena u est biogrupa: 1A, 1B, 2, 3, 4 i 5. Vrste biogrupe 1A nisu udruene sa humanim bolestima. Identifikovano je 34 serotipa. Biohemijski potvrene izolate treba slati u referentnu laboratoriju za seroloku identifikaciju.
72
25
Identifikacija gram negativnih nefermentujuih bacila

Uvod
25.1
Nefermentujui gram negativni bacili imaju sve vei kliniki znaaj zbog poveanja broja imunokompromitovanih pacijenata. Faktori rizika za infekciju ovim mikroorganizmima su: imunosupresija (diabetes mellitus, cancer, transplantacija organa, hormonalni poremeaji), traume, opekotine, vjetaki implantati. Ovo je veoma heterogena grupa bacila, jedina zajednika osobina je nereaktivnost na Kligler-ovom eeru /trostrukom eeru.
25.2
Izolacija
Krvni agar - neselektivna podloga: aerobno, 35-37oC, 16-24h Endo agar/ MacConkey agar - selektivne podloge: aerobno, 35-37oC,
16-24h
25.3
Identifikacija (shema br.2)
Za identifikaciju nefermentujuih bacila koriste se sljedee osobine: Nereaktivnost na Kligler-ovom eeru /trostrukom eeru Preparat sa kulture - gram negativni bacili, kokobacili Oksidaza reakcija Za preciznu biohemijsku identifikaciju koriste se komercijalni biohemijski testovi.
25.4
Komentar
Definitivna identifikacija nefermentujuih bacila zahtijeva vrijeme i novac, a esto i ne odgovara dijagnozi bolesti. Odluka da se identifikuje organizam do vrste, zavisi od materijala iz koga je izolovan: a) da li je izolovan iz materijala koji je primarno sterilan, b) ili iz primarno nesterilnog materijala, zajedno sa tri ili etiri bakterije.
73
Prvi sluaj zahtijeva identifikaciju i izradu antibiograma. U drugom sluaju dovoljna je identifikacija na osnovu gore pomenutih osobina.
Nereaktivnost na Kligler-ovom eeru
Gram negativni bacili
Gram negativne koke i kokobacili
Oksidaza test pozitivan
Oksidaza test negativan
Oksidaza test negativan
Pseudomonas species
Uraditi komercijalni biohemijski test
Acinetobacter species
SHEMA 2. Identifikacija nefermentujuih bakterija
74
26
Identifikacija Haemophlius spp. i HACEK grupe organizama
26.1
Uvod
HACEK grupa obuhvata vrste:
Haemophilus spp. Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Eikenella corrodens Kingella spp.
26.2
Izolacija
selektivni okoladni agar za Haemophilus: u uslovima sa 510 % krvni agar sa stafilokoknom crtom: u uslovima sa 510 % CO2, 35
CO2, 3537C, 1648h 37C, 1648h Haemophilus ducreyi selektivni agar - u atmosferi 5 10 % CO2, 33 34C, 5 dana
26.3
Identifikacija

Haemophilus species su male, okrugle, konveksne kolonije koje se presijavaju. Rastu poslije 24h inkubacije na okoladnom agaru. Satelitizam Haemophilus influenzae se moe vidjeti na krvnom agaru oko kolonija Staphylococcus aureus-a.

Haemophilus species su mali kokobacili ili dui tapii, Gram negativni, razliitih duina, naznaenog pleomorfizma, ponekad sa filamentima (slika br.9).
75
SLIKA 9. Haemophilus spp. u hemokulturi bojenje po Gram-u

(Izvor: http://wwwstud.uni-leipzig.de/~mai03kbz/bioinfprak/einfuerung.htm)
Drugi HACEK organizmi su sferine, ovalne ili tapiaste Gram negativne elije sa izraenim pleomorfizmom, mogu stvarati filamente (slika br.10).
SLIKA 10. Kingella kingae preparat sa kulture-bojenje po Gram-u

(Izvor: www.nature.com/.../v20/n9/fig_tab/6702119f2.html)
76
26.4
Konana identifikacija (ako je kliniki indikovano)

Komercijalni testovi za biohemijsko ispitivanje.
26.5
Izvjetavanje
izvjestiti o svim pozitivnim kulturama iz normalno sterilnih uzoraka izvjestiti o prethodnoj ili potvrdnoj dijagnozi Haemophilus spp. ili
drugih lanova HACEK grupe organizama kod: meningitisa ili modanog apscesa facijalnog celulitisa ili septinog artritisa epiglotitisa, pneumonije, mastoiditisa ili empiema toraksa septikemije ili endokarditisa pelvinog apscesa suspektnog ankroida
26.6
Komentar
26.6.1 HACEK grupa organizama

