Kinetika Degradacije Fenolnih Jedinjenja Hidroksil Radikalima

Univerzitet u Niu
Prirodno-matematiki fakultet
Departman za hemiju

Milan N. Miti

KINETIKA DEGRADACIJE FENOLNIH JEDINJENJA
HIDROKSIL RADIKALIMA

Doktorska disertacija

Ni, 2011.

PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET
NI
KLJUNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
Redni broj, RBR:
Identifikacioni broj, IBR:
Tip dokumentacije, TD: monografska
Tip zapisa, TZ: tekstualni
Vrsta rada, VR: Doktorska disertacija
Autor, AU: Milan Miti
Mentor, MN: Dr Mirjana Obradovi
Naslov rada, NR:
Kinetika degradacije fenolnih jedinjenja hidroksil radikalima
Jezik publikacije, JP: srpski
Jezik izvoda, JI: srpski i engleski
Zemlja publikovanja, ZP: Srbija
Ue geografsko podruje, UGP: Srbija
Godina, GO: 2011.
Izdava, IZ: autorski reprint
Mesto i adresa, MA: Ni, Viegradska 33
Fiziki opis rada, FO:
(poglavlja/ strana/ citata/ tabela/ slika/
grafika/ priloga)
10 poglavlja, 308 strana, 167 citata, 71 tabela, 172 slike
Nauna oblast, NO: hemija
Nauna disciplina, ND: Fizika hemija i analitika hemija
Predmetna odrednica/Kljune rei, PO: Kinetika degradacije, polifenoli, metali, antioksidativna aktivnost, UV-Vis
spektrofotometrija, HPLC metoda, ICP-OES analiza
UDK
543.23 : 547.562 + 54.024
uva se, U: biblioteka
Vana napomena, VN: Disertacija je uraena u laboratorijama PMF-a Univerziteta u Niu

Izvod, IZ:

Sedam sorti groa, tri sorte vinje, crvena ribizla i malina gajena na
razliitim podrujima, 15 vrsta crvenih vina, 10 vrsta belih vina, 9 vrsta
komercijalnih crvenih sokova i 12 vrsta komercijalnih i domaih crvenih
vonih vina je analizirano na sastav polifenolnih jedinjenja i
antioksidativnu aktivnost.
Prouena je kinetika degradacije malvidin-3-glukozida, malvidin-3-
acetil-glukozida, katehina i epikatehina crvenih vina hidroksil radikalima
pri pH=3,5. Pri validaciji HPLC metode odreeni su sledei parametri:
linearnost, limit detekcije, limit kvantifikacije, tanost i preciznost.
Izraunati su termodinamiki parametri. Predloen je mehanizam reakcije
degradacije.
Prouena je kinetika i razraene su kinetiko-spektrofotometrijske
metode za odreivanje ukupnih monomernih antocijana crvenih vina,
ukupnih polifenola belih vina i ukupnih monomernih antocijana sokova
vinje, crvene ribizle i maline, na osnovu reakcije njihove degradacije
hidroksil radikalima. Izraunati su termodinamiki parametri. Predloen je
mehanizam reakcije degradacije. Odreeni su optimalni uslovi odigravanja
reakcije. Izraunata je tanost, preciznost, limit detekcije i limit
kvantifikacije. Metode su primenjene za odreivanje ukupnih monomernih
antocijana u crvenim vinima i sokovima od vianja, crvenih ribizli i malina
i za odreivanje ukupnih fenolnih jedinjenja u belim vinima.

Datum prihvatanja teme, DP:
19.09.2011.
Datum odbrane, DO:

lanovi komisije,
KO:
Predsednik:
lan:
lan, mentor:

PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET
NI
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: Monography
Type of record, TR: Textual
Contents code, CC: Ph.D.dissertation
Author, AU: Milan Miti
Mentor, MN: Mirjana Obradovi PhD
Title, TI: Kinetics degradation of phenolic compounds by hydroxyl radicals
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: Serbian and English
Country of publication, CP: Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2011.
Publisher, PB: Autor
,
s reprint
Publication place, PP: Ni, Viegradska 33
Physical description, PD:
(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs
/appendixes)
10 chapters, 308 pages, 167 references, 71 tables, 172 pictures
Scientific field, SF: Chemistry
Scientific discipline, SD: Physical Chemistry and Analytical Chemistry
Subject/Key words, S/KW: Kinetics degradation, polyphenols, metals, antioxidant activity, UV-Vis
spectrophotometry, HPLC method, ICP-OES analysis
UC 543.23 : 547.562 + 54.024
Holding data, HD: Library
Note, N: The dissertation work was done at PMF, University of Ni laboratories

Abstract, AB: Seven cultivars of grapes, three cultivars of sour cherry, red currant
and raspberry from different geographical regions, 15 varieties of red
wines, 10 varieties of white wines, 9 varieties of commercial red juices
and 12 varieties of commercial and domestic red fruit wines were
analyzed for their phenolic compounds and antioxidant activity.
The kinetics of the degradation of malvidin-3-glucoside, malvidin-3-
acetil-glucosire, catechin and epicatechin in red wines by hydroxyl
radicals in aqueous solution (pH=3.5) was investigated. HPLC methods
were validated for linearity, limit of detection, limit of quantification,
precision and accuracy. The thermodynamic parameters were obtained.
The mechanism of degradation was discussed.
The kinetics was investigated and the kinetic-spectrophotometric
methods for determining the amounts of total monomeric anthocyanins in
red wines, of total polyphenols in white wines and total monomeric
anthocyanins in sour cherry, red currant and raspberry juices, based on the
reaction of their degradation by hydroxyl radicals. The thermodynamic
parameters were obtained. The mechanism of degradation was discussed.
The optimal working conditions were determined. Limit detection, limit
quantification, accuracy and precision were calculated. The methods were
applied to determine the total monomeric anthocyanins in red wines, sour
cherry juices, red currant juice and raspberry juices, and the total
polyphenols in white wines.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 19.09.2011.
Defended on, DE:
Defended Board,
DB:
President:
Member:
Member,
Mentor:

Mojoj erki Milici

Ova doktorska disertacija uraena je u laboratorijama
Departmana za hemiju Prirodno-matematikog fakulteta
Univerziteta u Niu.
Izradom doktorske disertacije rukovodila je dr Mirjana
Obradovi, redovni profesor Prirodno-matematikog fakulteta
Univerziteta u Niu, koja je predloila temu za doktorsku disertaciju
i ovom prilikom joj se zahvaljujem na svestranoj pomoi i
sugestijama tokom izrade rada.
Zahvaljujem se dr Zori Grahovac, redovnom profesoru
PMF-a u Niu i dr Predragu ureviu, redovnom profesoru PMF-
a u Kragujevcu sto su se prihvatili ocene ove doktorske disertacije.
Zahvaljujem se Jean-Marc Souquet-u, istraivau na
National Institute for Agricultural Research, Montpellier, INRA,
France, koji me je uveo u oblast hemijske analize groa i vina
HPLC metodom.
Nastavno-naunom timu Katedre za Analitiku i Fiziku
hemiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu
zahvaljujem na saradnji tokom proteklih godina.
Zahvaljujem se svojoj supruzi Jeleni na strpljenju, pomoi u
tehnikoj obradi ilustrovanih eksperimentalnih rezultata i podrci
tokom izrade doktorske disertacije.
Posebnu zahvalnost dugujem svojoj majci prof. dr Sneani
Miti na strunim savetima, podrci i razumevanju.

Autor

SADRAJ
1. UVOD .............................................................................................................................1
2. OPTI DEO ...................................................................................................................7

2.1. Brzina hemijskih reakcija ...............................................................................9
2.1.1. Teorija brzine hemijskih reakcija ..............................................................10
2.1.1.1. Teorija prelaznog stanja. Aktivirani kompleks molekula .............13
2.1.2. Osnovi katalize...........................................................................................19
2.1.3. Mehanizmi homogeno-katalitikih reakcija...............................................23
2.1.3.1. Reakcije katalizovane jonom koji menja svoje
oksidaciono stanje tokom reakcije.................................................29
2.1.3.2. Redoks reakcije sa organskim supstratima.....................................29
2.1.4. Kinetike metode analize...........................................................................30
2.1.4.1. Vrste kinetikih metoda..................................................................31
2.1.4.2. Karakteristike kinetikih metoda analize.......................................33

2.2. Fenolna jedinjenja..........................................................................................37
2.2.1. Flavonoidi...................................................................................................40
2.2.2. Antocijani...................................................................................................43
2.2.3. Flavan-3-oli................................................................................................48
2.2.4. Flavonoli.....................................................................................................49
2.2.5. Fenolna jedinjenja neflavonoidne strukture...............................................49

2.3. Slobodni radikali i oksidativni procesi.........................................................51
2.3.1. Definicija i podela slobodnih radikala........................................................51
2.3.2. Antioksidanti..............................................................................................53
2.3.3. Oksidacija fenolnih jedinjenja....................................................................54

2.4. Hromatografija...............................................................................................64
2.4.1. Tena hromatografija visokih performansi (HPLC)..................................65
2.4.1.1. HPLC parametri.............................................................................67
2.4.1.2. Razvoj i validacija HPLC metode..................................................70

2.5. UV/Vis spektrofotometrija............................................................................73
2.5.1. Apsorpcija UV/Vis zraenja.......................................................................73
2.5.2. Snimanje UV/Vis spektra...........................................................................75
2.5.3. Tanost i preciznost merenja......................................................................76

3. EKSPERIMENTALNI DEO......................................................................................79

3.1. Materijal..........................................................................................................81

3.2. Aparati i reagensi...........................................................................................81
3.2.1. Aparati.......................................................................................................80
3.2.2. Reagensi....................................................................................................83
3.3. Metode............................................................................................................85
3.3.1. Priprema uzoraka........................................................................................85
3.3.1.1. Postupak ekstrakcije.......................................................................85
3.3.1.2. Postupak mineralizacije..................................................................85
3.3.2. UV/Vis spektrofotometrijske metode........................................................85
3.3.2.1. Odreivanje sadraja ukupnih fenolnih jedinjenja.........................86
3.3.2.2. Odredjivanje sadraja ukupnih flavonoida.....................................86
3.3.2.3. Odredjivanje sadraja antocijana (sing pH i pH diferenci-
jalnom metodom.87
3.3.2.4. Odreivanje procenta polimerne boje............................................89
3.3.2.5. Odreivanje radikal skevener kapaciteta, ukupne
antioksidativne aktivnosti i antioksidativnog potencijala..............90
3.3.3. HPLC metoda.............................................................................................91
3.3.4. ICP-OES metoda........................................................................................92
3.3.5. Metode za odreivanje brzine reakcije.......................................................93
3.3.5.1. Kinetiko-spektrofotometrijska metoda.........................................93
3.3.5.2. HPLC metoda.................................................................................94
3.3.6. Statistika obrada podataka........................................................................94

4. REZULTATI ...............................................................................................................95

4.1. Odreivanje sadraja polifenola, metala i antioksidativne aktivnosti......97

4.1.1. Odreivanje sadraja polifenola, metala i antioksidativne
aktivnosti groa........................................................................................97
4.1.1.1. Spektrofotometrijsko odreivanje polifenola i
antioksidativne aktivnosti groa...................................................98
4.1.1.2. HPLC odreivanje antocijana, flavan-3-ola i
hidroksicimetnih kiselina u grou..............................................103
4.1.1.3. ICP-OES odreivanje metala u grou........................................109

4.1.2. Odreivanje sadraja polifenola i antioksidativne
aktivnosti crvenih vina.............................................................................114
antioksidativne aktivnosti crvenih vina........................................115
4.1.2.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola,
flavan-3-ola i hidroksicimetnih kiselina crvenih vina..................121

aktivnosti belih vina................................................................................126
antioksidativne aktivnosti belih vina............................................126

4.1.3.2. HPLC odreivanje hidroksicimetnih kiselina u belom vinu........130

4.1.4. Odreivanje sadraja polifenola, metala i
antioksidativne aktivnosti vinje..............................................................132
antioksidativne aktivnosti vinje..................................................132
4.1.4.2. HPLC odreivanje antocijana i hidroksicimetnih
kiselina u vinji............................................................................134
4.1.4.3. Promene sadraja fenolnih jedinjenja u vinji tokom zrenja.......136
4.1.4.4. ICP-OES odreivanje metala u vinji.........................................140

4.1.5. Odreivanje sadraja polifenola i antioksidativne aktivnosti
komercijalnih sokova...............................................................................144
antioksidativne aktivnosti komercijalnih sokova.........................144
4.1.5.2. HPLC odreivanje antocijana i hidroksicimetnih
kiselina u komercijalnim sokovima..............................................147

aktivnosti vonih vina..............................................................................153
antioksidativne aktivnosti vonih vina.........................................153
4.1.6.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola i hidroksicimetnih
kiselina u vonim vinima.............................................................157

aktivnosti crvene ribizle...........................................................................164
antioksidativne aktivnosti crvene ribizle......................................164
4.1.7.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola,
flavan-3-ola i hidroksicimetnih kiselina u crvenoj ribizli...........166

aktivnosti maline.....................................................................................172
antoksidativne aktivnosti maline..................................................172
4.1.8.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola i hidroksicimetnih
kiselina u malini..........................................................................173

4.2. Ispitivanje kinetike degradacije fenolnih jedinjenja
hidroksil radikalima.....................................................................................178

4.2.1. Kinetiko-spektrofotometrijsko ispitivanje reakcije
degradacije antocijana crvenih vina.........................................................178

4.2.1.1. Kinetike i termodinamike karakteristike sistema......................179
4.2.1.2. Validacija kinetiko-spektroforometrijske metode
za odreivanje antocijana crvenih vina........................................185

4.2.2. Ispitivanje kinetike reakcije degradacije antocijana
crvenih vina HPLC metodom...................................................................190
4.2.2.1. Validacija HPLC metode za odreivanje Mv-3-G.......................190

4.2.3. Ispitivanje kinetike reakcije degradacije flavan-3-ola
crvenih vina HPLC metodom...................................................................199
4.2.3.1. Validacija HPLC metode za odreivanje
katehina i epikatehina...................................................................199

degradacije fenolnih jedinjenja belih vina................................................206
za odreivanje ukupnih fenola belih vina.....................................211

degradacije antocijana soka vinje...........................................................215
za odreivanje antocijana soka vinje..........................................221
degradacije antocijana soka crvene ribizle...............................................225
4.2.6.2. Uticaj rastvaraa na brzinu reakcije
degradacije antocijana hidroksil radikalima.................................231
4.2.6.3. Validacija kinetiko-spektroforometrijske metode za
odreivanje antocijana u soku crvene ribizle i maline.................235

5. DISKUSIJA REZULTATA.....................................................................................239

5.1. Kinetika i mehanizam degradacije fenolnih jedinjenja hidroksil radikalima.....241
5.1.1. Mehanizam degradacije fenolnih jedinjenja belih vina............................244
5.1.2. Mehanizam degradacije antocijana crvenih vina.....................................248
5.1.3. Mehanizam degradacije antocijana ceenih sokova od
vianja, crvene ribizle i maline.................................................................251
5.1.4. Mehanizam degradacije flavan-3-ola.......................................................253

6. IZVOD.......................................................................................................................257
7. SUMMARY...............................................................................................................263
8. LITERATURA.........................................................................................................269
9. PRILOG....................................................................................................................285
10. BIOGRAFIJA SA BIBLIOGRAFIJOM................................................................301

Skraenice

AP Antioksidativni potencijal
C - Katehin
CE Katehin ekvivalent
C
L
Limit detekcije
C
Q
Limit kvantifikacije
Cy Cijanidin
Cy-3-G Cijanidin-3-glukozid
C3GE Ekvivalent cijanidin-3-glukozida
Dp Delfinidin
Dp-3-G Delfinidin-3-glukozid
EC - Epikatehin
GAE Ekvivalent galne kiseline
HPLC Tena hromatografija visokih performansi
ICP-OES Optiki emisioni spektrofotometar sa induktivno kuplovanom plazmom
IUPAC Meunarodno udruenje za istu i primenjenu hemiju (International Union of Pure
and Applied Chemistry)
MA Monomerni antocijani
MeOH metanol
Mv Malvidin
Mv-3-G Malvidin-3-glukozid
Mv-3-AG Malvidin-3-acetil-glukozid
M3GE ekvivalent malvidin-3-glukozida
nd nije naeno
Pn - Peonidin
Pn-3-G Peonidin-3-glukozid

Pt Petunidin
Pt-3-G Petunidin-3-glukozid
RSC radikal skevinzer kapacitet
RSD Relativna standardna devijacija
RG Relativna greka
TA Ukupni antocijani
TAA Ukupna antioksidativna aktivnost
TE Troloks ekvivalent
TF Ukupni flavonoidi
TP Ukupni fenoli
t
R
Retenciono vreme

