Kolegij Molekularna biologija

Nastanak i uzroci raka

posljedica sloma regulacijskih mehanizama koji upravljaju ponaanjem normalne stanice proliferacija, diferencijacija i preivljavanje stanice viestaninog organizma precizno regulirani u stanicama raka regulacije nema i one nekontrolirano rastu, dijele se i ire po itavom organizmu ometajui normalne funkcije zdravih stanica poremeaji aktivnosti mnogih proteina koji imaju kljunu ulogu u staninoj signalizaciji, regulaciji staninog ciklusa i kontroli programirane stanine smrti dovode do nekontrolirane proliferacije karakteristine za stanice raka

RAK
doc. dr. sc. Jerka Dumi
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta Sveuilita u Zagrebu

Vrste raka

Rak guterae

rak moe nastati kao posljedica poremeaja proliferacije bilo koje vrste stanica u tijelu vie od stotinu vrsta raka razlikuju se u ponaanju i odgovoru na lijeenje tumor svaka nenormalna proliferacija stanica u organizmu benigni (dobroudni) i maligni (zloudni) tumori benigni tumor ostaje ogranien na mjesto na kojem je nastao, ne iri se na okolna tkiva niti na udaljene dijelove organizma maligni tumor moe proiriti na okolna tkiva ili udaljene dijelove organizma putem krvoilnog ili limfatikog sustava (metastaze) pojam rak odnosi se na iskljuivo maligne tumore

Klasifikacija tumora

Najee vrste raka u SAD

i benigni i maligni tumori klasificiraju se prema vrsti stanica iz kojih nastaju klasifikacija zloudnih tumora: KARCINOMI zloudne bolesti epitelnih stanica (90%) SARKOMI solidni tumori vezivnih tkiva (miii, kosti, hrskavice) rijetki kod ljudi LEUKEMIJE i LIMFOMI zloudne bolesti hematopoetskih stanica i stanica imunosustava (7%)

tumori se dalje klasificiraju prema tkivu iz kojeg nastaju (karcinom plua ili dojke) vrsti zahvaenih stanica (fibrosarkomi fibroblasti, eritoblastina
leukemija eritroblast)

Nastanak raka

Uestalost raka poveva se s dobi

temeljno svojstvo tumora klonalnost nastanak tumora iz jedne stanice koja pone nenormalno proliferirati analiza inaktivacije X kromosoma
normalna su tkiva mozaik stanica u kojima su inaktivirani razliiti X kromosomi (X1 i X2) tumori nastaju iz jedne promijenjene stanice , tako da je u svim tumorskim stanicama inaktiviran isti X kromosom (X1 je inaktivan, X2 aktivan)

klonalno podrijetlo tumora ne implicira da je ishodina stanica u poetku stekla sva obiljeja stanice raka

nastanak raka proces koji se sastoji od vie koraka tijekom kojih stanice zbog niza progresivnih promjena postaju zloudne nakupljanje promjena tijekom godina uestalost pojave raka poveava se s dobi uestalost raka debelog crijeva (kolona) povea se vie od 10x u razdoblju izmeu 30. i 50. godine ivota i jo 10x izmeu 50. i 70. godine

Stupnjevi razvoja tumora

Progresija razvoja tumora

nastanak raka na staninoj razini proces koji se sastoji od vie koraka i ukljuuje mutaciju i selekciju stanica sa sve izraenijim mogunostima proliferacije, preivljavanja, irenja i metastaziranja INICIJACIJA TUMORA rezultat genetike promjene koja dovodi do proliferacije jedne stanice proliferacija stanica dovodi do prekomjernog rasta monoklonske populacije tumorskih stanica PROGRESIJA TUMORA nakupljanje dodatnih mutacija u populaciji tumorskih stanica selektivna prednost stanice s veim potencijalom proliferacije njezini potomci s vremenom postaju dominantna populacija u tumoru = klonska selekcija stalno prisutna tumori sve bre rastu i postaju sve zloudniji