Za razlikovanje HACEK grupe organizama od kliniki brojnih, morfoloki slinih, aerobnih ili fakultativno anaerobnih Gram negativnih tapia, uglavnom udruenih sa endokarditisom i infekcijama normalno sterilnih materijala, potreban je sistematski pristup. HACEK grupa mikroorganizama su komensali orofaringealnog/respiratornog trakta. Identifikacija je udruena sa klinikim detaljima i izolati se dalje identifikuju, ako je kliniki indikovano. Izolati kliniki znaajnih HACEK organizama se alju referentnoj laboratoriji.
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Ovo je Gram negativan kokobacil ili kratak tapi, 0,3-0,5 x 0,5-1,5 m, moe pokazivati nepravilno bojenje. Povremeno se jave dui oblici (do 6 m). U preparatu bakterije su pojedinane, u parovima ili rjee u lancima. Mogu produkovati manje koliine sluzi. Ne zahtijevaju X i V faktor rasta. Poslije 24 h inkubacije, kolonije na krvnom ili okoladnom agaru su manje od 0,5mm, rastu do 1mm poslije nekoliko dana inkubacije. Mogu biti vrste, adherentne, zvjezdaste, ponekad neravne povrine, urasle, teko se skidaju sa povrine agara. Ako produkuju ekstacelularnu sluz, kolonije su ljepljive u primoizolatu. Povrne kulture su slabo vitalne i mogu uginuti za 5-7 dana. Najbolje rastu u mikroaerofilnim uslovima sa CO2 i fakultativno su anaerobne. Optimalna temperatura rasta je 37C. Nepokretan je, ne produkuje ureazu.
77
Cardiobacterium hominis
Genus Cardiobacterium sadri samo jednu vrstu. elije su pleomorfne ili pravi tapii (1-3 m duine), zaobljenih krajeva, a mogu imati i duge filamente. U preparatu, bakterije su u parovima, kratkim lancima ili rozetama. Gram negativne su, ali djelovi bakterijske elije mogu biti Gram pozitivni. Rast na krvnom agaru je slab. Ne zahtijevaju V i X faktore rasta. Stvaraju vrlo male kolonije, osim pri inkubaciji u vlanoj aerobnoj ili anaerobnoj atmosferi sa 5% CO2. Poslije dvodnevne inkubacije kolonije su prenika 1 mm, glatke, opalescentne i mogu prijanjati za agar. C.hominis je fakultativni anaerob, ali CO2 moe biti potreban nekim sojevima za primoizolaciju. Optimalna temperatura rasta je 30-37 C. Nepokretan je, oksidaza pozitivan, ureaza i katalaza negativan.
Eikenella corrodens
Genus Eikenella sadri samo jednu vrstu. elije su pravi, nerazgranati, nesporogeni, tanki, Gram negativni tapii 0,3-0,4 x 1,5-4 m duine. Kolonije su vrlo sitne poslije jednodnevne inkubacije, ili su nevidljive i poslije nekoliko dana. Kolonije imaju vlaan, ist centar. Mogu urastati u podlogu, a uta obojenost se vidi kod starijih kultura zbog gustine bakterijskih elija. U istom izolatu se mogu vidjeti razliite kolonije. Nehemolitine su, mada se nekad oko kolonije moe pojaviti svijetlo zelena zona. Za aerobni rast je obino potreban hemin, a rijetki sojevi ostaju X zavisni poslije subkultivisanja. Optimalna temperatura rasta je 35 37 C. Nepokretna je, ali na nekim podlogama moe biti pokretna. Sojevi su fakultativno anaerobni, oksidaza pozitivni, katalaza negativni, ureaza negativni. Mogu se zamijeniti za Bacteroides ureolyticus, ali je on obligatni anaerob i ureaza pozitivan.
Kingella spp.
Genus Kingella ima dvije vrste: Kingella kingae i Kingella denitrificans. Kingella indologenes je u novom genusu identifikovana kao Sutonella indologenes. Kingella su pravi tapii, 10 m duine, zaobljenih ili etvrtastih krajeva. Javljaju se u parovima ili kratkim lancima. Ne stvaraju endospore, Gram negativni su, sa tendencijom opiranja odbojavanju. Na krvnom agaru se javljaju dva tipa kolonija: ire, neravne i konveksne, glatke. Ne trai V i X faktor rasta. Rastu aerobno ili fakultativno anaerobno. Optimalna temperatura rasta je 30 37C. Sojevi su nepokretni, oksidaza pozitivni, katalaza negativni, ureaza negativni. Glukozu i druge ugljene hidrate fermentuju uz produkciju kisjeline, ali ne i gasa.
78
Izgled kolonija HACEK organizama zavisi od vrste i podloge (tabela br.9). TABELA 9. Izgled kolonija HACEK organizama
HACEK grupa organizama Actinomyces actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Karakteristike rasta na krvnom agaru poslije aerobne inkubacije na 35-37C, 16-48h Ne rastu u vazduhu, ali rastu uz CO2 . Male kolonije za 24h, 1mm poslije 48h. vrste adherentne, zvjezdaste kolonije neravne povrine, mogu urastati u agar. Nehemolitine su. Neki sojevi ne rastu uz CO2. Kolonije glatke, konveksne, sjajne, 1-2mm za 48h, blago hemolitine. Kolonije vrlo male, vlane, jasan centar okruen zaravnjenjem, mogu urastati; irenje je rijetko, vrlo malo oko kolonije. Nehemolitine. Veliina kolonija 0.5-1mm poslije 48h, zahtijeva 5-10 CO2. Dva tipa kolonija: ire, neravne i glatke, konveksne. Mala zona hemolize, sojevi su esto sa kapsulom, produkuju sluzave kolonije. Ne zahtijava 5-10 % CO2. Nehemolitine, dva tipa kolonija: ire, neravne i glatke, konveksne.
Eikenella corrodens
Kingella kingae
Kingella denitrificans
79
27
27.1
Identifikacija Bordetella spp.

Uzorkovanje
Kad su simptomi najizraeniji, ako je mogue prije antibiotske
terapije
Uzimanje uzorka nazofaringealnog sekreta kod pacijenata sa velikim

kaljem moe izazvati napad kalja i opstrukciju vazdunih puteva, zato mora biti dostupna oprema za reanimaciju. Osoba koja uzima uzorak mora izbjei direktan kontakt sa pacijentom dok kalje. Savitljiv dakronski bris se ubacuje kroz nozdrvu po podu nosne duplje do nazofarinksa. Preporuuje se da se bris zadri na zadnjem nazofarinksu 30-tak sekundi dok se pacijent nakalje. U praksi, pacijent ovo tolerie samo nekoliko sekundi. Nazofarigealni eksudat se uzima sukcionim kateterom, ubaenim kroz nos. Eksudat se sakuplja u sterilnu plastinu posudu u kojoj se transportuje do laboratorije Perinazalni bris - nije dokazano koji nain uzimanja uzorka je najbolji.
27.2
Transportovanje
Uzorak se transportuje i obrauje to je prije mogue Podloga se moe inokulisati pored kreveta pacijenta Bris se moe transportovati u transportnoj podlozi na bazi drvenog
uglja
27.3
Izolacija
Komercijalna podloga za Bordetella spp. ili krvni agar sa drvenim
ugljem i cefaleksinom - aerobno, 35-37C, 7 dana (oitavanje 4. i 7 dan) u vlanoj komori (Podloga treba da je deblje razlivena) Perinazalni i nazofaringealni bris: inokulisati brisom agar plou Nazofaringealni aspirat: sterilnom ezom odabrati reprezentativni dio uzorka i inokulisati punu ezu na agar plou.
80
27.4
Identifikacija

Kolonije sitne (oko 1,5 mm), glatke, sjajne, jako konveksne, srebrenaste (kao kapi ive)

Sitni Gram - kokobacili i bacili (Slika br.8)
SLIKA 8. Bordetella pertussis preparat sa kulture bojen po Gram-u

(Izvor: http://microblog.me.uk/20)
27.5
Konana identifikacija (u referentnoj laboratoriji)

Seroloka identifikacija (ili DIF)
27.6
Izvjetavanje
Bordetella pertussis nije izolovana Bordetella pertussis je izolovana
81
28
28.1
Identifikacija Campylobacter spp.

Izolacija
Selektivna podloga za kampilobakter: mikroaerofilni uslovi, 42C,
40-48 h. Ako se na 1 plou zasijavaju 4 uzorka stolice, prethodno vrelom ezom napraviti ljebove koji e plou podijeliti na 4 dijela.
28.2
Identifikacija

Slivene, sjajne kolonije, prozirne ili lagano bjeliasto-sive. Ivice nisu jasne i stapaju se sa podlogom.
28.3
Konana identifikacija
28.3.1 Mikroskopske osobine u preparatu sa kulture Preparat bojen karbol fuksinom

