Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Sveuilite u Zagrebu Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologije

Preddiplomski studij: EKOINENJERSTVO Kolegij : MIKROBIOLOGIJA MIKROSKOPSKO PROUAVANJE MORFOLOGIJE MIKROORGANIZAMA (III)

Dr. sc. Felicita Briki, red. prof. fbriski@fkit.hr

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Sadraj III dijela

GRAA SLOENOG SVJETLOSNOG MIKROSKOPA MO RAZDVAJANJA LEE RADNA DALJINA OBJEKTIVA MIKROMETRIJA PRIPRAVA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE BOJENJE BAKTERIJSKIH STANICA BOJENJE BAKTERIJSKIH ENDOSPORA BOJENJE BAKTERIJSKIH AHURA OSTALE VRSTE MIKROSKOPA

GRAA SLOENOG SVJETLOSNOG MIKROSKOPA

Mehaniki dijelovi: 1. Podloga 2. Stalak 3. Tubus s revolverom 4. Stoli 5.Makrovijak i mikrovijak 6. Izvor svjetlosti

Optiki dijelovi: 1. Okulari 2. Objektivi 3. Kondenzor

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

MO RAZDVAJANJA LEE Mo razdvajanja je sposobnost lee da: ISTAKNE FINE DETALJE I

STRUKTURU STANICE ODNOSNO RAZDVOJI DVIJE TOKE KOJE SU VRLO BLIZU

Mo razdvajanja ovisi o: - Indeksu refrakcije ( ) sredstva kroz koje svjetlost prolazi prije ulaska u objektiv - Valnoj duljini svjetlosti () - Numerikoj aperturi (NA) lee objektiva

NA = sin
- kut koji tvore zrake svjetlosti dolazei iz kondenzora i prolazei kroz preparat

Mo razdvajanja (d) je vea to je valna d = duljina upotrijebljene svjetlosti () kraa, NA

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

RADNA DALJINA OBJEKTIVA Radna daljina je najmanja udaljenost izmeu preparata i lee objektiva pri kojoj se slika jasno vidi

IMERZIJSKA TEKUINA (anisol, cedrovo ulje) koristi se pri mikroskopiranju s imerzijskim objektivom da se sprijei rasipanje zraka svjetlosti Kod vlanog preparata - stavlja se na pokrovnicu ispod koje je preparat na predmetnici i lee imerzijskog objektiva
imerzijski objektiv ( 100) imerzijska tekuina pokrovnica predmetnica

OBJEKTIVI: malo poveanje, srednje poveanje i imerzijski

Kod obojenog preparata stavlja se izravno na preparat na predmetnici (suspenzija kulture prethodno fiksirana, obojena i preparat osuen)

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Shematski prikaz poprenog presjeka mikroskopa s preparatom

U mikrobiolokim istraivanjima bitno je odrediti dimenzije stanica. Kod svjetlosnog mikroskopa to se obavlja : a) okularnim mikrometrom (sadri brojanu ljestvicu)
i

MIKROMETRIJA

b) objektnim mikrometrom (sadri 100 podjeljaka neobrojanih, a ukupne duljine 1 mm)

10

Prije mjerenja treba badariti okularni mikrometar i badarenje provesti za sve objektive .

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

PRIPRAVA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE i PROMATRANJE MIKROBNIH STANICA

Odreivanje pokretljivosti bakterijskih stanica:

- Metoda visee kapi (udubljena pokrovnica, kap suspenzije u udubinu, rubovi namazani vazelinom, obrnuti predmetnicu i poklopiti pokrovnicu. Ponovo rotirati i promatrati pod mikroskopom). Bakterijske stanice

ivi mikroorganizmi vlani preparat, visea kap,

ubodni agar Fiksirani mikroorganizmi bojanje preparata

Vlani preparat:
suspenzija mikroorganizama mikrobioloka uica, predmetnica i pokrovnica

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

- Metoda ubodnog agara (poluvrsti hranjivi agar u epruveti inokulirati s bakterijskom kulturom i inkubirati 24 h. Pokretljive stanice e rasti i na veoj udaljenosti od samog mjesta uboda ezom u odnosu na nepokretne stanice. Nepokretne stanice Pokretne stanice

Vlani preparati se rabe za izravno istraivanje

mikroorganizama u normalnome ivom stanju. Meutim veina stanica su propusne za svjetlo i gotovo su bezbojne pa je oteano njihovo promatranje. Da bi se stanice bakterija mogle promatrati pod mikroskopom potrebno je primijeniti razliite postupke bojenja.