1

1. UVOD
2

3

Fenolna jedinjenja (polifenoli) su veoma rasprostranjeni proizvodi sekundarnog
metabolizma biljaka i antioksidativno delovanje biljnih ekstrakata uglavnom se vezuje za
njihovo prisustvo. Poznato je vie od 8000 fenolnih jedinjenja, koja se po svojoj strukturi
veoma razlikuju, od jednostavnih molekula, kao to su fenolne kiseline do visoko
kondenzovanih jedinjenja kao to su tanini. U biljkama se ova jedinjenja preteno nalaze u
konjugovanom obliku, sa jednim ili vie molekula eera, te pokazuju aktivnost kako u
hidrofobnim, tako i u liofilnim sistemima. Najzastupljenija fenolna jedinjenja su: fenolne
kiseline (derivati benzoeve i cimetne kiseline), flavanoli, flavonoidi i dihidrohalkoni.
Smatra se da je antioksidativna aktivnost fenola prvenstveno rezultat njihove
sposobnosti da budu donori vodonikovih atoma i kao takvi uklanjaju radikale uz formiranje
manje reaktivnih fenoksil radikala. Brojne in vitro studije potvrdile su da sekundarni
metaboliti imaju pozitivne efekte na procese u elijama sisara, npr. na ekspresiju gena,
zgruavanje krvi, oksidaciju LDL, dilataciju krvnih sudova, signalizaciju izmeu elija,
modulaciju enzimske aktivnosti, deaktivaciju kancerogena i detoksikaciju i da, na osnovu
toga, mogu in vivo ispoljiti antikancerogeno dejstvo. Bobiasto voe poput maline, jagode,
ribizle, vinje i crnog groa bogato je polifenolnim jedinjenjima, usled ega ono predstavlja
znaajan izvor antioksidanata u svakodnevnoj ishrani.
Odrivost kvaliteta voa i proizvoda od voa od velikog je interesa, zbog njihove
iroke upotrebe, to podrazumeva sauvati njihova antioksidativna svojstva i sauvati ih od
procesa oksidacije. Smatra se da antioksidativna svojstva variraju u zavisnosti od
kompleksnih interakcija izmeu razliitih faktora, ukljuujui tip i koncentraciju aktivnih
komponenti potencialnog antioksidanta i prirodu ispitivanog matriksa voa, odnosno
proizvoda od voa. Takoe se mora uzeti u obzir i termiki tretman primenjen u proizvodnji.
Neki metalni joni, organske kiseline, etanol i fenolna jedinjenja prisutna u vou, grou i
vinu, podlona su oksidaciji. Meu njima fenolna jedinjenja se smatraju supstancama koje su
najpogodnije za oksidaciju, a pogotovo orto-difenoli. Direktna oksidacija izmeu kiseonika i
fenola se ne moe odigrati ili je ekstremno spora u kiselim sredinama, uglavnom zbog
nepovoljnih termodinamikih uslova. Meutim, pojedini prelazni metali, naroito gvoe i
bakar mogu promeniti reakcione mehanizme, smanjujui slobodnu energiju reakcije i
poveavajui brzinu reakcije. Stoga Fe i Cu mogu odigrati vanu ulogu u prevazilaenju
nepovoljnih termodinamikih uslova i doprineti oksidaciji voa, vina, sokova (Danilewicz,
2003). U vou i vinu, joni prelaznih metala su iroko zastupljeni. Njihova koncentracija u
vinu najvie zavisi od zemljita na kojem je gajena vinova loza odnosno voe i opreme za
proizvodnju vina. Vino uobiajeno sadri 0-5 mg/L gvoa i 0,1-0,3 mg/L bakra (Li i sar.,
2005). Meutim, i pri ovako niskim koncentracijama ovih metala moe doi do oksidativnog
4

kvarenja vina. Osim njihovih koncentracija vaan je i oblik u kome se nalaze joni. Ovi joni su
najee prisutni u formi kompleksa sa drugim jedinjenjima prisutnih u vou i vinu.
Kompleksiranje smanjuje potencijal para Fe
3+
/Fe
2+
, stabilzuje oksidaciono stanje Fe
3+
jona i
poveava redukcionu stabilnost Fe
2+
jona, to ukazuje da organski ligandi prisutni u vou i
vinu osiguravaju brzu oksidaciju Fe
2+
(Li i sar., 2008). Osim toga, kada je uz jon gvoa u
obliku svojih kompleksnih jedinjenja prisutan H
2
O
2
, Fentonovom reakcijom nastaje moan
oksidans
OH. Bakar takoe moe reagovati sa H

2
O
2
i proizvoditi
OH, i pri tome je mnogo

reaktivniji od gvoa. Hidroksil radikal, (
OH) sa kratkim vremenom ivota od oko 10

-6
s u
vodi, je trenutno najmoniji oksidans od reaktivnih kiseoninih vrsta i u mogunosti je da
brzo oksiduje veinu organskih jedinjenja. Neki autori smatraju da
OH moe da oksiduje u
potpunosti gotovo svako jedinjenje u vinu (Laurie i Waterhouse, 2006).
Procesi oksidacije fenolnih jedinjenja u vinu, vou i proizvodima od voa su ozbiljan
problem koji se odraava na njihov kvalitet. To je razlog da ovi procesi budu predmet mnogih
istraivanja.
Brovingovanje belih vina nastaje kao posledica oksidativnih procesa u njemu. Proces
brovingovanja belih vina, testom ubrzanog brovingovanja zagrevanjem belih vina na
temperaturi od 55
o
C tokom 10 dana, ispitali su mnogi autori (Salacha i sar., 2008; Sioumis i
sar., 2005; Sioumis i sar., 2006), dok su Perez-Zuniga i sar. (2000) primenili test ubrzanog
bruniranja vina tako to su ih zagrevali na 45
o
C

tokom 40 dana.
Mnogi autori su pratli stabilnost monomernih antocijana u crvenim vinima sa
vremenom starenja u boci. Pri tome su doli do zakljuka da se procenat monomernih
antocijana znatno smanjuje, dok se u istom vremenskom periodu procenat polimernih
antocijana poveava, zbog reakcije antocijana sa taninima ali i zbog njihovog razlaganja pod
uticajem kiseonika (Poiana i sar., 2008; Luoana, 2005). Kinetika termike degradacije
antocijana predmet je izuavanja mnogih autora. Kechinski i sar. (2010) su prouavali
kinetiku degradacije antocijana u soku borovnice, i pri tome su nali da ovoj proces prati
kinetiku reakcije prvog reda i odredili njene termodinamike parametre. Verbeyst i sar.
(2010) su prouili kinetiku degradacije antocijana u jagodi na temperaturama od 95
o
C, 100
o
C,
110
o
C, 120
o
C i 130
o
C i pri tome odredili i energije aktivacije na ovim temperaturama. Cisse i
sar. (2009) su pratili kinetiku degradacije antocijana u ekstraktu crvene narane, kupine i
ekstraktima etiri vrste rua na povienim temperaturama u intervalu od 50
o
C 90
o
C. Pored
energije aktivacije odredili su i entropiju i entalpiju aktiviranja, i pri tome utvrdili da najveu
vrednost energije aktivacije pokazuje reakcija termike degradacije ekstrakta crvene
narane. Procesi termalne degradacije antocijana su prouavani i u model rastvorima
(Harbourne i sar., 2008).
Uticaj vodonik peroksida na kinetiku degradacije antocijana u sokovima od vianja,
nara i jagoda ispitali su zkan i sar. (2002). Reakcija degradacije je prvog reda u odnosu na
koncentraciju H
2
O
2
. zkan i sar. (2004) su takoe prouavali uticaj vodonik peroksida na
stabilnost askorbinske kiseline u vonim sokovima.
5

Uticaj bakra i gvoa na reakciju degradacije fenolnih jedinjenja je uglavnom
prouavan u model sistemima. Tako je utvreno da reakcijom izmeu cijanidin-3-glukozida i
Cu(II)-jona dolazi do obrazovanja kompleksa (Smyk i sar., 2008). Meutim, u model sistemu
doi e do oksidacije (+)-katehina u prisustvu Cu(II)-jona (Clark i Scollary, 2002), odnosno
Fe(II)-jona (Oszmianski i sar., 1996).
Istovremeni uticaj vodonik peroksida i bakra, odnosno vodonik peroksida i gvoa je,
takoe prouavan u model sistemima (De Heredia i sar., 2001; Karakhanov i sar., 2010).
Vie podataka o oksidaciji fenolnih jedinjenja prisutnih u vinu Fentonovim reagensom mogu
se nai u revijalnim radovima (Li i sar., 2008; Karbowiak i sar., 2010). Meutim, kinetika
degradacije fenolnih jedinjenja prisutnih u vou i proizvodima od voa hidroksil radikalima,
koja nastaje u sistemu Cu(II)/H
2
O
2
nije dovoljno prouena.
Hidroksil radikali i druge kiseonine reaktivne vrste, uz veoma vanu ulogu bakra i
gvoa u inicijaciji neenzimske oksidacije, mogu biti osnova za razumevanje oksidacije
fenolnih jedinjenja, to dovodi do velike potrebe za dalja istraivanja i nove podatke na ovu
temu. Uzimajui u obzir sve napred navedene relevantne faktore u okviru ove doktorske
disertacije postavljeni su sledei ciljevi:
- da se najpre izvri hemijska analiza na sadraj organskih komponenti i metalnih jona
ekstrakata groa, vianja, crvene ribizle i maline, kao i crvenih, belih i vonih vina i
komercijalnih sokova, a potom
- da se spektrofotometrijskom metodom proui kinetika degradacije ukupnih fenolnih
komponenata u belom vinu i ukupnih monomernih antocijana u crvenom vinu i
ceenim sokovima od vinje i crvene ribizle testom ubrzane oksidacije, tj. u prisustvu
sistema Cu(II)/H
2
O
2
. Da bi se ovaj cilj ostvario neophodno je:
- pokazati na koji nain, na osnovu kinetikih ispitivanja reakcija oksidacije
fenolnih komponenti u belom i crvenom vinu, kao i u ceenim sokovima vinje
i crvene ribizle mogu da se odrede redovi reakcija u odnosu na svaki reaktant i
da se na osnovu toga postave kinetike jednaine odgovarajuih procesa,
- izraunati konstante brzine odgovarajuih procesa uz pomo kinetikih
jednaina,
- odrediti termodinamike parametre (E
a
, H
*
, S
*
i G
*
) za procese oksidacije
ukupnih fenola (za bela vina), odnosno ukupnih monomernih antocijana (za
crvena vina, sokove vinje i crvene ribizle),
- na osnovu eksperimentalnih rezultata i literaturnih podataka predloiti
najverovatniji mehanizam degradacije fenolnih jedinjenja i antocijana hidroksil
radikalima,
6

- izvriti validaciju kinetiko-spektrofotometrijskih metoda za odreivanje
ukupnih fenola belih vina i ukupnih monomernih antocijana crvenih vina i
ceenih sokova vinje, crvene ribizle i maline
- ispitati mogunost primene razraenih kinetiko-spektrofotometrijskih metoda
za odreivanje ukupnih fenola i ukupnih monomernih antocijana u veem broju
razliitih uzoraka.
- potrvrditi tanost i preciznost rezultata kinetikog odreivanja pomenutih
komponenti u razliitim uzorcima paralelnim odreivanjem u istim uzorcima
referentnim metodama.
- da se HPLC metodom ispita kinetika degradacije malvidin-3-glukozida i malvidin-3-
acetil-glukozida, kao i katehina i epikatehina prisutnih u crvenim vinima testom
ubrzane oksidacije, tj. u prisustvu sistema Cu(II)/H
2
O
2
. Da bi se ovaj cilj ostvario
neophodno je:
- izvriti validaciju HPLC metoda za odreivanje malvidin-3-glukozida, katehina
i epikatehina
- ispitati uticaj reaktanata na brzinu reakcije degradacije i postaviti odgovarajue
kinetike jednaine
- izraunati konstante brzine a potom odrediti termodinamike parametre (E
a
,
H
*
, S
*
i G
*
) za procese degradacije malvidin-3-glukozida, malvidin-3-
acetil-glukozida, katehina i epikatehina
- na osnovu eksperimentalnih rezultata i literaturnih podataka predloiti
najverovatniji mehanizam degradacije malvidin-3-glukozida, malvidin-3-acetil-
glukozida, katehina i epikatehina hidroksil radikalima.

7

2. OPTI DEO
8

9

2.1. BRZI NA HEMIJ SKI H REAKCIJ A

Hemijska promena je proces u kome iz jednih hemijskih vrsta, reaktanata, nastaju
druge hemijske vrste, proizvodi reakcije. Moe se posmatrati kao proces koji se odvija na
molekulskom ninou u kome molekul A u interakciji sa molekulom B daje hemijski novu
vrstu proizvod reakcije, ali i kao makroskopska pojava koja predstavlja proces sastavljen od
n dogaaja, n elementarnih hemijskih promena. Broj elementarnih dogaaja u kojima se
desila hemijska promena makroskopski je merljiva veliina.
Odigravanje hemijske reakcije karakterie se odreenim pravcem promene reaktanata
u proizvode reakcije kao i brzinom te promene. Koncentracije reaktanata i produkata menjaju
se tokom odigravanja hemijske reakcije (sl. 2.1.) i to tako da koncentracije reaktanata
opadaju, a proizvoda rastu, sve dok se ne postigne ravnoteno stanje.

Slika 2.1. Promena koncentracije reaktanata i produkata tokom reakcije.

Na ravnotei koncentracije svih uesnika u reakciji su konstantne. Termodinamike
karakteristike neke hemijske reakcije obuhvataju promene termodinamikih funkcija:
Gibsove energije, entropije i entalpije pod odreenim uslovima pritiska i temperature, kao i
vrednosti konstante ravnotee. Na osnovu ovih veliina moe se doi do zakljuka u kom
pravcu e se reakcija spontano odigravati i kolike e biti koncentracije reakcionih uesnika u
ravnotei. Meutim, da li e se reakcija, koja je termodinamiki mogua, odigrati i kojom
brzinom e se dostii ravnoteno stanje nemogue je odrediti iz termodinamikih podataka.
Osim toga, veina hemijskih reakcija odvija se preko niza stupnjeva, pri emu najsporiji od
10

njih odreuje brzinu reakcije u celini. Brzina svakog stupnja ponaosob, odreena je
strukturom i prirodom hemijske veze molekula reaktanata (urevi i sar., 1997). Deo
fizike hemije koji se bavi vremenskim tokovima hemijskih reakcija naziva se: hemijska
kinetika, gde je osnovni pojam brzina hemijske reakcije, koja se definie kao promena
koncentracije reaktanata u jedinici vremena. Metode analize koje se zasnivaju na merenju
brzine reakcije nazivaju se kinetike metode.
Da bi se bolje razumelo odigravanje hemijske reakcije, moe se posmatrati reakcioni
sistem kao skup estica koje se nalaze u odreenim energetskim stanjima, a hemijska
promena kao proces u kome dolazi do promene energije. Molekuli reaktanti A i B, kao i
proizvodi C i D, nalaze se u energetskim stanjima koja su definisana odgovarajuim
elektronskim, vibracionim i rotacionim kvantnim brojevima. Da bi reagovali, molekuli
reaktanti A i B se moraju nai u odreenim energetskim stanjima sa njima svojstvenim
elektronskim, vibracionim i rotacionim kvantnim brojevima A( ) i B(
). Na isti
nain e i molekuli C i D, nastali prilikom ove hemijske promene, takoe biti u odreenim
energetskim stanjima koja definiu njihovi kvantni brojevi C(
) i D(
).
Posmatrana na ovaj nain, hemijska promena, odnosno elementarna hemijska reakcija se
moe prikazati na sledei nain:
A( ) + B(
) C(
) + D(
)
Ovako zapisana hemijska promena se moe shvatiti kao proces u kome reakcioni
sistem menja svoja energetska stanja od energetskih stanja u kojima se nalaze reaktanti do
energetskih stanja u kojima se nalaze proizvodi. Moe se zamisliti da e se prilikom hemijske
promene sistem menjati du jedne nove koordinate koja bi se u ovom sluaju nazvala
reakciona koordinata. Du te reakcione koordinate doi e do raspodele energije,
preraspodele hemijskih veza i odreenog rearamana unutar molekula reaktanata, tj.
formirae se molekul ili molekuli produkta (Veljkovi, 1967; Laidler, 1981; Frost, 1961).