Tipian mikroskopski izgled -galeb u letu ili slovo S (slika br.11). Atipian mikroskopski izgled: kokoidni oblici.
28.3.2 Ispitivanje biohemijskih osobina Katalaza pozitivan; oksidaza pozitivan
SLIKA 11. Tipian mikroskopski izgled Campylobacter spp. -galeb u letu ili slovoS
Izvor: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch023.htm
82
29
Identifikacija Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis
29.1
Uzorkovanje
bris koe bris grla i nosa bris nazofarinksa
ako su prisutne membrane sa ivice membrane
29.1.1 Uzorci za ispitivanje
29.1.2 Nain uzorkovanja poto se radi o kontagioznom i ozbiljnom oboljenju koje zahtijeva bris
hospitalizaciju, uzorci se uzimaju u bolnikim uslovima inflamiranih povrina u tonzilofaringealnoj regiji, nazofaringealnoj regiji i nosu-uzeti energinim rotacionim pokretima Ne skidati pseudomembrane!-opasnost od krvarenja propisno obiljeiti uzorak i naglasiti da se radi o sumnji na difterijuvano zbog posebnih procedura u izolaciji i identifikaciji koje se rutinski ne rade
29.2
Transportovanje
uzorke transportovati odmah ili deponovati u transportni medijum pri transportu obiljeiti prema vaeim propisima
29.3
Izolacija
Za obradu uzoraka izolaciju i identifikaciju obavezno koristiti komoru za bezbjedan rad nivoa zatite II. Bris koe:
83
Krvni agar: u uslovima sa 5 10 % CO2, 35-37C, 40-48 h Cistein telurit krvni agar (Hoyles teluritni agar): aerobno, 35-37C,
16-18 h Bris grla, nosa i nazofarinksa: Krvni agar: anaerobno, 35-37C, 16-24 h Cistin telurit krvni agar (Hoyle's teluritni agar): aerobno, 35-37C, 16-18 h
29.4
Identifikacija

Corynebacterium diphteriae Hoyles teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije var. gravis: mat povrine, trone, suve, kidaju se u manje segmente kad se uzimaju ezom, radijalno su izbrazdane, nepravilnih ivica (na krvnom agaru: nehemolitine) var. mitis: glatke, sjajne povrine, jasno oiviene (na krvnom agaru: mala zona hemolize) var. intermedius: sjajne, diskretno prozirne (na krvnom agaru: mala zona hemolize) var. belfanti: glatke, sjajne povrine (na krvnom agaru: mala zona hemolize) Corynebacterium ulcerans Hoyle's teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije, veoma suve (na krvnom agaru: mala zona hemolize) Corynebacterium pseudotuberculosis Hoyle's teluritni agar: neprozirne sivo/crne kolonije, veoma suve (na krvnom agaru: hemoliza)

Bojenje po Gramu: Gram + pleomorfni bacili, bez kapsule (slika br.12) Specijalno bojenje po Neisser-u: u tijelu bacila tamno prebojene granulemetahromatske ili volutinske granule (energetski depoi sastavljeni od neorganskih polifosfata)
84
SLIKA 12. Corynebacterium spp. tipian raspored razbacanih tapia ibice - u preparatu sa kulture bojenom po Gram-u
Izvor: www.emlab.com/s/sampling/env-report-05-2007.html
29.4.3 Biohemijsko ispitivanje

Komercijalnim testovima za ispitivanje biohemijskih osobina
29.4.4 Dokazivanje toksigenosti soja

Modifikovani Elekov test za in vitro ispitivanje toksigenosti izolovanog soja (slika br.13) 2 ml sterilnog seruma kunia i 1 ml 0.03% kalijum telurita dodati u 10 ml agara za ispitivanje virulencije (KL virulence agar Difco) zagrijanog na 55C u vodenom kupatilu Razliti u petri olju i rotirati 20 puta da se dobro izmjea Prije nego se podloga stvrdne staviti sterilan filter papir dimenzija 1x8 cm natopljen difterinim antitoksinom (razblaen da sadri 100 jedinica antitoksina u ml seruma) po dijametru ploe. Papir treba da potone na dno to treba pomoi sterilnom pincetom, ako je potrebno Ostaviti podlogu da se stvrdne, pa je sa poluotvorenim poklopcem smjestiti u termostat da ispari viak vlage sa povrine Inokulisati podlogu unutar 2 h poslije suenja povlaei pod pravim uglom u odnosu na filter papir paralelne linije 24-asovne kulture poznatog toksinog soja, negativnog soja i ispitivanog soja. Inkubirati 24-48 h na 35C Traiti na ploi bijele precipitacione linije koje se pod uglom od 45 pruaju od linija zasijavanja prema filter papiru. Rezultat: prisustvo precipitacionih linija = toksigeni soj odsustvo precipitacionih linija = netoksigeni soj
85
SLIKA 13. Elekov test za in vitro ispitivanje toksigenosti izolovanog soja
Sve sumnjive sojeve ili dokazane patogene sojeve odmah slati u referentnu laboratoriju na kosom krvnom agaru radi ispitivanja toksinosti (London).
86
30
Identifikacija anaerobnih bakterija
30.1
Uzorkovanje
Sadraj apscesa dobijen punkcijom sterilnom iglom i pricem,
potujui principe aseptinog rada. Upotreba brisa je loija alternativa zbog izloenosti bakterija suenju i toksinom dejstvu kiseonika. Napomena: obrada ovih uzoraka ima prioritet u odnosu na druge uzorke
30.2
Transportovanje
to je prije mogue, maksimalno do 20 minuta (najdue za pola sata).
Ako je brz transport nemogu, koristiti transportne podloge za anaerobe.
30.3
Izolacija
Preparat bojen po Gram-u prikazuje tip i relativan broj
mikroorganizama i elija domaina. Takoe moe sugerisati upotrebu odgovarajuih podloga i pomoi kliniaru u odreivanju terapije prije zavrene kultivacije.
30.3.2 Kultivacija Podloga za anaerobe sa 5 g diskom metronidazola - u anaerobnoj

atmosferi, 35 - 37 C, 48 h
Sve procedure zavriti za to krae vrijeme. Preporuuje se uporedo aerobna kultivacija - krvni agar - aerobno,
35-37C, 18-24 h
87
30.4
Identifikacija
Na osnovu morfolokih osobina bakterijske elije (preparat sa kulture bojen po Gram-u), izgleda kolonije, osjetljivosti na prisustvo kiseonika (izostanak rasta na krvnom agaru u aerobnim uslovima), pigmentacije, fluorescencije itd. Krajnja identifikacija se vri ispitivanjem biohemijske aktivnosti upotrebom komercijalnih testova Minimalan nivo - naene anaerobne bakterije
30.5
Komentar
Anaerobne infekcije su najee mijeane infekcije, tj. uz anaerobne bakterije kao uzronici se javljaju fakultativno anaerobne i aerobne bakterije. Najee izolovane anaerobne bakterije iz humanih uzoraka su: Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogenica, Fusobacterium, Actinomyces, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus, Veillonella. Od znaaja su i kliniki znaci koji ukazuju na moguu anaerobnu infekciju: prisustvo gnoja neprijatnog mirisa, gas u tkivu (krepitacije), lokacija infekcije u blizini povrine sluzokoa, prisustvo sulfatnih granula itd.
88
31
Ispitivanje osjetljivosti bakterija na antimikrobne supstance disk difuzionionim metodom