Uzroci raka

Uzroci raka (nastavak)

karcinogeni tvari koje uzrokuju rak zraenje, kemikalije, virusi zraenje i karcinogene tvari oteuju DNA i induciraju mutacije UV-zraenje (Sunce), karcinogene tvari iz duhanskog dima, aflatoksin (iz plijesni itarica) puenje uzrokuje 80-90% svih sluajeva raka plua; uz rak usne upljine, drijela, grla, jednjaka jedna treina svih smrtnih sluajeva uzrokovanih rakom posljedica je puenja virusi rak jetre i rak grlia maternice (10-20% raka u svijetu)

promotori tumora pridonose nastanku raka stimulirajui proliferaciju stanica ne uzrokuju mutacije uzrokuju poveanje broja dioba (forbol esteri - stimuliraju proliferaciju
stanica aktivirajui protein kinazu C)

model kemijski inducirani koni tumori kod mieva

inicijacija tumora mutacije uzrokovane kancerogenima; za nastanak tumora, mieve je potrebno izloiti tumorskom promotoru koji potie proliferaciju mutiranih stanica

hormoni (estrogeni) vani promotori nastanka nekih tumora kod ljudi

estrogeni stimuliraju proliferaciju stanica endometrija; prekomjerno izlaganje poveava vjerojatnost nastanka raka trupa maternice nadomjesna hormonska terapija u menopauzi OPREZ!

Svojstva stanica raka

A. Gubitak inhibicije proliferacije ovisne o gustoi stanica B. Autokrina stimulacija rasta C. Smanjena adhezivnost D. Gubitak kontaktne inhibicije E. Izluivanje proteaza i angiogeneza F. Poremeaji diferencijacije G. Izbjegavanje programirane stanine smrti

Svojstva stanica raka

nekontrolirana proliferacija stanica raka slina in vivo i in vitro u kulturi normalnih stanica INHIBICIJA PROLIFERACIJE OVISNA O GUSTOI STANICA (normalne stanice proliferiraju dok ne dostignu
gustou koja dijelom ovisi o raspoloivosti fakora rasta u mediju; proliferacija prestaje, stanice ulaze u G0 fazu)

veina stanica raka nije osjetljiva na inhibiciju ovisnu o gustoi

(mnoge stanice raka imaju smanjenu potrebu za faktorima rasta)

AUTOKRINA STIMULACIJA RASTA neke stanice raka same stvaraju faktore rasta posljedica neprekidna stimulacija proliferacije

meustanine interakcije i interakcije izmeu stanica i izvanstaninog matriksa slabije kod stanica raka smanjena ekspresija adhezijskih molekula na povrini (E-kadherin)
stanice raka manje ograniene interakcijama s drugim stanicama i izvanstaninim matriksom sposobnost irenja i metastaziranja

SMANJENA ADHEZIVNOST promjene u st. obliku i citoskeletu

stanice raka okruglastije, dijelom zbog slabijeg prijanjanja

GUBITAK KONTAKTNE INHIBICIJE

normalne stanice (fibroblasti) migriraju po posudici za kulturu dok ne dou u dodir sa susjednom stanicom; tumorske stanice se nastavljaju kretati, migriraju jedne preko drugih i rastu neuredno u vie slojeva

dodir sa susjedima inhibira kretanje i proliferaciju normalnih stanica, tumorskih ne

IZLUIVANJE PROTEAZA veina zloudnih stanica izluuje proteaze koje razgrauju sastojke izvanstaninog matriksa omoguen prodor kroz bazalne membrane i irenje tumora ANGIOGENEZA stanice raka izluuju faktore koji stimuliraju stvaranje novih krvnih ila (angiogeneza je nuna radi opskrbe stanica
tumora kisikom i hranjivim tvarima)

Transformacija stanica u kulturi

eksperimentalni modeli za ispitivanja karcinogena

in vitro testovi za otkrivanje pretvorbe normalnih stanica u

tumorske stanice u kulturi transformacija stanica nakon izlaganja kulture normalnih stanica kancerogenom agensu, otkrivaju transformirane stanice sa znaajkama in vitro rasta tumorskih stanica test arita temelji se na mogunosti otkrivanja skupine transformiranih stanica koje ine morfoloki prepoznatljivo arite na pozadini normalnih stanica na dnu posudice za kulturu stanica test arita koristi se trima znaajkama transformiranih stanica
promijenjenim izgledom gubitkom kontaktne inhibicije gubitkom inhibicije rasta ovisne o gustoi

krvne ile u nastajanju propusnije za stanice tumora olakano metastaziranje

POREMEENA DIFERENCIJACIJA veina terminalno diferenciranih stanica se ne dijeli stanice raka ostaju zaustavljene u ranoj fazi diferencijacije koja odgovara (leukemije)

PROGRAMIRANA STANINA SMRT tumorske stanice izbjegavaju apoptozu; ne trebaju faktore rasta za preivljavanje; otoprnije na oteenja DNA (terapija zraenjem)