2.1.1. Teorije brzine hemijskih reakcija

Kao to je ve reeno, veina hemijskih reakcija odvija se preko niza elementarnih
reakcija, odnosno, moe se prikazati kao odreeni skup elementarnih reakcija, ijim
sabiranjem se dobija steheometrija ukupne reakcije. Skup elementarnih reakcija preko kojih
se odigrava posmatrana reakcija odreuje mehanizmom hemijske reakcije. Osnovni problem
u razjanjenju mehanizma jedne reakcije satoji se u nalaenju relacije kojom su povezani
konstanta brzine i red ukupne reakcije sa konstantom brzine i molekularnou elementarnih
reakcija koje ine mehanizam. Polazei od injenice da se produkti ne mogu formirati veom
brzinom neo to je brzina najsporije reakcije u mehanizmu, moe se zakljuiti da e brzina
ukupne reakcije biti jednaka brzini najsporije elementarne reakcije. Drugaije reeno brzina
najsporije elementarne reakcije odreuje brzinu reakcije u celini.
11

Brzina hemijske reakcije zavisi od koncentracije reagujuih supstanci i od spoljanjih
parametara stanja pritiska i temperature. Na reakcije u tenoj i vrstoj fazi promena pritiska
utie veoma malo. Eksperimentalni podaci pokazuju da se brzina svake reakcije menja
prilikom promene temperature. Pri tome za svakih 10
o
C poveanja temperature reakcija se
ubrzava za 1,5 -3 puta. Objanjenje ovih eksperimentalnih injenica daju teorije brzine
hemijskih reakcija. Osnovni princip teorijskog objanjenja mehanizma odigravanja jedne
hemijske reakcije polazi od toga da je neophodan uslov za odigravanje hemijske reakcije
sudar izmeu molekula. Pri tome molekuli dolaze na rastojanje, jedan od drugoga, koje je
priblino jednako njihovom radijusu. Ako bi svaki sudar dovodio do hemijske reakcije,
reakcija bi se zavrila za ~ 10
-9
s. Meutim, veina reakcija odvija se mnogo manjim
brzinama reda veliine 10
-2
- 10
-3
mol/dm
3
s. S druge strane poto je v~T
1/2
onda bi poveanje
broja sudara, kada se temperatura povisi za 10
o
C bilo mnogo manje od eksperimentalno
dobijenih vrednosti. Na taj nain dolazi se do zakljuka da ne dovodi svaki sudar do reakcije,
i drugo, da je brzina hemijske reakcije mnogo osetljivija na promene temperature nego to to
predvia teorija sudara.
Objanjenje za eksperimentalno dobijene brzine rekcija moe se dati razmatranjem
Makvelove distribucije molekula po energijama. Broj molekula, koji na datoj temperaturi
imaju energiju veu od neke energije E
a
, srazmeran je povrini ispod distribucione krive (sl.
2.2). Samo molekuli koji prilikom sudara imaju srednju energiju jednaku ili veu od E
a
mogu
da reaguju meusobno. Ova minimalna energija koju molekuli moraju da poseduju, iznad
njihove srednje termalne energije, da bi stupili u hemijsku reakciju, naziva se energija
aktivacije. Ovu energiju ima samo mali broj od ukupnog broja molekula, priblino 10%, tako
da e u reakciju stupiti mnogo manji broj molekula nego to predvia teorija sudara. Prilikom
porasta temperature, povrina ispod distribucione krive raste bre od T
1/2
, tako da sa porastom
temperature broj reakciono sposobnih molekula raste bre nego po teoriji sudara.

Slika 2.2. Maksvelove raspodele molekula po energijama.
12

Zavisnost konstante brzine reakcije od temperature, prvi je empirijski dobio Arenijus.
S toga se jednaina

2.1
zove Arenijusova jednaina, a konstanta A u jednaini zove se Arenijusova konstanta,
predeksponencijalni faktor ili faktor uestalosti.
Merei konstantu brzine reakcije na vie temperatura mogue je odrediti Arenijusovu
konstantu i energiju aktivacije molekula. Naime, iz Arenijusove jednaine (2.1) se dobija,
nakon logaritmovanja:

2.2
pa se nanoenjem vrednosti ln k u funkciji 1/T dobija prava linija iji je nagib jednak E
a
/R, a
odseak na ordinati jednak je ln A (sl. 2.3).
Teorija sudara ne moe da objasni eksperimentalno dobijene vrednosti Arenijusove
kostante, kao ni zavisnost energije aktivacije od termodinamikih karakteristika reakcije.
Jedno potpunije tumaenje Arenijusove jednaine kao i mehanizma odvijanja hemijskih
reakcija daje teorija prelaznog ili aktiviranog stanja.

Slika 2.3. Grafiko odreivanje energije aktivacije.

13

2.1.1.1. Teorija prelaznog stanja. Aktivirani kompleks molekula

Teoriju o prelaznom stanju razradili su oko 1940. godine Polanyi, London, Pelzer,
Wigner i Laidler. Po ovim autorima, reagujui sistem se menja postupno du reakcione
koordinate. To je neki promenljivi parametar hemijske reakcije: vreme, atomsko rastojanje
itd. Pri tome se kod polaznih jedinjenja javljaju promene u rastojanju i rasporedu atoma i
atomskih grupa. Kombinacijom tako modifikovanih molekula dolazi do pojave aktiviranog
kompleksa. U njemu su samo slabo izraeni polazni oblici molekula. U isto vreme ve se
mogu nazreti i odnosi koji odgovaraju krajnjim proizvodima reakcije. Onaj deo reakcione
koordinate du koga postoji prelazno stanje, odnosno aktivirani kompleks, obeleava se
posebno sa . Na kraju tog dela, kompleks ima konfiguraciju pogodnu za direktan prelaz u
proizvode reakcije. Samo formiranje prelaznog kompleksa je povratan proces, pa postoji
odreena verovatnoa i za povratak u polazno stanje. Kao osnovni uslov za postojanje
kompleksa je viak energije u reagujuem sistemu u iznosu energije aktiviranja (ili vie od
toga) za posmatranu hemijsku promenu do stvaranja krajnjih proizvoda. ematski prikaz
ovih odnosa dat je na slici 2.4. Poto je ceo reakcioni sistem izmenjen, smatramo da se nalazi
u posebnom prelaznom stanju.

Slika 2.4. ematski prikaz sadraja potencijalne energije kod molekula koji se menjaju u toku
reakcije.

Promene u sadraju potencijalne energije sistema zavisi od promene rasporeda i
rastojanja atoma u molekulima tokom reakcije. Najednostavniji sistem za prouavanje je
sistem od jednog diatomnog molekula i jednog atoma. Reakcija razmene atoma u tom
sistemu se moe prikazati emom na sledei nain:
14

Kada se atom C pribliava du linije centra molekula poinje da se menja i rastojanje
AB, tako da poinje da raste potencijalna energija molekula. Prirataj je najvei u momentu
uspostavljanja aktiviranog kompleksa, . Ceo sistem se tada nalazi u prelaznom
stanju: iz polazne u krajnju konfiguraciju. Poto kompleks pree u proizvode reakcije,
osloboeni atom A, poinje da se udaljava. U isto vreme umanjuje se i rastojanje sve
do svog ravnotenog rastojanja na minimumu potencijalne krive.
Sistemi atoma i molekula, koji se ovde posmatraju, mogu se najbolje predstaviti
odreenim funkcijama stanja, koje reflektuju energetski sadraj molekula i moguu raspodelu
te energije na odreene stepene slobode unutar molekula.
Na osnovu statike mehanike, mogue je za neki molekul odrediti verovatnou da se
on nalazi u odreenom energetskom stanju. Verovatnoa stanja koje odgovara sadraju
energije
i
data je izrazom:

Svaki molekul moe imati razna energetski obogaena stanja, aktivirana stanja, i
ukoliko sadri dovoljno veliku koliinu energije, , postoji verovatnoa da se sva ona jave u
njemu. Zbir verovatnoa za sva mogua energetska stanja molekula je dat jednainom:

Q se naziva funkcija stanja molekula ili molekulska funkcija raspodele stanja, a esto se
naziva i particiona funkcija molekula.
Pri tome treba uzeti u obzir sve mogue vrste kretanja molekula koja odgovaraju
pojedinanim vrednostima
i
. Kao aproksimacija, to se moe prikazati raspodelom ukupno
sadrane energije , na energiju translatornog, vibracionog i rotacionog kretanja, i na energiju
elektronske aktivacije:

(svaki lan sadri zbir odgovarajuih vrednosti
i
). Ogovarajue particione funkcije bi bile:
Q
t
, Q
r
, Q
v
, Q
el
.
Ukupna particiona funkcija Q, za sva stanja u molekulu je jednaka proizvodu
pojedinanih (zbog zbira u eksponentu):

Svaka od ovih funkcija dalje odgovara proizvodu pojedinanih funkcija raspodele za
svaki stepen slobode te vrste kretanja:
t
,
r
, itd. One su takoe molekulske funkcije kao i Q.

(3 stepena slobode);
(za nelinearan molekul 3 stepena slobode).
, a odgovarajui sadraj energije je:

15

Svako se moe izraziti pomou odgovarajuih izraza za energetski sadraj molekula, i mera
je verovatnoe odreene raspodele energije.
Za translaciju se daje verovatnoa odreene kinetike energije pri kretanju molekula
du puta l, koji je deo ose x, y ili z. Za jedan stepen slobode:

2.3
(m je masa molekula).
Za sva tri stepena slobode, Q
t
je:

, odnosno V = zapremina.
Za rotaciono kretanje linearnog molekula postoje dva stepena slobode kretanja, pa je:

2.4
je broj simetrije, odnosno broj ekvivalentnih orijentacija u prostoru, I je moment inercije.
Za nelinearni vieatomni molekul:

Gde su I
x
, I
y
i I
z
momenti inercije molekula du tri pravca u prostoru x, y i z.
Kod vibracija dvoatomnog molekula, za jedan stepen slobode:

2.5
je osnovna frekvencija vibracija.
Za vieatomni molekul, za s vibracionih stepena slobode:

i

su osnovne frekvencije vibracija.
Za elektronsku aktivaciju, ukoliko se molekul nalazi u osnovnom elektronskom
stanju:

16

Ove funkcije imaju razliite vrednosti, u zavisnosti od vrste kretanja koje
predstavljaju. Poto svaka od njih sadri temperaturski lan, njihove vrednosti e se menjati
sa promenom temperature.
Particione funkcije za translatorno kretanje u jednom pravcu, l, su reda veliine 10
8
do
10
9
, a zavise od T
1/2
, kako se moe videti iz jednaine 2.3. Particione funkcije za rotaciju
linearnog molekula su reda veliine 10 do 10
2
, i zavise od T
1/2
, prema jednaini 2.4.
Particione funkcije za vibraciono kretanje, za jedan stepen slobode, su reda veliine 1 do 10 i
zavise eksponencijalno od T, po jednaini 2.5.
Najlake je izazivati translaciju molekula, a najtee vibraciju. Poznato je da se najvei
broj vibracionih stepena slobode aktivira tek na temperaturama iznad 100
o
C.
Poto particione funkcije (odnosno funkcije stanja) predstavljaju verovatnou
pojavljivanja odreenih ravnotenih stanja molekula, mogu se iskoristiti za prikazaivanje
hemijske ravnotee, to se moe prikazati na primeru reakcije:

Ravnotea ove reakcije moe se prikazati konstantom ravnotee:

Neka je prisutno N identinih estica u reagujuem sistemu. Opta particiona funkcija za ceo
sistem sadri sve molekulske particione funkcije. Opta particiona funkcija se esto zove i
molarna funkcija stanja:

2.6
Gibbsova slobodna energija moe se prikazati pomou Q
mol
:

Uz aproksimaciju: ln N = N ln N N i zamenom Q
mol
iz jednaine 2.6 dobija se:
2.7
Uporeujui ovu jednainu sa jednainom:

i uzimajui osnovno stanje molekula A za referentno, i da e particione funkcije za B imati
dodatni lan za energetsku razliku izmeu osnovnih nivoa A i B (E
o
), i da je Nk=R, dobija se
konstanta ravnotee izraena preko parcijalnih funkcija stanja:

2.8
Gde su
particione funkcije za molekule A i B koje se odnose po jedinici zapremine.

17

Odreivanje brzine hemijskih reakcija metodom prelaznih stanja
Brzina hemijskih reakcija zavisi, po teoriji prelaznih stanja, od dve stvari. Prvo, od
uspostavljanja ravnotee izmeu polaznih jedinjenja i aktiviranog kompleksa:

a drugo od brzine prelaska u proizvode reakcije:

Ako je ravnotea uspostavljena u celom sistemu moe se predpostaviti da polovina
prisutne koliine kompleksa uestvuje u ravnotei sa polaznim komponentama, a druga
polovina slui za graenje proizvoda reakcije. Sa
obeleena je koncentracija
kompleksa.
Brzina hemijske reakcije odgovarae brzini prelaska aktiviranog kompleksa u
proizvode reakcije. To bi odgovaralo srednjoj brzini promene, , sistema du dela reakcione
koordinate . Taj prelaz je spontana reakcija.
Na osnovu zakona o raspodeli brzina estica, u sistemu od vie estica, mogue je
proceniti :

gde je
masa aktiviranog kompleksa. Srednje vreme promene sistema du puta je:

Brzina reakcije zavisi i od prisutne, raspoloive koncentracije aktiviranog kompleksa
2.9
Ravnoena konstanta koja se odnosi na proces formiranja aktiviranog kompleksa, po
jednaini je:

Zamenom u predhodnom izrazu, dobija se brzina reakcije:

2.10
a odgovarajua konstanta brzine reakcije je:
18

2.11
Ravnotena konstanta se moe izraziti pomou particionih funkcija polaznih
jedinjenja i aktiviranog kompleksa. Particiona funkcija komleksa
sadri onoliko
stepena slobode koliko iznosi zbir stepena slobode polaznih jedinjenja, uz izdvajanje jednog
vibracionog stepena slobode za vibraciju u pravcu reakcione koordinate. Taj stepen slobode
odgovara jednoj vrsti kretanja celog sistema u pravcu dobijanja proizvoda reakcije. Zato je
Eyring sugerisao da se taj stepen moe prikazati jednom particionom funkcijom za translaciju
aktiviranog kompleksa, mase
, du odreenog dela reakcione koordinate, . Koristei

jednaine 2.3 i 2.8 moe se napisati:

2.12
je toplota reakcije za stvaranje aktiviranog kompleksa. Ta energija je u stvari energija

neophodna za uspostavljanje prelaznog stanja molekula i zato odgovara energiji aktiviranja
za tu reakciju. Na osnovu jednaine 2.8 uzima se E
o
kao razlika energija osnovnih nivoa AB i
C i aktiviranog kompleksa.
Zamenom vrednosti iz jednaine 2.12 u jednainu 2.11, posle skraivanja, dobija se:

2.13
odnosno, dobija se Ajrinogova jednaina, koja povezuje konstantu brzine reakcije sa
konstantom ravnotee stvaranja aktiviranog kompleka
2.14

Termodinamiko tumaenje prelaznog stanja
Prelazno stanje reagujuih molekula moe se definisati termodinamikim funkcijama
stanja, to je poeljno za svaki sistem sa velikim brojem particionih funkcija. Ako postoji
ravnotea izmeu polaznih jedinjenja i aktiviranog kompleksa, vana je konstanta ravnotee
. Termodinamike funkcije
odnose se na odgovarajuu konstantu ravnotee,

saglasno optim zakonima termodinamike:

2.15

2.15a
Sve veliine se odnose na proces aktiviranja molekula i graenja kompleksa. Zato se naziva:
slobodna energija aktiviranja i entalpija aktiviranja. Ako je:
19

2.15b
gde je n molekularnost procesa. Zamenom K
P
iz jednaine 2.15b u jednainu 2.15a dobija se:

2.16
koristei jednainu

Moe se pomou entropije aktiviranja i slobodne entalpije aktiviranja predtaviti

2.17
Na osnovu svega reenog, jednaina za
glasi:

2.18
Termodinamiko tumaenje principa teorije prelaznog stanja pomae boljem
razumevanju hemijskih reakcija. To se posebno vidi iz lana koji odgovara Arenijusovoj
konstanti A. Ako u lanu

raste entropija aktiviranja, to ukazuje na veu
nesreenost aktiviranog prelaznog stanja, a samim tim i veu verovatnou za promene u
pravcu formiranja proizvoda reakcije. Smanjena entropija aktiviranja ukazuje na sreenost u
prelaznom stanju, a samim tim znai i manju verovatnou dobijanja novih jedinjenja
(Veljkovi, 1969).

2.1.2. Osnovi katalize

Mnoge supstance pokazuju afinitet prema drugim supstancama razliit od hemijskog
aktiviteta. One izazivaju promene delujui na supstance a da se pritom same ne menjaju. Ovu
novu mo, do sada nepoznatu, zajedniku kako za organsku tako i za neorgansku materiju ja
bih nazvao katalitika mo. Takoe mogu rei da je kataliza razlaganje pod dejstvom te
moi Bercelijus 1836, u asopisu Edinburgh New Philosophical Journal.
Katalizator je supstanca koja dovodi do ubrzanja hemijske reakcije ali tako da ukupna
promena standardne Gibsove energije ostaje nepromenjena. Definicija katalize usvojena
od strane Internacionalne unije za istu i primenjenu hemiju (IUPAC) 1981. godine.
Hemijski proces se najee odvija preko vie reakcionih stupnjeva, a svi stupnjevi u
nekom mehanizmu odreuju put kojom reakcija tee. Meutim, gotovo uvek postoji vie
naina da se od posmatranih reaktanata nagrade proizvodi, pa samim tim reakcioni put za
20

neku reakciju nije jednoznano odreen. Reakcija od reaktanata prema proizvodima moe ii
razliitim reakcionim putevima, a da se pri tom poetno i krajnje stanje sistema ne promene.
Do razlaganja neke supstance A moe doi u jednom stupnju:

P (I)
Ali pored ovog, postoji jo niz naina da doe do razlaganja supstance A. Reakcija moe ii i
nekim drugim reakcionim putevima. Jedan od moguih puteva reakcije razlaganja hipotetike
supstance A bio bi prikazan sledeim mehanizmom:

k
1

(II)
k
1

k
2

AC C + P (III)

U ovom sluaju supstanca A gradi sa supstancom C intermedijer AC koji se u narednom
stupnju transformie u produkt, P.
Brzina nastajanja produkta razlaganjem supstance A u reakciji direktne transformacije (I)
e biti:
2.19
i razlikovae se od brzine nastajanja produkta u ciklusnom procesu (II i III) u kome, pored A,
uestvuje i supstanca C. Brzina nastanka produkta tada e biti izraena sledeom jednainom:

2.20
u sluaju kada se izmeu reaktanata A i C i novonastale vrste intermedijera AC uspostavlja
brza ravnotea, odnosno kada je
, tada e ravnotena koncentracija intermedijarne

vrste AC biti :

2.21
Ravnotena koncentracija data ovim izrazom e u sluaju navedenog uslova biti jednaka
trenutnoj koncentraciji , pa je brzina reakcije jednaka:
21

2.22
Odnos konstanti
je konstanta ravnotee, tako da je brzina obrazovanja produkta

jednaka:

2.23
Iz izraza (2.23) postaje oigledno da e brzina razlaganja supstance A u prisustvu supstance
C biti vea od brzine direktne transformacije A u produkte, ako je
. Budui da je
i sledi da navedeni uslov znai da e, u sluaju brze ravnotee, proces u

kome uestvuje supstanca C biti bri od direktnog formiranja produkta iz reaktanta A. Proces
u kome se brzina poveava zato to u njemu uestvuje supstanca C naziva se katalizovani
proces. Supstanca C koja ubrzava datu reakciju u posmatranom krunom ciklusu (sl. 2.5)
zove se katalizator (Perez-Bendito i Silva, 1988; Avery, 1974).