Opte napomene
Antibiotici se uvaju prema uputstvu proizvoaa (u friideru, na
31.1
sobnoj temperaturi itd.) Medijum: Zavisno od vrsta mikoorganizma za koji treba uraditi antibiogram koriste se razliiti medijumi(podloge) Mueller-Hinton agar (MHA) je standardizovana podloga (SZO) za izvoenje antibiograma. Za bakterije koje su izbirljive u nutritivnim potrebama dodaje se 4-6% defibrinisane ovije, govee ili konjske krvi (tabela br. 10) TABELA 10. Podloge za ispitivanje osjetljivosti razliitih sojeva bakterija na antimikrobne supstance
Mikroorganizam Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Staphylococci Staphylococci (meticillin/oxacillin test) Enterococci Streptococcus pneumoniae Beta hemolitiki streptokoki Moraxella catarrhalis Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Haemophilus spp. Medijum (podloga) MHA MHA MHA Columbia agar sa 2 % NaCl MHA MHA + 5% defibrinisane krvi MHA + 5% defibrinisane krvi MHA + 5% defibrinisane krvi MHA + 5% defibrinisane krvi MHA + 5% defibrinisane krvi MHA + 5% defibrinisane krvi + 20 mg/l NAD
31.2
Priprema podloge
Autoklavirati podlogu i rashladiti je na 45- 50 C (vodeno kupatilo) Razliti podlogu u Petri olje( 25ml podloge u Petri olju prenika
90mm ili oko 50 ml podloge u Petri olju prenika 160mm)
89
Debljina podloge mora da bude 4 mm Podloga razlivena uz plamenik pod aseptinim uslovima i ohlaena
na sobnoj temperaturi uva se u friideru (2-8C) sa poklopcem okrenutim nadolje Prije upotrebe podloga mora stajati bar pola sata na sobnoj temperaturi Ako se na povrini podloge nalaze kapi kondenzovane vode, neophodno je prije upotrebe podlogu prosuiti u termostatu tako da povrina podloge bude okrenuta nadolje i naslonjena na otvoreni poklopac Pripremljena podloga se moe iskoristiti najdue za 7 dana
31.3
Inokulum
Priprema se razblaivanjem 18- 24 asovne iste bakterijske kulture Ezom se pikira 4-5 kolonija i prenese u 5 ml fiziolokog rastvora Gustina suspenzije se podeava poreenjem sa McFarland
standardom 0,5 za turbiditet Inokulum se zasijava brisom, ezom ili staklenim tapiem ravnomjerno na povrinu podloge Poslije zasijavanja inokuluma poeljno je da podloga stoji 10-15 minuta na sobnoj temperaturi da bi se povrina osuila.
31.4
Postavljanje tableta ili diskova

Izvodi se dispenzerom ili sterilnom pincetom Razmak izmeu diskova je najmanje 3 cm, a rastojanje od ivice suda
najmanje 1cm
Na plou prenika 10 cm nanosi se maksimalno 6 diskova, a na plou

prenika 12 cm maksimalno 8 diskova.
31.5
Izbor tableta ili diskova
Prema CLSI (Institut za klinike i laboratorijske standarde u Vejnu, SAD, Clinical and Laboratory Standards Institute, engl.) antibiotici su podijeljeni u grupe od A do I: grupa A Antibiotici koji se rutinski primarno ispituju i izvjetavaju grupa B Antibiotici koji su kliniki znaajni i mogu da se primarno ispituju, ali se selektivno izvjetavaju npr. kad je soj rezistentan na antibiotike iz grupe A, kod posebnih situacija npr. cefalosporini 3.
90
generacije za enterobakterije izolovane iz likvora ili kotrimoksazol za izolate iz urina grupa C - alternativni antibiotici (za sojeve rezistentne na vie primarnih antibiotika) grupa U - Antibiotici za izolate iz urina grupa O - Ostali antibiotici grupa I - Antibiotici u fazi istraivanja
Izbor antibiotika zavisi od brojnih faktora meu kojima su najbitniji izolovani soj i vrsta materijala iz kojeg je izvrena izolacija.
31.5.1 Staphylococcus aureus

Izbor antibiotika Grupa A: Oxacillin, Penicillin Grupa B: Erytromycin, Clindamycin, Trimethoprim/sulphametoxasol, Vancomycin, Fusidinska kiselina Grupa C: Chloramphenicol, Ciprofloxacin (Ofloxacin), Gentamycin, Rifampicin, Tetracyclin Grupa U: Penicillin, Oxacillin, Norfloxacin, Nitrofurantoin, Trimethoprim/ sulfametoxasol Rezistencija na Ciprofloxacin se stie brzo u toku terapije, za 2-3 dana, pa je obavezno ponovno testiranje. Najnovije preporuke su da se umjesto diska Oxacillina koristi disk Cefoxitima! Ako je zona inhibicije rasta oko diska Cefoxitima 19mm izvjetava se kao Oxacillin rezistentan (R). Ako je zona inhibicije rasta oko diska Cefoxitima >19mm izvjetava se kao Oxacillin osjetljiv (S). Osjetljivost stafilokoka na beta-laktamske antibiotike se testira Penicilinom i Oksacilinom ili Meticilinom. Penicilin tablete za testiranje osjetljivosti na sve beta- laktamaza labilne peniciline: Ampicillin, Amoxicillin, Azlocylin, Mezlocylin, Karbenicylin, Piperacillin i Tikarcillin. Oxacillin/ Meticillin tablete za testiranje osjetljivosti na beta-laktamaza stabilne peniciline. Tumaenje rezultata Oxacillin S / Penicillin S Stafilokok je istovremeno osjetljiv i na druge peniciline, beta laktamaza inhibitorne kombinacije, cefalosporine i karbapeneme
91
Oxacillin S / Penicillin R Stafilokok je rezistentan na beta- laktamaza labilne peniciline (Ampicillin, Amoxicillin, Azlocylin, Mezlocylin, Karbenicylin, Piperacillin, Tikarcillin), a osjetljiv na beta- laktamaza stabilne peniciline, beta- laktamaza inhibitorne kombinacije, odgovarajue cefalosporine (Cefahlor, Cefalexin) i Karbapeneme. Oxacillin R Stafilokok je rezistentan na sve beta- laktamske antibiotike, kao i karbapeneme. Za Staphylococcus aureus koji pokazuje umjerenu osjetljivost na Oxacillin treba uraditi oksacilin test na slanom agaru: Podloga: MHA sa 4% NaCl i 6 g/ ml oksacilina ili 10 g/ ml meticilina Inokulum: Suspenzija ispitivanih kolonija gustine 0,5 Mc Farland Inkubacija: aerobno, 35-37 C, 24 h Rezultat: Porast vie od jedne kolonije ukazuje na rezistenciju soja na Oxacillin. Izvjetavanje Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a rezultate izvjetavati u zavisnosti od vrste uzorka.
31.5.2 Streptococcus spp.

