115

Nhng v#n '( v( k* thu,t c.n '!/c quan tm khi p d1ng

PCR v real-time PCR trong phng th nghi3m ch4n 'on
S6 khc bi3t gia phng th nghi3m ch4n 'on v phng th nghi3m nghin c7u
Phng th nghim nghin c$u l phng th nghim m cc th' nghim )%*c th,c hin
)- )p $ng m/t nhu c1u nghin c$u no ) nh3m gip nh nghin c$u gi5i )p m/t v6n
)8 c9a khoa h;c. K<t qu5 c9a m/t phng th nghim nghin c$u khng lin quan tr,c ti<p
v t$c th=i )<n quy<t )?nh c9a ng%=i g'i mAu xt nghim, do vCy trong chDn nui hay
th9y s5n sE khng lin quan )<n quy<t )?nh h9y hay c lCp m/t qu1n th- gia sc hay tm
c, hay trong y h;c khng lin quan )<n quy<t )?nh )i8u tr? c9a bc sG trn bnh nhn. Do
vCy k<t qu5 c9a phng th nghim nghin c$u sE khng c1n thi<t ph5i k?p th=i )<n tay
ng%=i g'i mAu xt nghim.
Phng th nghim chIn )on l phng th nghim c nhim vJ chnh y<u l lm xt
nghim trn cc mAu th' )- pht hin )%*c tc nhn gy bnh v tr5 l=i k<t qu5 )<n
ng%=i g'i yu c1u xt nghim )- h; th- cho cc cch gi5i quy<t cJ th- trn cc vCt ch9
)%*c l6y mAu g'i )i xt nghim. Trong chDn nui hay th9y s5n, k<t qu5 c9a m/t phng
th nghim chIn )on sE r6t quan tr;ng v c lin quan )<n quy<t )?nh c9a giKi hLu trch
)- tiu h9y hay c lCp m/t b1y )n gia sc hay tm c. Trong y h;c, phng th nghim
chIn )on cn )%*c g;i l phng th nghim lm sng v k<t qu5 xt nghim sE )%*c cc
nh lm sng tham kh5o )- )%a ra pht )M )i8u tr? trn bnh nhn. Chnh v vCy m/t
phng th nghim chIn )on ph5i l phng th nghim khng chN cho k<t qu5 chnh xc
m cn ph5i cho k<t qu5 k?p th=i )<n tay ng%=i lm xt nghim.
Vic $ng dJng PCR v real-time PCR trong chIn )on ) trO nn ngy cng dP dng v
)y l m/t cng ngh mO, phng th nghim c th- t, pha ch< cc thuQc th' )- th,c hin
th' nghim. Ngoi ra, nhu c1u s' dJng PCR v real-time PCR trong chIn )on ngy cng
nhi8u v c nhi8u tc nhn gy bnh chN c th- chIn )on hay theo di )%*c b3ng cng
ngh PCR v real-time PCR. Khng chN vCy, hin nay trn th< giKi, cng ngh PCR chIn
)on sRp h<t b5n quy8n nn )ang c s, bng nS cc s5n phIm chIn )on d,a trn cng
ngh PCR v real-time PCR )%*c nhi8u hng s5n xu6t cung c6p. Do vCy, c th- ni PCR
hin nay khng cn b hTp trong cnh c9a c9a cc phng th nghim nghin c$u m )
d1n d1n xm nhCp vo trong cc phng th nghim chIn )on.

116
Tuy nhin vic p dJng PCR v real-time PCR trong chIn )on cUng )i hVi ng%=i lm
th nghim ph5i bi<t quan tm )<n cc v6n )8 kW thuCt c lin quan )- k<t qu5 xt nghim
)Yt )%*c )/ chnh xc cao, v )Yt )%*c )/ nhYy c5m tuyt v=i )ng nh% b5n ch6t c9a
PCR v real-time PCR, v ph5i k?p th=i )<n tay ng%=i chN )?nh xt nghim.
Cc v#n '( k* thu,t c.n quan tm p d1ng PCR v real-time PCR trong ch4n 'on
1. Tin trnh xt nghi$m PCR v real-time PCR
K- tZ khi l6y mAu th' g'i )<n phng th nghim )- lm xt nghim PCR hay real-
time PCR chIn )on cho )<n khi k<t qu5 xt nghim )<n tay ng%=i cho chN )?nh xt
nghim, ti<n trnh sE qua cc b%Kc m trong m[i b%Kc )8u c nh%ng v6n )8 kW thuCt r6t
c1n )%*c quan tm bOi ng%=i lm xt nghim, ng%=i l6y mAu xt nghim, v ng%=i
nhCn )- s' dJng k<t qu5 xt nghim ny. S& '( 3 d%Ki )y trnh by cc b%Kc trong
m/t ti<n trnh xt nghim.













L6y v chuy-n mAu th' )i lm
xt nghim PCR/realtime PCR
ChuIn b? mAu th' v tch chi<t
nucleic acid tZ mAu th'
Th,c hin ph5n $ng khu<ch )Yi
nucleic acid (PCR/real-time PCR)
Lm th nghim )- );c k<t qu5
Phn tch k<t qu5
Cc v6n )8 kW thuCt trong
l6y v g'i mAu th'
Cc v6n )8 kW thuCt trong
tch chi<t nucleic acid (NA)
Cc v6n )8 kW thuCt trong
khu<ch )Yi NA
Cc v6n )8 kW thuCt trong th nghim
);c KQ v trong phn tch KQ
S' dJng k<t qu5 xt nghim
PCR/real-time PCR
Cc v6n )8 kW thuCt trong
s' dJng k<t qu5
S !" 3: Tin trnh m$t xt nghi'm PCR/real-time PCR ch(n +on v cc v,n +- k/ thu2t c3n +45c quan tm
V
6
n

)
8

n
g
D
n

n
g
Z
a

n
h
i
P
m

c
h

o


v

l
o
Y
i

t
r
Z

n
g
o
Y
i

n
h
i
P
m

s
5
n

p
h
I
m

k
h
u
<
c
h

)
Y
i


117
2. Cc v*n ', k- thu0t c1n quan tm
a. Cc v6n )8 kW thuCt c1n quan tm khi l6y v g'i mAu th'
MAu th' )%*c l6y lm xt nghim PCR/real-time PCR l cc mAu )%*c l6y tZ vCt
ch9 tYi n+i m ng%=i l6y mAu cho l c th- c s, hin din c9a nucleic acid c9a tc
nhn )ch, do vCy ph5i l6y mAu th' )ng chS. V dJ )- pht hin M. tuberculosis gy
lao phSi trn bnh nhn th mAu th' ph5i l6y l )m hay d?ch ht tZ r'a kh/ph< qu5n,
khng th- l6y mu hay huy<t thanh. Hay muQn pht hin Cytomegalovirus trong bnh
nhn th mAu th' tQt nh6t l mu tan ph1n )- tch huy<t t%+ng hay tch bYch c1u,
khng th- l mu )ng )- tch huy<t thanh )%*c.
VCt liu dng )- l6y v giL mAu th' cUng ph5i )%*c quan tm v n<u khng, cc
nucleic acid c9a tc nhn )ch c trong mAu sE b? phn h9y hay mAu th' sE ch$a cc
ch6t $c ch< ph5n $ng khu<ch )Yi sau ny. Do vCy vCt liu tQt nh6t )- l6y v giL mAu
th' l cc vCt liu tinh sYch v8 m\t sinh h;c, nghGa l khng nhiPm cc protein hay cc
nuclease ti<t ra tZ cc vi sinh vCt nh% endonuclease, ribonuclease; v chN s' dJng m/t
l1n, khng nn )%*c r'a xi lYi. Hnh 59 m t5 m/t sQ vCt liu nn )%*c s' dJng )-
l6y v giL cc mAu th' lm xt nghim PCR/qPCR. Cc vCt liu ny hin c s]n tYi
cng ty Nam Khoa.







^- b5o qu5n v chuyn chO mAu th v6n )8 kW thuCt c1n quan tm l lm th< no
mAu giL nguyn trYng, nucleic acid c9a tc nhn )ch khng b? phn h9y trong qu
trnh b5o qu5n. Do vCy )Qi vKi cc mAu m nucleic acid )ch c1n pht hin l DNA th
c th- b5o qu5n ngRn ngy (trong vng 48 gi=) O t9 mt 2-8
o
C, cn n<u b5o qu5n lu
di th c1n giL -18
o
C )<n -30
o
C. ^Qi vKi RNA, n<u l cc mAu t hay khng b? tYp
nhiPm nh% mu, d?ch c+ th- th c th- b5o qu5n 48 gi= O 2-8
o
C, nh%ng )Qi vKi cc mAu





Hnh 59: Cc l7 v tube nh4 th ny nn +45c s8 d:ng +< l,y v gi= cc m>u th8 lm xt nghi'm PCR/qPCR

118
tYp nhiPm nhi8u nh% qut h;ng, qut mUi sau tm virus, )m...hay c1n b5o qu5n di
ngy th ph5i giL mAu O -70
o
C. ^- chuyn chO mAu th chN c1n chuyn chO trong thng
lYnh vKi th=i gian chuyn chO khng qu 48 gi=. N<u th=i gian chuyn chO lu h+n th
r6t c1n ph5i giL trong ) kh.
Ni chung, cc v6n )8 kW thuCt )%*c nu ln l chN nh3m m/t mJc tiu, ) l l6y
mAu cho )ng chS l n+i c s, hin din c9a nucleic acid )ch muQn tm, ph5i giL v
chuyn chO mAu th' )<n phng th nghim trong )i8u kin sao cho nucleic acid muQn
tm khng b? phn h9y cUng nh% mAu th' khng b? nhiPm cc ch6t sinh h;c gy $c ch<
ph5n $ng khu<ch )Yi v mAu th' khng bi nhiPm cho.
b. Cc v6n )8 kW thuCt trong chuIn b? mAu th' v tch chi<t nucleic acid
Trong khu ny, mJc tiu chnh l ph5i lm sao tch chi<t )%*c tQi )a nucleic acid
)ch d l%*ng nucleic acid c9a tc nhn )ch c nhV v c b? pha long qu th6p trong
mAu th'. Tch chi<t thu )%*c ph5i tinh khi<t, khng lAn cc protein hay ch6t gy $c
ch< ph5n $ng khu<ch )Yi.
Ty loYi mAu th' v cUng ty loYi tc nhn )ch c trong mAu th' m c nhLng
mAu th' c th- )%a vo tch chi<t nucleic acid ngay, nh%ng cUng c nhLng mAu th'
c1n ph5i )%*c chuIn b? tr%Kc khi )%a vo tch chi<t nueic acid (NA). V dJ cc mAu
th' nh% huy<t thanh, huy<t t%+ng, c6y t< bo...vKi cc tc nhn )ch nh% virus hay cc
vi khuIn c c6u tYo t< bo khng )\c bit th c th- )%a vo tch chi<t nuleic acid ngay,
nh%ng vKi cc mAu th% nh% mAu m, mAu sinh thi<t hay cc vi khuIn c c6u tYo t< bo
)\c bit nh% M. tuberculosis, n6m men, n6m s*i, m th,c vCt nh% cy-l-rP-hoa th c1n
ph5i )%*c )%a vo chuIn b? tr%Kc )- cc c6u trc c9a m tan )i (vdJ ph5i s' l
proteinase K), )- t< bo vO ra (vdJ dng cc ch6t tIy TRITON X100, hay tn siu m,
hay nghi8n trong nitrogen lVng...), hay nh% trong tr%=ng h*p cc lt cRt sinh thi<t )c
sp th c1n ph5i loYi bV sp khVi m, ho\c cc mAu c cc ch6t nh1y nh% )m th c1n
ph5i lm tan nh1y (b3ng NALC...) tr%Kc khi )%a vo tch chi<t nucleic acid...Do vCy,
ng%=i lm xt nghim c1n ph5i bi<t khng chN cc mAu th' no c1n ph5i qua giai );an
x' l mAu tr%Kc khi tch chi<t NA m cn ph5i bi<t ph5i s' dJng ph%+ng php g vKi
qui trnh kW thuCt nh% th< no.