Slika 2.5. Hipotetiki reakcioni putevi reagovanja supstance A u reakcijama u kojima
reaktant C ima ciklini nain reagovanja.

Katalitiko dejstvo je uslovljeno meusobnim dejstvom elektronskog sistema katalizatora
i reagensa. Ovo dovodi do hemijskog vezivanja molekula katalizatora, tj. do graenja
proizvoda, u iji sastav ulazi katalizator i jedan, ili vie reaktanta. Kao rezultat takvog
dejstva, elektronska struktura reaktanta se menja na takav nain, da meu njima moe
proticati znatno bra reakcija, a kao rezultat te reakcije katalizator se oslobaa u poetnom
obliku.
Na ovaj nain katalizator uzima uee u reakciji, menja njen mehanizam i samim tim
smanjuje i slobodnu entalpiju aktivacije hemijske reakcije..
Konstanta brzine katalitike reakcije
ima znatno veu vrednost nego odgovarajua

konstanta brzine nekatalitike reakcije .Ona se naziva se konstantom katalize ili
katalitikom konstanto, i karakterie efikasnost katalizatora.
22

Katalitike reakcije se esto karakteriu i ciklinim brojem N
C
. Ciklini broj oznaava
broj reakcionih ciklusa u kojima jedna estica katalizatora uzima uee u jedinici vremena.
N
C
se odreuje iz odnosa promene koncentracije indikatorske supstance, za vreme At i
poznate koncentracije katalizatora (jednaina 2.24):

2.24
to je vei ciklini broj katalitike reakcije, to je ona vie osetljiva na dejstvo katalizatora
C.
Razlika izmeu brzina katalitike i nekatalitike reakcije uslovljene su time to je slobodna
entalpija aktivacije za katalitiku reakciju manja nego za nekatalitiku, zato takve reakcije
protiu bre (sl. 2.6).

Slika 2.6. Energetski put katalizovane i nekatalizovane reakcije

Za kinetiko-katalitiku analizu fundamentalni znaaj ima uticaj katalizatora na brzinu
reakcije. Iz jednaine (I) vidi se da je brzina reakcije proporcionalna koncentraciji
katalizatora, i ovo je u osnovi kinetiko-katalitike metode analize.

23

2.1.3. Mehanizmi homogeno-katalitikih reakcija

Jedan od najvanijih zadataka hemijske kinetike je postavljanje kinetike jednaine
sloene hemijske reakcije na osnovu njenog mehanizma. Pri reavanju ovih problema koriste
se osnovni postulati hemijske kinetike, princip nezavisnosti i princip stacionarnih
koncentracija.
Koncentracija
se naziva stacionarnom, ako se u datom reakcionom sistemu tokom

trajanja hemijske reakcije ne menja sa vremenom, tako da je brzina definisana po reaktantu
. Ako su koncentracije svih supstanci koje uestvuju u reakciji konstantne, i ne menjaju

se sa vremenom, govori se o potpuno stacionarnom stanju. Ako su stacionarne samo
koncentracije intermedijera onda se govori o stacionarnom stanju datog intermedijera.
Ako se posmatra reakcija koja se najee odigrava uz uee dva reaktanta pri emu
nastaju dva prelazna jedinjenja, nastala prelazna jedinjenja mogu posedovati osobine
prelaznih jedinjenja Arenijusa ili Vant-Hoffa. Ukoliko se prelazno jedinjenje raspada na
proizvode reakcije veoma sporo, i ako izmeu reaktanata, katalizatora i prelaznog jedinjenja
postoji ravnotea (prelazna ravnotea) tada je za dalje promene potrebna izvesna energija
aktivacije, takvo prelazno jedinjenje naziva se prelazno jedinjenje Arenijusa. U drugom
sluaju, prelazno jedinjenje je toliko nestabilno da se po obrazovanju odmah raspada.
Prelazno jedinjenje sa ovakvim osobinama nazivamo prelazno jedinjenje Vant-Hoffa.
Na slikama 2.7 i 2.8 prikazan je reakcioni put katalizovane reakcije sa obrazovanjem
prelaznih jedinjenja Vant-Hoffa i Arenijusa.

Slika 2.7. Reakcioni put katalizovane reakcije sa prelaznim jedinjenjem Vant-Hoffa i
Arenijusa,

24

Slika 2.8. Reakcioni put katalizovane reakcije sa prelaznim jedinjenjem Arenijusa i Vant-
Hoffa,

Mogua su etiri tipa reakcija koje protiu uz obrazovanje prelaznih jedinjenja X
1
i X
2
:
Prelazno jedinjenje
Prelazno jedinjenje

1. prelazno jedinjenje Arenijusa prelazno jedinjenje Arenijusa
2. prelazno jedinjenje Arenijusa prelazno jedinjenje Vant-Hoffa (slika 2.8)
3. prelazno jedinjenje Vant-Hoffa prelazno jedinjenje Arenijusa (slika 2.7)
4. prelazno jedinjenje Vant-Hoffa prelazno jedinjenje Vant-Hoffa
U prvom sluaju:

25

Brzina reakcije bie jednaka:

Ovde imamo dve prelazne ravnotee. Koncentracije prelaznih supstanci izraunavamo
iz konstanti ravnotea su:

2.25

Uzmemo li pri tome da je koliina
uporediva sa koliinom C, i da je
uporediva po
veliini sa
, iz jednaine 2.25 nalazi se:

Odavde je brzina reakcije jednaka:

2.26
Shodno jednaini 2.26, red reakcije u odnosu na reaktante A i B nije ceo broj. Meutim, ako
je
, brzina reakcije definisana je izrazom:

2.27
U drugom sluaju:

Manja strelica oznaava da se promena
i B odvija ali veoma sporo (
), tako
da se ravnotea ne moe uspostaviti. Koncentraciju
odreujemo u uslovima ravnotee,

predpostavljajui da je

26

Odakle je:

Koncentraciju
nalazimo iz kvazistacionarnih uslova:

Odavde brzinu obrazovanja produkta izraunavamo na osnovu izraza:

2.28
Iz jednaine 2.28. sledi da je reakcija prvog reda u odnosu na reaktant B, dok u odnosu na
reaktant A je lomljiv broj. Meutim, u sluaju kada je
, jednaina 2.28. dobija

oblik:

2.29
i dalje ukoliko je vrednost proizvoda
znatno manja od 1, to jednaina 2.29. prelazi u

jednainu tipa 2.27., a pri
jednaina prelazu u oblik:

odnosno:

2.30
Trei sluaj razlikuje se po tome, to je prvi prelazni kompleks
nestabilan
(prelazno jedinjenje Vant-Hoffa) i lako prelazi u drugi prelazni kompleks
, koji se polako
razlae dajui proizvode reakcije i regenerisan katalizator. Izmeu
postoji ravnotea.
Odgovarajuu ravnotenu koncentraciju prvog prelaznog jedinjenja odreuje se iz
stacionarnih uslova, a koncentraciju drugog iz uslova ravnotee. ema je sledeeg oblika:

2.31

27

Pri emu je:

gde je - ukupna koncentracija katalizatora, a
- u slobodnom stanju.
Sada je:

gde je uzeto da je
. Da bi se odredila
koristie se konstanta ravnitee:

ili

Zamenjujui izraz za
dobijamo:

Brzina reakcije jednaka je:

kako je:
, to poslednji izraz dobija oblik:

2.32
U sluaju da se ne mogu zanemariti koncentracije
u odnosu na onda
konaan izraz za brzinu reakcije ima oblik:

S obzirom da se proces stvaranja prelaznog kompleksa
moe smatrati nepovratnim, pa se

konstanta
moe zanematiti, pa se dobija izraz za brzinu reakcije:

2.33
koji u sluaju kada je
dobija oblik:

2.34
28

odakle se moe videti, da pri datim uslovima brzina reakcije ne zavisi od koncentracije
reaktanata.
U etvrtom sluaju svi stadijumi su neravnoteni. Radi izvoenja jednaina koriena je
metoda stacionarnih stanja:

2.35

Kod stacionarnog stanja
ili
. Pri tome dobija se:

2.36
Ako se uzme u obzir reciprona vrednost brzine dobie se jednaina:

2.37
koja zavisi od odnosa veliina
. Brzina reakcije moe biti izraena kao:

2.38

2.39

2.40
Brzina katalitike reakcije sa dva reaktanta, koja protie obrazovanjem dva prelazna
jedinjenja tipa Vant-Hoffa, moe se odrediti brzinom bilo kog stadijuma (Erofeev, 1977).

29

2.1.3.1. Reakcije katalizovane jonom koji menja svoje oksidaciono stanje
tokom reakcije

Veina katalitikih metoda bazira se na reakcijama koje su katalizovane jonima koji
menjaju svoje oksidaciono stanje tokom reakcije.
Jedan od reakcionih ciklusa kod ovih reakcija je sledei:

Red i Ox su reagensi (polarne komponente) redox procesa,
su produkti reakcije, a M
jon katalizator. Uloga Ox je da vrati katalizator iz nieg valentnog stanja u vie (aktuelno)
oksidaciono stanje, iz kojeg e on da vri oksidaciju komponente Red i ponovo prei u nie
valentno stanje. Ovaj se proces stalno vri dok traje reakcija. Tipini primeri ovakvih reakcija
su reakcije katalizovane jonima metala sa promenljivim oksidacionom stanjem, kao to su
vanadijum, mangan, gvoe i bakar.
Reakcija ovakvog tipa bie pogodna za analitiko odreivanje ukoliko ispunjava sledea
dva uslova:
- Oksidacioni potencijal
redoks para
u reakcionim uslovima treba da

je vei od potencijala
redoks para
/Red, a nii od oksidacionog potencijala

redoks para Ox/
, tj.

- Direktna interakcija izmeu Red i Ox je termodinamiki dopustiva, ali se sporo
odigrava, dok oksidacija
pomou Ox protie brzo.

2.1.3.2. Redoks reakcije sa organskim supstratima

Reakcije ovog tipa obino ukljuuju oksidaciju arilamina, fenola ili obojene organske
supstance (boje). Oksidacijom arilamina i fenola dobijaju se obojeni produkti, dok
oksidacijom obojenih organskih supstanci obino se dolazi do obezbojavanja. Zbog toga se
kinetike takvih reakcija najee ispituju spektrofotometrijski.Ove oksidacije su najee
spore ali se mogu katalizovati metalnim jonima. Kada se koriste metalni joni prelaznih metala
(i drugi jednoelektronski oksidansi), prvi stepen oksidacije arilamina ili fenola je uvek
homolitian:

30

gde R
-
predstavlja arilaminov radikal (
) ili ariloksi radikal (
). Niska jonizaciona
energija arilamina i fenola omoguava lako otkidanje elektrona. Radikali se stabilizuju
konjugacijom nesparenog
elektrona azota ili kiseonika sa -elektronskim sistemom

aromatinog prstena. Reagensi sa supstituentima koji poveavaju elektronsku gustinu u
konjugovanom sistemu se oksidiu lake nego li kad su nesupstituisani. Tako homolitina
oksidacija polifenola, arilamina, aminofenola, alkil- i aril-supstituisanih fenola i aril amina
protie vrlo lako.
Stvaranje primarnih arilaminskih i fenolnih radikala i njihovo dalje reagovanje jako
zavisi od pH sredine. U kiselim sredinama obino se stvaraju manje reaktivni produkti sa
relativno niskim molekulskim teinama. Poslednja reakcija ne protie tako lako u kiselim
rastvorima, a koordinacija metalnog jona sa slobodnim elektronskim parom azota ili
kiseonika je oteana, zbog velikog broja konkurentnih
jona. Velika brzina stvaranja

radikala u alkalnom rastvoru poveava koncentraciju radikala, a ujedno i broj moguih
produkata reakcije. Alkalna sredina moe da stabilizuje neke vrste radikala, kao semihinone
dobijene tokom oksidacije polifenola.

2.1.4. Kinetike metode analize

Kinetike metode merenja se obavljaju pod dinamikim uslovima u kojima se
koncentracije reaktanata i produkata neprekidno menjaju. Kao analitiki parametar slui ili
pojavljivanje produkta ili nestajanje reaktanta. Nasuprot tome, merenja kod termodinamikih
metoda obavljaju se u sistemu koji se nalazi u ravnotei, tako da su koncentracije
nepromenljive.
Razlika izmeu ova dva tipa metoda ilustrovana je slikom 2.9, koja prikazuje
vremensko odigravanje reakcije:
A + R P 2.41
u kojoj A oznaava analit, R reagens, a P produkt. Termodinamike metode koriste vreme
nakon t
e
, nakon koga je koncentracija reaktanata i produkata postala stalna, a hemijski sistem
je u ravnotei. Nasuprot tome, kinetike metode koriste vremenski interval od 0 do t
e
, u kome
se koncentracije reaktanata i produkata neprekidno menjaju.
31

Slika 2.9. Promena koncentracije analita (1) i produkata (2) u funkciji vremena.

Kod kinetikih metoda selektivnost se postie odabirom reagensa i uslova koji
pojaavaju razlike u brzinama kojima uzorak i mogue interferencije reaguju. Kod
termodinamikih metoda selektivnost se postie odabirom reagensa i uslova koji poveavaju
razlike u ravnotenim konstantama.
Postoje dva tipa kinetikih metoda koje se temelje na katalitikim reakcijama. Kod prvog
tipa analit je katalizator, a odreuje se na osnovu njegovog katalitikog uticaja u
indikatorskoj reakciji, koja ukljuuje lako merljive reaktante ili produkte. Ove metode se
ubrajaju u najosetljivije hemijske metode. Kod drugog tipa kinetikih metoda uvodi se
katalizator koji ubrzava reakciju izmeu analita i reagensa. Ovakve metode su esto vrlo
selektivne, ak specifine, naroito ako se kao katalizator koristi enzim (Skoog i sar., 1998).

2.1.4.1. Vrste kinetikih metoda

Za merenje brzine hemijskih reakcija potrebno je pratiti promenu koncentracije sa
vremenom bilo kog reaktanta ili proizvoda reakcije. Meutim, kod kinetikih metoda analize,
za praenje kinetike hemijskih reakcija ee se primenjuju tzv. indirektne metode. Kao
preduslov za primenu neke indirektne metode, neophodno je da postoji to prostiji i linearan
odnos izmeu merene fizike osobine (apsorbancije, elektrine provodljivosti, jaine
difuzione struje i dr.) i koncentracije analizirane supstance.
U zavisnosti od odnosa koji postoji izmeu merene veliine i koncentracije uzorka,
kinetike metode se dele na diferencijalne i integralne metode.
32

Kod diferencijalnih metoda koncentracije se raunaju iz diferencijalnih oblika izraza za
brzinu. Brzine se odreuju merenjm nagiba krivih koje opisuju koncentraciju analita ili
produkta kao funkcije vremena odigravanja reakcije. To se moe objasniti ako se zameni [A]
iz jednaine

(za reakciju
)
sa [A]
t
iz jednaine:
da je:

2.42
Osim toga, brzina se moe izraziti i pomou koncentracije produkta. Jednaina 2.42 pokazuje
da brzina reakcije zavisi od konstante k, vremena t, i kao najvanije od poetne koncentracije
analita [A]
0
. Pri bilo kom odreenom vremenu t faktor
je konstantan, tako da je brzina

srazmerna poetnoj koncentraciji analita.
Izbor vremena u kome se meri brzina esto se temelji na mogunosti preciznog merenja
u odreenom vremenu, postojanju sporednih reakcija koje ometaju merenja i dr. esto je
pogodno merenja vriti u blizini vremena t=0, jer je taj deo eksponencijalne krive priblino
linearan, pa je lako mogue odmeriti nagib pomou tangente na krivi (slika 2.10).

Slika 2.10. Diferencijalna metoda.

Slika 2.10 prikazuje primenu diferencijalne metode za odreivanje koncentracije
uzorka analita iz eksperimentalnih podataka merenja brzine reakcije. Krive nacrtane punom
linijom na slici prikazuju izmerene vrednosti koncentracije produkta [P] kao funkcije
33

vremena reakcije za etiri razliite koncentracije A. Ove krive se koriste za konstruisanje
kalibracione krive. Brzine se dobijaju pomou tangenata na svaku krivu slike 2.10a., pri
vremenu blizu nule (tanke linije). Kada se tangens ugla nagiba prikae u funkciji [A] dobija
se prava prikazana na slici 2.10b.
Nasuprot diferencijalnim metodama, integralne metode primenjuju integralne oblike
zakona brzine. Naime, preureenjem jednaine (2.42) dobija se:

2.43
pri emu bi se kao kinetika kriva dobila zavisnost prirodnog logaritma eksprimentalno
izmerene vrednosti koncentracije A (ili P) u funkciji vremena sa pravcem nagiba k i
odsekom ln[A]
0
na y-osu (slika 2.11).

log([A]
o
-[P]) tg
c
1
c
2
c
3

c
4
Vreme [A]
o
Slika 2.11. Integralna metoda.

