HROMATOGRAFIJA

Izoterme

Fizikohemijska metoda razdvajanja komponenti smee zasnovana na njihovoj razliitoj raspodeli izmeu stacionarne i mobilne faze

Razdvajanje Izolovanje Identifikacija Odreivanje

2. 1. OPTA PODELA
PLANARNA
Tankoslojna (TLC) Papirna (PC) Elektrohromatografija

Prema agregatnom stanju

(mobilna / stacionarna faza) 1. Teno vrsta

U KOLONI
Gasna (GC) Tena (LC)

2. Teno Tena 3. Gas vrsta 4. Gas Tena

3.

Prema nainu pomeranja faza

4.

Prema cilju

1. Eluirajua 2. Frontalna 3. Istiskujua 4. Kombinovana

1. Analitika (kvalitativno-kvantitativna) 2. Preparativna

5. Prema fiziko-hemijskom procesu

na granici faza
1. Adsorpciona 2. Podeona (particiona) 3. Jonoizmenjivaka

POSEBNI TIPOVI HROMATOGRAFIJA

Gel hromatografija Afinitetna hromatografija

Adsorpciona hromatografija

Particiona hromatografija

Komponenta

adsorbovana
na povrinu stacionarne faze

Komponenta

rastvorena u
tenoj stacionarnoj fazi koja je vezana za nosa stacionarne faze

1. Van der Waalsove sile 2. Vodonina veza 3. Jonske sile 4. Koordinativne veze 5. Asocijacija dipola 6. Sposobnost graenja kompleksa

Gel hromatografija

Afinitetna hromatografija

Veliki molekuli Mali molekuli

prodiru u unutranjost pora gela ne prodiru u pore gela

Jedna vrsta molekula iz smee biva vezana specifinim reverzibilnim vezama za stacionarnu fazu

Gel filtracija Hromatografija molekulskog prosejavanja Ograniena difuziona hromatografija

Podela hromatografskih metoda i osnovne karakteristike

Mode
Stationary Phases chemistry Typical Stationary Phases

Hromatografija normalnih faza

Size Exclusion
Sieving by size

Normal Phase
Polarhydrophilic

Reversed Phase
Non-polarlipophilic

Ion exchange
Ionbonding

Chiral
Chiral recognition

Affinity
Bioaffinity

Za razdvajanje polarnih jedinjenja

Silica, Alumina

Alkylated silica, mostly C18

Ionic functional groups on silica or polymer Water; buffers; acid; base

Chiral groups on silica surfaces

Either substrates or biomolecules,

Gel type polymers

S M

Polarna (voda vezana za SiO2, Al2O3) Nepolarna (heksan, izopropiletar)

Typical mobile phase

Hexane; isopropanol; methylene chloride

Water; methanol; acetonitril; buffers; ion pairing agents Almost all organic compounds

Two modes: aqueous and non-aqueous

Water; buffers

Two modes: aqueous and nonaqueous

Hromatografija reversnih faza

Za razdvajanje nepolarnih jedinjenja

Typical solutes

Fatty and oily

Any ioncharged compounds

Enantiomers small and large molecules

Biomolecules or their substrates

Polymers: synthetic or biological

S M

Nepolarna (n-oktil, n-oktadecil) Polarna (voda, metanol, acetonitril)

Redosled eluiranja NP ELUIRANJE RP ELUIRANJE

(nepolarna mobilna faza) (polarna mobilna faza)

Normalnih faza

Reversnih faza

Jako polarna komponenta Srednje polarna komponenta Nepolarna komponenta

Skala polarnosti jedinjenja

Kiseline Amini Alkoholi Aldehidi Ketoni Estri Etri Halogena jedinjenja Ugljovodonici
O p a d a nj e p o l a r n o s t i

TENOTENA PODEONA HROMATOGRAFIJA

Parovi tenih faza

Stacionarna faza
Polietilenglikol

Mobilna faza
Pentan ili cikloheksan Pentan ili cikloheksan Izooktan ili heksan Izooktan ili heksan

Stacionarna faza (tena)

Mobilna faza (tena)