119
Ty loYi mAu th'; ty loYi tc nhn )ch l vi khuIn, virus, vi n6m, hay t< bo c
nhn; v ty NA ph5i tch chi<t l DNA hay RNA m ph5i l,a ch;n ph%+ng php tch
chi<t cho ph h*p, khng nn lAn l/n. V dJ ph%+ng php Boom r6t tQt )- tch chi<t
cc d?ch sinh h;c hay cc mAu th' t lAn DNA c9a vCt ch9 v nguyn tRc l d,a vo s,
h6p phJ c9a DNA trn hYt silica, nn n<u mAu c qu nhi8u DNA vCt ch9 nh% cc m
sinh thi<t th DNA tc nhn )ch sE b? cYnh tranh khng bm )%*c vo hYt silica. Do
vCy, )- tch chi<t DNA cho cc mAu th' l m v sinh thi<t th nn ch;n ph%+ng php
phenol/chloroform h+n l ph%+ng php BOOM. CUng khng th- s' dJng ph%+ng php
tch chi<t cho RNA vo )- tch chi<t DNA, do vCy m chng ta th6y ph%+ng php
BOOM r6t tQt cho tch chi<t DNA nh%ng lYi r6t km cho tch chi<t RNA. Khi l,a ch;n
ph%+ng php hay b/ thuQc th' tch chi<t cho tc nhn virus hay vi khuIn )ch, cUng
ph5i xem kW b/ tch chi<t hay ph%+ng php tch chi<t NA m mnh )ang l,a ch;n c
p dJng )%*c cho vi khuIn hay virus khng? V c khi s, th6t bYi trong xt nghim
PCR l do nhLng s, v ny.
Tch chi<t NA l m/t khu r6t quan tr;ng; tch chi<t NA ph5i )5m b5o )%*c )/
nhYy th xt nghim PCR mKi c th- )Yt )%*c )/ nhYy mong muQn. Do vCy khi t, pha
m/t b/ thuQc th' tch chi<t NA hay khi s5n xu6t m/t b/ thuQc th' tch chi<c NA,
tr%Kc khi )%a vo s' dJng trong xt nghim PCR/real-time PCR, phng th nghim hay
nh s5n xu6t ph5i ki-m tra ch6t l%*ng )- xem b/ tch chi<t c )5m b5o )%*c )/ nhYy
hay khng. Ph%+ng php ki-m tra l ph5i th' trn cc )/ pha lang c9a m/t tc nhn
)ch (l )Qi t%*ng m phng th nghim hay ng%=i dng sE ph5i s' dJng b/ tch chi<t
NA )- th,c hin xt nghim) hay c9a m/t tc nhn khc t%+ng )%+ng. ^Yt )/ nhYy l
b/ tch chi<t NA khi th' nghim trn cc )/ pha long tc nhn )ch ny ph5i )Yt )%*c
giKi hYn pht hin (limit of detection, LOD), t$c l )Yt )%*c sQ l%*ng vi khuIn )ch
th6p nh6t c trong m/t )+n v? th- tch mAu th' m ph%+ng php hay b/ th' nghim c
th- tch chi<t v pht hin )%*c.
Minh h;a d%Ki )y (hnh 60) l m/t k<t qu5 ki-m tra ch6t l%*ng b/ kit tch chi<t
DNA tn l
NK
DNAPREP-BOOM do cng ty Nam Khoa s5n xu6t v )%*c ki-m tra
ch6t l%*ng. Ph%+ng php ki-m tra l s' dJng cc )/ pha long c9a vi khuIn M.
tuberculosis, cho vo tch chi<t DNA vKi b/ thuQc th' ) s5n xu6t )Mng th=i so snh
vKi b/ thuQc th'
NK
DNAPREP-BOOM )%*c s5n xu6t tr%Kc ). K<t qu5 ki-m tra cho

120
th6y b/ thuQc th'
NK
DNAPREP-BOOM mKi s5n xu6t v b/ thuQc th'
NK
DNAPREP-
BOOM s5n xu6t tr%Kc ) )8u )Yt )%*c kh5 nDng tch chi<t vi khuIn )ch )<n )/ pha
lang 10
-4
, ch$a 1 vi khuIn trong m/t th- tch 100ml d?ch vi khuIn )%a vo tch chi<t.
Trong ph%+ng php ny n<u huy8n d?ch vi khuIn c b? gi5m ch6t l%*ng th k<t qu5
ki-m tra vAn c th- );c )%*c nh= c so snh
NK
DNAPREP-BOOM mKi s5n xu6t vKi
NK
DNAPREP-BOOM s5n xu6t l tr%Kc ) v l ny ) )Yt ch6t l%*ng.













Khng chN ki-m tra ch6t l%*ng cc b/ thuQc th' tch chi<t NA )%*c pha ch< tr%Kc
khi s' dJng, m ngay c5 trong m[i l1n s' dJng )- lm xt nghim, b/ thuQc th' tch
chi<t cUng ph5i )%*c ki-m sot )/ nhYy b3ng cch cho nucleic acid ch$ng n/i tYi O
nMng )/ LOD vo mAu ch$ng [-] v n<u muQn, c th- cho vo mAu th' )- )%*c th,c
hin tch chi<t cng lc vKi cc mAu th' (xem ph1n ch$ng n/i tYi).
c. Cc v6n )8 kW thuCt trong khu<ch )Yi nucleic acid )ch
V8 nguyn tRc th PCR/real-time PCR )Yt )%*c )/ nhYy r6t cao, tuy nhin trn
th,c t< th )/ nhYy cn ty thu/c r6t nhi8u vo s, thi<t k< hay ch;n l,a mMi; vo thi<t
b? lun nhit; vo ha ch6t, )\c bit l enzyme Taq polymerase )%*c s' dJng. Khu
Hnh 60: Kt qu@ ki<m tra ch,t l45ng b$ thuAc th8
NK
DNAPREP-BOOM do cng ty Nam Khoa s@n xu,t. BAi
t45ng dng +< ki<m tra b$ thuAc th8 l huy-n dCch vi khu(n M. tuberculosis TB1 chEa 10.000 t bo vi
khu(n/ml +45c pha long theo h' sA 10 +< c 1,000 t bo vi khu(n/ml (T2), 100/ml (T3), 10/ml (T4), v
1/ml (T5). Ph46ng php ki<m tra l s8 d:ng b$ thuAc th8
NK
DNAPREP-BOOM c3n ki<m tra v b$
NK
DNAPREP-BOOM +45c s@n xu,t tr4Gc + +< thHc hi'n tch chit trn cc huy-n dCch vi khu(n + pha
long ny, th< tch huy-n dCch +< tch chit l 100ml, rIi l,y 10ml dCch tch chit +< chJy PCR pht hi'n
M. tuberculosis. Pht hi'n DNA cKa M. tuberculosis c trong dCch tach chit qua +i'n di pht hi'n s@n
ph(m khuch +Ji 249bps. Kt qu@ cho th,y c@ hai b$ thuAc th8
NK
DNAPREP-BOOM mGi v cK +-u +Jt
LOD l 1 t bo vi khu(n M. tuberculosis trong th< tch tch chit.

121
khu<ch )Yi sE r6t kh )Yt )%*c )/ nhYy v duy tr )/ nhYy trong qu trnh l%u trL n<u
nh s5n xu6t hay ng%=i lm th nghim khng ch;n l;c Taq polymerase )- s' dJng.
Ngoi cc y<u tQ kW thuCt c1n ph5i quan tm O trn, )- )5m b5o )%*c )/ nhYy c9a
khu khu<ch )Yi, n<u t, pha hay s5n xu6t PCR mix cho ph5n $ng khu<ch )Yi, ng%=i
lm th nghim hay nh s5n xu6t ph5i ki-m tra )/ nhYy c9a cc PCR mix tr%Kc khi )%a
vo s' dJng. Ph%+ng php ki-m tra l th' nghim trn cc )/ pha lang c9a DNA )ch
) bi<t tr%Kc sQ l%*ng copy trong m/t )+n v? th- tch. PCR mix )%*c g;i l )Yt )/
nhYy khi )Yt )%*c giKi hYn pht hin (LOD) l m/t copy DNA )ch cho vo PCR mix,
nghGa l trong th- tch mAu cho vo PCR mix chN c1n c 1 copy DNA )ch l c th- cho
k<t qu5 khu<ch )Yi thnh nhi8u b5n sao c th- pht hin )%*c khi phn tch k<t qu5
(xem mJc ki-m tra )/ nhYy c9a PCR mix ) pha O bi PCR-cc v6n )8 c+ b5n).