Izbor antibiotika Grupa A: Grupa B: Grupa C: Grupa U: Penicillin ili Ampicillin, Erytromycin Vancomycin, Chloramphenicol, Clindamycin Cefotaxim( Ceftriaxon), Ofloxacin Ampicillin, Ofloxacin( Ciprofloxacin), Norfloxacin, Nitrofurantoin
Beta- hemolitiki streptokoki (BHS ) Streptococcus pyogenes se NE mora testirati na Penicillin jer u uslovima in vitro jo nisu otkriveni rezistentni sojevi. Streptococcus agalactiae moe biti umjereno osjetljiv (I) na Penicillin. Tumaenje nalaza BHS koji je S na Penicillin moe se smatrati S i na: Ampicillin, Amoxicillin/ klavulanska kiselina, Cefahlor, Cefotaxim, Ceftibuten (samo za S. pyogenes), Ceftriaxon, Cefuroxim, Cefpodoxim, Imipenem, Meropenem (ne mora se testirati na ove antibiotike).
92
BHS koji je S na Erytromycin moe se smatrati S i na: Azitromycin, Claritromycin i Diritromycin (ne mora se testirati na ove antibiotike). Izvjetavanje Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A i B, a po potrebi (zavisno od vrste uzorka) i za antibiotike iz drugih grupa.
31.5.3 Streptococcus pneumoniae

Izbor antibiotika Grupa A: Penicillin (Oxacillinom), Erytromycin, Trimethoprim/sulphametoxasol Grupa B: Ofloxacin (Ciprofloxacin), Tetracyclin, Vancomycin Grupa C: Chloramphenicol, Rifampicin Osjetljivost na Penicillin se radi iskljuivo Oxacillinom! Tumaenje nalaza Ako je S. pneumoniae S na Oxacillin znai da je S i na Penicillin. Sojevi S.pneumoniae koji su S na Penicillin smatraju se S i na: Ampicillin, Amoxicillin, Ampicillin + sulbactam, Amoxicillin/klavulanska kiselina, Ceftriaxon, Cefahlor, Cefotaxim, Cefpodoxim, Imipenem i Meropenem, pa se osjetljivost na ove antibiotike ne ispituje, jer pouzdani disk difuzioni testovi za sada ne postoje. Ako je soj R na Oxacillin ne smije se proglasiti R ili I na Penicillin samo na osnovu oksacilin testa. Obavezno se radi MIK za Penicillin dilucionom metodom ili E- testom Ako se ne moe uraditi MIK treba u komentaru antibiograma naznaiti da soj ima smanjenu osjetljivost na Penicillin, a da se za terapiju moe preporuiti Ceftriaxon (izuzev za izolate iz krvi i likvora). Za sojeve S. pneumoniae izolovane iz krvi i likvora osjetljivost na Penicillin, Ceftriaxon, Cefotaxim i Meropenem treba utvrditi odreivanjem MIK- ova bez prethodnog testiranja sa Oxacillinom. Za ove sojeve treba istovremeno ispitati i osjetljivost na Vancomycin disk- difuzionim metodom ili odreivanjem MIK- a Ako je soj S na Erytromycin moe se smatrati S i na: Azitromycin, Claritromycin i Diritromycin. Izvjetavanje
93
Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupe A, a po potrebi (zavisno od vrste uzorka) i za antibiotike iz grupa B i C.
31.5.4 Enterococcus spp.

Izbor antibiotika Penicillin ili Ampicillin Vancomycin Gentamycin (120 g), Streptomycin (300 g) Ampicillin, Ciprofloxacin (Ofloxacin), Norfloxacin, Nitrofurantoin, Tatracyclin Za umjereno osjetljive sojeve na aminoglikozide (zona inhibicije rasta 79 mm) treba uraditi agar dilucioni metod. Za Vancomycin rezistentne sojeve treba testirati: Chloramphenicol, Erytromycin, Tetracyclin, Rifampicin. U testovima in vitro sojevi enterokoka mogu biti osjetljivi na cefalosporine, aminoglikozide (uobiajena doza), klindamicin i kotrimoksazol, ali ovi antibiotici su kliniki neefikasni pa ih ne treba uvrtavati u antibiogram. Tumaenje nalaza Sojevi enterokoka koji ne produkuju beta- laktamaze- ako su S na Ampicillin- S su na sve peniciline, kao i na Amoxicillin/ klavulanska kiselina, Ampicillin + sulbactam, Piperacillin + tazobactam Rezistencija enterokoka na Ampicillin koja je uslovljena produkcijom beta-laktamaza ne moe se pouzdano utvrditi rutinskim disk-difuzionim ili dilucionim metodom. Preporuuje se nitrocefinski test za izolate iz krvi i likvora! Ako je nitrocefinski test pozitivan izolat je rezistentan na Penicillin, kao i na acil amino, karboksi i ureidopeniciline. Kad se testira osjetljivost enterokoka na Vancomycin, inkubacija mora biti puna 24 sata, a oitavanje pod kosim uglom. Prisustvo bilo kakvog rasta ili zamagljenja unutar zone inhibicije rasta ukazuje na rezistenciju! Za sojeve sa umjerenom rezistencijom na Vancomycin treba uraditi MIK. Za njih treba uraditi i Vankomicin test: Podloga: MHA sa 6g vankomicina/ml Inokulum: zasijava se 1-10 g suspenzije gustine 0,5 Mc Farland Inkubacija: na 35-37C, 24 h Rezultat: Pojava vie od jedne kolonije ukazuje na rezistenciju na Vancomycin Tetracyclin je predstavnik svih tetraciklina, pa se rezultati osjetljivosti odnose i na Doksicyclin i Minocyclin Rezultate osjetljivosti na velike doze aminoglikozida (Gentamycin, Streptomycin) izvjetavati kao komentar kliniaru da e se kombinovanom Grupa A: Grupa B: Grupa C: Grupa U:
94
terapijom (npr. ampicilin sa gentamicinom) postii oekivani baktericidni efekat! Izvjetavanje Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a izvjetavati zavisno od vrste uzorka.
31.5.5 Enterobakterije
Izbor antibiotika Grupa A: Ampicillin, Cephalexin, Gentamycin Grupa B: Amoxicillin/klavulanska kiselina, Cefotaxim(Ceftriaxon), Amikacin, Ciprofloxacin, Imipenem(Meropenem), Piperacillin, Trimethoprim/sulphametoxasol Grupa C: Aztreonam,Ceftazidim, Chloramphenicol, Netilmycin, Tetracyclin Grupa U: Ampicillin, Cephalexin, Ceftriaxon (Cefotaxim), Gentamycin, Ciprofloxacin (Ofloxacin), Nitrofurantoin, Norfloxacin, Trimethoprim/sulphametoxasol, Pipemidinska kiselina Tumaenje nalaza
Za Salmonella spp. i Shigella spp. rutinski treba testirati samo osjetljivost na Ampicillin, Trimethoprim/sulphametoxasol i hinolone. Za ekstraintestinalne izolate treba ukljuiti Chloramphenicol i cefalosporine 3. generacije Ako je soj S na Ampicillin S je i na Amoxicillin Salmonele i igele mogu pokazivati in vitro dobru osjetljivost prema cefalosporinima 1. i 2. generacije i aminoglikozidima, ali bez odgovarajueg terapijskog efekta, pa ih ne bi trebalo smatrati osjetljivim. Enterobacter spp., Citrobacter spp. i Serratia spp. mogu razviti rezistenciju u toku terapije cefalosporinima 3. generacije. Osjetljivi izolati mogu postati rezistentni u roku 3- 4 dana, pa je opravdano vriti ponovno ispitivanje osjetljivosti soja izolovanog sa istog mjesta infekcije! Izvjetavanje Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a izvjetavati u zavisnosti od vrste uzorka. Detekcija ESBL posebni Protokol !
95
31.5.6 Haemophilus spp.