Uloga virusa u nastanku raka

Virusi hepatitisa B i C

kronine infekcije jetre poveavanju nastanak raka za 100 puta trajna proliferacija jetrenih stanica zbog kroninog oteenja tkiva i upale potie nastanak raka virus hepatitisa B gen X utjee na ekspresiju niza staninih gena i dovodi do poremeaja proliferacije i staninog preivljavanja

SV40 i poliomavirus

ne izazivaju rak u stanicama svojih prirodnih domaina - permisivne stanice nepermisivne stanice
integracija u genom domaina transformacija stanica zbog

proteini ranoga podruja potiu replikaciju virusne DNA, ali i gena u stanici domainu trajni poticaj proliferacije ukoliko doe do ugradnje u genom domaina T antigen vee i inaktivira tumor supresore p53 i Rb

ekspresije virusnih gena

Papilomavirusi

Adenovirusi

60 razliitih vrsta infekcija epitelnih stanica

dobroudne promjene (bradavice) karcinom grlia maternice

rani geni E6 i E7 interferiraju sa staninom proliferacijom

E6 vee Rb E7 potie razgradnju p53

u nepermisivnim domainima izazivaju transformaciju (kao SV40 i poliovirus) rani geni E1A i E1B interferiraju sa staninom proliferacijom
E1A vee Rb E1B vee p53

Retrovirusi Herpesvirusi

razliiti retrovirusi razlikuju se po onkogenim sposobnostima

Rausov sarkomski virus (RSV)

najsloeniji ivotinjski virusi uzrokuju tumore u ivotinja i ljudi Epstein-Barrov virus

nekoliko vrsta raka, Burkittov limfom mehanizam nastanka raka nedovoljno razjanjen zbog

transformira stanice pileeg embrija, dok srodni virus ptije leukoze (ALV) koji se replicira u istim stanicama ne uzrokuje transformaciju

sloenosti genoma

Herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom

nekoliko virusnih gena utjee na staninu proliferaciju i

preivljavanje

veina retrovirusa nije kancerogena, a nastanak raka povezan je s mutacijom staninih gena uzrokovanom integracijom virusnog genoma karcinogeni retrovirusi sadre ONKOGENE

jedan od njih djeluje na Rb i p53

Genomi retrovirusa ALV i RSV

Onkogeni i protoonkogeni
retrovirusni onkogeni nastaju rekombinacijom DNA virusa i DNA domaina potjeu od srodnih gena iz stanica domaina (PROTOONKOGENI - regulacijski stanini geni; src, raf, ras) onkogeni su mutirani ili nenormalno eksprimirani oblici staninih protoonkogena:
transkripcija virusnog

onkogena je pod kontrolom virusnih promotora i pojaivaa delecije ishodnih protoonkogena nastanak fuzijskih proteina tokaste mutacije

Retrovirusni onkogeni

Onkogeni u ljudskim tumorima

tumori koji nisu inducirani virusima mogu sadravati STANINE ONKOGENE koji su nastali mutacijama ili prestrojavanjem DNA tijekom nastanka raka
pokus: DNA ljudskog karcinoma mokranog mjehura uinkovito transformora mije stanice u kulturi ljudski tumor sadrava bioloki aktivan stanini onkogen)

humani onkogen koji je prvi otkriven testom prijenosa gena je homologan s rasH onkogenom Harveyeva sarkomskog virusa najei onkogeni kod ljudi rasH, rasK i rasN imaju ulogu u nastanku ~20% svih ljudskih malignoma (50% sluajeva raka kolona i 25% sluajeva raka plua) neki onkogeni nemaju svoje homologe s virusnim onkogenima

Onkogeni svojstveni ljudskim tumorima

Onkogeni ras

onkokena nema u tumorskim stanicama nastaju zbog mutacija koje se dogaaju tijekom razvoja tumora ras onkogeni se od ras protoonkogena razlikuju po zamjenama pojedinanih aminokiselina na kljunim mjestima mutacija glicin valin na poloaju 12, ili neke druge kemijski karcinogeni mogu izazvati mutacije mutirani Ras konstitutivno aktivan (vee GTP) jer GAP (protein koji aktivira GTPazu) ne djeluje na mutirani Ras

ras protoonkogen je prisutan u normalnim stanicama, dok ras

Onkogen c-myc

Onkogen abl

mnoge stanice raka imaju poremeenu grau kromosoma (translokacije, duplikacije, delecije) prestrojavanja gena uzrokovana kromosomskim translokacijama esto dovode do nastanka onkogena

translokacija protoonkogena abl s kromosoma 9 na 22 povezana s kroninom mijeloinom leukemijom (KML)

fuzija abl s genom bcr fuzijski Bcr/Abl protein u kojem je normalni aminokraj Abl protoonkogenog proteina zamijenjen aminokiselinskim slijedom iz Bcr poremeaj regulacije aktivnosti Abl protein-tirozin-kinaze i transformacija stanica

c-myc u ljudskim Burkittovim limfomima i mijim plazmocitomima

kromosomske translokacije koje zahvaaju podruja gena za imunoglobuline translokacija djelia kromosoma 8 na jedan od lokusa gena za imunoglobuline na 2., 14. ili 22. kromosomu na mjestu loma u kromosomu 8 protoonkogen c-myc