Bi2u '( 16 minh h;a m/t k<t qu5 ki-m tra ch6t l%*ng real-time PCR mix dng
mMi v Taqman probe )- pht hin v )?nh l%*ng HBV-DNA do cng ty Nam Khoa
s5n xu6t. K<t qu5 ki-m tra cho th6y )/ nhYy c9a PCR mix )Yt LOD l 1 copy cho m/t
th- tch mAu cho vo PCR mix, )y chnh l )/ nhYy )i hVi c9a PCR/real-time PCR
chIn )on.
Bi%u !" 16: Kt qu@ ki<m tra ch,t l45ng real-time PCR mix s8 d:ng mIi v Taqman probe +Cnh l45ng HBV-
DNA. Kt qu@ ki<m tra cho th,y +$ nhJy cKa PCR mix +Jt LOD 1 copy HBV-DNA trong m$t th<
tch m>u cho vo PCR mix. Cc +4Lng bi<u diNn mu xanh sng l +4Lng bi<u diNn khuch +Ji
cKa chEng n$i tJi +45c cho vo PCR mix O nIng +$ LOD cng vGi m>u ki<m tra.
10,000
1,000
100
10
1

122
Ngoi vic ki-m tra ch6t l%*ng cc PCR mix tr%Kc khi )%a vo s' dJng, ng%=i
lm xt nghim khi th,c hin xt nghim PCR cUng ph5i ki-m sot cho )%*c )/ nhYy
c9a PCR mix )%*c s' dJng trong m[i l1n lm xt nghim. Th,c hin v6n )8 ki-m sot
ny l m/t )i8u kin bRt bu/c v d PCR mix c )%*c ki-m tra )Yt ch6t l%*ng sau khi
pha ch< hay s5n xu6t, vAn c th- gi5m ch6t l%*ng trong qu trnh l%u tr' hay b5o qu5n,
)\c bit khi )%*c pha ch< b3ng nguMn Taq polymerase khng )5m b5o ch6t l%*ng.
C nhi8u cch )- ki-m sot ch6t l%*ng PCR mix m[i khi lm xt nghim
PCR/real-time PCR chIn )on. C th- s' dJng ch$ng [+] l DNA )ch )%*c pha s]n
hay )%*c nh s5n xu6t cung c6p O nMng )/ LOD cho vo PCR mix trong m[i l1n lm
xt nghim PCR/real-time PCR chIn )on, hay c th- s' dJng DNA ch$ng n/i tYi s'
dJng chung mMi )%*c pha O nMng )/ LOD cho vo PCR chung vKi tch chi<t DNA tZ
mAu )- ki-m sot $c ch< PCR v )Mng th=i ki-m sot )/ nhYy c9a PCR mix (xin xem
thm O cc mJc ch$ng n/i tYi, ch$ng d%+ng, v ch$ng m trong ph1n cc chuIn m,c
v ki-m sot ch6t l%*ng cho xt nghim PCR/real-time PCR dnh cho chIn )on).
d. NgZa nhiPm cho v loYi trZ ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi
MuQn s' dJng PCR/real-time PCR trong chIn )on, ng%=i lm xt nghim ph5i
nhCn din )%*c )- c cc bin php kW thuCt ngDn ngZa hay loYi trZ cc nguy c+ ngoYi
nhiPm lm cho mAu th' khng c tc nhn )ch lYi b? c k<t qu5 d%+ng tnh khi lm xt
nghim, nghGa l b? nguy c+ d%+ng tnh gi5. NgoYi nhiPm trong xt nghim PCR/real-
time PCR chIn )on c th- xy ra do hai nguyn do.
Nguyn do th$ nh6t l nhiPm cho lm cho mAu m hay cc thuQc th' lm xt
nghim b? nhiPm nucleic acid )ch tZ cc mAu d%+ng. VKi nguyn do ny th ng%=i
lm th nghim han tan c th- phng ngZa )%*c b3ng cc b/ tr phng th nghim
m/t cch h*p l vKi cc ph%+ng tin v thi<t b? ph h*p, v dJ thi<t k< )- khu v,c pha
cc thuQc th' cch xa khu lm mAu; khng )- lAn l/n cc thuQc th' ) pha v )ang
dng vKi cc nguyn liu v dung d?ch sE )%*c dng )- pha thuQc th'; cc dJng cJ v
ti liu dng trong khu v,c lm mAu khng )%*c )em qua khu v,c pha thuQc th';
khng )- phng th nghim vi sinh nui c6y tc nhn )ch trong phng th nghim
PCR/real-time PCR chIn )on pht hin )ng tc nhn ). Ngoi cch bQ tr phng th
nghim lm vic cho h*p l, ng%=i lm xt nghim PCR/real-time PCR ph5i )%*c

123
hu6n luyn )- nhu1n nhuyPn cc thao tc v trng )\c bit trong )ng mO tube, chai l;,
thao tc pipetting, trong bQ tr cc vCt liu v dJng cJ khi thao tc...
^Qi vKi nguyn do th$ hai l ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi th chN vKi cc gi5i
php kW thuCt nh% ) nu trn vAn kh c th- trnh )%*c nguy c+ ny, l do l trong
m/t phng xt nghim PCR/real-time PCR chIn )on, s5n phIm PCR sE tch tJ ngy
cng nhi8u v chRc chRn khng sKm th mu/n cc s5n phIm PCR ny sE nhiPm vo cc
dJng cJ, thuQc th', thi<t b?...v )<n m/t lc no ) ng%=i lm xt nghim sE nhCn dYng
)%*c th5m h;a ny khi cc mAu xt nghim PCR )8u cho k<t qu5 d%+ng tnh. ^<n lc
ny th chN c m/t gi5i php l )S bV tan b/ thuQc th', kh' nhiPm tan b/ phng th
nghim, )ng c9a vi thng...RMi lYi mO c'a lm lYi, rMi th5m h;a ti xu6t hin...M t5
nh% vCy )- chng ta th6y r3ng khng th- c bin php no hiu qu5 )- ngZa ngoYi
nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi, m chN c m/t cch duy nh6t ) l ph5i loYi trZ )%*c nguy
c+ ny. ^- lm )%*c )i8u ny th cch duy nh6t l phng th nghim PCR chIn )on
ngay tZ )1u ph5i s' dJng cc PCR mix c pha thm dUTP v UNG. C+ ch< loYi trZ
)%*c ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi b3ng dUTP v UNG ) )%*c ni chi ti<t trong
mJc loYi trZ ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi c9a bi PCR-cc v6n )8 c+ b5n.
Qua phn tch nh% trn, chng ta th6y l n<u muQn lm )%*c xt nghim PCR
chIn )on, khng th- khng s' dJng bin php dng PCR mix c pha dUTP v UNG.
N<u khng p dJng bin php ny, khng sKm th mu/n, th5m h;a ngoYi nhiPm s5n
phIm khu<ch )Yi sE xy ra. Tuy nhin cUng c cc v6n )8 kW thuCt khi dng dUTP v
UNG v n<u khng ch;n )%*c enzyme UNG hiu qu5 v ph h*p th )/ nhYy c9a
PCR/real-time PCR sE gi5m v/hay khng th- c hiu qu5 loYi trZ ngoYi nhiPm s5n
phIm khu<ch )Yi. Chnh v vCy ng%=i s' dJng ph5i ki-m tra )/ nhYy v ki-m tra kh5
nDng loYi trZ ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi c9a PCR mix )%*c cng bQ l c
dUTP v UNG. Hin nay t6t c5 cc hng n%Kc ngoi s5n xu6t cc PCR mix dng cho
PCR/real-time PCR chIn )on )8u s' dJng dUTP v UNG. TYi Vit Nam, cng ty
Nam Khoa l cng ty tin phong v hng )1u p dJng gi5i php ny. T6t c5 cc b/
thuQc th' PCR/real-time PCR dng trong chIn )on do cng ty Nam Khoa s5n xu6t
)8u s' dJng PCR mix c dUTP v UNG b3ng nguMn ha ch6t ch;n l;c )- )5m b5o
khng gi5m )/ nhYy m hiu qu5 loYi trZ ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi vAn cao
vKi b3ng ch$ng ki-m tra ch6t l%*ng v8 )/ nhYy lun )i km vKi s5n phIm.

124
e. Cc v6n )8 kW thuCt trong th' nghim )in di trn thYch )- );c k<t qu5
^Qi vKi ph%+ng php PCR cS )i-n th muQn );c )%*c k<t qu5, ng%=i lm th
nghim ph5i lm ti<p th nghim )- xc )?nh )%*c trong Qng ph5n $ng c s5n phIm
khu<ch )Yi )\c hiu hay khng. Ph%+ng php th%=ng )%*c p dJng nh6t trong cc
phng th nghim PCR chIn )on l dng kW thuCt )in di )- xc )?nh kch th%Kc s5n
phIm khu<ch )Yi c )ng nh% kch th%Kc mong muQn hay khng. Chnh v )y l
ph%+ng php th%=ng )%*c s' dJng nh6t, nn chng ti xin )%a ra )y m/t sQ v6n )8 kW
thuCt c1n )%*c ng%=i lm th nghim quan tm.
Ch;n t_ l % agarose )- )in di cho ph h*p vKi kch th%Kc s5n phIm khu<ch
)Yi. Trung bnh nh6t l dng t_ l 2%. ^Qi vKi cc s5n phIm khu<ch )Yi lKn trn
500bps th nn dng agarose 1.5%, cn )Qi vKi cc s5n phIm khu<ch )Yi kch
th%Kc d%Ki 100bps th nn dng agarose trn 2.5%.
Khi pha gel agarose, l%u l ph5i lm tan han tan agarose trong )m )in di,
v )- lm )%*c )i8u ny ph5i cho agarose vo bnh ) c s]n m/t t dung d?ch
)m din di, nh= vCy trnh agarose b? bm vo )y bnh rMi sE khng tan )%*c sau
khi )un. Tr%Kc khi cho vo l vi sng ph5i lRc tr/n )- agarose ha )8u trong dung
d?ch )m. Khi )un, ph5i t nh6t hai l1n l6y bnh ra khVi l vi sng )- lRc tr/n )8u
rMi mKi cho vo )un ti<p. Ph5i )5m b5o agarose tan )8u trong dung d?ch )m,
khng cn th6y l*n c*n d r6t nhV. C nh% vCy mKi c k<t qu5 )in di tQt.
Tr%Kc khi )S agarose vo khun, ph5i )5m b5o khun n3m trn m\t ph`ng n3m
ngang ki-m tra b3ng bng kh )- b8 dy c9a agarose thCt s, dy )8u nh% nhau v
k<t qu5 )in di sE chnh xc h+n
Trong PCR chIn )on, khng nn tr/n )m t5i vKi s5n phIm PCR trn gi6y
paraffin v lm nh% vCy sE gy nguy c+ ngoYi nhiPm. Nn cho )m t5i vKi th- tch
b3ng th- tch c9a dung d?ch ph5n $ng c trong tube PCR rMi tr/n ngay trong
tube.
Th- tch mAu cho vo gi<ng khng nn qu t m ph5i tZ 15ml trO ln v c nh%
vCy mKi c th- pht hin )%*c cc k<t qu5 [+] y<u
Lun )in di km vKi thang DNA v )y l m/t chuIn khng chN dng )- xc
)?nh kch th%Kc c9a cc vYch )in di trong cc mAu m cn l m/t chuIn )- ki-m