U skladu sa jednainama (2.42 i 2.43) , za obradu kinetikih podataka koriste se sledee
metode: tangensna metoda (diferencijalna varijanta tangensne metode je poznata kao
metoda inicijalne brzine), metoda fiksnog vremena, metoda fiksne koncentracije i metoda
indukcionog perioda (Jacimirskii i sar., 1967, Perez-Bendito i Silva, 1988).

2.1.4.2. Karakteristike kinetikih metoda analize

Kinetike metode analize zauzimaju znaajno mesto u savremenoj kvantitativnoj
hemijskoj analizi. Posebna oblast primene kinetikih metoda analize je u odreivanju niskih
koncentracija organskih supstanci. Posebno veliki izazov predstavlja poveanje osetljivosti i
selektivnosti kinetikih metoda za odreivanje organskih molekula i biomolekula.
34

Osnovne karakteristike analitikih medoda su: osetljivost, selektivnost, tanost i
preciznost.
Osetljivost, S je svojstvo instrumenta, a u instrumentalnoj analizi izraava se kao
nagib kalibracione krive :

2.44
Pojam osetljivosti i dalje je jedan od najkontraverznijih pojmova u analitikoj hemiji.
Iako se jasno razlikuje od limita detekcije i dalje se u nekim radovima ovi pojmovi koriste
kao sinonimi.
Koncept osetljivosti trenutno se identifikuje sa nagibom kalibracione krive, tj.sa IUPAC-
ovom analitikom osetljivou. Osetljivost treba raunati kao odnos nagiba i njegove
standardne devijacije. Prema tome, osetljivost raste sa porastom nagiba i smanjenjem
standardne devijacije. Ovo je dobar kriterijum za poreenje analitikih metoda i tehnika.
Prema IUPAC-ovoj definiciji, limit detekcije je najmanja koncentracija ili koliina
analita za koju se moe tvrditi da se statistiki razlikuje od slepe probe. Limit detekcije, c
L
se
moe izraziti jednainom:

2.45
gde je: x
L
- analitiki signal koji odgovara koncentraciji c
L
,

- srednja vrednost odgovora slepe probe za n ispitivanja (obino n>20),

m - analitika osetljivost (ili nagib kalibracione prave).
Detekcioni limit se moe izraziti preko standardne devijacije slepe probe, standardne
devijacije fitovanja kalibracione prave ili standardne devijacije odseka:

2.46
Gde je numeriki faktor izabran prema eljenom nivou pouzdanosti. Obino se uzima da je
=3,3, to bi trebalo da odgovara verovatnoi od 99,86% (tj. verovatnoi da e se 99,86% x
L

nalaziti u datom intervalu pouzdanosti).
Kvantifikacioni limit (granica odreivanja) je najmanja koncentracija ispitivane
supstance u uzorku koja moe biti odreena sa prihvatljivom preciznou i tanou, pod
datim eksperimentalnim uslovima i izraunava se prema jednaini:

2.47
Postoje tri glavna analitika regiona (slika 2.12) povezana sa odreivanjem supstance:
35

a) region u kome se analit ne moe pouzdano odrediti, za koncentracije manje
;
b) detekcioni region, izmeu
i
c) kvantifikacioni region, za koncentracije vee ili jednake
.

Slika 2.12. Regioni analitikog odreivanja.

Osetljivost i detekcioni limit kinetikih metoda se mogu poboljati optimizacijom
eksperimentalnih uslova (temperatura, pH vrednost, koncentracija reaktanta, jonska
jaina,dielektrina konstanta rastvaraa), primenom separacionih tehnika i pre svega
upotrebom aktivatora. Pored poveanja osetljivosti i smanjenja detekcionog limita, primena
aktivatora poveava selektivnost kinetike analitike metode.
Prema IUPAC-u, selektivnost je stepen interferiranja drugih supstanci na odreivanje
analita datom metodom. Interferent je supstanca koja dovodi do sistematske greke u
odreivanju analita.
Kinetike metode su selektivnije od ravnotenih, jer se zasnivaju na diferencijalnim, a
ne apsolutnim merenjima. Zato izostaje interferencija signala od drugih komponenti uzorka
sve dok one ne interaguju sa nekom komponentom sistema. Njihova vea selektivnost
proizilazi iz dinamike procesa. Krakto vreme meanja uzorka i reagensa i injenica da
merenje poinje odmah nakon meanja smanjuje efekat interferenata. Uticaj interferenata kod
ravnotenih metoda je znatno vei, to je posledica dugog vremena potrebnog za postizanje
ravnotee, u toku kog aktivni interferenti mogu reagovati sa jednom ili vie komponenti
sistema, ukljuujui i analit.
Tanost nekog rezultata oznaava blizinu tog rezultata njegovoj pravoj vrednosti i
vezana je za odstupanja primenjene metode odreivanja. Opisuje se kao apsolutna ili
relativna greka. Tanost se moe odrediti poznavajui pravu vrednost merene veliine ili
srednju vrednost velikog broja merenja iste.
36

Recovery je mera mogunosti analitike metode da tano izmeri istu supstancu kada se
njena poznata koliina (spike) doda u uzorak koji se rutinski analizira, pri emu se uzima u
obzir uticaj svih supstanci realno prisutnih u matriksu tog uzorka. Zbog toga je recovery u
direktnoj vezi sa tanou metode i moe da se koristi za procenu njene primenljivosti,
naroito u situacijama kada nema odgovarajue referentne metode ili referentnog materijala.
Recovery vrednosti izmeu 95 i 105 % predstavljaju dokaz odsustva interferencija u
odreivanju analita.
Preciznost je mera usaglaenosti rezultata dobijenih iz vie paralelnih odreivanja iz
istog uzorka pod istim uslovima. Termin preciznosti danas je zamenjen terminom
nepreciznost koja se izraava standardnom devijacijom ili koeficijentom varijacije
izraunatim iz grupe ponovljenih merenja, a predstavlja meru za sluajnu greku. Na veliinu
sluajne greke, odnosno na nepreciznost metode odreivanja u jednoj/vie serija uzoraka
koje se rade u jednom danu utiu razliiti faktori: nestabilnost instrumenta, promena
temperature, promena sastava reagensa i standarda, promena zapremine pipetiranjem,
nejednako meanje u svim uzorcima, sloenost procedure rada, zamor operatera itd. Sluajna
greka se poveava kada se metoda primenjuje iz dana u dan, jer se pojavljuju novi faktori
uticaja: promene u reagensima i standardima, naroito ako se svakog dana priprema sve
reagens, promene u radu aparata itd. Zbog toga je za svaku metodu potrebno odrediti
ponovljivost tj. nepreciznost u seriji (u jednom danu) i srednju preciznost tj. nepreciznost iz
dana u dan.

37

2.2. FENOLNA J EDI NJ ENJ A

Fenolna jedinjenja predstavljaju iroko rasprostranjenu grupu biljnih metabolita koja
mogu biti vrlo jednostavne strukture, kao to su fenolne kiseline, ili vrlo sloene strukture,
odnosno, polikondenzovana jedinjenja kao to su proantocijanidoli. Zajednika karakteristika
fenolnih jedinjenja je da sadre aromatian prsten sa jednom ili vie hidroksilnih grupa. Do
danas je identifikovano vie od hiljadu, u slobodnom obliku ili ee u obliku glikozida
(Leucuta i sar., 2005). Monosaharidi koji najee ulaze u sastav glikozida su: glukoza,
galaktoza, arabinoza, ramnoza, ksiloza, manoza, glukuronska i galakturonska kiselina, pored
toga eeri mogu biti prisutni u obliku: mono-, di-, tri-, ili tetra-saharida.
U literaturi se navode razliite klasifikacije fenolnih jedinjenja, po jednoj ova
jedinjenja se svrstavaju u sledee grupe:
- Flavonoidi
- Fenolna jedinjenja neflavonoidne strukture
- Isparljiva fenolna jedinjenja
Meutim, najea klasifikacija se zasniva na broju ugljenikovih atoma vezanih za
osnovni skelet fenola (Robards i sar., 1999), to je prikazano u tabeli 2.1.
Smatra se da je antioksidativna aktivnost fenola prvenstveno rezultat njihove
sposobnosti da budu donori vodonikovih atoma i kao takvi uklanjaju slobodne radikale uz
formiranje manje reaktivnih fenoksil radikala:
Ph-OH + ROO Ph-O + ROOH 2.48
Ar-OH + OH H
2
O + ArO 2.49
Poveana stabilnost fenoksil radikala pripisuje se prvenstveno delokalizaciji elektrona
i postojanju vie rezonantnih formi (slika 2.13):

38

Tabela 2.1. Klasifikacija fenolnih jedinjenja.

Osnovni skelet Klasa Jedinjenje
C6 Prosti fenoli Katehol, hidrohinon, rezorcinol
Benzohinoni
C6-C1 Fenolne kiseline p-hidroksibenzoeva kiselina
C6-C2 Fenilsiretne
kiseline
p-hidroksifenilsiretna
C6-C3 Cimetne kiseline Kafena kiselina, ferulna kiselina
Fenilpropeni Eugenol, miristicin
Kumarini Umbeliferon, eskuletin, skopolin
Hromoni Eugenin
C6-C4 Naftohinoni Juglon
C6-C1-C6 Ksantoni Mangostin, magniferin
C6-C2-C6 Stilbeni Razveratrol
Antrahinoni Emodin

Flavonoidi
Flavoni Apigenin, luteolin, sinensitin, nobiletin, izosinensitin,
tangeretin, diosmin
Flavonoli Kvarcetin, kamferol
Flavonol glikozidi Rutin
C6-C3-C6 Flavanoli Dihidrokvarcetin i dihidrokamferol glikozidi
Flavanoni Hesperidin, naringenin
Flavanon glikozidi Hesperidin, neohesperidin, narirutin, naringinin,
eriocitrin
Antocijanini Glikozidi peralgonidina, peonidina, delfinidina,
petunidina, cijanidina
Katehini Katehin, epikatehin, galokatehin, epigalokatehin
Halkoni Floridin, arbutin, halkonarigenin
(C6-C3)2 Lignini Pinorezinol
(C6-C3-C6)2 Biflavonoidi Agatisflavon, amentoflavon
39

Slika 2.13. Rezonantna stabilizacija fenoksil radikala.

Sa poveanjem stabilnosti nastalog fenoksil radikala poveava se mogunost
nastajanja reakcija koje dovode do slobodno radikalskih procesa kod flavonoida, kumarina i
fenolnih kiselina. Dokazano je da su vicinalne diolne funkcije znaajne za kapacitet hvatanja
radikala kao i da metoksilacije ili glikolizacije o-hidroksi grupa kumarina i esterifikacija
fenolnih kiselina smanjuju antioksidativnu aktivnost ovih jedinjenja.
Najzastupljenija fenolna jedinjenja su: fenolne kiseline (derivati benzoeve i cimetne
kiseline), flavanoli, flavonoidi i dihidrohalkoni.
Fenolna jedinjenja nisu ravnomerno rasprostranjena u biljnim tkivima. Najznaajniji
izvori fenolnih jedinjenja, a time i izvori antioksidanata su razni napici (crno vino, voni
sokovi, zeleni i crni aj, kafa, pivo), kakao, crna okolada, jezgrasto voe (lenik, badem,
kikiriki), ljive, groe, borovnice, brusnice, kupine, maline, jabuke, masline, soja, integralne
itarice, brokoli, celer, itd., to je dato u tabeli 2.2.

40

Tabela 2.2. Prirodni izvori fenolnih jedinjenja (Sakakibara, 2003).
Klasa Primer Izvor

Prosti fenoli Hlorogenska, kafena, galna,
ferulna kiselina
veoma rasprostranjeni,
naroito u krtolastom
povru
Glikozidi flavona i
flavonola
Apigenin, luteolin,
kvercetin, kamferol,
glikozidi miricetina
lisnato povre
Aglikoni flavona i flavonola Apigenin, luteolin, galangin perun, celer, prokelj i
biljke
Izoflavoni Genistein, daidein i njihovi
glikozidi
soja
Flavanoni Naringenin i glikozidi
hesperidina
citrus voe
Katehini Epigalokatehin,
epigalokatehingalat,
galokatehin
ajevi i kakao
Antocijani Pelargonidin, cijanidin,
malvidin, delfinidin
obojeni prirodni proizvodi:
patlidan, borovnica, crna
soja
Antrahinoni Emodin, hrizofanol, rein kruina, sena, aloja

2.2.1. Flavonoidi

Flavonoidi su najzastupljenija grupa fenolnih jedinjenja u biljkama sa 15 atoma
ugljenika u osnovnoj C
6
-C
3-
C
6
strukturi (slika 2.14), od kojih devet pripada benzopiranskom
prstenu (benzenski prsten A kondenzovan sa piranskim prstenom C) a ostalih est
ugljenikovih atoma ine benzenski prsten B povezan sa benzopiranskim prstenom na poziciji
dva (slika 2.14 i slika 2.15) (flavoni, flavonoli, flavononi, dihidroflavoni, flavan-3-oli, flavan-
3,4-dioli i antocijanidini), tri (izoflavoni) i etiri (neoflavoni).

41

Slika 2.14. Osnovni skelet flavonoida.

Slika 2.15. Razlike izmeu osnovnih klasa flavonoida.

Osnovno jedinjenje, po kojem je itava grupa dobila ime, izolovao je 1985. godine
Kostanesku i nazvao ga flavon (lat. flavus, ut). Prema stepenu oksidacije centralnog
piranskog prstena flavonoidi se mogu podeliti u nekoliko klasa to je prikazano u tabeli 2.3,
dok su strukture razliitih klasa flavonoida prikazane na slici 2.16.

42

1 2 3

4 5
Slika 2.16. Struktura razliitih klasa flavonoida.

Tabela 2.3. Razliite klase flavonoida
1 Flavanoni R=H, OH, OMe
2 Flavoni R=H, OH
3 Flavanoli R=H-katehin,R=OH-galokatehin
4 Flavonoli R
1
, R
2
=H, OH
5 Antocijanini

Zbog svoje specifine strukture flavonoidi su potencijalni prirodni antioksidanti.
Prisustvo flavonoida dovodi do prekidanja slobodno-radikalskih reakcija, pri emu oni
predaju vodonikov atom radikalima i sami prelaze u slobodne radikale. Ovako nastali
slobodni radikali rezonantno su stabilizovani i nemaju dovoljno energije da pokrenu lananu
reakciju sa supstratom:

ROO + Flavonoid-OH ROOH + Flavonoid-O 2.50
OH + Flavonoid-OH H
2
O + Flavonoid-O 2.51
O O H
OH
OH
R1
O
OH
O H
OH
OH
OH
O
R
O
OH
O H
OH
OH
R1
O
R2
O
OH
O H
OH
OH
R1
R2
+
O
O H
O H
O H
R
O
43

Kao snani antioksidanti, fenolna jedinjenja razliitim mehanizmima neutraliui
slobodne radikale u elijama, mogu da spree oksidativna oteenja DNK i irenje tumora
(Ohshima i sar., 1998). Osim toga, flavonoidi kvercetin i naringenin inhibiraju enzime
citohroma-P450, za koje je dokazano da potpomau bioaktivaciju karcinogena. Fenolna
jedinjenja kao antioksidanti, mogu uticati i na primarni proces starenja, mogu biti efikasni
inhibitori oksidacije LDL, a epidemioloka prouavanja pokazuju inverzni odnos izmeu
unosa hrane bogate flavonoidima i kardiovaskularnih oboljenja. Svi ovi podaci ukazuju na to
da poveana konzumacija voa i povra bogatog nutritivnim i nenutritivnim sastojcima koji
ispoljavaju antioksidativna svojstva moe doprineti poboljanju kvaliteta ivota.

2.2.2. Antocijani

Antocijani (anthos-cvee, kyanos-plav) su klasa flavonoidnih jedinjenja koja
predstavljaju prave biljne pigmente. Prvi put su izolovani jo 1835. godine. Mogu se nai u
svim delovima biljke, od cveta do korena, a osim to biljci daju obojenost, tite je i od
prekomerne i UV svetlosti, zatim od tetnog dejstva slobodnih radikala, a smatra se i da
predstavljaju signalne molekule u odgovoru biljke na negativne spoljane uticaje (Gould i
sar.,2009).
Antocijani se u grou, za razliku od ostalih flavonoida, preteno nalaze u obliku
glukozida nastalih vezivanjem flavonoidne komponente, koja se naziva antocijanidin, sa
eernom komponentom, najee glukozom. Pored glukoze kao eerna komponenta
glikozida mogu se nai i galaktoza i ramanoza. Vezivanjem za eernu komponentu poveava
se stabilnost antocijanidina i njegova rastvorljivost u vodi. Ukoliko antocijani sadre samo
jedan molekul eera onda se on nalazi iskljuivo vezan u poloaju 3, a ako sadri dva, onda
je ili diglikozid u poloaju 3, ili se eeri nalaze u poloajima 3 i 5 (Laji i Gruji-Injac,
1998). Struktura antocijana moe biti dalje usloena vezivanjem siretne, kumarne ili kafene
kiseline, za eernu komponentu, pri emu nastaju tzv. acil derivati (slika 2.18).
Osnovna podela antocijana u est klasa izvrena je na osnovu poloaja slobodnih i
metilovanih hidroksilnih grupa na prstenu B (slika 2.18). Meusobni odnos i koliina svake
pojedinane klase zavisi od sorte vinove loze i naina njenog uzgajanja, pri emu odnos
antocijanina veoma utie na nijansu i stabilnost boje groa (Jackson, 2008). Nijansa, kao i
stabilnost boje, groa direktno su uslovljeni brojem i poloajem slobodnih hidroksilnih
grupa na prstenu B, tako je plava nijansa izraenija to je vei broj slobodnih hidroksilnih
grupa, dok se njihovim metilovanjem dobija crvena nijansa.