Onkogen N-myc

Djelovanje onkogenih proteina

>100 virusnih i staninih onkogena koji mogu dovesti do nenormalnog ponaanja stanica veina onkogena proteini signalnih puteva koji reguliraju proliferaciju i preivljavanje faktori rasta takoer mogu postati onkogeni u sluajevima poremeene ekspresije velik broj onkogena kodira receptore faktora rasta (uglavnom protein-tirozin-kinaze)
translokacija receptora za PDGF amplifikacija ErbB-2 mutacije protoonkogena ras delecije regulatornih podjedinica Raf pojaana transkripcija protoonkogena jun i fos (podjedinice trasnskripcijskog faktora AP-1) putem Elk-1 i ERK

amplifikacija gena mehanizam aktivacije onkogena amplifikacija onkogena uloga u progresiji mnogih tumora koja je karakterizirana brim rastom i zloudnijim ponaanjem onkogen N-myc u neuroblastomima (djeji tumori izgraeni od embrionalnih ivanih stanica) u agresivnim i brzorastuim tumorima onkogen erbB-2 kodira receptorsku protein-tirozin-kinazu amplifikacija erbB-2 povezana s progresijom karcinoma dojke i jajnika

Mehanizam onkogene aktivacije Tel/PDGF

Djelovanje onkogenog proteina PML/RAR

do aktivacije normalnog receptora za PDGF dolazi zbog dimerizacije uzrokovane vezanjem PDGF Tel/PDGFR onkogen kodira fuzijski protein u kojem je normalna izvanstanina domena receptora za PDGF zamijenjena slijedom s amino-kraja transkripcijskoga faktora Tel taj dio Tel sadrava uzvojnica-oma-uzvojnica dimerizacijsku domenu ovaj slijed dimerizira i u odsutnosti PDGF to dovodi do konstitutivne aktivacije onkogenske protein-kinaze

onkogeno djelovanje nekih transkripcijskih faktora posljedica je inhibicije diferencijacije hormoni titnjae i retinoina kiselina potiu diferencijaciju stanica
mutirani oblici receptora za hormone titnjae (ErbA) - kokoja eritroleukemija i mutirani oblici receptora za retinoinu kis. (PML/RAR) ljud. promijelocitna leuk.

mutirani onkogeni ometaju djelovanje svojih normalnih homologa onemoguavaju sazrijevanje stanica zaustavljaju leukemijske stanice u stanju aktivne proliferacije

terapija akutne promijelocitne leuk. visoke doze retinoine kiseline prevlada se uinak PML/RAR onkogenog proteina

Onkogeni i preivljavanje stanica

Tumor-supresorski geni

inhibiraju staninu proliferaciju i nastanak tumora u mnogim tumorima tumor-supresorski geni su nestali ili su inaktivni ne funkcionira negativna regulacija stanine proliferacije
retinoblastom rijetki tumor oka kod djece; mogue lijeenje retinoblastomi se javljaju kod 50% potomstva oboljelih za sklonost

nastanka tumora odgovoran je jedan gen koji se nasljeuje autosomno domonantno

Mutacije Rb gena tijekom nastanka retinoblastoma

Tumor-supresorski Rb gen

Rb gen negativni regulator tumorogeneze

Dijete s nasljednim retinoblastomom je od zahvaenog roditelja naslijedilo defektnu kopiju Rb gena (Rb). Druga somatska mutacija, koja inaktivira jedinu preostalu normalnu kopiju Rb+ u stanici retine, dovodi do nastanka retinoblastoma. U sporadinim sluajevima, bolesnici su naslijedili dva normalna Rb+ gena pa retinoblastom nastaje samo ako dvije somatske mutacije inaktiviraju obje kopije Rb gena u istoj stanici.

delecije kromosoma 13q14 nedostatak Rb gena odgovoran za nastanak karcinoma mjehura, dojke, plua... Rb protein je kljuna meta onkogenih proteina nekih DNA virusa (SV40, adenovirusa, ljudskih papilomavirusa, herpesvirusa...) Rb vee transkripcijski faktor E2F i sprijeava sintezu proteina potrebnih za staninu diobu