125
sot ch6t l%*ng c9a )in di. G;i l ch6t l%*ng din di tQt khi thang DNA tch )%*c
nhau r rng v )9 t6t c5 cc vYch c9a thang.
Trong m/t k<t qu5 )in di chuIn m,c cho PCR chIn )on cn c1n ph5i c m/t
gi<ng cho ch$ng [+] )- so snh kch th%Kc c9a s5n phIm khu<ch )Yi trong vYch
)in di tZ cc gi<ng ch$a mAu, v m/t gi<ng cho ch$ng m )- ch$ng minh qu
trnh lm xt nghim PCR chIn )on khng b? ngoYi nhiPm (xem chuIn m,c cho
PCR/real-time PCR chIn )on). Hnh 61 minh h;a mt k<t qu5 chuIn m,c c9a
xt nghim PCR );c qua )in di, phn tch trn hnh chng ta sE th6y lun c
ch$ng [+], ch$ng [-] v thang DNA.
Ph5i thay dung d?ch )m din di trong mng )in di trong vng khng qu 1
tu1n )- )5m b5o ch6t l%*ng )in di lun tQt.
N<u khng muQn ti<p xc vKi ethidium bromide, m/t ha ch6t c ti8m nDng
gy ung th% mYnh, th c th- s' dJng cc mu hynh quang chn khc t )/c hYi
h+n nh% SYBR (SYBR safe c9a Invitrogene), hay han tan khng )/c hYi nh%
GelRed hay GelGreen (c9a Biotium). Tuy nhin gi5i php ny sE mRc ti8n h+n r6t
nhi8u.
N<u ph5i s' dJng ethidium bromide th ph5i tuyt )Qi ch cc bin php an
tan. Cc bin php an tan khi s' dJng ethidium bromide )%*c trnh by ti<p
theo )y.

MK Thang DNA
1 ChEng [+]
2 WSSV [+]
3, 4 WSSV [+], IC [+]
5 WSSV [-], IC [+]
6 ChEng [ -]

MK 6 5 4 3 2 1
633bps (WSSVout+)
221bps (WSSVin+)
#260bps (WSSVout/in+)
195bps (IC+)

Hnh 61: Minh h7a m$t kt qu@ nonstop nested PCR pht hi'n WSSV +45c thHc hi'n tJi cng ty Nam Khoa.
L4u kt qu@ di'n di ph@i lun lun c cc chEng [+], chEng [-], v ph@i c thang DNA


126
f. Bin php an tan khi s' dJng ethidium bromide
Ti sao ph#i thao tc v%i ethidium bromide?
Ethidium bromide (EB) l m/t loYi mu chn (intercalating dye) c )\c )i-m chn
vo cc s*i )i DNA v lm cc s*i )i ny pht huanh quang )%*c d%Ki nh sng c,c
tm. D,a vo )\c )i-m c+ b5n ny c9a EB m trong sinh h;c phn t', ng%=i th,c hin
th' nghim th%=ng dng EB )- nhu/m cc bDng )in di (cc vYch DNA tch bit nhau
d,a vo kch th%Kc sau khi )in di trn thYch hay trn gel polyacrylamide) v pht hin
cc bDng ny qua h/p )n UV trn m\t knh l;c.
^- c th- nhu/m cc bDng DNA trn thYch )in di, ng%=i ta c th- cho EB pha
vo trong thYch khi )S thYch hay nhu/m thYch sau )in di b3ng cch ngm thYch )in
di vo chCu n%Kc c pha EB. Tua thu/c vo s, ch;n l,a %u )i-m no m ng%=i lm
th' nghim c th- ch;n cch pha EB vo thYch hay cc nhu/m EB sau khi )in di.
Cch pha EB vo thYch th sE cho php );c k<t qu5 ngay sau khi )in di nh%ng lYi lm
cho ton b/ h thQng mng-khay-l%*t )in di )8u b? nhiPm EB. Cch nhu/m EB sau
)in di th giL )%*c h thQng mng-khay-l%*t )in di khng b? nhiPm EB nh%ng ph5i
ch= )<n 30 pht sau khi )in di )- nhu/m EB rMi mKi );c )%*c k<t qu5.
Thao tc an tan v%i Ethidium bromide
V )\c )i-m chnh c9a EB chn vo cc s*i )i DNA nn EB )%*c xem v )
)%*c ch$ng minh l m/t ch6t sinh ung th% mYnh. Do vCy ng%=i s' dJng EB lm th
nghim ph5i tun theo cc qui tRc an ton )- trnh nguy c+ ti<p xc tr,c ti<p vKi EB.
Sau )y l m/t sQ qui tRc an ton nn tun th9:
PhJ nL )ang c thai, cho con b, hay )ang d, tnh mang thai khng nn lm
vic trong phng th nghim c s' dJng EB.
Trong phng th nghim ph5i c hai thng ch$a ch6t th5i c nhiPm EB: m/t
thng dnh cho ch6t lVng v thYch, m/t thng dnh cho ch6t rRn nh% gDng tay,
gi6y lau, )M nh,a. TYi cc n%Kc tin ti<n, hai thng ch6t th5i ny ph5i )%*c g'i )i
hu_ bV m/t cch )\c bit. TYi Vit Nam, chng ta ch%a c m/t c+ quan no )$ng
ra x' l cc loai ch6t th5i )\c bit nguy hYi nh% EB nn tYm th=i c th- x' l nh%
sau tr%Kc khi cho vo rc y t<: ) l tr%Kc khi cho ch6t th5i vo thng, ph5i lt
thng vKi bao nylon dy )- ch6t th5i )%*c cho vo bao nylon ch$ khng ti<p xc

127
tr,c ti<p vKi thng, ngm ch6t th5i vKi cloramin P 10% (ch6t th5i lVng hay thYch)
hay rRc tr,c ti<p b/t choramin P (ch6t th5i rRn) v giL t nh6t 1 thng tr%Kc )- EB
b? cloramin P phn hu_ tr%Kc khi giao qua x' l rc y t<.
Trnh tuyt )Qi nguy c+ ti<p xc tr,c ti<p EB qua cc bin php nh% sau:
(1) Khi cn hay pha EB th ph5i mang gDng tay, khIu trang, v )eo knh b5o
v. Sau khi cn th b6t c$ cc dJng cJ no ti<p x$c vKi EB k- c5 gDng tay, khIu
trang )8u ph5i cho vo thng ch$a ch6t th5i rRn. Nn dng que xc ho ch6t b3ng
nh,a )- xc EB khi cn v sau ) bV que xc ny )i cng vKi gDng tay ch$ khng
nn dng que xc ho ch6t b3ng inox v chng ta khng th- )5m b5o lau sYch EB
sau khi cn.
(2) N<u pha EB vo trong thYch th ph5i dng m/t chai )un thYch khng nhiPm
EB v sau khi ) )un tan hon ton thYch, chng ta cho thYch vo m/t chai th$ hai
l chai th%=ng dng )- tr/n EB vo thYch. Ch= thYch trong chai th$ 2 ny ngu/i
)<n 50
o
C rMi mKi cho EB vo (th%=ng m[i 50ml thYch, chN cho 1-2l EB
10mg/ml), trnh cho EB vo thYch khi thYch cn nng v nguy c+ EB bQc ln cng
vKi h+i n%Kc khi thYch cn nng. Sau khi )S thYch vo mng, chai ch$a thYch c
nhiPm EB ph5i )%*c sc b3ng n%Kc )- lm sYch thYch v n%Kc sc chai ny ph5i
)%*c cho vo thng ch$a ch6t th5i EB lVng. Ph5i )eo gDng, khIu trang v knh b5o
v khi thao tc, v sau khi thao tc, ph5i bV gDng tay v khIu trang cUng nh% )1u
pipette ht EB vo thng ch$a th5i EB rRn. Micropipette dng )- ht EB l chN
)%*c chuyn dng )- ht EB, ph5i )%*c ghi ch pipette nhiPm EB v )%*c giL
ring trong m/t h/p c ghi ch h/p ch$a nhiPm EB. TQt nh6t thao tc tr/n EB
vo thYch v )S EB vo trong mng )in di ph5i )%*c th,c hin trong m/t hood
pha ho ch6t )/c c p su6t m v kh th5i qua l;c h6p phJ ho ch6t tr%Kc khi )%a
ra ngoi (biosafety class I). N<u khng c t9 ny th nn t, )ng m/t t9 )S thYch
trn nRp t9 l my ht l;c than hoYt tnh (xem hnh 62) v l;c ny ph5i )%*c thay
m[i 4-6 thng m/t l1n. Sau khi thYch )\c hon ton, n<u ch%a s' dJng th c th-
giL thYch nguyn trong khun rMi cho vo bao nylon dy c m/t t dung d?ch )m
)in di rMi hn hay c/t ming lYi. Thao tc cho thYch vo bao nylon ph5i thCt s,
thCn tr;ng )- trnh m\t ngoi bao b? nhiPm EB. Bao nylon ch$a thYch ph5i cho
vo giL trong t9 mt 2-8
o
C tYi m/t ngDn hay h/p dnh ring cho )<n khi s' dJng.

128
Bao nylon ch$a thYch sau khi dng xong ph5i cho vo thng ch$a th5i rRn. ThYch
sau khi )in di n<u ch%a dng h<t cc gi<ng th khng l6y khVi mng )in di m
nn )- lYi ngay trong mng )in di cho )<n khi dng h<t (khng nn qu 1 tu1n).
ThYch )in di sau khi dng h<t th ph5i cho vo thng ch$a th5i EB lVng. Dung
d?ch )m )in di cUng vCy, ph5i thay sau m[i tu1n v dung d?ch )m bV )i ph5i )S
vo thng th5i EB lVng, khng )%*c )S vo chCu r'a trong phng th nghim.
Mng-khun-l%*t )in di sau khi dng nn ngm r'a trong m/t chCu nh,a ring
c ghi ch chCu r'a nhiPm EB v d?ch r'a ny ph5i )%*c )S vo thng ch$a th5i
EB lVng. Ph5i c m/t h/p ch$a ring )- giL cc mng-khun-l%*t nhiPm EB v
ph5i ghi ch h/p ch$a nhiPm EB. Ph5i mang gDng tay khi s= )<n cc mng hay
h/p ch$a nhiPm EB ny, v gDng tay sau khi dng ph5i cho vo thng ch$a th5i
EB rRn.
(3) N<u nhu/m EB sau )in di th cc thao tc )S thYch, b5o qu5n thYch sE
khng b? nhiPm EB nn chng ta khng lo v8 an ton O cc khu ny. Nh%ng khi
thao tc pha thuQc nhu/m, nhu/m v sau nhu/m th chng ta ph5i ch cc bin
php an ton: Tr%Kc h<t ph5i dng m/t khay nhu/m ring bit v c ghi r l
khay nhu/m nhiPm EB. Ph5i mang gDng tay, khIu trang v knh b5o v khi pha
dung d?ch nhu/m, thao tc nhu/m v sau nhu/m. GDng tay, khIu trang v cc )1u
pipette dng ht EB ph5i
)%*c cho vo thng ch$a
th5i rRn EB sau khi dng
xong. Micropipette dng
)- ht EB l chN )%*c
chuyn dng )- ht EB,
ph5i )%*c ghi ch pipette
nhiPm EB v )%*c giL
ring trong m/t h/p c ghi
ch h/p ch$a nhiPm EB.
Ph5i mang gDng tay khi s=
)<n cc vCt liu c ghi ch
nhiPm EB ny, v gDng
Hnh 62: M hnh m$t tK dng +< +P gel +i'n di tH +ng. TK ny
hi'n +ang +45c cng ty Nam Khoa s@n xu,t v cung c,p
+n cc phng th nghi'm PCR khi c yu c3u.