44

Antocijani su jedinstveni meu polifenolima biljaka jer mogu biti prisutni u razliitim
hemijskim oblicima u zavisnosti od pH sredine, pri emu ove promene u strukturi se
odraavaju i na promenu boje molekula (slika 2.17). Na niskim pH vrednostima antocijani su
prisutni u obliku veoma stabilnih, u vodenoj sredini crveno obojenih, flavonijum katjona. Pri
poveanju pH vrednosti flavonijum katjon moe prei ili u ljubiasto obojenu konjugovanu
bazu hinonoidalne strukture, ili moe doi do njegove transformacije u poluacetalni oblik,
ijom hidrolizom nastaju uto obojeni halkoni. Neke od predhodno opisanih transformacija
mogu biti i ireverzibilne. Na slici 2.19 prikazane su promene u strukturi i boji antocijana pri
promeni pH.

Slika 2.17. Uticaj pH na boju antocijana.

45

Acil derivati
antocijana

Acetil

R
3
=
CH3
O

Kumaril

R
3
=
O
OH

Kafeoil

R
3
=
O
OH
OH

Slika 2.18. Osnovne klase antocijana.
Antocijani

O
OH
HO
OH
R
1
R
2
O O
HO
OH
OH
O
R
3

Antocijanin R
1
R
2
max
(nm)
R
3
= H
Antocijani-
din
Delfinidin OH OH 546 541
Petunidin OH OCH
3
543 540
Malvidin
OC
H
3

OCH
3
542
538
Cianidin OH H 535 530
Peonodin
OC
H
3

H 532
528
Pelargonidin H H 520 516
46

Slika 2.19. Promene u strukturi i boji antocijanina pri promeni pH.

U vinovoj lozi, antocijani se akumuliraju u listovima tokom njegovog biolokog
starenja, a odgovorni su i za obojenost pokoice (ponekada i pulpe) crnih i roze sorti groza.
Akumulacija antocijana u pokoici groa poinje nakon fenoloke faze, poznate pod
GLy
f lavilijmkatjon
(crveno obojen)
O HO
OH
O
OMe
OH
OMe
- H
+
- H
+
GLy
O O
OH
O
OMe
OH
OMe
GLy
O HO
OH
O
OMe
O
OMe
hinonoidalna baza
ljubicasto obojena
pKa=4
GLy
O O
OH
O
OMe
O
OMe
- H
+
pKa=7
anjon hinonoidalne baze
plavo obojen
GLy
O HO
OH
O
OMe
OH
OMe
OH
hemiacetalni oblik
bezbojan
O
OH
HO
O
OMe
OMe
OH
OH
E i l i Z halkon
zuto oboj en
- H
+
/ H
2
O
47

imenom vraison, ali njihov sadraj u mnogome zavisi od vremenskih uslova, pre svega od
intenziteta svetlosti i temperatute, to ograniava uzgoj crnih sorti groa na umereno topla
podruija (Revilla i sar., 1998).
Antocijani su zasluni i za obojenost crvenih i roze vina, koja pored groa
predstavljaju vaan izvor ove klase flavonoida u ishrani. Meutim utvreno je da tokom
starenja vina dolazi do obrazovanja novih strukturno razliitih, najee narandasto
obojenih, kopigmenata reakcijom antocijana sa drugim bezbojnim polifenolima, karbonilnim
jedinjenjima, jonima metala, proteinima i ugljenim hidratima (Seabra i sar., 2008). Struktura
antocijana omoguava im izuzetnu reaktivnost kako ka elektrofilima tako i prema
nukleofilima (Gould i sar., 2009). Do nukleofilnog napada moe doi u poloaju 2 i 4
piranovog prstena C, to je favorizovano pozitivnom arom na kiseoniku, dok su mesta
elektrofilnog napada hidroksilne grupe, kao i C6 i C8 atomi prstena A u hemiacetalnom
obliku antocijanina (slika 2.20).

Slika 2.20. Mesta moguih elektrofilnih i nukleofilnih napada u strukturi antocijanina.

Smatra se da veina novih familija kopigmenata iz crvenog vina nastaje:
a. U reakciji antocijanina sa malim molekulima (piruvatna kiselina, acetaldehid, p-
vinilfenol) pri emu nastaju piranoantocijaninski pigmenti,
b. Kondenzacijom antocijanina i flavanola u prisustvu aldehida,
c. Direktnom kondenzacijom antocijanina i flavanola.

Nastankom ovih kopigmenata vino zadobija narandasto-braon nijansu tokom
starenja. Boja ovih kopigmenata znatno je stabilnija prema promeni pH, a i prema
dekolorizaciji pod dejstvom SO
2
u odnosu na antocijanine.
Skoranje studije sa istim antocijaninima i ekstraktima koji su bogati njima na in
vitro biolokim sistemima pokazale su njihovo blagotvorno dejstvo: u prevenciji oteenja
jetre, na sniavanju krvnog pritiska, na poboljanje vida, zatim, snano antiimflamatorno i
antimikrobno dejstvo, kao inhibitorno dejstvo na mutacije nastale usled mutagena iz hrane i
6
8
4
2
O
OH
HO
OH
Nu
Nu
6
5
8
4
2
O
OH
HO
OH
OH
E
E
E
f lavinijum katjon poluacetalni oblik
48

na proliferaciju kancerogenih elija kod ljudi. Zajedno sa ostalim polifenolima predstavljaju
odline antioksidante, iako imaju i pro-oksidativno dejstvo. S obzirom na njihovu iroku
paletu fiziolokih dejstava konzumacija antocijana moe imati vanu ulogu u prevenciji
bolesti, povezanih sa stresnim i brzim nainom ivota, poput kancera, dijabetesa,
kardiovaskularnih i neurolokih bolesti.

2.2.3. Flavan-3-oli

Flavan-3-oli su gradivne jedinice tanina. Tanini (proantocijanidoli ili
proantocijanidini) su polimeri koji se sastoje iz dve ili vie razliito vezane jedinice flavan-3-
ola ili flavan-3,4-diola, pri emu stereohemija supstituenata na C
2
i C
3
atomu pojedinih
jedinica, kao i stereohemija meusobno povezanih jedinica ima vanu ulogu. Najee
jedinice proantocijanidola su: (-)-epikatehin sa 2,3 cis i (+)-katehin sa 2,3 trans poloajem
supstituenata.
U zavisnosti od broja OH-grupa u prstenu B i poloaja supstituenata na C
2
i C
3
atomu
razlikuju se katehinska i galokatehinska serija flavan-3-ola (Kova i sar., 1991), to je
prikazano na slici 2.21.

Slika 2.21. Struktura flavan-3-ola.

Katehinska serija je znaajnija, poto je zastupljenija u biljnom svetu. Ova jedinjenja
se nalaze u slobodnom obliku, ali mogu biti i esterifikovana, najee galnom kiselinom.

R1 R2 R3
Katehini:
(+)-katehin H OH H
(-)-epikatehin OH H H
Galokatehini:
(+)-galokatehin H OH OH
(-)-epigalokatehin OH H OH
OH
O H
OH
OH
R1
O
R3
R2
49

2.2.4. Flavonoli

Flavonoli su flavonoidi pronaeni u mnogim biljnim vrstama, uglavnom u obliku
glikozida. To su pigmenti ute boje koji odreuju boju belih vina, dok su u crvenim vinima i
sokovima maskirani antocijanima crvenim pigmentima. Sinteza flavonola se uglavnom
odvija u pokoici bobice (Price i sar., 1995). Ekstrakcija flavonola iz pokoice odvija se u
fazi maceracije.
Hidroksilne grupe u B prstenu flavonola (slika 2.22) mogu se nalaziti na C-4, C-3
,
i C-4
,
i
C-3
,
, C-4
,
i C-5
,
, pa su u vou i proizvodima od voa prisutni kemferol, kvercetin i miricetin.
Metilovanjem 3
,
-OH kvercetina nastaje izorhamnetin. Produkt metilovanja miricetina na C-3
,
,
poznat je pod nazivom laricitin. Singletin je dimetoksi derivat miricetina sa metoksi grupama
na poloajima C-3
,
i C-5
,
(Puka, 2010).

Slika 2.22. Struktura flavonola.

2.2.5. Fenolna jedinjenja neflavonoidne strukture

Fenolna jedinjenja neflavonoidne strukture, fenolne kiseline i stilbeni, sadre C
6
-C
1
, C
6
-
C
3
ili C
6
-C
2
-C
6
osnovni skelet. Fenolne kiseline su derivati benzoeve i cimetne kiseline (slika
2.23).

R
1
R
2
kemferol H H
kvercetin H OH
miricetin OH OH
izoharmnetin H OCH
3

laricitrin OH OCH
3

siringetin OCH
3
OCH
3

50

Benzoeva kiselina R
2
R
3
R
4
R
5
Cimetna kiselina
p-hidroksi benzoeva H H OH H Kumarinska
Prokatehinska H OH OH H Kafena
Vanilinska H OCH
3
OH H Ferulna
Galna H OH OH OH

Slika 2.23. Fenolne kiseline.

Fenolne kiseline su prisutne u vou u glikozidnoj formi, iz koje se mogu osloboditi
kiselom hidrolizom (Riberau-Gayon, 1965). Slobodne fenolne kiseline prisutne u crvenim
vinima i sokovima, uglavnom su nastale reakcijama kiselom hidrolizom glikozida, alkalnom
hidrolizom estara ili termikom degradacijom kompleksa antocijana (Galvin, 1993). Estri sa
vinskom kiselinom, pre svega estar kafene kiseline lako podleu oksidaciji i odgovorni su za
brzo potamnjivanje ire.
Hidroksicimetne kiseline su delimino zaslune za boju crvenih vina, jer njihovom
oksidacijom nastaju uto obojena jedinjenja. Takoe iz derivata cimetne kiseline, pod
uticajem kvasca Bettannomzces i nekih mlenih bakterija nastaju isparljivi fenoli. Isparljivi
fenoli su jedinjenja koja i u veoma malim koncentracijama daju vinu neprijatan miris
(Puka, 2010).

51

2.3. SLOBODNI RADI KALI I OKSIDATI VNI PROCESI
2.3.1. Definicija i podela slobodnih radikala

Slobodni radikali predstavljaju atome, jone, molekule koji imaju jedan ili vie
nesparenih elektrona u svojoj strukturi. Nespareni elektroni su uzrok njihove visoke i
neselektivne aktivnosti i nestabilnosti. Oni mogu biti neutralni, ali i pozitivno (radikal-
katjon) i negativno (radikal-anjon) naelektrisani. Nespareni elektron se moe nalaziti na
atomima razliitih elemenata, pa se slobodni radikali dele na slobodne radikale (reaktivne
slobodnoradikalske vrste) kiseonika, hlora, azota itd.
Reaktivne vrste se dele na reaktivne slobodnoradikalske i neradikalske (oksidaciona
sredstva koja lako prelaze u slobodne radikale). Najvanije reaktivne vrste kiseonika (ROS
od engl. reactive oxygen species) date su u tabeli 2.4.

Tabela 2.4. Najvanije reaktivne slobodnoradikalske i neradikalske vrste kiseonika.
Slobodnoradikalske vrste Neradikalske vrste
Superoksid anjon radikal, O
2
-
Hidroksil radikal,
OH
Hidroperoksil radikal, HO
2

Peroksil radikal, RO
2

Alkoksil radikal, RO

Karbonatni radikal, CO
3
-

Ugljenoksidni radikal, CO
2
-

Vodonik peroksid, H
2
O
2

Hipobromna kiselina, HOBr
Hipohlorna kiselina, HOCl
Ozon, O
3

Singletni kiseonik,
1
O
2

Organski peroksid, ROOH
Peroksinitrit, ONOO
-

Slobodni radikali spadaju u najreaktivnije hemijske vrste i zbog svoje visoke hemijske
reaktivnosti oni lako stupaju u rekciju, meusobno ili sa drugim molekulima, pri emu
nespareni elektroni obrazuju hemijske veze, oslobaa se energija, a sistem prelazi u nie
energetsko stanje.
Reaktivni slobodni radikali mogu nastati brojnim reakcijama koje se uglavnom svode
na etiri osnovna tipa:
-termolizu
-fotolizu
52

-oksido-redukcione procese i
-radijaciju visoke energije (Pileti i sar., 1993).
U biosistemima se produkcija slobodnih radikala deava tokom sledeih procesa:
apsorpcije radijacije, fagocitoze, biotransformacije egzogenih i endogenih supstrata u
endoplazmatinom retikulumu, enzimskih reakcija koje katalizuju oksidaze, itd. Koliinu
slobodnih radikala poveavaju zagaeni vazduh, puenje, stres, izlaganje suncu, hronine
bolesti, infekcije i genetska predispozicija na neku bolest (slika 2.24).

Slika 2.24. ema nastanka slobodnih radikala.

Neki slobodni radikali nastaju i u toku normalnog metabolizma. Preko 90% kiseonika
iz vazduha u organizmu sisara redukuje se do vode primanjem etiri elektrona od
transportnog sistema elektrona u respiratornom lancu mitihondrija (Acworth, 2003).
Superoksid anjon radikal (O
2
-
) odnosno njegov protonovani oblik, peroksilni radikal
(HO
2
-
), nastaje jednoelektronskom redukcijom molekulskog kiseonika, a moe se dobiti i
jednoelektronskom oksidacijom vodonik peroksida. Znaajne koliine produkuju se u
reakcijama katalizovanim nekim oksidazama (npr. ksantin oksidazom) (Ohara i sar., 1993).
Hidroksil radikal, (
OH) je najreaktivniji od svih ROS i najodgovorniji za

citostatike efekte kiseonika. Brzo reaguje sa biomolekulima, pa je njegov poluivot kratak.
Hidroksil radikal se u elijama stvara kada postoje uslovi za Haber-Vajsovu ili Fentonovu
53

reakciju. Takoe, nastaje dejstvom -zraenja na molekul vode, u procesu fagocitoze,
troelektronskom redukcijom iz molekulskog kiseonika u respiratornom lancu mitihondrija.
Vodonik peroksid (H
2
O
2
) nije slobodni radikal, ali se ubraja u reaktivne vrste kiseonika.
Najstabilniji je, odnosno najmanje reaktivan intermedijer redukcije kiseonika. Nastaje
direktno dvoelektronskom redukcijom molekulskog kiseonika, jednoelektronskom
redukcijom superoksid anjon radikala ili njegovom enzimskom mutacijom, dejstvom
superoksid dismutaze:
2O
2
-
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
2.52
Proces stvaranja vodonik peroksida odvija se na nivou peroksizoma, mitohondrija,
mikrozoma i elijske membrane.
Singletni kiseonik (
1
O
2
) je izrazito reaktivan, nastaje enzimskim putem, u prisustvu
mieloperoksidaza i laktoperoksidaza.

2.3.2. Antioksidanti

Najire prihvaena definicija biolokih antioksidanata jeste ona koju je dao Halliwell
(1990), a prema kojoj su antioksidanti supstance koje prisutne u malim koncentracijama u
odnosu na supstrat (biomolekul) koji se oksiduje, znaajno usporavaju ili spreavaju
oksidaciju tog supstrata.
Antioksidanti mogu ispoljavati svoju aktivnost razliitim mehanizmima (slika 2.25)
zahvaljujui njihovoj sposobnosti da:
- deluju kao hvatai (skevinder) slodobnih radikala
- deluju kao donori elektrona ili
- donori H-atoma

peroksil ili hidroksil radikalima, ili da:
- deluju kao akceptori elektrona i
- akceptori H-atoma
ugljenikovih slobodnih radikala.

54

Slika 2.25. Nain delovanja antioksidanta.
Shi i sar. (2001) klasifikovali su antioksidante prema nivou i nainu delovanja u
ljudskom organizmu na: preventivne antioksidante, skevinder antioksidante i
reparacione antioksidante. Preventivni antioksidanti spreavaju nastanak slobodnih
radikala. Skevinder antioksidanti poseduju sposobnost da hvataju slobodne radikale.
Reparacioni antioksidanti deluju posebnim mehanizmima, obnavljujui ili uklanjajui
oteene vitalne biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog stresa. U reparacione
antioksidante ubrajaju se fosfolipaze, proteaze, enzimi koji obnavljaju DNK, transferaze, itd.
Prema mestu nastajanja antioksidanti znaajni za ljudski organizam dele se na: endogene
i egzogene. Endogeni antioksidanti predstavljaju antioksidante koji nastaju u ljudskom
organizmu, dok se egzogeni unose putem hrane ili lekova. Fenolna jedinjenja su jedna od
najvanijih grupa prirodnih egzogenih antioksidanata, ija je aktivnost uslovljena strukturnim
karakteristikama.