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

BOJENJE BAKTERIJSKIH STANICA

Svrha usporedba morfolokih oblika i raspored bakterijskih stanica Jednostavno tijekom bojenja primjenjuje se otopina koja sadri samo jedno bojilo (karbolfuksin, metilensko modrilo) Sloeno ili diferencijalno zahtijeva upotrebu najmanje triju kemijskih reagensa (najpoznatije bojenje po Gramu) Bojanje endospora primjenom kemijskih reagensa

Diferencijalno bojenje po Gramu

Ukazuje na debljinu stanine stijenke bakterije. Priprava preparata: A. Suspenzija mikroorganizama (ista ili mjeovita kultura), mikrobioloka uica, predmetnica

Kap suspenzije kulture priprava razmaza Bojanje ahura - primjenom kemijskih reagensa

suenje razmaza

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

B. Postupak bojanja po Gramu

Gram pozitivne stanice Gram negativne stanice

Objanjenje zato se stanice oboje Gram pozitivno ili Gram negativno

Fiksiranje Kristalviolet Lugol Ispiranje etanolom Kontrastno bojilo Safranin

PEPTIDOGLIKAN

PEPTIDOGLIKAN

MEMBRANA

MEMBRANA PERIPLAZMA LIPOPOLISAHARID + PROTEIN

Deblja stanina stjenka

Tanja stanina stjenka

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Dokazivanje ispravnosti dokazane reakcije na bojanje po GRAMU

Jedna od reakcija - test kalijevim hidroksidom (KOH): a) b) na predmetnicu kapnuti 2 kapi 3%-tne KOH mikrobiolokom uicom uzeti koloniju bakterije izrasle na vrstoj podlozi, dodati u KOH i mijeati 30 s tijekom mijeanja podizati uicu i ukoliko vise vlakna dokaz je da je prisutna gram negativna kultura. (KOH razara staninu stjenku, oslobaajui DNK i tvorei vlakna).

BOJANJE BAKTERIJSKIH ENDOSPORA

Bakterije: anaerobni rodovi Clostridium i Desulfotomaculum i aerobni rod Bacillus Tvore endospore kada su nepovoljni okolini uvjeti kao: 1. nedostatak hranjivih tvari 2. nedostatak vode ili 3. nagomilavanje produkata metabolizma

c)

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Postupak bojenja po Shaefer-Fultonu Svrha uoiti oblik i poloaj endospore u bakterijskoj stanici. Postupak: 1. Suspenzija bakterijske kulture razvue se na predmetnicu 2. Preparat osui na zraku i fiksira iznad plamena 3. Na preparat nanijeti primarno bojilo malahitnozelenilo 4. Zagrijavati predmetnicu s bojilom 315 sekundi 5. Preparat oprati pod mlazom vode 6. Obojiti kontrastnim bojilom safraninom (3-5 min)

Preparat promatrati pod mikroskopom primjenom imerzijskog objektiva U vidnom polju mikroskopa pojaviti e se zeleno obojene endospore i crveno obojene vegetativne stanice bakterija.