129
tay sau khi dng ph5i cho vo thng ch$a th5i EB rRn. Dung d?ch nhu/m sau khi
dng xong, ph5i )S vo thng ch$a th5i EB lVng.
(4) Ph5i )\c bit quan tm )<n an ton khi thao tc quan st thYch )in di trn
h/p )n UV v )y l khu m ng%=i lm th nghim dP b? nguy c+ ti<p xc tr,c
ti<p vKi EB nh6t. Sau )y l cc khu c1n l%u :
(i) Ph5i mang gDng tay khi l6y thYch sau khi )in di mang )<n h/p )n UV, v
)- trnh r+i vi cc gi;t dung d?ch c EB tZ thYch xuQng sn nh, ng%=i thao tc
ph5i dng m/t gi6y th6m h$ng bn d%Ki khi mang thYch )<n h/p )n UV v gi6y
th6m ny ph5i cho vo thng ch$a th5i rRn nhiPm EB. TQt nh6t cho thYch ln m/t
khay c ghi ch khay nhiPm EB )- mang )<n quan st trn h/p )n UV.
(ii) Sau khi )\t thYch ln h/p )n UV, ph5i dng ngn tay ch%a chYm g )<n
EB )- bCt cng tRc mO v tRt )n UV )- cng tRc ny khng b? nhiPm EB. N<u
dng h thQng geldoc c9a Biorad th cc thao tc mO c'a, bCt tRt cng tRc hay
nh6n cc nt chNnh trn geldoc hay trn bn phm vi tnh ph5i )%*c thao tc b3ng
m/t bn tay khng nhiPm EB.
(iii) H/p )n UV sau khi dng xong ph5i )%*c lau sYch b3ng gi6y th6m nuKc
v cc gi6y lau ny ph5i )%*c cho vo thng ch$a th5i rRn nhiPm EB.
(iv) H/p )n UV l n+i nhiPm EB r6t cao, do vCy trnh s= hay chYm vo h/p
)n UV vKi tay tr1n.
(v) M/t l%u c1n )%*c lun tuyt )Qi tun theo: trnh )- bn tay mang gDng
) nhiPm EB dJng )<n b6t c$ vCt dJng g trong phng th nghim, )\c bit cc n+i
r6t dP b? s= vo bOi tay tr1n nh%: Micropipette; tay nRm mO c'a t9 lYnh, ngDn ko;
tay nRm c'a, bt vi<t...
Trn l cc thao tc an ton trong phng th nghim c thao tc vKi EB m phng
th nghim nn tS ch$c v nhn vin nn tun theo. Nn nhK l nhiPm EB vo c+ th-
khng cho tc hYi t$c th m c th- gy hCu qu5 sau ) nhi8u nDm. Do vCy cIn tRc v
y ny, tuy nhin cUng khng nn qu c,c )oan v phng )Yi cc mQi nguy c th-
phng ngZa )%*c ny )- tIy chay khng dng EB v )y l m/t ho ch6t hLu hiu nh6t
v rE ti8n nh6t )- phn tch )%*c k<t qu5 sau )in di.

130
g. Vai tr c9a ch$ng [+], ch$ng [-] v ch$ng n/i tYi
Ch(ng [+] cho PCR mix
*,nh ngh.a: ^ l DNA )%*c cho vo PCR mix )- cho s5n phIm khu<ch )Yi c
kch th%Kc v trnh t, )ng giQng ht s5n phIm khu<ch )Yi c9a DNA )ch tch chi<t
)%*c tZ bnh phIm. Thng th%=ng ch$ng [+] cho PCR mix l dung d?ch pha lang O
nMng )/ bi<t tr%Kc c9a plasmid c chn );an DNA )ch.
Vai tr: Ch$ng [+] cho PCR mix nn )%*c cho vo m/t PCR mix cho m[i l1n
chYy PCR v cc mJc )ch sau:
Ki-m tra )/ nhYy c9a PCR mix )ang s' dJng xem c )Yt khng n<u ch$ng [+]
)%*c cho vo PCR mix vKi nMng )/ LOD )- cho )%*c s5n phIm khu<ch )Yi pht
hin )%*c. PCR mix )%*c cho l )Yt )/ nhYy khi ch$ng [+] cho k<t qu5 [+] pht
hin )%*c b3ng cc ph%+ng php trn, v khng )Yt )/ nhYy khi ch$ng [+] cho k<t
qu5 [-] tnh.
^Qi vKi PCR pht hin s5n phIm khu<ch )Yi b3ng )in di th k<t qu5 )in di
s5n phIm PCR c9a ch$ng [+] sE cho vYch )in di )ng kch th%Kc mong )*i, nh=
vCy ng%=i );c k<t qu5 c th- dP dng so snh vKi cc vYch )in di s5n phIm PCR
c9a mAu bnh phIm )- k<t luCn mAu bnh phIm c k<t qu5 d%+ng tnh (khi cho
vYch )in di trng vKi kch th%Kc vYch )in di c9a s5n phIm PCR c9a ch$ng [+])
hay m tnh (khi cho vYch )in di khng trng vKi kch th%Kc vYch )in di c9a s5n
phIm PCR c9a ch$ng [+] hay khng c vYch )in di).
Tuy nhin ch$ng [+] cho PCR mix khng ki-m tra )%*c qui trnh tch chi<t
nucleic acid tZ mAu c )Yt hay khng. MuQn ki-m tra )%*c v6n )8 ny th ng%=i
th,c hin th' nghim ph5i c m/t mAu bnh phIm ) bi<t tr%Kc [+] hay m/t mAu
gi5 bnh phIm [+] )- th,c hin tch chi<t nucleic acid mAu ny song song vKi cc
mAu bnh phIm thCt.
V cc mJc )ch nh% vCy nn khi th,c hin th' nghim PCR, ng%=i th,c hin th'
nghim nn lun )- dnh m/t PCR mix )- cho ch$ng [+].

131
Ch(ng [-] cho PCR mix
*,nh ngh.a: Ch$ng [-] cho PCR mix l mAu n%Kc tinh sYch hay TE 1X )%*c cho
vo PCR mix trong m[i l1n lm xt nghim PCR/real-time PCR chIn )on.
Vai tr: Ch$ng [-] cho PCR mix nn )%*c cho vo m/t PCR mix cho m[i l1n chYy
PCR, v cho vo cuQi cng sau khi ) cho mAu v ch$ng [+] vo cc PCR mix t%+ng
$ng v cc mJc )ch sau:
Ch$ng minh thao tc cho mAu v ch$ng [+] vo cc PCR mix khng b? nhiPm
cho hay khng b? nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi v n<u ch$ng [-] cho PCR mix lYi
c k<t qu5 [+] s5n phIm khu<ch )Yi th c th- cc thao tc trn b? nhiPm cho hay
ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi.
Ch$ng minh PCR mix )ang s' dJng l hon ton tinh sYch khng b? nhiPm cc
DNA ngoYi lai v n<u ch$ng [-] lYi c k<t qu5 s5n phIm khu<ch )Yi khng )\c
hiu [+] th ch$ng tV PCR mix ) b? nhiPm cc DNA ngoYi lai.
Tuy nhin ch$ng [-] cho PCR mix khng ki-m tra )%*c ton b/ qui trnh th,c
hin th' nghim PCR c b? ngoYi nhiPm s5n phIm khu<ch )Yi hay nhiPm cho
khng. MuQn ki-m tra )%*c ton b/ qui trnh th,c hin th' nghim PCR th ng%=i
th,c hin th' nghim ph5i th,c hin qui trnh PCR trn m/t mAu th' ) bi<t tr%Kc
[-] tnh v th,c hin song song vKi cc mAu bnh phIm.
V cc mJc )ch nh% vCy nn khi th,c hin th' nghim PCR, ng%=i th,c hin th'
nghim nn lun )- dnh m/t PCR mix )- cho ch$ng [-].
Ch(ng n1i ti (Internal control, IC)
*,nh ngh.a: L DNA )%*c khu<ch )Yi song song vKi DNA )ch nh%ng cho s5n
phIm khu<ch )Yi c: (1) kch th%Kc khc (trong PCR kinh )i-n) s5n phIm khu<ch )Yi
c9a DNA )ch nh= vCy c th- phn bit )%*c khi )in di; v/hay (2) trnh t, khc hon
ton hay khc m/t ph1n (trong PCR-ELISA hay trong real-time PCR) nh= vCy c th-
phn bit )%*c khi s' dJng d )\c hiu (specific probe).
Cc loi ch(ng n1i ti: C 4 loYi ch$ng n/i tYi sau )y, ty nguMn gQc v thi<t k<:
Ch$ng n/i tYi l DNA b/ gen vCt ch9 (hnh 63-A), v dJ b globin gene n<u
bnh phIm l m l6y tZ ng%=i, hay myoglobin gene c9a tm n<u bnh phIm l cc

