LIKVORSKA DIJAGNOSTIKA

eljka Vogrinc

Promjene sastava likvora mogu biti posljedica:

Poremeenog metabolizma ivanog tkiva Vee propusnosti barijera Upalne ili imunoloke aktivnosti Ulaska ili prisustva stranih elemenata (krv, zarazne klice, lijekovi, premosnice) Poremeaja u izmjeni likvora Neoplazme Smrti stanica...

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Neke bolesti SS se ne mogu dijagnosticirati pregledom krvi i/ili urina promjene vidljive samo u likvoru

1950-60: nagli razvoj pretraga likvora pretrage neizostavne u dijagnostici veine bolesti SS Danas: slikovne tehnike (CT, MRI) zamjenjuju pretrage likvora u nekim stanjima (krvarenja, tumori...) Vanost pretraga likvora: Akutne upale SS (meningitis, encefalitis) Kronine upale SS (autoimune bolesti, vaskulitisi...)

PREGLED LABORATORIJSKIH PRETRAGA CST

Cerebrospinalni likvor
CITOLOGIJA
Ukupan broj stanica Sediment Diferencijalna analiza stanica Aktivirani B limfociti Tumorski biljezi Specijalna bojenja (RBM, po Gramu i dr.)
CEA IgM 2 mikroglobulin Feritin

Krv
BIOKEMIJA, IMUNOKEMIJA
Serum/plazma

Ukupni proteini Supernatant

Albumin, IgG, IgA, IgM

Albumin, IgG, IgA, IgM

Q
Oligoklonski IgG
Organizamspecifina At

Oligoklonski IgG
Organizamspecifina At

Modani proteini
NSE

ASI
Modani proteini u krvi Autoimuna At

Mikrobiologija,PCR

S-100 Prostaglandin D sintetaza Biljezi demencije

PRETRAGE LIKVORA NISU SPECIFIAN POKAZATELJ BOLESTI SS-a

za svrstavanje u pojedinu skupinu neurolokih bolesti (upalne, neoplastike, metabolike...)

PROTEOMIKA

?
NOVI BIOMARKERI

Lumbalna punkcija

Bolesnik u sjedeem poloaju nagnut prema naprijed ( 20) ili leei na boku Dezinfekcija, lokalna anestezija Aseptini uvjeti Dovoljno dugo uzimanje uzorka (polagano otputanje likvora) Po zavretku punkcije bolesnik na trbuhu min. 30 minuta

Punkcija :
lumbalna (L3-L4 ili L4-L5 ) - ventrikularna

- subokcipitalna

Sakupljanje u vie epruveta (2-3)

Istovremeno sakupljanje likvora i seruma!

LIKVOR dostaviti u laboratorij odmah nakon punkcije !!!

Najee indikacije za lumbalnu punkciju:

Klinika sumnja na meningitis Konvulzije s temperaturom (i djeca maa od 18 mj.) Subarahnoidalno krvarenje (uz normalan CT) Kronine upalne bolesti SS-a (MS, SSPE, neuroborelioza...) Maligna infiltracija u SS (hemoblastoze, adenokarcinomi...) Akutne upalne bolesti perifernog ivanog sustava (poliradikuloneuritis)

Preporueno vrijeme prve (dijagnostike) punkcije

Bolest
Bakterijski meningitis Virusni meningitis Herpes encefalitis Guillain-Barr-ov poliradikulitis TBC meningitis Krvarenja, traume Akutni ishemijski inzult

Preporueno vrijeme punkcije (od pojave prvih simptoma)

1. ili 2. dan 3. do 5. dan 5. do 7. dan 3. do 5. dan 2. do 3. tjedan 6 do 10 sati 36 do 72 sata

Vrijeme ponovne punkcije (druga i trea punkcija) ovisno o tijeku i klinikoj slici bolesti

UZORCI LIKVORA KOJI STIU U LABORATORIJ:

1. LIKVOR DOBIVEN LUMBALNOM PUNKCIJOM 2. LIKVOR DOBIVEN OSTALIM PUNKCIJAMA 3. LIKVOR IZ DRENAE (PAMPUS, EVD, LD...)
EPRUVETE: -Staklene, sterilne bez dodataka

SAMO ZA CITOLOGIJU

NIKAKO NE RADITI CITOLOGIJU IZ EPRUVETA S CLOT ACTIVATOROM!!

OSNOVNE PRETRAGE LIKVORA

IZGLED I BOJA LIKVORA
CITOLOKE PRETRAGE

BIOKEMIJSKE PRETRAGE

Izgled i boja likvora:

(PRIJE I NAKON CENTRIFUGIRANJA)

Normalan nalaz likvora: bistar, bezbojan

Zamuen ( leukociti)
Nakon centrifugiranja: - najee bistar, biljei se boja

Krvav (eritrociti)

1000 eritrocita = bistar, nema vidljive obojenosti

>1000 eritrocita = lagano krvav, krvav... Nakon centrifugiranja: - bezbojan - ksantokroman (vrlo lagano, lagano...) - hemolitian

Ksantokroman
Krvarenje
Eritrociti hemoglobin BILIRUBIN

Hiperbilirubinemija

Ostalo (lijekovi, kontrast i sl.)