Tumor-supresorski geni

Tumor-supresorski gen p53

gen p53 inaktiviran u brojnim humanim tumorima (leukemije, limfomi, sarkomi, tumori

mozga, karcinomi dojke, kolona, plua) 50% svih sluajeva raka

protein p53 je meta onkogenih proteina SV40, adenovirusa... p53 regulira napredovanje staninog ciklusa oteenje DNA inducira p53 koji aktivira transkripciju p21 inhibitora Cdk proteina

p21 inhibira sve Cdk/ciklin komplekse zaustavlja napredovanje staninog ciklusa replikaciju DNA inhibira vezanjem PCNA (jezgreni antigen stanica u proliferaciji)

zaustavljanje st. ciklusa mogunost popravka mutacija nedostatak p53 stanica podlonija mutacijama p53 nuan je za apoptozu izazvanu oteenjem DNA otpornost tumorskih stanica na kemoterapiju

Uloge onkogeni i tumor-supresorskih gena u nastanku tumora

Primjena molekularne biologije u sprjeavanju i lijeenju raka

tumorigeneza stupnjeviti proces postupna pretvorba normalnih st. u tumorske nune mutacije koje uzrokuju i aktivaciju onkogena i inhibiciju tumor-supresora nakupljanje genskih oteenja proliferacije i preivljavanja rak debelog crijeva mutacije onkogena ili tumor-supresorskih gena s 4 razliita djelovanja:

ras ili raf onkogeni koji djeluju u putu ERK tumor-supresori ili onkogeni puta Wnt (APC)
tumor-supresori signalnog lanca TGF- p53

sprjeavanje bolesti pouzdano otkrivanje promjena u ranoj, premalignoj fazi lijeenje: lokalna terapija, kirurki zahvat, zraenje uspjenost lijeenja ovisi o fazi bolesti uloga MB: prepoznavanje osoba s naslijeenom sklonou za nastanak bolesti (otkrivanje genskih poremeaja) rano okrivanje raka mutacije tumor-supresorskog gena APC karcinom kolona bez polipoze (15% svih sluajeva raka kolona i 1-2% raka uope); BRCA1 i BRCA2 5-10% svih sluajeva raka dojke u SAD nepoznati geni predispozicija za nastanak drugih tumora specifini markeri?

Molekularna dijagnostika

Lijeenje

molekularna analiza onkogena i tumorsupresorskih gena, odgovornih za pojedine vrste raka korisni podaci za dijagnostiku i praenje uspjenosti lijeenja translokacija abl gena u KML otkrivanje rekombinantnog bcr/abl onkogena lananom reakcijom polimeraze (PCR) analiza sveukupne ekspresije gena u stanicama raka DNA mikroipovi mogua istovremena analiza desetak tisua gena stvaranje molekularne klasifikacije tumora na temelju profila ekspresije pojedinih gena

veina lijekova u primjeni oteuju DNA ili sprjeavaju replikaciju DNA tetni ne samo za stanice raka nego i za normalne stanice neselektivno djelovanje cilj = lijekovi sa selektivnim djelovanjem lijekovi koji inhibiraju angiogenezu lijekovi specifino usmjereni protiv onkogena (onkogeni su prisutni i u normalnim stanicama) visoka selektivnost
akutna promijelocitna leukemija (fuzija gena za receptor retinoine kiseline (RAR) i gena PML); lijek = kombinacija citostatika i visokih koncentracija retinoine kiseline rak dojke (u 30% sluajeva pojaana ekspresija gena erbB-2); lijek = herceptin - monoklonsko protutijelo naspram izvanstanine domene sprjeava proliferaciju tumorskih stanica KML (translokacija abl Philadelphia kromosom); lijek = mala molekula STI-571, Gleevec ili imatinib)

FDA (Food and Drug Administration, Uprava za hranu i lijekove SAD)

HRVATSKO DRUTVO ZA BIOKEMIJU I MOLEKULARNU BIOLOGIJU CROATIAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY

Stanimir Vuk-Pavlovi
Mayo Clinic College of Medicine, Rochester, Minnesota

Imatinib mesylate disrupts cell cycle progression, modifies the nucleoskeleton and suppresses activationinduced transcription in human T cells
3. veljae 2005. godine u 15:00 sati u Velikoj predavaonici Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta Sveuilita u Zagrebu, A. Kovaia 1, Zagreb