132
mAu tm s. ^- c th- khu<ch )Yi )%*c DNA ch$ng n/i tYi, chng ta ph5i cho
thm vo trong PCR mix m/t c\p mMi )\c hiu vKi DNA ch$ng n/i tYi v nn
thi<t k< mMi sao cho nhit )/ bRt c\p t%+ng t, nhit )/ bRt c\p c9a mMi dnh cho
DNA )ch, v khng tYo ra cc dimer primer vKi mMi c9a DNA )ch. Do s' dJng
DNA b/ gene vCt ch9 nn ch$ng n/i tYi ny ki-m sot )%*c mAu th' c )9 khng,
ki-m sot )%*c h thQng tch chi<t nucleic acid trn mAu th' c tQt khng, ki-m
sot )%*c $c ch< c hay khng. Tuy nhin loYi ch$ng n/i tYi ny khng ki-m sot
)%*c h thQng khu<ch )Yi DNA )ch v dng mMi khc bit v chN dng cho m/t
sQ bnh phIm c ch$a )9 l%*ng t< bo m vCt ch9.
Ch$ng n/i tYi l DNA tSng h*p c nguMn gQc l DNA )ch (hnh 63-B), ) l
DNA )%*c tSng h*p b3ng cch dng )ng s5n phIm khu<ch )Yi c9a DNA )ch
nh%ng cRt ngRn )i hay chn m/t )oYn DNA nhV )- lm cho n di h+n. Ch$ng n/i
tYi loYi ny s' dJng cng mMi vKi DNA )ch nn khng c1n thi<t k< mMi )- cho
thm vo PCR mix.
Ch$ng n/i tYi l DNA tSng h*p c nguMn gQc khc DNA )ch nh%ng s' dJng
cng mMi vKi DNA )ch (hnh 63-C), ) l DNA )%*c tSng h*p b3ng cch dng
A
B
C D
Hnh 63: Cc l7ai chEng n$i tJi (A) l b$ gene v2t chK; (B) l DNA tPng h5p c nguIn gAc tQ DNA
+ch; (c) DNA tPng h5p c nguIn khc DNA +ch nh4ng s8 d:ng cng mIi DNA +ch; (D)
DNA khc bi't han tan vGi DNA +ch

133
s5n phIm khu<ch )Yi c9a DNA khc bit vKi DNA )ch nh%ng chn O hai )1u cc
trnh t, giQng ht trnh t, mMi c9a DNA )ch. Do s' dJng cng mMi vKi DNA )ch
nn khng c1n thi<t k< mMi )- cho thm vo PCR mix.
Ch(ng n1i ti l m1t h4 th6ng m8i v DNA khc bi4t v%i DNA 9ch (hnh 63-
D), ^%*c khu<ch )Yi song song vKi DNA )ch nh%ng dng mMi khc bit DNA
)ch v DNA ch$ng n/i tYi c nguMn gQc khc bit hon ton vKi DNA )ch. ^-
c th- khu<ch )Yi )%*c DNA ch$ng n/i tYi, ph5i cho thm vo trong PCR mix m/t
c\p mMi )\c hiu vKi DNA ch$ng n/i tYi v nn thi<t k< mMi sao cho nhit )/ bRt
c\p t%+ng t, nhit )/ bRt c\p c9a mMi dnh cho DNA )ch, v khng tYo ra cc
dimer primer vKi mMi c9a DNA )ch.
Vai tr ch(ng n1i ti: Tua )%*c cho vo cc giai )oYn no m ch$ng n/i tYi c th-
)%*c dng cho cc vai tr sau:
Ki-m sot )%*c s, tch chi<t trn mAu bnh phIm tQt hay khng n<u )%*c cho
vo bnh phIm O l%*ng tQi thi-u vZa )9 (LOD) hay c s]n trong bnh phIm.
Ki-m sot )%*c $c ch< )- xc )?nh )%*c k<t qu5 l m tnh thCt hay m tnh
gi5 do c $c ch< cn hin din trong cc mAu tch chi<t n<u )%*c cho vo PCR
mix O nMng )/ LOD tr%Kc hay sau khi cho tch chi<t DNA tZ bnh phIm
Ki-m sot )%*c h thQng khu<ch )Yi DNA )ch c )Yt )%*c )/ nhYy hay
khng n<u ch$ng n/i tYi dng chung mMi vKi DNA )ch v hin din trong mAu
th' hay cho vo trong PCR mix O nMng )/ LOD.
Ki-m sot )%*c h thQng tch chi<t )ang dng c tQt hay khng v thao tc c
ngoYi nhiPm khng n<u c s]n trong mAu thCt lm ch$ng m hay )%*c cho vo
mAu thCt lm ch$ng m )- )%*c tham gia tch chi<t cng vKi mAu bnh phIm
h. Cc v6n )8 kW thuCt c1n bi<t khi );c v phn tch m/t k<t qu5 real-time PCR )?nh
l%*ng s' dJng mMi v taqman probe
Sau khi han t6t ch%+ng trnh chYy real-time PCR trn my, phn tch )- c k<t
qu5 )?nh l%*ng chnh xc l m/t v6n )8 r6t quan tr;ng )i hVi ng%=i phn tch ph5i
hi-u r cc v6n )8 l thuy<t cUng nh% kW thuCt real-time PCR. b )y chng ti xin
trnh by cc b%Kc phn tch m/t k<t qu5 real-time PCR vKi mMi )\c hiu v Taqman
probe gRn mu FAM pht hynh quang dnh pht hin/)?nh l%*ng DNA )ch, cn

134
Bi%u !" 17: M$t bi<u +I chu(n +45c +nh gi +Jt khi c E trong khRang
90-105%, cn R2d0.99. Ph@i c bi<u +I chu(n +Jt mGi tip
t:c phn tch kt qu@
Taqman probe gRn mu Hex pht hynh quang dnh pht hin s5n phIm khu<ch )Yi tZ
ch$ng n/i tYi s' dJng chung mMi DNA )ch. Phn tch k<t qu5 nn theo cc b%Kc sau
Tr)%c h:t ch;n gi:ng ch(ng [-]: ChN ch;n gi<ng )- phn tch l gi<ng ch$ng [-].
Ch;n knh hynh quang Fam, chng ta sE th6y gi<ng ch$ng [-] c )%=ng bi-u diPn
khu<ch )Yi khng v%*t qua khVi )%=ng hynh quang n8n (baseline) t$c l m tnh.
N<u O knh Fam m ch$ng [-] c )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi v%*t qua khVi baseline
(d%+ng tnh) th c nguy c+ ngoYi nhiPm trong qu trnh cho mAu vo cc PCR mix. BV
knh hynh quang Fam, ch;n knh hynh quang Hex, lc ny ch$ng [-] c )%=ng
bi-u diPn khu<ch )Yi v%*t qua khVi baseline (d%+ng tnh). N<u O knh Hex m
ch$ng [-] cho )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi khng v%*t qua khVi baseline (m tnh) th
cUng c nguy c+ l PCR mix khng )9 nhYy c5m cho khu<ch )Yi/pht hin DNA ch$ng
n/i tYi hay ch$ng n/i tYi cho vo b? h% (khi ) trong t6t c5 cc gi<ng khc, )%=ng bi-u
diPn khu<ch )Yi O knh Hex )8u m tnh, O tnh huQng ny ph5i yu c1u nh s5n xu6t
cung c6p lYi ch$ng n/i tYi).
*,nh 9)<ng chu>n: ChN
ch;n knh hynh quang
Fam l knh hynh quang
cho taqman probe c9a DNA
)ch, khng ch;n knh
Hex. Ch;n cc gi<ng
chuIn v gi<ng ch$ng [-],
)Mng th=i loYi trZ cc gi<ng
c mAu th' cUng nh% cc
gi<ng khc. Sau ) cho cc
gi tr? sQ b5n sao (copies)
DNA )ch chuIn ban )1u
vo cc gi<ng ch$a cc )/ pha long DNA chuIn. Sau khi ) cho cc gi tr? sQ copies
vo cc gi<ng chuIn, chng ta )- my ch;n )%=ng baseline theo ch< )/ t, )/ng )- c
bi-u )M chuIn (g;i l standard graph). N<u )%=ng baseline m my ch;n theo ch< )/ t,
)/ng cRt ph5i )%=ng bi-u diPn c9a ch$ng [-] th ng%=i s' dJng tr%Kc h<t chNnh baseline
cycle (cc chu ka n8n) c9a gi<ng ch$ng [-] )- xem )%=ng bi-u diPn ch$ng [-] c hY

135
xuQng khng, n<u khng )%*c th c th- ph5i nng )%=ng baseline ln )- )%=ng
baseline ny khng cRt )%=ng bi-u diPn c9a ch$ng m. ^nh gi bi-u )M chuIn l
t%Ong nh6t (bi2u '( 17) l bi-u )M cho h sQ t%+ng quan (R) l 0.990; )Mng th=i hiu
qu5 PCR (PCR efficiency = E) tZ 90% )<n 105%, )/ dQc (slope) c9a )%=ng bi-u diPn
trong khVang -3.4 )<n -3.6. N<u )%=ng bi-u diPn khng )Yt th chng ta, tr%Kc h<t xem
lYi tZng gi<ng chuIn )- )i8u chNnh baseline cycle c9a tZng gi<ng k<t h*p vKi vic nng
ln hay hY xuQng )%=ng baseline )- c th- )%a cc gi tr? R v E v8 cc tr? sQ l t%Ong.
N<u vAn ch%a )%a )%*c R v E v8 cc gi tr? l t%Ong th c th- thay )Si gi tr? c9a cc
tr? sQ copies trong khVang cho php khng qu m/t )/ pha lang (v dJ n<u gi tr? ghi
l 10 copies, c th- thay gi tr? tZ 10 )<n 99; hay n<u gi tr? ghi l 100 th c th- thay
gi tr? tZ 100 )<n 999) )- chng ta c )%*c )%=ng bi-u diPn chuIn )Yt l t%Ong (tuy
nhin chN lm cch ny m/t cch b6t kh5 khng thi v thCt ra n<u ph5i thay )Si gi tr?
sQ copies chuIn c nghGa l chng ta ) ph5i ch6p nhCn sai sQ khi thao tc pipetting rMi,
m n<u ch6p nhCn nh% vCy th chng ta cUng sE ph5i ch6p nhCn c sai sQ trong k<t qu5
)?nh l%*ng). Chuy-n bi-u )M khu<ch )Yi sang dYng log )- cQ )?nh )%*c )%=ng n8n rMi
sau ) chuy-n lYi dYng graph bnh th%=ng. Ghi nhCn tr? sQ baseline c9a )%=ng chuIn.
L!u : Vic th,c hin PCR cc mAu chuIn c hai ngh9a: (1) Cho )%*c )%=ng chuIn
)- lm c+ sO tnh ton sQ copies ban )1u c9a mAu th'; (2) Ki-m sot )%*c thao tc
pipetting c9a ng%=i lm th nghim c tQt khng, qua tr? sQ R v E c )Yt khng. Do
vCy m ng%=i lm th nghim bRt bu/c ph5i cho cc mAu chuIn v chYy PCR. M/t sQ
cng ty trong n%Kc khng hi-u )%*c nghGa c9a vic ny nn h; cung c6p chuIn )
cho s]n vo PCRmix, v lm nh% vCy th k<t qu5 )?nh l%*ng chRc chRn sE khng )5m
b5o )%*c s, chnh xc v khng th- ki-m sot )%*c thao tc pipetting c9a ng%=i lm
xt nghim c tQt khng.
*,nh s6 l)@ng copies ban 9Au c trong cc gi:ng ch(a mBu thD: Sau khi ) c
)%=ng chuIn, xc )?nh sQ l%*ng copies ban )1u (SQ = starting quantity) c9a DNA )ch
trong cc gi<ng mAu th' b3ng cch ch;n tZng gi<ng vo phn tch cng vKi cc gi<ng
chuIn.
^Qi vKi cc mAu c )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi cRt )%*c )%=ng baseline th sQ
l%*ng )?nh l%*ng )%*c chnh l SQ c trong th- tch mAu )%a vo ph5n $ng (bi2u '(
18). ^- tnh )%*c sQ copies trong 1ml huy<t thanh, chng ta sE nhn SQ vKi h sQ K (l