2.3.3. Oksidacija fenolnih jedinjenja

Voe i proizvodi od voa ispoljavaju snaan bioloki efekat koji se, pre svega pripisuje
visokom sadraju fenolnih jedinjenja (Cao i sar., 2009). Postoji visok stepen pozitivne
korelacije izmeu sadraja ukupnih fenolnih jedinjenja, kao i pojedinanog udela galne
kiseline, katehina, epikatehina i antioksidativnog potencijala (Minussi i sar., 2003).
Najizraeniju aktivnost u pogledu hvatanja slobodnih radikala ima galna kiselina, zatim
taninska kiselina, kafena kiselina, kvercetin, rutin, ferulna kiselina, a najniu aktivnost
poseduje resveratrol (Sanchez-Moreno, 1999). Meutim, prema Ghiselli i sar. (1998) najvii
stepen antioksidativne aktivnosti pokazuju antocijani. Videli smo, da su antioksidanti
hvatai slobodnih radikala, a najei slobodni radikali jesu reaktivne vrste kiseonika.

55

Pri standardnoj temperaturi i pritisku, kiseonik postoji kao gas sa 20,9% u atmosferi. To
je diatomni molekul formule O
2
. Najstabilniji oblik kiseonika je triplet
3
O
2
. Tripletni kiseonik
je biradikal sa dva nesparena elektrona, koji imaju isti spinski kvantni broj i locirani su u
suprotno orijentisanim antivezivnim
*
orbitalama (slika 2.26). Strukturna formula O = O ne
simbolizuje biradikalsku prirodu kiseonika, pa je zato treba prikazati kao O-O. Sa ovakvom
elektronskom konfiguracijom, kiseonik ne moe direktno reagovati u mnogim organskim i
neorganskim reakcijama.

Slika 2.26. Elektronska konfiguracija tripletnog kiseonika

56

e e Radikalske

3
O
2
O
2
-
O
2
2-

OH reakcije
tripletni superoksidni peroksidni hidroksil
kiseonik anjon anjon radikal

energija pK=4,8 pK>14

1
O
2
HOO HO
2
-

pK=11,9 Fentonova reakcija
2H
2
O
2
OH+OH
-
+O
2
+2H
+

H
2
O
2

vodonik
peroksid Haber-Vajsova reakcija
H
2
O
2
+ O
2
-
OH+HO
-
+
1
O
2

Slika 2.27. Produkcija reaktivnih kiseoninih vrsta.

Dovoenjem energije, osnovno stanje molekula kiseonika se moe aktivirati pri emu
nastaje neradikalska vrsta. Re je o singletnom kiseoniku
1
O
2
, u kojem je spinska restrikcija
uklonjena, te je mo oksidacije znatno uveana (slika 2.27).
U vodenim prirodnim sredinama, jednoelektronskom redukcijom tripletni kiseonik se
moe prevesti u superoksidni anjon radikal (O
2
-
), koji se moe predstaviti kao O-O:,
dovoenjem jednog elektrona u antivezivnu
*
orbitalu (slika 2.28)

57

Slika 2.28. Elektronska konfiguracija antivezivne 2 orbitale superoksidnog anjona.

Novonastali radikal (O
2
-
) se moe oksidovati ili redukovati, a pri pH vrednosti vina
postoji kao protonovani hidroperoksil radikal (HOO
). Hidroperoksil radikal nastaje u reakciji

vodonik peroksida i hidroksil radikala (HO
):

Hidroperoksil radikal (
moe nastati i reakcijom tripletnog kiseonika i atoma

vodonika koji nastaje iz vode. Ekscitovano stanje molekula vode se postie adsorpcijom
energije koja molekul vode hidrolitiki razlae na atom vodonika ( ) i hidroksil radikal
(
) za 10
-14
-10
-13
s (Halliwell i Gutteridge, 2001):

Hidroksil radikal (
moe nastati iz vode ili vodonik peroksida. Naime, pod

uticajem zraenja visoke energije (-zraenje) u vodi protiu sledee reakcije (Jacobien i sar.
1996):

Hidroksil radikali mogu nastati UV-izazvanim cepanjem veze kiseonik-kiseonik u vodonik
peroksidu ili dekompozicijom vodonik peroksida u prisustvu kompleksa prelaznih metala
(Salem i sar., 2000).

Haber-Vajsovom reakcijom mogu nastati hidroksil radikali u reakciji vodonik peroksida i
superoksidnog anjona (Hu i Jiang, 1996):
58

Dismutacijom superoksidnog anjona moe nastati vodonik peroksid, reakcijom koja je
veoma spora (Bielski i sar., 19983):

Konstanta brzine nekatalizovane dismutacije superoksidnog anjona strogo zavisi od pH
rastvora. Pri tome je odreeno da se brzina dismutacije superoksidnog anjona kree od 10
2
do
5 10
5
mol/s za oblast pH od 11 do 7 (Halliwell i Gutteridge, 2001).
Singletni kiseonik nije radikal s obzirom da nema nesparene elektrone (slika 2.29).

Slika 2.29. Elektronska konfiguracija antivezivne 2 orbitale singletnog kiseonika
Singletni kiseonik u osnovnom stanju sadri visoku energiju od 93,6 kJ. U rastvoru prelazi u
tripletni kiseonik predajui svoju energiju rastvoru (Girotti, 1998). Vreme ivota singletnog
kiseonika zavisi od hemijskih osobina rastvora, u vodi iznosi 2s dok je u ugljentetrahloridu
700 s.
Reaktivnost kiseoninih vrsta moe se prikazati nizom (Karbowiak i sar., 2010):
Tripletni kiseonik < superoksidni anjon < hidroperoksidni radikal < peroksidni anjon <
hidroksil radikal
Hidroksil radikal (
OH), nastao redukcijom kiseonika, sa kratkim vremenom ivota od

oko 10
-6
s u vodi, je trenutno najmoniji oksidant od svih reaktivnih kiseoninih vrsta i u
mogunosti je da brzo oksiduje veinu organskih jedinjenja (Choe i Min, 2005). Neki autori
smatraju da
OH moe da oksiduje gotovo svako jedinjenje u vinu u potpunosti (Laurie i

Waterhouse, 2006).
Mehanizam hemijske oksidacije vina je dugo prouavan. Ovde e biti prikazane dve
hipoteze.
Po prvoj hipotezi, oksidacija fenola vri se direktno u prisustvu prelaznih metala, kao to
su feri joni, uz formiranje semi-hinoidnih radikala koji se dalje oksiduju do odgovarajuih
hinona (slika 2.30).
59

Slika 2.30. ema oksidacije vina (prva hipoteza).

Slika 2.31. ema oksidacije vina (druga hipoteza).

Paralelno, u lananoj radikalskoj reakciji, od tripletnog kiseonika posredstvom fero jona
nastaju tri reaktivne kiseonine vrste: hidroperoksil radikal, vodonik peroksid i hidroksil
radikal. Ove kiseonine vrste su veoma nestabilne i reaguju veoma brzo ukljuujui pri tome
veoma neselektivne reakcije. Ove vrste su sposobne da oksiduju ne samo fenolna jedinjenja
ve sve supstance koje su prisutne u vinu i sklone su procesu oksidacije. Veliki proj
produkata se pri tome formira. S obzirom da je u vinu prisutan u visokoj koncentraciji, etanol
se takoe moe oksidovati hidroksil radikalima, koji se redukuju do vode. U drugom koraku,
60

karbon radikal koji se formira od etanola moe reagovati sa molekulskim kiseonikom
prelazei u acetilaldehid i novi hidroperoksil radikal. Regenerisani radikali obezbeuju
kontinuitet procesa oksidacije fenolnih komponenti do njima odgovarajuih hinona.
Po drugoj hipotezi (slika 2.31), oksidacija fenola moe biti rezultat reakcije fenola sa
hidroperoksil radikalima, koji nastaju u reakciji kiseonika sa Fe
2+
jonima. Naime, fenoli su
dobri donori vodonika hidroperoksil radikalima, pri emu prelaze u semihinonski radikal a
dalje u odgovarajue hinone, dok hidroperoksil radikali prelaze u H
2
O
2
. Vodonik peroksid u
prisustvu prelaznih metala i etanola uestvuje dalje u ve opisanim reakcijama.
Bez obzira na mehanizam, oksidacijom fenola nastaju hinoni. Hinoni, nastali kao
primarni produkti, su nestabilni i mogu uestvovati u novim reakcijama. Ove reakcije mogu
uzrokovati nastajanje pigmenata, proizvoda sa visokom molekulskom masom. Naime, hinoni
mogu da se spontano kombinuju sa nukleofilnim jedinjenjima (ukljuujui neke fenole,
amine i dr.) zbog njihovog visokog elektronskog afiniteta i pri tome dolazi do formiranja
dimera ili polimera. Nastali dimeri ili polimeri u kuplovanoj oksidaciji imaju nii redoks
potencijal od polaznih fenola i lake se oksiduju (slika 2.32) (Li i sar., 2005).

Slika 2.32. Formiranje dimera procesom oksidacije fenola.
61

Takoe, acetaldehid, produkt oksidacije etanola, moe imati veoma vanu ulogu u
procesu oksidacije vina tokom starenja u boci. Acetaldehid je sklon da reaguje sa
antocijanima i flavanolima dajui nove polimerne fenole. Kondenzovanim reakcijama sa
antocijanima i taninima daje stabilne polimerne pigmenate, koji obezbeuju stabilnu boju
crvenih vina (Monagas i sar., 2005).
Uobiajeno, vino sadri od 05 mg/L gvoa. Meutim, i pri ovako niskoj koncentraciji
ovog metala moe doi do oksidativnog kvarenja vina. Osim koncentracije, vaan je i oblik u
kome se nalaze joni gvoa. Feri jon (Fe
3+
) prisutan u vinu, nije u slobodnom obliku ve u
obliku kompleksa sa drugim jedinjenjima. Isti sluaj je i sa fero jonima (Fe
2+
).
Kompleksiranje smanjuje pH vrednost sistema zbog oslobaanja vodonikovih jona. U kiselim
vodenim sredinama joni Fe
3+
i Fe
2+
su prisutni kao heksaakvakompleksi [Fe(H
2
O)
6
]
3+
i
[Fe(H
2
O)
6
]
2+
. [Fe(H
2
O)
6
]
2+
jedini reaguje sa kiseonikom i to veoma sporo zbog nepovoljnih
termodinamikih uslova (Danilewicz, 2003). Meutim, molekuli vode mogu biti lako
zamenjeni drugim ligandima, kao to su neki fenoli (katehol) ili sadre 3-hidroksi-4-
karbonilne grupe (kao to je kafena kiselina). Broj i poloaj hidroksilnih grupa takoe utie
na kompleksiranje (Anelkovi i sar. 2006). Broj liganda u kompleksima Fe-polifenoli zavisi
od pH: istiskivanjem jednog molekula vode nastaje kompleks sa jednim ligandom (FeL
+
) sa
dvema orto-hidroksilnim grupama koje ulaze u koordinacionu sferu; sa porastom pH, dva ili
tri molekula vode mogu biti zamenjeni pri emu nastaju FeL
-
i FeL
3-
. Pri tome,
kompleksiranje smanjuje potencijal Fe
3+
- Fe
2+
, stabilizuje oksidaciono stanje Fe
3+
i poveava
redukcionu sposobnost Fe
2+
jona, to ukazuje da organski ligandi prisutni u vinu osiguravaju
brzu oksidaciju Fe
2+
jona. Kao rezultat, u prisustvu kiseonika, kiseonik je redukovan do H
2
O
2

a Fe
2+
joni oksidovani do Fe
3+
, to poveava pokretljivost gvoa u oksidacionim procesima
(Danilowicz, 2003).
Bakar takoe moe reagovati sa H
2
O
2
i generisati hidroksil radikale, i pri tome je mnogo
reaktivniji od gvoa. Osim
OH mogu nastati i drugi radikali:

Cu
2+
+ H
2
O
2
Cu
+
+ HO
2
+ H
+
2.53
Cu
+
+ H
2
O
2
Cu
2+
+
OH + OH
-
2.54
Tako se oksidacija katehina kiseonikom u prisustvu Cu
2+
jona moe prikazati jednainom
(slika 2.33):

62

Slika 2.33. Oksidacija katehina kiseonikom u prisustvu Cu(II).

pri emu se Cu
2+
i
OH stvaraju reakcijom (7).

Uoeno je da postoji sinergisiko delovanje gvoa i bakra. Tako je Danilewicz (2007)
pokazao da prisustvo gvoa u koliini od 5 mg/L izaziva neoekivano mali uticaj na brzinu
reakcije oksidacije u odnosu na brzinu reakcije kada se u isti sistem doda i mala koliina
bakra (0,15 mg/L). Efikasnost gvoa kao katalizatora u oksidaciji katehola zavisi od redoks
ciklusa u kome se fero jon, koji nastaje redukcijom feri jona, vraa u reakcioni ciklus. Bakar
obezbeuje efikasniju interakciju sa kiseonikom, verovatno zbog mogunosti formiranja
CuO
2
+
vrsta. Ceo proces moe biti predstavljen emom (slika 2.34), u kojoj se katehol
oksiduje feri jonima i hidroperoksil radikalima, pri emu je ceo proces voen kruenjem
metala.

Slika 2.34. Oksidacija katehola u prisustvu gvoa i bakra.

Oksidacija fenolnih komponenti je dugotrajan problem u proizvodnji vina. Sumpor-
dioksid je najvanija i najee koriena supstanca za spreavanje oksidacije vina. Pored
antioksidativne aktivnosti SO
2
ima i antimikrobne osobine i druge vane funkcije zbog kojih
je godinama korien. Meutim, dodavanje SO
2
vinu izaziva ozbiljne alergijske reakcije,
zbog ega je Svetska zdravstvena organizacija (World Health Organization WHO) donela
niz propisa o njegovoj ogranienoj upotrebi. U isto vreme, proizvoai su zabrinuti zbog
63

dodavanja SO
2
vonim sokovima i vinima zbog gubljenja kvaliteta. Do danas nije pronaena
uspena zamena za SO
2
, bez obzira na veliki broj radova uraenih u ovoj oblasti (Comuzzo i
Tat, 2003; Ribereau-Gayon i sar., 2006).
Neki autori smatraju (Danilewicz, 2007; Boulton i sar., 2001) da je glavna
antioksidativna uloga SO
2
u vinu da reaguje sa H
2
O
2
, ograniavajui oksidaciju fenola.
Rastvaranjem SO
2
u vodi uspostavljaju se ravnotee:
H
2
O + SO
2
HSO
3
-
+ H
+
SO
3
2-
+ 2H
+
2.55
pK
a
=1,86

pK
a
=7,2
a u prisustvu kiseonika protie reakcija:
2HSO
3
-
+ O
2
2H
+
+ 2SO
4
2-
2.56
U sistemu koji sadri fenolna jedinjenja i u prisustvu gvoa ili bakra protie reakcija
kojom nastaju bisulfitni joni, koji mogu reagovati sa vodonik-peroksidom:

Slika 2.35. Oksidacija katehola u prisustvu SO
2
.

Meutim, isti autori navode i mogunost proticanja reakcije izmeu hinona i bisulfitnog
jona:

Slika. 2.36. Reakcija bisulfitnog jona sa hinonima.

64

2.4. HROMATOGRAFIJ A

Hromatografija (od gr. : chroma, boja i : grafein pisati) je zbirni naziv
za grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje smea. Ona ukljuuje kretanje ispitivane
smee, rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu", ime se delovi smee razdvajaju
i izoluju, pa ih je mogue analizirati i kvantitativno odrediti.
Hromatografski sistem ine dve faze, pokretna i nepokretna kao i ispitivani analit.
Tokom hromatografskog procesa analit se nalazi u dinamikoj ravnotei izmeu ovih dveju
faza. Zbog kretanja analita naruava se ravnoteno stanje, to uzrokuje kretanje grupe
molekula u pravcu kretanja mobilne faze. Nepokretna faza mora biti odabrana tako da
zadravanje molekula na njoj bude selektivno, tj. da razliiti sastojci smee budu vremenski
razliito vezani za nju, to uzrokuje njeno razdvajanje (slika 2.37). Sama raspodela je
posledica raznih fiziko-hemijskih procesa kao to su adsorpcija, desorpcija, apsorpcija,
podela izmeu dva rastvaraa i jonska izmena.

Slika 2.37. Razdvajanje komponenata uzorka u koloni.