Spektralna analiza hem-pigmenata

(vidljivi dio spektra 400 700 nm)
APSORPCIONI MAKSIMUMI

Oksihemoglobin Methemoglobin Bilirubin

(412-415; 540; 575 nm) (406-408; 630 nm) (430-470 nm)

U normalnom likvoru odrasle osobe hem-pigmenti nisu prisutni!

CITOLOKE PRETRAGE LIKVORA

Ukupan broj stanica Vrste stanica diferencijalna slika

CITOLOGIJA LIKVORA

HITNO!
PUNKCIJA

BROJ STANICA
SPREMNICI (LABORATORIJ) MIKROSKOPSKA ANALIZA

DIFERENCIJALNA SLIKA: CITOGRAM

CITOCENTRIFUGA

OBOJENI PREPARAT

CITOLOGIJA LIKVORA

Nalaz stanica ovisan o dobi

T limfociti i monociti, eritrocita nema
Vrsta stanica: eritrociti leukociti limfociti monociti neutrofilni granulociti dojenad<1 godine varijabilno 30 x 10 /L
6

Djeca 1-4 godine varijabilno 20 x 10 /L

6

odrasli
0 nekoliko

5 x 10 /L
6

5% - 35% 50% - 90% < 8%

5% - 35% 50% - 90% < 8%

40% - 80% 15% - 45% < 6%

Citoloke pretrage likvora (1)

Ukupan broj stanica u likvoru

Fuchs Rosenthalova komorica Broj stanica/3 u 1 l ( x 106 / L) Brojanje: nativno ili u razrjeenju s fiziolokom otopinom
Leukociti se broje i izdaju zasebno od eritrocita

Hematoloki brojai broj stanica x 106 / L

(3,2l)

Citoloke pretrage likvora (2)

Diferencijalna analiza stanica

Izrada

preparata:

Citocentrifuga Volumen uzorka : ~ 0.2 ml Vrijeme izvedbe : <10 min. Bojenje preparata

Metoda po Pappenheimu (MGG)

Reakcija Berlinskog modrila (RBM) Citokemijska i imunocitokemijska bojenja

Poremeaj stanica u likvoru se moe oitovati na vie naina:

Poveanjem ukupnog broja stanica (pleocitozom) i do 10000 puta iznad normale (u gnojnim meningitisima)

Pojavom nove vrste stanica (tumorskih, tkivnog

porijekla)

Promjenom funkcionalnog stanja stanica (pojava fagocita ili plazma stanica)

U PLEOCITOZI VEINA STANICA U LIKVORU SU REAKTIVNE STANICE

NEUTROFILNI GRANULOCITI
Stanini reaktanti akutne upale SS-a
Fagocitiraju strano tijelo, razaraju ga i sami ugibaju Gnojni meningitis

Vrlo uspjean obrambeni mehanizam, ali nespecifian i time opasan za tkivo SS-a Neutrofilna reakcije je stoga kratkotrajna, i brzo se zamjenjuje mononuklearnom

Gnojne upale SS-a Serozne upale SS-a Reaktivne pleocitoze razliite geneze

EOZINOFILNI GRANULOCITI
Imaju sposobnost fagocitoze At+Ag kompleksa, stoga se javljaju neto kasnije u upali
Meningoencefalitis (cisticerkoza)

Parazitarne infekcije SS-a

Nau se uz strane ili denaturirane proteine sposobne da izazovu alergijsku reakciju Serozne upale razliite geneze Neoplastini procesi i krvarenja Prisutnost stranog tijela

MONONUKLEARNI FAGOCITI
TRANSFORMIRAJU SE IZ MONOCITA I TKIVNIH STANICA
MONOCITI IZ KRVI
TKIVNE STANICE LIKVORSKIH PROSTORA (mezenhimskog podrijetla)

Fagocitiraju strano tijelo, razaraju ga, nakon prerade mogu ga predoiti imfocitima

Najei tip staninog odgovora u bolestima SS-a

Aktivirani monociti (monocitoidne stanice)

Fagociti : prepoznaje se fagocitirani sadraj (leukofag, eritrofag, lipofag, pigmentofag i dr.)