136
h sQ c lin quan )<n )/ thu hMi sau tch chi<t cc mAu chuIn bi<t r sQ copy c chn
DNA).
^Qi vKi cc mAu m )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi khng ngc ln )%*c hay ngc
ln )%*c nh%ng vAn khng cRt )%*c baseline th ch;n thm knh mu Hex )- xem c
)%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi c9a DNA ch$ng n/i tYi hay khng? N<u c th k<t luCn l
mAu m tnh )Qi vKi cc mAu c )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi khng ngc ln )%*c
(bi2u '( 19) v tr5 l=i l mAu d%Ki ng%eng pht hin )Qi vKi cc mAu c )%=ng bi-u
diPn khu<ch )Yi ngc ln )%*c nh%ng khng cRt )%*c )%=ng baseline. N<u khng c
)%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi c9a ch$ng n/i tYi th c th- c kh5 nDng l mAu cn ch6t
$c ch<, nn th,c hin lYi tch chi<t, n<u mAu vAn cn b? $c ch< (khng c tn hiu
Bi%u !" 18: M>u c +4Lng bi<u diNn khuch +Ji ngc ln cSt +45c baseline l m>u +Cnh l45ng d46ng tnh. TrC sA
+Cnh l45ng SQ +45c xc +Cnh l sA copies c trong th< tch m>u th8 cho vo Ang ph@n Eng. SA l45ng
copiesDNA c trong 1 ml mu b'nh nhn +45c tnh bUng cch nhn SQ vGi 50
Bi%u !" 19: M>u chV c th< kt lu2n m tnh (+4Lng bi<u diNn khuch +Ji +7c bUng kng FAM khng ngc ln) hay
d4Gi ng4Xng pht hi'n (+4Lng bi<u diNn khuch +Ji +7c bUng kng FAM ngc ln nh4ng khng cSt
+45c +4Lng baseline) khi c tn hi'u khuch +Ji cKa chEng n$i tJi +7c +45c bUng knh hynh quang
HEX

137
khu<ch )Yi c9a DNA ch$ng n/i tYi) th k<t luCn l mAu b? $c ch<, xin mAu khc )-
lm lYi. ^Qi vKi cc mAu c )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi cRt )%=ng baseline qu sKm
hay l ngc ln qu sKm cRt )%=ng baseline rMi lYi khng ngc ln thm nLa, ch;n
gi<ng ny, chNnh lYi baseline cycle v c khi my t, )/ng ch;n khVang baseline cycle
qu ngRn nn ) lm mAu c tn hiu khu<ch )Yi ngc ln qu sKm. N<u sau khi ch;n
lYi cc mAu ny c )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi giQng cc mAu m tnh th phn tch
nh% cc mAu m tnh. N<u c )%=ng bi-u diPn khu<ch )Yi giQng cc mAu d%+ng tnh
th phn tch giQng cc mAu d%+ng tnh.
i. Tr5 l=i k<t qu5 PCR/real-time PCR chuIn m,c
PCR/real-time PCR l m/t xt nghim r6t nhYy c5m v )\c hiu. Tuy nhin v ch6t
l%*ng xt nghim r6t tua thu/c vo ph%+ng php v trnh )/ th,c hin xt nghim, do
vCy %u )i-m ny chN )Yt )%*c khi ng%=i lm xt nghim c )9 tri th$c )- ki-m sot
)%*c cc s+ st trong qu trnh th,c hin xt nghim thng qua cc chuIn m,c bRt
bu/c ph5i c khi lm xt nghim.
Ngoi ra m/t )i hVi r6t quan trong nLa )Qi vKi real-time PCR )?nh l%*ng, ) l
ph5i c k<t qu5 )?nh l%*ng chnh xc. Trong y sinh h;c, b6t c$ m/t xt nghim )?nh
l%*ng no cUng )i hVi ph5i chYy mAu th' cng lc vKi mAu chuIn. MAu chuIn trong
PCR )?nh l%*ng ph5i cho k<t qu5 )Yt tuy<n tnh cao vKi hiu qu5 PCR tuyt )Qi )-
ch$ng minh ng%=i lm xt nghim thao tc pipetting chuIn, khng c s+ st. Khng

Ch$ng [+] ph5i cho k<t qu5 [+]
)- ch$ng minh khu khu;ch '<i '<t '= nh<y
Ch$ng [-] ph5i cho k<t qu5 [-]vKi )ch nh%ng
ph5i cho k<t qu5 [+] vKi ch$ng n/i tYi
)- ch$ng minh khu tch chi;t v khu;ch '<i '<t '= nh<y
v qu trnh lm xt nghi3m khng b? ngo<i nhiAm
MAu muQn k<t luCn [-] ph5i cho k<t qu5 [+] vKi
ch$ng n/i tYi v k<t qu5 [-] vKi )ch
)- ch$ng minh mCu khng b? 7c ch;

Hnh 64: M$t kt qu@ PCR +Cnh tnh chu(n mHc ph@i th< hi'n +45c t,t c@ cc +i<m ki<m sot qu trnh lm
xt nghi'm nh4 +45c gi@i thch

138
chN ph5i bi<t s' dJng cc chuIn m,c )- ki-m sot ch6t l%*ng c9a cc khu khi lm xt
nghim, m ngay c5 trong khu tr5 li k<t qu5 xt nghim, ng%=i lm th nghim cUng
ph5i th- hin )%*c cc ki-m sot ny trn phi<u tr5 l=i.
M/t k<t qu5 xt
nghim PCR )?nh tnh )<n
tay ng%=i chN )?nh xt
nghim sE khng )%*c
xem l chuIn m,c n<u trn
phi<u tr5 l=i k<t qu5 khng
th- hin v ch$ng minh
)%*c cc ki-m sot c
th,c hin trong qu trnh
lm xt nghim. Hnh 64
minh h;a v cRt nghGa cc
chuIn m,c ph5i th- hin
trn k<t qu5 xt nghim
PCR )?nh tnh.
M/t k<t qu5 xt
nghim PCR )?nh l%*ng
khi )<n tay ng%=i chN )?nh xt nghim sE khng )%*c xem l chuIn m,c n<u trn phi<u
tr5 l=i k<t qu5 khng th- hin v ch$ng minh )%*c l
(i) mAu th' )%*c chYy chung vKi mAu chuIn qua )%=ng bi-u diPn chuIn c v? tr
c9a mAu th',
(ii) thao tc )?nh l%*ng chuIn m,c qua hiu qu5 PCR v h sQ t%+ng quan trn
bi-u )M chuIn )Yt cc thng sQ l t%Ong, v
(iii) n<u mAu k<t luCn m tnh hay d%Ki ng%eng ph5i c d%=ng bi-u diPn khu<ch
)Yi c9a ch$ng n/i tYi. Cc bi2u '( 20-A v 20-B minh h;a v cRt nghGa cc chuIn m,c
ph5i th- hin trn k<t qu5 xt nghim real-time PCR )?nh l%*ng
Thao tc th nghim chuIn m,c v th- hin k<t qu5 chuIn m,c, ) mKi l
PCR/real-time PCR chIn )on.

Khuch +Ji trnh tH
chEng n$i tJi
Khng c
khuch +Ji +ch
Khuch $%i ch(ng n+i
t%i $)-c pht hi/n nh0
taqman probe $2c hi/u
gip ng4Li s8 d:ng ki%m
sat !()c +c ch- trong
m>u c hay khng
Khuch +Ji cc n$ng +$
chu(n cKa trnh tH +ch

Cc chu4n gip ki%m sat !/ chnh xc pipetting khi
bi<u +I chu(n +Jt R0.99 and E=90-105% v gip !0nh
l()ng chnh xc sA copies +ch c trong cc m>u th8


Bi%u !" 20: Minh h7a m$t trnh by kt qu@ PCR +Cnh l45ng chu(n mHc
vGi bi<u +I chu(n chEng minh m>u lun chJy chung vGi
chu(n v thao tc pipetting +45c ki<m sot chu(n mHc (B),
nhL v2y m kt qu@ +Cnh l45ng l chnh xc (A)

139
j. Cc v6n )8 kW thuCt c1n bi<t khi s' dJng m/t k<t qu5 PCR/real-time PCR chIn
)on
PCR/real-time PCR l m/t cng cJ tuyt v=i dng trong chIn )on v )/ nhYy
c5m kh c th- c m/t xt nghim no snh k?p, )Mng th=i )/ )\c hiu c9a PCR/real-
time PCR trong chIn )on pht hin cc tc nhn vi sinh gy bnh cUng khng khc g
ph%+ng php vi sinh nui c6y. Tuy nhin vic s' dJng k<t qu5 PCR/real-time PCR c
hiu qu5 hay khng l r6t ty thu/c vo s, hi-u bi<t c9a ng%=i s' dJng k<t qu5 v cho
chN )?nh lm xt nghim. Chng ti xin )%a ra m/t sQ minh h;a trong s' dJng k<t qu5
PCR/real-time PCR )- pht hin tc nhn vi sinh gy bnh cho ng%=i
K<t qu5 PCR/real-time PCR [+] c xc )?nh )%*c ng%=i b? th' nhiPm tc nhn vi
sinh gy bnh?: ^ng nh% vCy v PCR/real-time PCR pht hin tr,c ti<p tc nhn vi
sinh gy bnh thng qua pht hin cc nucleic acid )ch )\c hiu vi sinh vCt c m\t
trong bnh phIm l6y tZ bnh nhn. Tuy xc )?nh )%*c l ng%=i b? th' th' nhiPm tc
nhn vi sinh gy bnh nh%ng c xc )?nh )%*c ng%=i ) b? bnh hay khng )- )%*c
)i8u tr? l m/t v6n )8 khc. L6y v dJ m/t ng%=i th' )m pht hin vi khuIn lao b3ng
th' nghim PCR, k<t qu5 [+], bc sG vAn ch%a nn cho chN )?nh )i8u tr? lao m ph5i
xem th' X quang phSn c thm nhiPm r O )Nnh phSi tiu bi-u cho nhiPm lao hay
khng rMi mKi )i8u tr?. N<u X quang phSi vAn trong v bnh th%=ng th chN nn theo di
ti<p quan xt nghim PCR v qua X quang phSi )- xem c diPn ti<n )<n lao hay khng
tong vng 1-3 thng, n<u khng diPn ti<n )<n lao th khng c1n thi<t )- )i8u tr? cho
bnh nhn.
K<t qu5 PCR/real-time PCR [-] c xc )?nh )%*c ng%=i b? th' khng mang tc
nhn gy bnh khng? Khng chRc nh% vCy v PCR/real-time PCR khng th- cho gi
tr? tin )on m (negative predictive value, NPV) )Yt 100% cho d l6y mAu chnh xc
v th' nghim chnh xc, v k<t qu5 cn ty thu/c r6t nhi8u vo diPn ti<n c9a tc nhn
gy bnh trong c+ th- ng%=i th'. V dJ m/t ng%=i HbsAg [+], th' HBV-DNA cho k<t
qu5 [-], c th- ni ng%=i ) khng nhiPm HBV hay khng? ChRc chRn l khng, v
ng%=i ) vAn cn mang HBV trong gan v )ang O trong giai );an m miPn d?ch khng
)\c hiu c9a c+ th- cn t ch< )%*c virus nn HBV chN O trong gan v tYo ra cc virus
khng han chNnh l cc khng nguyn b8 m\t khng c li DNA m thi. ^y chnh
l cc tr%=ng h*p ng%=i lnh mang HBV, vAn l ng%=i )ang b? nhiPm HBV v vAn c