,-oksi-dipropionitril Dimetilsulfoksid Etilendiamin

Stacionarna faza
(voda adsorbovana na nosa)

Vodaetanol ili vodaglikol Ugljovodonici i polimeri

Heksanugljentetrahlorid Vodaetanol

Nosa stacionarne faze

(silikagel, dijatomejska zemlja, staklene kuglice) Vodaetanolizocijanat Hloroformcikloheksannitrometan

Uticaj stacionarne faze na separaciju

Zahtevi za stacionarnu fazu

C18

C8 1. Hemijska indiferentnost 2. Nerastvorljivost u mobilnoj fazi Silikagel

Uticaj stacionarne faze na separaciju

Mobilna faza
Jednokomponentna i viekomponentna

Zahtevi za mobilnu fazu

1. Rastvorljivost ispitivanih komponenti smee (polarnost) 2. istoa, bez stranih primesa organskog i neorganskog porekla (filtriranje) 3. Osloboena mehuria gasova (deaerizovana) 4. Viskoznost 5. Protok 6. Temperatura 7. pH mobilne faze 8. Kompatibilnost sa detektorom 9. Ne menja karakteristike kolone

Sastav mobilne faze

Uticaj temperature na separaciju

Uticaj pH na razdvajanje

Uticaj pH na razdvajanje i redosled eluiranja

Kolona: Develosil ODS-UG-5 150 x 4.6 mm Mobilna faza: Metanol/20mM natrijum-fosfat pH3.0, pH7.0, pH10 (35:65 V/V) Protok: 1.0 mL/min. Temperatura: 30 C Detekcija: UV 254 nm

Sample:
1. Pyridoxine 2. Amiloride 3. Pyridine 4. Benzylamine 5. Procainamide 6. N-Methylbezylamine 7. N-Acethylprocainamide

Promena vrednosti pH mobilne faze of 2,9 do 4,1 i uticaj na retenciona vremena kiselih i baznih jedinjenja

Uticaj protoka mobilne faze na separaciju

S poveanjem pH mobilne faze smanjuje se retenciono vreme kiselih jedinjenja (crni hromatogram)

Uticaj sastava mobilne faze na viskoznost

IZOKRATSKO I GRADIJENTNO ELUIRANJE

IZOKRATSKO I GRADIJENTNO ELUIRANJE

Izooktan/hloroform (90:10 V/V)

IZOKRATSKO I GRADIJENTNO ELUIRANJE

Izooktan/hloroform 100 % izoooktan Po 5 % poveanja sadraja hloroforma

1. Metoksi-4-benzaldehid; 2. etoksi-3-hidroksi-4-benzaldehid; 3. metoksi-3-hidroksi-4-benzaldehid; 4. 4-hidroksi-benzojeva kiselina

IZOKRATSKO I GRADIJENTNO ELUIRANJE

Hromatografski parametri

1. Retenciono vreme tr 2. Korigovano retenciono vreme tr 3. Retencioni faktor k 4. Faktor selektivnosti 5. Faktor rezolucije Rs

Retenciono vreme
tr
Povrina pika

Retenciono vreme
trB trA t

t0
Povrina pika

t r

W1/2

A t0

W
Injektovanje

t (min.)

Injektovanje

WA

WB

t (min.)

10

Retencioni faktor k
Mera zadravanja komponente u koloni

Retenciono vreme tr (=) s, min., h

Vreme koje protekne od unoenja uzorka u kolonu do pojave maksimuma pika

k' =
k << 1

t r t0 t0

Redukovano (korigovano) retenciono vreme tr

Vreme koje ispitivana supstancija provede u stacionarnoj fazi

Eluiranje suvie brzo (komponenta bez zadravanja prolazi kroz kolonu) Eluiranje suvie dugo

t r' = t r t0

k > 2030 1 < k < 10

Idealni uslovi

Efikasnost kolone
Kolona mora dati otre, nerazvuene, simetrine pikove (Gausovi) Broj teorijskih platoa (N) HETP High Equivalent to one Theoretical Plate (H) Visina ekvivalentna teorijskom platou Redukovana visina (h) Asimetrija pika (As)

t N = 16 r W

tr N = 5,54 W 1/ 2

11

L H= N
Efikasnost se poveava ukoliko je
broj teorijskih platoa vei, a visina platoa manja Redukovana visina