Leukofag Faza ienja u bakterijskom meningitisu

Eritrofag Faza ienja kod krvarenja u likvorski prostor

Ishemiki modani udar

LIMFOCITI
Virusni meningitis

Prepoznavanjem antigena pokreu specifinu imunoloku otpornost (staninu i humoralnu)

Virusni encefalitis (izrazito reaktivne forme limfocita)

Serozne upale SS-a Rekovalescentna faza gnojnih upala Ostale reaktivne pleocitoze razliite geneze

Aktivirani B-limfociti plazmociti

Stvaraju antitijela unutar SS-a (intratekalna sinteza)

Plazma stanice u SS-u

U likvoru se dokazuju razliitim kvantitativnim i kvalitativnim metodama

Subakutne i kronine upale SS-a

razliite etiopatogeneze

Limfoidna i plazma stanica

- infekcije velikim virusima grupa mikso/paramikso i herpes - autoimune bolesti tipa multipla skleroza

(Mumps meningitis)

Tumorske stanice
(metastaze u SS-u)

Limfatika leukemija

Adenokarcinom

Biokemijske pretrage likvora:

Za analize koristiti centrifugirani likvor!

Glukoza Laktat Kloridi CRP Proteini

Kvantitativne

analize Kvalitativne analize

GLUKOZA

Koncentracija u likvoru ovisna o koncentraciji u krvi (u likvoru 60 % vrijednosti iz krvi); ravnoteno stanje se uspostavlja nakon 3-4 sata (KMB) Stabilnost ovisna o broju stanica i prisutnosti bakterija

Sniene vrijednosti : Bakterijski meningitis - poremeeni mehanizmi ulaska iz krvi (olakana difuzija) - pojaana potronja (leukociti) Krvarenja Metastaze u meningama i dr.

LAKTAT

Pokazatelj anaerobne glikolize u modanom tkivu Metabolike promjene Neovisan o koncentraciji u krvi! Normalan nalaz : 1,2-2,2 mmol/L Poviene vrijednosti: bakterijski meningitis diferencijalna dijagnoza (laktat CST 4,0 mmol/L) CVI Hipoksija Traume glave, konvulzije i dr.

PROTEINI U LIKVORU
Oko 80 % proteina u likvoru je krvnog podrijetla, oko 15 % je antigenski srodno krvnim proteinima i dodatno se stvaraju i unutar SS-a (npr. prealbumin / transtiretin)
DOB REFERENTNE VRIJEDNOSTI:

0-6 mjeseci

0,10-1,20 g/L

odrasli
> 40 godina

0,15-0,40 g/L
Porast koncentracije s dobi

Najei uzroci poremeaja proteina u likvoru:

Ulazak plazmatskih proteina kroz sustav barijera

(akutne upale razliite etiopatogeneze)

Usporena izmjena likvora (jaki edem mozga,

tumorske tvorbe koje urastaju u likvorske prostore)

Direktan unos plazmatskih proteina (traume mozga,

teka krvarenja u likvorski prostor)

Lokalna (intratekalna) sinteza protutijela unutar SS-a (kronine upale razliite etiopatogeneze)

Evaluacija proteina u likvoru

Kvantitativne metode
Ukupni proteini
Albumin, IgG, IgA, IgM (likvor + serum) kvocijenti Q (L/S) Matematiki model po Reiber-u za evaluaciju kvocijenata Q Procjena funkcije barijere i lokalne (intratekalne) sinteze imunoglobulina

Kvalitativne metode
Elektroforeza Multifrakcionirana elektroforeza Izoelektrino fokusiranje

Dokazivanje intratekalne sinteze imunoglobulina

Ostali proteini (CEA, NSE, MBP i dr.)

Nalaz oligoklonskih IgG

Kvocijenti (Q) za procjenu stanja KMB i intratekalnu sintezu At:

Qalb = alb(likvor) / alb(serum) Stanje barijere

QIgG = IgG(likvor) / IgG(serum)

QIgG

Sinteza At unutar SS

Qalb

Reiberov matematiko-statistiki model za evaluaciju proteinskih kvocijenata

REIBERGRAM

Procjena funkcije barijere i intratekalne sinteze protutijela

1 Normalna funkcija barijere 2 Disfunkcija barijere s proporcionalnim porastom Alb i IgG kvocijenta 3 Disfunkcija barijere uz sintezu IgG unutar SS-a 4 Normalna funkcija barijere uz sintezu IgG unutar SS-a 5 - Rezultati nesigurnog biolokog znaaja (posljedica analitike greke)

Elektroforetske tehnike za evaluaciju proteina u likvoru i dokazivanje oligoklonskih IgG

Elektroforeza proteina likvora
Serum Likvor

Multifrakcionirana elektroforeza +
imunoprecipitacija s anti-IgG antiserumom

Izoelektrino fokusiranje + imunoprecipitacija s

anti-IgG antiserumom

Denzitometrijski prikaz

Cilj kvalitativnih (elektroforetskih) metoda je dokazivanje promjena prvenstveno u gama globulinskoj frakciji promjene imunoglobulina

DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA KRONINIH UPALNIH BOLESTI SS

Kronine upalne bolesti SS-a

Dugotrajna stimulacija humoralnog odgovora unutar SSa (limfocitna reakcija traje tjednima i mjesecima) Lokalno (intratekalno) stvaranje antitijela (imunoglobulini A, G, M)
Lokalno stvoreni imunoglobulini uske, oligoklonske zone u gama globulinskoj frakciji u elektroforezi

Karakteristine znaajke humoralnog odgovora unutar SSa:

Intratekalno stvorena frakcija Ig i do 90% od ukupnog Ig Dugotrajna sinteza i spora normalizacija Oligoklonski tip humoralnog odgovora

protutijela ograniene heterogenosti Definicija OIgG u likvoru: Nalaz barem dvije vrpce Ig u likvoru koje nisu prisutne i u serumu

INDEKS ANTIGEN-SPECIFINIH PROTUTIJELA (AI) Odreuje udio intratekalno stvorenih antigen-specifinih protutijela u pulu imunoglobulina likvora (iste klase Ig) 1. Odreivanje titrova specifinih protutijela

AI = CST- IgG

CST- titar x serum - IgG

x serum - titar

( normalno < 4 )

2. Odreivanje specifinih protutijela ELISA metodom

AI =

Kvocijent specifinih At (CST/S) Kvocijent imunoglobulina (CST/S)

Q spec. At Q Ig

(normalno < 1.5)

(Morbili, Rubela, Varicela zoster) - MRZ reakcija

NALAZI LIKVORA

BAKTERIJSKI MENINGITIS Izgled: zamuen (bjelkast, ukast) Citoloki nalaz: pleocitoza Ukupan broj leukocita: > 1000/L Diferencijalna slika: 80% neutrofilnih granulocita Biokemijski nalaz: Glukoza : < 2,2 mmol/L - omjer glukoza CST/serum : < 0,6 Laktat: > 4,0 mmol/L Ukupni proteini: > 1,0 g/L CRP: > 1 mg/L Mikrobioloki nalaz - izoloran uzronik (70-90%)

VIRUSNI MENINGITIS Izgled: bistar, bezbojan Citoloki nalaz: Ukupan broj leukocita: 100-1000/L Diferencijalna slika: mononuklearne stanice (limfociti,
monociti)

< 20% neutrofilnih granulocita Biokemijski nalaz: Glukoza: normalan nalaz - omjer glukoza CST/serum : > 0,6 Laktat: normalan nalaz Ukupni proteini: 0,5-1,0 g/L CRP: < 1,0 mg/L Mikrobioloki nalaz: - negativan nalaz kulture

Nalaz likvora u encefalitisu

Citoloki nalaz:
Ukupan broj stanica: - blago do mjereno povien Diferencijalna slika: - razliiti reaktivni oblici mononuklearnih stanica, stanice ependima, bazofili

Nalaz ovisi o etiologiji, proirenosti i stupnju patoanatomskih promjena u mozgu

Biokemijski nalaz:
Glukoza: normalna ili poviena Proteini: ovisno o etiologiji (blago do umjereno povieni) - poveana gama globulinska frakcija; mogu nalaz oligoklonskih Ig

Nalaz likvora kod MS

Citoloki nalaz likvora: ukupan broj stanica normalan (remisija) ili blago do umjereno povien (relaps) prevladavaju mononuklearne stanice (limfociti, monociti, reaktivni oblici mononuklearnih stanica) Biokemijski nalaz likvora: Proteini: blago poviene vrijednosti Elektroforeza proteina likvora: poveana gama globulinska frakcija IEF+imunofiksacija: nalaz oligoklonskih IgG (u 95-98%) Dokazana lokalna sinteza IgG-a: (kvantitativno, Reiber) - oko 75% MRZ reakcija: pozitivna
Reiberov dijagram
Limfociti (mononuklearne stanice)

OIg

Nalaz likvora u svjeem subarahnoidnom krvarenju:

Izgled, boja:
- krvav, bistar/lag. ksantokroman

Hematogeni pigmenti:
- oksiHb /trag bilirubina

OksiHb

Citoloki nalaz:
Nalaz eritrocita, odnos L:E vei od krvi (neutrofilija)

Biokemijski nalaz:

Glukoza: sniena Laktat: povien Ukupni proteini: povieni (ovisno o jaini krvarenja)

OEKIVANI NALAZI CST U TRAUMATSKOJ PUNKCIJI NASUPROT SAH

NALAZ ksantokromija CST TRAUMATSKA PUNKCIJA ne SAH da

smanjenje broja E od 1. do 3. epruvete

da

ne

spontana koagulacija CST da

omjer leukociti/eritrociti slian perifernoj krvi (1:1000)

ne
premauje onaj u perifernoj krvi