Izbor antibiotika Grupa A: Ampicillin, Trimethoprim/sulphametoxasol Grupa B: Cefotaxim( Ceftriaxon, Ceftazidim), Chloramphenicol, Meropenem Grupa C: Azitromycin, Aztreonam, Cefahlor, Imipenem, Ciprofloxacin (Ofloxacin), Rifampicin, Tetracyclin Podloga izbora je HTM (haemophilus test medium). Moe se koristiti i MHA sa dodatkom 3-5% hemolizirane konjske krvi (okoladni agar), ali su rezultati testiranja pouzdani samo za Ampicillin, Chloramphenicol, Amoxicillin/ klavulanska kiselina i Ampicillin + sulbactam. Ne stavljati vie od 4 diska na jednu plou!!! Za sojeve Haemophilus-a iz krvi i likvora, kao i u toku drugih tekih infekcija, u antibiogram se ukljuuju samo Ampicillin, jedan cefalosporin 3. generacije, Chloramphenicol i Meropenem. Za empirijsku terapiju infekcija respiratornog trakta izazvanih Haemophilus influenzae mogu se koristiti Amoxicillin/ klavulanska kiselina, Azitromycin, Clarytromycin, Cefahlor, Cefpodoxim i Cefuroxim (sve oralni antibiotici) ne moraju se rutinski testirati. Tumaenje nalaza Ako je soj S na Ampicillin istovremeno je S i na Amoxicillin. Veina sojeva R na Ampicillin i Amoxicillin su produktori betalaktamaza. Nitrocefinski test moe odrediti osjetljivost na Ampicillin i Amoxicillin. Izvjetavanje Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a izvjetavati u zavisnosti od vrste uzorka.
31.5.7 Neisseria gonorrhoeae

Izbor antibiotika
Penicillin, Tetracyclin, Ciprofloxacin Osjetljivost N. gonorrhoeae ispituje se samo kad za to postoje klinike indikacije (alergija na Penicillin, neodgovarajui kliniki odgovor). Za sojeve rezistentne na Penicillin testiranje se vri i na: Ceftriaxon i Cefoxitin.
96
Koristi se podloga za ispitivanje osjetljivosti gonokoka na antibiotike u uslovima sa 5-10% CO2 na 35C, 24 sata. Alternativna podloga je okoladni MHA ali se moe koristiti samo za Penicillin, Tetracyclin i Cefoxitim. Tumaenje rezultata Kod svih sojeva N. gonorrhoeae prvo treba uraditi beta-laktamaza test (Nitrocefinski test). Ako je nitrocefinski test pozitivan soj je rezistentan na Penicillin, Ampicillin i Amoxicillin (PPNG sojevi). U disk - difuzionom testu ovi sojevi imaju zonu inhibicije rasta oko diska Penicillina 19 mm. Sojevi sa zonom inhibicije rasta 19 mm oko diska Tetracyclina su potencijalno TRNG sojevi i za njih treba odrediti MIK dilucionom metodom.
31.5.8 Neisseria meningitidiis

N. meningitidis se ne testira disk- difuzionom metodom na: Penicillin, Ampicillin i Rifampicin obavezno treba uraditi MIK- ove E - testom Moe se uraditi oksacilin disk difuzioni test sa diskom Oxacillina na KMHA. Sojevi N. meningitidis sa zonom inhibicije rasta < 10 mm su potencijalno rezistentni na Penicillin i Ampicillin! Ovi sojevi imaju zonu inhibicije rasta 26 mm oko diska Penicillina Disk difuzioni test se moe uraditi i na okoladnom MHA.
31.5.9 Pseudomonas spp. i Acionetobacter spp.

Izbor antibiotika grupa A: Ceftazidim, Gentamycin, Piperacilin, grupa B: Amikacin, Aztreonam, Ciprofloxacin, Imipenem (Meropenem) grupa C: Cefotaxim (Ceftriaxon), Chloramphenicol, Trimethoprim/sulphametoxasol grupa U: Piperacilin, Cefotaxim (Ceftriaxon), Imipenem (Meropenem), Ceftazidim, Gentamycin, Amikacin, Ciprofloxacin Pseudomonas aeruginosa moe brzo da razvije rezistenciju na sve antibiotike (unutar 3- 4 dana od zapoete terapije), pa je zbog toga preporuljivo retestirati isti soj. Izvjetavanje
97
Ispitivanje rezistencije raditi za antibiotike iz grupa A, B i C, a izvjetavati u zavisnosti od vrste uzorka.
31.6
Inkubacija
Zasijane podloge sa postavljenim diskovima antibiotika se inkubiraju 18 24 h na odgovarajuoj temperaturi (uglavnom 35-37C) u aerobnim, mikroaerofilnim ili anaerobnim uslovima, zavisno od vrste bakterija koje se ispituju (tabela br.11). Ploe su okrenute poklopcem na gore. TABELA 11. Uslovi i vrijeme inkubacije za pojedine vrste bakterija
MIKROORGANIZAM Enterobacteriaceae Pseudomonas species Staphylococci Staphylococci (meticillin/oxacillin test) Haemolytic streptococci Enterococci Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae INKUBACIJA 18 - 20 sati, na 35- 37C 18 - 20 sati, na 35- 37C 18 - 20 sati, na 35- 37C 24 sata, na 30C 18 20 sati, na 35- 37C 24 sata, na 35- 37C 1820 sati, na 3537C, u uslovima sa 510 % CO2 1820 sati, na 3537C, u uslovima sa 5-10 %CO2 1820 sati, na 35-37C, u uslovima sa 510 % CO2 1820 sati, na 3537C, u uslovima sa 510 % CO2
31.7
itanje rezultata
Mjeraem sa milimetarskom podjelom se mjeri prenik zone
inhibicije rasta za pojedine antibiotike
Na osnovu njihove vrijednosti se vri procjena stepena osjetljivosti

ispitivanog bakterijskog soja na pojedine antibiotike
Procjena se vri u skladu sa kriterijumima koje postavlja proizvoa

tableta i diskova, tako to se prema izmjerenim vrijednostima prenika zone inhibicije rasta ispitivana bakterija svrstava u jednu od tri kategorije: S (sensitive) osjetljiva - Infekcija izazvana osjetljivim sojem lijei se uobiajenim (optimalnim) terapijskim dozama I (intermediate) umjereno osjetljiva - Infekcija izazvana umjereno osjetljivim sojem lijei se viim terapijskim dozama antibiotika R (resistant) otporna - Infekcija izazvana rezistentnim sojem ne moe se lijeiti ispitivanim antibioticima.
98
32
Identifikacija -laktamaza proirenog spektra
32.1
Opte napomene
Beta-laktamaze proirenog spektra (eng. extended spectrum
lactamases ESBL) najznaajniji su uzrok rezistencije na cefalosporine 2. i 3. generacije. Proizvodnju ESBL kodiraju geni plazmida tako da je irenje meu sojevima iste ali i razliitih vrsta jednostavno. Da bi otkrili produkciju ESBL koristimo screening testove i potvrdne testove. Testiraju se sojevi Klebsiella spp., Escherichia coli i Proteus spp. Ukoliko su izolati: Acinetobacter species, Pseudomonas aeruginosa i Stenothrophomonas maltophilia ESBL testove ne treba raditi. U ovih bakterija produkcija ESBL je mogu, ali rijedak uzrok rezistencije tako da se u rutinskom radu testiranje ne preporuuje. Osim toga, metode za screening i potvrdne testove za ove izolate jo nisu odreene. Produkcija ESBL je esto udruena sa rezistencijom na antibiotike koji ne pripadaju -laktamskim antibioticima. Bakterije sa ESBL produkcijom je teko otkriti ako su u pitanju sojevi sa inducibilnim AmpC hromozomalnim enzimima.
32.2
Screening test
Zasniva se na standardnoj metodi izrade antibiograma disk
difuzionom metodom uz korienje odreenih cefalosporina kao indikatora mogue produkcije ESBL (tabela br.12). Pri izboru indikator cefalosporina treba voditi rauna o tome da je ceftazidim indikator za TEM i SHV tipove, cefotaxim za CTX-M, a cefpodoxim za sve tipove, tako da se kao indikator cefalosporini mogu koristiti ili ceftazidim i cefotaksim ili samo cefpodoxim.
99
Za Enterobacteriaceae izolovane iz uzoraka vanbolnikih pacijenata