ASIMETRIJA PIKA (A)

A10 = A5 =
a10 b10

b10 a10 b5 a5

A = 1 Gausov pik (idealno) 1 < A < 1,2

h=

H dp

dp prenik estica stacionarne faze a5 b5

10 % h 5%h

SEPARACIONA MO KOLONE
X Faktor selektivnosti () Y Faktor rezolucije (razdvajanja) (Rs)

Faktor rezolucije

Rs =
Rs < 1 Rs = 1 Rs > 1,2

Faktor selektivnosti

' kB = ' kA

2T WA WB

Pikovi nisu dovoljno razdvojeni Izvreno razdvajanje od 90 % Zadovoljavajue razdvajanje

>1

12

Faktor rezolucije

Korigovanje hromatografskih parametara i k N H

Promenom sastava mobilne faze, temperature ili punjenja kolone Promenom duine kolone Promenom brzine protoka mobilne faze, veliine estica punjenja kolone ili viskoznosti mobilne faze

Promena duine kolone i protoka mobilne faze

Dua kolona i manji protok mobilne faze (A)

bolja separacija

13

k < 1

k > 10

14

1 < k < 10

1 < k < 10

Rs

9 1 < k < 10 9 >1 9 Rs > 1,2

(1) Rezervoar mobilne faze (2) Ureaj za deaerizaciju (3) Gradijent petlja (4) Rezervoar za meanje sastojaka mobilne faze (5) Pumpa (6) Petlja u poloaju "inject position", (6') Petlja u poloaju "load position (7) Mesto za injektovanje (8) Predkolona (9) Kolona (10) Detektor (11) Kompjuter (12) Kolektor

15

Kvalitativna i kvantitativna analiza

16

A N A L I T I K A L E K O V A

PRIMENA HPLC U FARMACEUTSKOJ ANALIZI

ISTRAIVANJA

RAZVOJ

PROIZVODNJA

KONTROLA KVALITETA

1. Novi lek 2. Preklinika i klinika 3. Farmakokinetika

1. Nove metode 2. Validacija 3. Transfer metode

Procesna kontrola

Aktivna supstancija Identifikacija i odreivanje Neistoe Stabilnost Rastvorljivost Ujednaenost sadraja ...

Kolona: Shodex RSpak DS-613 Mobilna faza: Fosfatni pufer (pH 7,2)acetonitril 75:25 (V/V) Protok: 1,0 mL/min. Detekcija: 254 nm Temperatura: 40 C

Kolona: Shodex Asahipak ODP-50 4D Mobilna faza: Fosfatni pufer (pH 11,0)acetonitril 75:25 (V/V) Protok: 0,5 mL/min. Detekcija: 254 nm Temperatura: 30 C

17

Kolona: Develosil ODS-UG-5 150 x 4,6 mm Mobilna faza: Acetonitril-Na soheksansulfonske kiseline + fosfatna kiselina (8:92 V/V) Protok: 1,0 mL/min. Temperatura: 40 C Detekcija: 210 nm

Kolona: Develosil ODS-UG-5 150 x 4,6 mm Mobilna faza: Acetonitril-voda (55:45 V/V) Protok: 1,0 mL/min. Temperatura: 40 C Detekcija: 254 nm

Sample 1. Ascorbic acid 2. Nicotinic acid 3. Nicotinamide 4. Calcium (+) - pantothenate 5. Pyridoxal hydrochloride 6. Pyridoxine hydrochloride 7. Pyridoxamine hydrochloride 8. Thiamin 9. Folic acid 10. (+)-Biotin 11. Riboflavin

Sample 1. Estriol 2. Beta-Estradiol 3. Estron

Ko je uinio dobro delo neka uti. Neka govori onaj koji ga je primio.
Kolona: Shodex RSpak DE-413 Mobilna faza: Natrijum-fosfatni pufer (pH 4,5)-acetonitril (50:50 V/V) Protok: 0,6 mL/min. Detekcija: 254 nm Temperatura: 40 C

Seneka

18