140
nguy c+ ly nhiPm cho ng%=i khc. Do vCy chng ta cUng r6t th%=ng g\p nhi8u k<t qu5
HBV-DNA [-] trn bnh nhn HBsAg [+].
S' dJng k<t qu5 real-time PCR )?nh l%*ng nh% th< no cho )ng? ^y cUng l
m/t v6n )8 c1n bn. Chng ta )8u bi<t real-time PCR dng trong )?nh l%*ng tc nhn
vi sinh )ch, nay g;i l qPCR, r6t c gi tr? )- )nh gi v theo di )%*c hiu qu5 )i8u
tr? cc bnh nhiPm virus nh% HBV, HCV, HIV. Tuy nhin lm th< no )- bi<t )%*c s,
khc bit v8 k<t qu5 )?nh l%*ng l c nghGa? C nhi8u ng%=i nh1m lAn v6n )8 ny
nn cho )nh gi hay nhCn xt sai l1m v8 hiu qu5 )i8u tr?. K<t qu5 )?nh l%*ng chN
)%*c coi l khc bit khi s, khc bit giLa hai l1n th' l trn hay b3ng 100 l1n, g;i l 2
log
10
. L do ph5i 2 log
10
l v khi )?nh l%*ng ng%=i ta ) xy d,ng )%=ng chuIn d,a
vo cc )/ pha long theo h sQ 10 c9a cc nMng )/ DNA chuIn, v do sai sQ c th-
ch6p nhCn )%*c l trong vng 1 )/ pha lang nn k<t qu5 chN )%*c xem l khc bit khi
cch nhau 2 )/ pha lang, t$c l 2 log
10
. Chnh v vCy, )- trnh cho cc nh lm sng
)nh gi sai, hin nay trn th< giKi cc nh bnh h;c ch6p nhCn tr5 li k<t qu5 l log
10

ch$ khng ph5i l sQ l%*ng copy chnh xc. V dJ k<t qu5 l 425,379,000 copy th nay
sE tr5 l=i l 4.25 log 8, hay )+n gi5n l log 8. Nh% vCy n<u k<t qu5 l1n 2 l 117,318,000
copy th sE tr5 l=i l 1.17 log 8, hay )+n gi5n l log 8. VKi cch tr5 l=i ny bc sG )i8u
tr? sE th6y )%*c l l%*ng virus ch%a gi5m sau th=i gian )i8u tr?. Ngoi ra, nh )i8u tr?
m/t khi ) hi-u )%*c v6n )8 ny, h; sE khng chN )?nh cho bnh nhn lm xt nghim
)?nh l%*ng trong th=i gian qu ngRn chN trong vi tu1n sau khi xt nghim )?nh l%*ng,
v chRc chRn chN trong th=i gian ngRn nh% vCy r6t kh )- )nh gi v so snh k<t qu5
)?nh l%*ng vKi nhau.
Xy d6ng m=t phng th nghi3m PCR/real-time PCR ch4n 'on
M/t phng th nghim PCR chIn )on sE bao gMm cc phng v khu v,c lm vic nh%
sau:
1. Phng tch chit nucleic acid
^y l phng lm nhim vJ tch chi<t nucleic acid v cho cc mAu tch chi<t vo
cc PCR/real-time PCR mix )- chuIn b? cho vo my chYy PCR.
Phng ny c1n trang b? cc thi<t b? v dJng cJ sau:

141
M/t buMng thao tc PCR l m/t t9 thao tc kh tNnh c trang b? )n chi<u sng v
)n c,c tm, buMng ny c th- )\t tZ cc hng s5n xu6t n%Kc ngoi hay t, )ng (hnh
65). Kch th%Kc tQi thi-u cho 2 ng%=i lm vic. Trong buMng thao tc ny ph5i trang b?
cc dJng cJ v thi<t b? nh% sau: vortex x 2, my 9 nhit kh x 2, my ht chn khng x
1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, l; )-
vCt liu d+, nhiPm x 2.
Cc thi<t b? khc ph5i c: my ly tm 13,000 x 2, my ly tm lYnh 13,000 x 1, my
ly tm bn 4000 cho tube 15ml x 1, t9 )ng -18 )<n -30
o
C vKi sQ l%*ng ty vo mAu
nhi8u hay t, t9 mt # 280 lt cUng vKi sQ l%*ng ty mAu nhi8u hay t.
2. Phng '4t my PCR v real-time PCR
^y l phng lm nhim vJ chYy my PCR v real-time PCR. Phng ny c1n
trang b? my real-time PCR v my PCR th%=ng vKi sQ l%*ng ty mAu nhi8u hay t. ^-
lm chIn )on th nn )\t my c9a cc hng c gi6y php quQc t< (lisence) )%*c cung
c6p my PCR/real-time PCR dng cho chIn )on v hin nay Biorad l cng ty c
)%*c gi6y php ny.
^- )5m b5o my chYy Sn )?nh, khng b? tRt khi cp )in giLa chZng th nn trang
b? b/ l%u )in 6KVA v ph5i c dy nQi )6t.
Phng )\t my PCR nn thng vKi phng tch chi<t nucleic acid.
3. Phng 'i$n di '6c kt qu7
^y l phng lm nhim vJ ch< cc gel )in di, th,c hin )in di v );c k<t qu5
)in di. Phng ny ph5i trang b? cc thi<t b? v dJng cJ sau:
M/t buMng thao tc )in di: l m/t t9 thao tc kh tNnh c trang b? )n chi<u sng
v )n c,c tm, buMng ny c th- )\t tZ cc hng s5n xu6t n%Kc ngoi hay t, )ng
(hnh 65). Kch th%Kc tQi thi-u cho 1 ng%=i lm vic. Trong buMng thao tc ny ph5i
trang b? cc dJng cJ v thi<t b? nh% sau: vortex x 1, b/ )in di agarose loYi minigel x 2,
my ly tm compact x 1, micropipette 1-20ul x 1, h/p nh,a ),ng gel ) dng xong x 1,
h/p nh,a ),ng gel ch%a/)ang dng x 1, h/p nh,a ),ng )1u pipette d+ x 1.
Cc dJng cJ v thi<t b? khc ph5i c l: m/t l vi sng, m/t h thQng chJp 5nh gel,
m/t t9 )S gel, m/t cn )in t' )- cn agarose.

142
Phng )in di );c k<t qu5 nn tch bit hay chN thng )%*c vKi phng )\t my
PCR/real-time PCR
4. Phng pha ch thu9c th: PCR v real-time PCR
ChN c cc phng th nghim chIn )on lKn mKi nn c phng ny, v ph5i tch
r6t ra 3 phng ni trn. Phng ny tr%Kc khi vo ph5i thay o b3ng o chuyn chN dng
trong phng ny m thi. Cc thi<t b?, ha ch6t, dJng cJ )- pha chN )- trong phng,
khng )%*c )em ra ngoi. Ni chung )y l phng ph5i tinh sYch. Cc thi<t b? v dJng
cJ trong phng nn c l:
T9 thao tc pha ch< thuQc th', nn l cc clean bench dnh cho 2 ng%=i c trang b?
)n c,c tm v )n chi<u sng. Trong t9 ny trang b?: vortex x 1, my 9 nhit kh x 1,
my ly tm 13000 x 1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2,
micropipette 1-20ul x 1, l; )- vCt liu d+, nhiPm x 2.
T9 thao tc cn chNnh pH, cUng nn l cc clean bench dnh cho 1 hay 2 ng%=i c
trang b? )n c,c tm v )n chi<u sng, bn trong c: cn )in t' x 1, my )o pH x1,
khu6y tZ x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x1.
T9 thao tc pha cc ha ch6t )/c, nn l t9 an tan sinh h;c lKp 1 bn trong cUng
trang b? cn )in t' x 1, my )o pH x1, khu6y tZ x 1, micropipette 1000ul x 1,
micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x 1, pipette aid x 1.
Cc thi<t b? khc, c sQ l%*ng ty qui m, nh% my lm ) v5y, my ly tm 13,000
x1, my ly tm bn 4000 cho tube 15ml x 1, t9 )ng -18 )<n -30
o
C vKi sQ l%*ng ty
vo mAu nhi8u hay t, t9 mt # 280 lt cUng vKi sQ l%*ng ty mAu nhi8u hay t.
D%Ki )y minh h;a m/t phng th nghim sinh h;c phn t' chIn )on lKn bao gMm c
PCR/real-time PCR v gi5i trnh t, (hnh 66, 67) dnh cho m/t bnh vin lKn c9a thnh
phQ HM Ch Minh m chng ti ) g'i thi<t k<. Ngoi ra chng ti cUng )%a ra thi<t k<
phng th nghim PCR/real-time PCR cho cc phng th nghim trung bnh (hnh 68)





143

Hnh 66: S6 +I phng pha ch cc thuAc th8 sinh h7c phn t8
Hnh 65: M hnh m$t tK thao tc PCR tH +ng

144








Hnh 67: S6 +I phng tch chit nucleic acid v phng +i'n di kt
h5p phng gi@i trnh tH


145
















Hnh 68: S6 +I m$t phng th nghi'm PCR v real-time PCR dnh cho phng th nghi'm lm
sng tJi cc b'nh vi'n tuyn thnh phA hay tVnh