preporuuje se upotreba cefpodoxima u screening testovima. Osjetljivost ispitivanog bakterijskog soja se procjenjuje nakon mjerenja prenika zone inhibicije rasta u skladu sa kriterijumima koji su standardizovani.
TABELA 12. Kriterijumi za oitavanje prenika zone inhibicije rasta u cilju otkrivanja ESBL
Sadraj diska Cefotaxim, 30g Ceftazidim,30g Escherichia coli & Klebsiella Ceftazidim,30g, ostale vrste Cefpodoxim,10g Zone inhibicije rasta (mm) R, 29 21 27 19 S, 30 22 28 20 R, > 1 2 2 1 MIC (mg/L) S, 1 2 2 1
Screening test se smatra pozitivnim ukoliko je naena rezistencija na Ukoliko je screening test pozitivan treba uraditi potvrdne testove. Automatizovani sistemi (npr. Phoenix i Vitek) ugrauju testove za
otkrivanje ESBL preporukama. i predstavljaju alternativna rjeenja datim cefotaxim/ceftazidim ili na cefpodoxim.
32.3
Potvrdni testovi
Zasnivaju se na dokazivanju sinergije cefalosporin/klavulanat. Cilj im je iskljuivanje drugih mehanizama rezistencije. Koriste se sledei testovi: 1. kombinovani disk test, 2. E-test, 3. dvostruki disk test.
32.3.1 Kombinovani disk test Zasniva se na uporeivanju zona inhibicije rasta oko diska koji sadri
samo cefalosporin i diska koji sadri isti cefalosporin+klavulanat.
100
Na produkciju proirenog spektra -laktamaza ukazuje poveanje

prenika zone inhibicije rasta za 5 mm ili 50% u prisustvu klavulanata.
32.3.2 E-test Koriste se trake impregnirane sa jedne strane cefalosporinom, a sa

druge strane cefalosporin/klavulanat kombinacijom u opadajuem gradijentu koncentracija. Oitavanje se vri pomou skale odtampane na traci. Mjesto presjecanja granine linije zone inhibicije rasta i trake oznaava MIC. Test se zasniva na uporeivanju MIC samog cefalosporina i MIC kombinacije cefalosporin/klavulanat. Ukoliko je razlika u MIC vrednostima 8 radi se o ESBL. Testovi su komercijalno dostupni. Precizni su, ali i skuplji od kombinovanih disk testova.
32.3.3 Dvostruki disk test Zasnovan je na standardnoj metodi izrade antibiograma. Nakon
zasejavanja uz diskove koji su oznaeni kao indikator cefalosporini postavlja se i co-amoksiklav disk. Co-amoksiklav disk (20+10) se postavlja centralno, a sa lijeve i sa desne strane, na udaljenosti od 25-30mm se postavljaju diskovi cefotaxima i ceftazidima (odnosno cefpodoxima). Slijedi inkubacija 18-20 h, u aerobnim uslovima, 35-37C i oitavanje. Proirenje zone inhibicije rasta oko cefalosporina uz zonu inhibicije rasta oko co-amoksiklava ukazuje na bakterije proirenog spektra laktamaza (ESBL). Test je jeftin i jednostavan, ali su optimalna rastojanja izmeu diskova razliita za razliite sojeve, pa se zbog toga njegova primjena ne preporuuje.
32.4
Kontrola testova koji se koriste za otkrivanje ESBL

Kao pozitivne kontrole mogu se koristiti: Escherichia coli ( NCTC13353, NCTC-13351 i NCTC-13352) i Klebsiella pneumoniae (ATCCC-13392).
101
Kao negativne kontrole mogu se koristiti Escherichia coli NCTC

10418 ili ATCC-25922. Zone inhibicije rasta u negativnim kontrolama moraju biti iste ili varirati 2mm.
32.5
Tumaenje nalaza
Ukoliko dokaemo ESBL produkciju u nalazu naglaavamo da je
izolovani soj rezistentan na sve peniciline (izuzev temocillina), sve cefalosporine (izuzev cefoksitima) i aztreonam bez prethodne izrade antibiograma koji ukljuuju navedene antibiotike. Karbapenemi (imipenem, meropenem, ertapenem) su aktivni protiv bakterija sa ESBL ukoliko ne postoje neki drugi uzroci rezistencije.
102
33
DODATAK: Nain pripremanja hranljivih podloga koje ne postoje u prakastom obliku kao gotove za pripremanje podloga
Obogaeni okoladni agar

Sipati 5 gr hemoglobina u prahu u bocu od 500 ml sa perlama. Dodati 250 ml destilate (prvo malo da se razbije hemoglobin, a zatim Kuvati na plameniku uz esto mukanje, pa presuti u drugu
Erlermajerovu bocu bez perlica. U drugu Erlermajerovu bocu izmjeriti 18 gr GC medium baze (ili 19,5 gr Thayer Martin baza) i 250 ml vode, i to homogenizovati. To se sve sterilie 15 minuta na 121C u autoklavu (autoklaviraju se odvojeno hemoglobin i baza, pa se po autoklaviranju sjedine). Kad se podloga rashladi na 50C dodaje se 5ml poliviteksa (1 ml poliviteksa na 100 ml podloge), homogenizuje se i nakon toga se razliva u Petrijeve ploe. se dodaje do 250 ml).
Selektivni okoladni agar za Haemophilus spp.