Vegetativne stanice

Endospore

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

BOJANJE BAKTERIJSKIH AHURA (kapsula)

ahura elatinozni vanjski sloj stanice (polisaharidi, glikoproteini, polipeptidi) Teko se oboji postupkom diferencijalnog bojenja, jer je tvar od koje je sainjena ahura topiva u vodi, pa moe biti isprana tijekom ispiranja preparata. Postupak bojenja: - bakterijsku suspenziju ezom umutiti u indijski tu - zatim obojiti metilenskim modrilom Preparati se tijekom bojenja ne zagrijavaju

Fotografski snimak sluzavih kolonija Bacillus antharcis koje tvore ahure (lijevo) i stanice obojene indijskim tuem (desno)

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Mikroskopija u tamnom polju

Koristi se za promatranje mikroorganizama koji se :
- ne vide pod svjetlosnim mikroskopom, - ne mogu se obojiti stanice ili se - bojanjem iskrivljuju njihova obiljeja Kondenzor s tamnim poljem, prolaze samo difraktirane zrake u leu objektiva Mikroskopski preparat se pojavljuje kao svijetla slika na tamnoj pozadini Pogodno za promatranje bakterija, kvasaca

Primjeri:
Kvasci: Candida tropicalis i Trichosporon sp.

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Fazno-kontrastna mikroskopija
Fazno-kontrastni mikroskop koristi prstenastom pregradom (dijafragma) kondenzor s

Primjer: 4 faze razvoja razvoja bakterijske stanice

Doputa krunom snopu svjetla prolazak kroz kondenzor, fokusiranje svjetla na preparat i ulazak difraktiranog svjetla u leu objektiva Ovaj postupak omoguava: Prouavanje unutranje strukture u ivim organizmima

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Mikroskop s fluorescencijom Funkcionira na osnovi fluorescencije tvari. Fluorescentne tvari apsorbiraju zrake kratke valne duljine (UV) i otputaju svjetlo koje ima dulje valne duljine, to se moe vidjeti posebnim filtrima. Primjer: fluorokromno bojilo auramin O sjaji uto pod UV, pa kada su tako obojene stanice Mycobacterium tuberculosis, one se vide kao jasni uti oblici na tamnoj pozadini

Primjer: stanice Bacillus subtilis u fazi sporulacije

Crveno odreivanje DNK Zeleno proteini Plavo sF transkripcijska aktivnost Enzim galaktozidaza

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Primjer: konzorcij nitrificirajuih bakterija

Usporedba razliitih tipova mikroskopa

Tip mikroskopa Max. poveanje Mo razdvajanja SVJETLOSNI 1500 100-200 nm TAMNO POLJE 1500 100-200nm FAZNO-KONTRASTNI 1500 100-200 nm FLUORESCENTNI 1500 100-200 nm ELEKTRONSKI Transmisijski 500.000 - 1.000.000 1 nm Pretrani 10.000 1.000.000 1-10 nm

Zeleno bakterije koje oksidiraju NH4+ Crveno bakterije koje oksidiraju NO2-

Fakultet kemijskog in inenjerstva i tehnologije Sveuili ilite u Zagrebu

Fakultet kemijskog in inenjerstva Sveuili ilite u Zagrebu i tehnologije

Primjer: bakterija Salmonela snimljena pod transmisijskim elektronskim mikroskopom

Pitanja za ponavljanje
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Navedite optike i mehanike dijelove sloenog mikroskopa. to je mo razdvajanja lee objektiva i o emu ovisi (objasniti sve lanove u izrazu)? Koja je uloga imerzijske tekuine u mikroskopiji? Navedite radne daljine pojedinih objektiva. to je mikrometrija i kako se badari mikroskop? Opiite pripravu vlanog preparata. Kako se odreuje pokretljivost bakterijskih stanica? Navedite svrhu i vrste bojenja bakterijskih stanica. Koja je svrha bojanja i opiite postupak diferencijalnog bojanja po Gramu. Koja je svrha jednostavnog bojanja bakterijskih stanica i opiite kratko postupak rada? Koja je svrha bojenja endospora i opiite ukratko postupak bojenja po Shaeffer-Fultonu? Opiite postupak bojenja ahura. Navedite ostale vrste mikroskopa i njihovu ulogu u mikroskopiji.