Sipati 5 gr hemoglobina u prahu u Erlermajerovu bocu od 500 ml sa
perlama. Dodati 250 ml destilate (prvo malo, da se razbije hemoglobin, zatim dodati do 250 ml). kuvati na plameniku uz esto mukanje, a zatim presuti u drugu Erlermajerovu bocu bez perlica. Podlogu sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C i nakon toga je ohladiti na 50C. U tako ohlaenu podlogu dodati bacitracin (2 ml bacitracina na 500 ml podloge) i 5 ml dodatka sa X i V faktorima rasta (1ml ovog dodatka na 100 ml podloge). U drugu Erlermajerovu bocu izmjeriti 18 gr GC medum baze i 250ml vode, i to homogenozovati. Sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C. Kad se podloga ohladi na 50C, pomijeati sadraj iz obje boce. Tako pripremljenu podlogu razliti u Petrijeve ploe.
103
VCN okoladni agar

Otopiti 18 gr GC AGAR BASE u 250 ml destilovane vode i sterilisati
u autoklavu 15 minuta na 121 C. U drugu tikvicu (sa perlama) sipati 5 gr hemoglobina u prahu i dodati 250 ml vode (prvo malo, da se razbije hemoglobin, zatim dodati ostatak do 250 ml). Kuvati na plameniku uz esto mijeanje i presuti u drugu Erlermajerovu bocu bez perli. Sterilisati u autoklavu 15 minuta na121C. Autoklaviran i ohlaen na 50C sadraj iz obje tikvice se sjedini i doda se 5 ml dodatka sa X i V faktorima rasta i 5 ml VCN dodatka (1 ml na 100 ml podloge). Tako pripremljena podloga se razliva u Petrijeve ploe.
Podloga za anaerobe
Otopiti 10,4 gr BRAINT HEART INFUSION AGAR u 200 ml
destilovane vode.
Sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C. Kad se autoklavira i ohladi na 50C dodati 0,2 ml vitamina K, 0,5 ml
pripremljenog i sterilisanog hemoglobina i 10 ml defibrinisane ovije krvi. Tako pripremljenu podlogu razliti u Petrijeve ploe.
Selektivna podloga za Campylobacter spp.

Otopiti 10 gr podloge COLUMBIA AGAR u 250 ml destilovane vode
i sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C. Kad se ohladi na 50C dodati 5-10% (15 ml) defibrinisane ovije krvi i 2,5 ml dodatka sa mjeavinom antibiotika za Campylobacter podlogu (jedna flaica se rastvara sa 2 ml aqua redestilata) Tako pripremljenu podlogu razliti u Petrijeve ploe.
Podloga za ispitivanje osjetljivosti gonokoka na antibiotike

Otopiti 7,2 gr MEDIUM BASE u 100 ml destilovane vode.Zagrijevati
na plameniku do kljuanja (da kljua oko 1 minut).
104
Sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121C. Ohladiti na 50C i dodati

dodatak sa X i V faktorima rasta: 2ml na 100 ml podloge. Lagano mijeati u jednom pravcu 3 puta i 3 puta u drugom pravcu (da se ne stvore mjehurii). Tako pripremljenu podlogu razliti u Petrijeve ploe (ne spaljivati ploe).
34
Literatura
1. Bradbury S.M. Collection of urine specimens in general practice-to clean or not to clean? J R Coll Gen Pract 1988; 38: 363-365. 2. Cheesbrough M. Collection and transport of specimens. Examination of specimens. In: Medical laboratory manual for tropical countries. Cheesbrough M. Ed. 100-199. Butterworth-Heinemann Ltd. Cambridge, 1993. 3. Health Protection Agency. National Standard Method. http://www.hpastandardmethods.org.uk/ 4. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C. The role of the mycrobiology laboratory in the diagnosis of infectious diseases: guidelines to practice and management. In: Diagnostic microbiology. Winters R. Ed. 1-15. J.B.Lippincott Company, Philadelphia, 1992. 5. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C. Guidelines for collection, transport, processing, analiysis, and reporting of cultures from specific specimen types. In: Diagnostic microbiology. Winters R. Ed. 61-104. J.B.Lippincott Company, Philadelphia, 1992. 6. Kunin C.M. Detection, prevention and management of urinary tract infections: A manual for physician, nurse and allied health worker. 2nd ed. Lea and Febriger, Philadelphia, 1974. 7. Mahon C.R., Manuselis G. Laboratory diagnosis of gastrointestinal pathogens. In: Diagnostic microbiology. Fabion K. Ed. 965. Saunders, Philadelphia, 2000. 8. Pelemi M.R., Lavadinovi L. Antimikrobna terapija gram negativnih infekcija. U: Antibiotici 2001. Prostran M. Ed. 231-275. Zavod za udbenike i nastavna sredstva, Beograd, 2001. 9. Radna Grupa za standardizaciju metodologije i interpretacije rezultata antibiograma, Srpsko lekarsko drutvo-Mikrobioloka sekcija. Izmene i dopune Prirunika za izradu antibiograma, Institut za imunologiju i virusologiju Torlak, Beograd, 2001.
105
10. Shanson D.C. Blood culture technique: current controversies. J Antimicrob Chemother 1990; 25(suppl): 17-29. 11. kerk V. Infekcije mokranog sustava-novosti u patogenezi i lijeenje. Medicus 2003; 12(2): 197-204. 12. vabi-Vlahovi M., uki-Ivanevi S., Daki I., Mija-Vasiljevi V., Opavski N. Uzimanje i slanje materijala na bakterioloki pregled. U: Praktikum iz mikrobiologije i imunologije. Jovanovi T. i sar. Eds. 16-23. Savremena administracija, Beograd, 2000.
www.mzd.gov.me

NV Bakteriologija MNE

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

NV Bakteriologija MNE

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

NV Bakteriologija MNE

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Crna Gora

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ministarstvo zdravlja Sekcija ljekara mikrobiologa Drutva ljekara Crne Gore

Laboratorijska dijagnostika u klinikoj bakteriologiji

Podgorica, 2012. godine

Laboratorijska dijagnostika u klinikoj bakteriologiji

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa grla

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa nosa

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa nazofarinksa

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

krvni agar endo agar selektivni okoladni agar za Haemophilus

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje sadraja apscesa i dubokih rana

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

podloga za anaerobne bakterije: anaerobno, 35-37C, 48 h (moe i do

okoladni agar: u uslovima sa 5-10% CO2, 35-37C, 48 h

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje brisa koe i povrinskih rana

sadraj iz ulkusa moe se uzeti irigaciono-aspiracionom metodom

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

krvni agar endo agar

Najei uzronici infekcija opekotina:

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Najei uzronici infekcija ulkusa i dekubitusa:

Najei uzronici paronihije:

Najei uzronici folikulitisa:

Najei uzronici celulitisa:

Najei uzronici infekcije ujeda:

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

Bakterije koje uzrokuju erysipelas:

Bakterija koja uzrokuje erysipeloid:

Bakterije koje uzrokuju ecthyma gangrenosum:

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

Ispitivanje tkiva i biopsija

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

Optimalno vrijeme transporta do laboratorije za tkiva i materijal

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA U KLINIKOJ BAKTERIOLOGIJI

TABELA 2. Hranljive podloge, uslovi inkubacije i ciljni mikroorganizmi Za sve uzorke:

40h i petog dana

5-10% CO2 anaerobno

svakodnevno 40h i petog dana

U sledeim situacijama dodati:

40h, sedmog i desetog dana

Nacionalne smjernice dobre klinike prakse

Inkubacija Temp. 35-37 i 25-30 Atmosfera aerobno Vrijeme 40-48h*

Standardni medijum Sabouraud agar

itanje kulture 40h i nakon osam nedelja

Ciljni organizmi Fungi

LowensteinJensen-ov medijum Staph/strep selektivni agar

Nakon 28 dana 40-48h*

Svaka 3-4 dana dnevno