S obzirom na prirodu ravnotee izmeu pokretne i nepokretne faze, hromatografske
tehnike se mogu podeliti na:
- podeonu hromatografiju, kada se ravnotea uspostavlja izmeu dve tene faze, to
znai da je i nepokretna faza tena ali je vezana za neki inertni vsti nosa
- adsorpcionu hromatografiju, pri kojoj se ravnotea uspostavlja izmeu tene ili
gasovite pokretne faze i povrine vrste nepokretne faze, pri emu se molekuli
ispitivanog analita vsto veu za povrinu adsorbensa
- afinitetnu hromatografiju, kod koje se na povrini vrste faze nalaze razliite
funkcionalne grupe s definisanim prostornim rasporedom, a vezivanje nastaje zbog
65

specifinih interakcija molekula s hemijski vezanim ligandom na povrini
nepokretne faze
- hromatografiju sa iskljuenjem, kod koje je nepokretna faza materijal s posebno
definisanim dimenzijama i slabo izraenim adsorpcionim svojstvima, a razdvajanje
molekula se deava zbog razlike u molekulskoj masi i veliini (obimu).
Hromatografske tehnike se mogu podeliti i na osnovu sastava pokretne faze. Tako je
kod gasne hromatografije pokretna faza inertni gas, kod tene hromatografije to je tenost
male viskoznosti, a kod fluidne hromatografije u superkritinim uslovima pokretna faza je
tenost iznad svoje kritine temperature i pritiska (Katelan-Macan, 2003).
Hromatografija moe biti analitika i preparativna. Preparativna hromatografija se
bavi razdvajanjem komponenata smee radi dalje obrade, pa se moe smatrati metodom
preiavanja. U analitikoj hromatografiji se obino radi sa malim uzorcima i moe se
odrediti relativni odnos komponenata u smei.

2.4.1. Tena hromatografija visokih performansi (HPLC)

Tena hromatografija visokih performansi (tena hromatografija pri visokim
pritiscima) ili HPLC (High performance liquid chromatography ili high pressure liquid
chromatography) predstavlja vrstu hromatografije kojom se postie izuzetno dobra rezolucija
pri razdvajanju ak i veoma kompleksnih smea (zbog toga se nekada naziva i tenom
hromatografijom visoke rezolucije). HPLC je vrsta eluacione hromatografije na koloni, koja
je nala iroku primenu u analitikoj hemiji i biohemiji, i koristi se za razdvajanja,
identifikaciju i kvantitativno odreivanje razliitih jedinjenja.
HPLC razdvajanja se zasnivaju na razliitoj raspodeli supstance izmeu dve faze:
tene (mobilne faze) koja nosi smeu analita kroz porozni materijal (stacionarnu fazu), pri
emu, usled razliite vrste interakcija analita sa stacionarnom fazom, dolazi do razlike u
vremenu migracije komponenti analiziranog uzorka. Ono to je razlikuje od ostalih metoda je
to to je mobilna faza izloena dejstvu visokog pritiska. Visok pritisak omoguava
kontinuirani protok mobilne faze i uspostavljanje dinamike ravnotee sa stacionarnom
fazom. Dinamika ravnotea je uslov dobre selektivne raspodele komponenti u ispitivanom
uzorku. Dejstvo visokog pritiska dovodi i do efikasnog i brzog eluiranja komponenti smee sa
kolone.
HPLC instrument je veoma sloen i skup, pri emu je slian aparatu za gasnu
hromatografiju. Njegova prednost u odnosu na gasnu hromatografiju je u tome to se mogu
analizirati i razdvajati neisparljive supstance i to se analize vre na sobnoj temperaturi.
Osnovni delovi HPLC sistema su:
66

- pumpa (pumpe koje se koriste u HPLC sistemima mogu da stvore pritisak
oko10
6
Pa. One omoguavaju kontinualnu promenu brzine mobilne faze.
Uzorak se ubacuje u injekcioni blok nakon ega dospeva u mobilnu fazu pod
visokim pritiskom. Kasnije podlee razdvajanju na koloni).
- kolona (najvaniji deo HPLC sistema).
- detektor (najee se koriste UV/Vis detektori). UV/Vis detektori kao izvor
zraenja najee koriste deuterijumsku lampu. Deuterijumska lampa ima
veoma irok emisioni spektar zraenja (200-700 nm).

Tipian HPLC sistem sastoji se od relativno polarne mobilne faze i nepolarne
stacionarne faze. Voda (ili pufer) se koristi kao slab rastvara i acetonitril, metanol, ili manje
zastupljen tetrahidrofuran, kao jak rastvara. Stacionarna faza (HPLC kolona) je materijal sa
silika esticama. Hidrofobna povrina ovih kolona tipino je napravljena kovalentnim
vezama organosilana na silika povrini. Ove modifikacije ukljuuju reakciju
monofunkcionalnih alkildimetilhlorosilana sa povrinskim silanolnim grupama.
Oktadecilsilan je bio prva komercijalno dostupna silika vezivna faza i jo uvek je jedna od
najee korienih (Kirkland, 2004). Takoe, i drugi ligandi alkil tipa sa razliitim brojem C
atona (C1, C4, C8, C12) se esto koriste, kao i faze sa fenil grupom. Veina pakovanog
materijala ima relativno nisko podruje pH primene (pH 2-7). Koji e tip kolone biti izabran
zavisi od jedinjenja i cilja analize. Za hidrofobnija jedinjenja, treba koristiti kolone sa
stacionarnom fazom koje imaju manju specifinu povrinu. Za veoma polarna jedinjenja,
koja ne mogu biti zadrana na tradicionalnim C18 fazama, treba koristiti manje hidrofobne
kolone kao to su C4 ili stacionarne faze sa ubaenim polarnim grupama. Meutim, sve ovo
zavisi i od pH analize, sobzirom da pojedine kolone nisu stabilne na niskim pH (< 2) i
visokim pH (> 7) za due vreme.
Mobilne faze uobiajeno koriene u HPLC su vodeno-organske smee. Najee
korieni organski modifikatori su metanol, acenonitri i/ili kombinacija ova dva modifikatora.
Kombinacija organskog modifikatora u eluentu je predominantan faktor koji upravlja
retencijom analita. Visoko preieni rastvarai (HPLC grade) se preporuuju kako bi se
minimizirala kontaminacija stacionarne faze sa neistoama rastvaraa. Razmatranja za izbor
rastvaraa ukljuuje kompatibilnost izmeu rastvaraa, rastvorljivost analita u eluentu,
polarnost, svetlosna propustljivost, viskoznost, stabilnost, pH. Rastvarai za mobilnu fazu
treba da budu meljivi i ne treba da dovode do taloenja kada se pomeaju. Svetlosna
propustvljivost je bitan parametar kada se koristi UV/Vis detektor. Rastvarai sa visokim
vrednostima donjih granica talasnih duina za UV propustljivost kao to su aceton (330 nm) i
etil acetat (256 nm) ne mogu biti korieni za analizu na niskim talasnim duinama kao to je
210 nm. Acetonitril je sobzirom na nisku vrednost donje granice talasne duine za UV
propustvljivost koju ima, jedan od najee korienih rastvaraa u HPLC. Kada se radi sa
metanolom, izopropanolom i etanolom preporuuje se rad na preko 210 nm.
67

Izbor odgovarajueg detektora zavisi od osobina analita. Postoje razliiti tipovi
detektora, UV-VIS, detektori na bazi merenja fluorescencije, indeksa refrakcije, plameno
jonizacioni detektori (FID), maseni (MS), NMR i drugi. Pravilan izbor detekcione talasne
duine je kritian deo razvoja metode.
Temperatura takoe utie na odreivanja kod tene hromatografije, posebno kada je re
o rastvorima male molekulske mase. Poviena temperatura poboljava difuznost uzorka i
smanjuje viskoznost pokretne faze, pa se time poboljavaju kinetiki parametri. Meutim,
maksimalno dozvoljena temperatura je nia za oko 20
o
C od temperature kljuanja pokretne
faze.
2.4.1.1. HPLC parametri

Retenciona zapremina i retenciono vreme. Odgovor HPLC sistema nakon separacije
analita dobija se u formi hromatograma. U odsustvu jakih interakcija analita sa stacionarnom
fazom i na relativno niskom koncentracionom nivou, pikovi su simetrini i nalikuju tipinoj
Gaus-ovoj (normalna distribucija) krivoj. Rastojanje maksimuma pika od polazne take
izraeno je retencionim vremenom, t
R
(slika 2.38) i slui za identifikaciju datog analita.
Retenciono vreme je verovatno najee korieni parametar za opisivanje ponaanja analita i
najlake je merljiv. Meutim, i pored toga on je i najmanje univerzalan parametar.
Retenciono vreme analita zavisno je od protoka mobilne faze; vei protok, manje retenciono
vreme. Proizvod retencionog vremena i protoka mobilne faze je retenciona zapremina, V
R
,
veliina koja je manje zavistna od instrumentalnih parametara (Kazakevich i Lobrutto, 2007).
Mrtva zapremina. ak i ako analit ne reaguje sa stacionarnom fazom, detektor ga nee
detektovati odmah nakon injektiranja. HPLC kolona je ispunjena malim esticama poroznog
materijala koji ima znaajnu zapreminu tene faze izmeu estica i unutar njihovog poroznog
prostora, tako da analit koji ne interaguje mora proi kroz tu zapreminu pre nego to doe do
detektora. Zapremina tene faze u koloni se zove mrtva zapremina, V
o
. Odnos retencionog
vremena (t
r
), retencione zapremine (V
R
), mrtve zapremine (V
o
) i mrtvog vremena (t
o
),
definisan je izrazima:

2.57 i 2.58
gde je F protok mobilne faze. Mrtvo vreme je deo ukupnog retencionog vremena koje analit
stvarno provodi u mobilnoj fazi kreui se kroz kolonu, a ostatak retencionog vremena analit
provodi na povrini stacionarne faze.
Retencioni faktor. Retencija analita sastoji se od dva dela: 1) vremena koje komponente
provedu u mobilnoj fazi kreui se kroz kolonu i 2) vremena koje komponente provedu
zadrane na stacionarnoj fazi (slika 2.38).

68

Slika 2.38. Parametri retencije analita.

Razlika izmeu ukupnog retencionog vremena (t
R
)

i

mrtvog vremena (t
o
)

zove se
redukovano retenciono vreme (t
R
,
), a odgovarajua razlika izmeu retencione zapremine (V
R
)
i mrtve zapremine (V
o
) zove se redukovana retenciona zapremina (V
R
,
).
Odnos redukovane retencione zapremine (V
R
,
) i mrtve zapremine (V
o
) je iroko
korieni bezdimenzioni parametar poznat kao retencioni faktor, k.

2.59
Retencioni faktor (ili faktor kapaciteta) je veoma pogodan hromatografski parametar
sobzirom da je bezdimenzionalni i nezavistan od protoka mobilne faze i dimenzija kolone.
Selektivnost. Sposobnost hromatografskog sistema da odvoji razliite analite zove se
selektivnost (). Selektivnost je odreena odnosom retencionih faktora (k) dva analita

2.60
Poveanje selektivnosti u separaciji dva analita iz kompleksne smee je primarni cilj razvoja
metode, jer ukoliko je selektivnost za par analita jednak 1, sistem nee moi da odvoji ove
komponente. Selektivnost je zavisna od razlike u interakciji analita sa stacionarnom fazom.
Efikasnost. Analit se injektira u kolonu u formi veoma male zone sa podjednakom
distibucijom analita ututar zone. Sa kretanjem ove zone kroz kolonu, on se razdvaja. Stepen
ovog razdvajanja zove se efikasnost. Efikasnost je mera hromatografskog razdvajanja i broja
teorijskih podova u koloni i izraunava se korienjem jednaine:
69

2.61
Gde je t
R
retenciono vreme analita i w irina pika merena u vremenskim jedinicama kao
rastojanje izmeu taki preseka tangenti prevojnoh taaka pika sa baznom linijom (slika
2.39). Teorija podova predpostavlja da je analit u trenutnoj ravnotei sa stacionarnom fazom i
smatra se da se kolona moe podeliti u brojne hipotetike (teorijske) podove. Svaki pod ima
ogranienu visinu (visina efikasnog teorijskog poda, HETP) i analit provodi ogranieno
vreme na ovom podu.

Slika 2.39. Odreivanje efikasnosti (broja teorijskih podova u koloni).

Efikasnost je osobina kolone. Idealno, svi analiti odvojeni na istoj koloni treba da
pokau isti broj teorijskih podova. Efikasnost i selektivnost su komplementarni
hromatografski parametri. Kolona sa visokom efikasnou moe proizvesti uske
hromatografske zone.
Rezolucija. Rezolucija, R, je definisana kao odnos rastojanja izmeu dva pika prema
prosenoj irini ovih pikova (na baznoj liniji), tako da ovaj parametar obuhvata i efikasnost i
selektivnost:

2.62

70

2.4.1.2. Razvoj i validacija HPLC metode

Polazna taka u razvoju analitike metode je odreivanje fiziko-hemijskih karakteristika
aktivne supstance, kao to su njena struktura, rastvorljivost, stabilnost u razliitim
rastvaraima, pKa i dr. Tipini HPLC sistem sastoji se od relativno polarne mobilne faze i
nepolarne stacionarne faze. Voda (ili pufer) se koristi kao slab rastvara i acetonitril, metanol,
ili manje zastupljen, tetrahidrofuran, kao jak rastvara. Retencija i separacija rastvorka je
bazirana na njegovoj podeli izmeu dve faze. Mnogo tipova kolona je zastupljeno,
ukljuujui klasine C8, C18, fenil, ciano faze sa razliitim formama silika estica. Koji e
tip kolone biti izabran zavisi od jedinjenja i cilja analize. Za hidrofobnija jedinjenja, treba
koristiti kolone sa stacionarnom fazom koje imaju manju specifinu povrinu. Za veoma
polarna jedinjenja, koja ne mogu biti zadrana na tradicionalnim C18 fazama, treba koristiti
manje hidrofobne kolone kao to su C4 ili stacionarne faze sa ubaenim polarnim grupama.
Meuti, sve ovo zavisi i od pH analize, s obzirom da pojedine kolone nisu stabilne na niskim
Ph (<2) i visokim (>7) za due vreme. Pre svega, uticaj pH na retenciju jedinjenja treba
najpre razmotriti, pa onda istraivati retenciju i selektivnost razliitih kolona (Kazakevich i
Lobrutto, 2007).vodeno-organske smee
Mobilne faze su uobiajeno vodeno-organske smee. Najee korieni organski
modifikatori su metanol, acetonitril i/ili kombinacija ova dva modifikatora. Drugi
modifikatori kao to su tetrafidrofuran, izopropil alkohol, dimetilsulfoksid koriste se za mala
podeavanja u selektivnosti. Koncentracija organskog modifikatora u eluentu je
predominantan faktor koji upravlja retencijom analita. Visoko preieni rastvarai (HPLC
grade) se preporuuju kako bi se minimizirala kontaminacija stacionarne faze sa neistoama
rastvaraa i smanjila njihova pozadinska apsorbanca ukoliko sadre neistoe sa UV
hromoforama >190 nm.
Razmatranja za izbor rastvaraa za mobilnu fazu ukljuuju kompatibilnost izmeu
rastvaraa, rastvorljivost uzorka u eluentu, polarnost, svetlostnu propustvljivost, viskoznost,
stabilnost, pH. Rastvarai za mobilnu fazu treba da budu meljivi i ne treba da dovode do
taloenja kada se pomeaju.
Dva razliita pristupa mogu biti razmatrana za dalju optimizaciju separacije. Jedan pristup
razmatra korienje kombinacije organskih modifikatora, na primer smee metanola i
acetonitrila. Drugi pristup razmatra modifikovanje dodatnih varijabli, kao to je pH mobilne
faze.
Pravilan izbor detekcione talasne duine je kritian deo razvoja metode. Kod izbora
talasne duine, sledee faktore treba uzeti u obzir da:
-mobilna faza ne treba da pokazuje jaku pozadinsku apsorpciju na izabranoj talasnoj
duini,
71

-detektabilnost treba biti maksimizirana za komponente od interesa i minimizirana za
interference.
Izbor odgovarajueg detektora zavisi od osobina analita. Postoje razliiti tipovi detektora,
kao to su UV-Vis, detektori na bazi merenja fluorescencije, indeksa reflekcije, elektrolitike
provodljivosti, plameno jonizacioni detektori (FID), maseni (MS), NMR i drugi.
Povienie temperature se koristi za poveanje kolonske efikasnosti, skraivanje vremena
hromatografisanja i poboljanja separacione selektivnosti (Hancock i sar., 1994). Poviena
temperatura takoe poveava rastvorljivost (difuznost) rastvorka.
Za procenu da li je hromatografska metoda odgovarajua za predviena analitika
odreivanja komponenti u realnim uzorcima, potrebno je definisati sledee parametare:
- test pogodnosti sistema
- specifinost i selektivnost
- linearnost
- preciznost ponovljivost
- limit detekcije i limit kvantifikacije
- tanost ili recovery

Test pogodnosti sistema. Pre izvoenja bilo kog validacionog eksperimenta, treba
pokazati da je HPLC sistem i procedura sposobna da obezbedi podatke zadovoljavajueg
kvaliteta. Ovi testovi se koriste zbog verifikovanja da su rezolucija i ponovljivost koju daje
sistem adekvatni za analize koje se izvode. Test pogodnosti je provera sistema u cilju
osiguranja performansi sistema pre ili tokom analize nepoznatog uzorka.
Specifinost/Selektivnost. Za hromatografske metode razvoj separacije ukljuuje
demonstriranje specifinosti, koja predstavlja sposobnost metode za tano merenje
analitikog signala u prisustvu svih potencijalnih komponenti uzorka. U tu svrhu se snima
hromatogram test rastvora koji sadri potencijalne komponente uzorka prisutnih u poznatim
koncentracijama.
Linearnost. Svrha testa linearnosti je demonstrirati da unutar analitikog sistema postoji
linearni odgovor i da je direktno proporcionalan odgovarajuim koncentracijama analita u
odreenom koncentracionom podruju. Test linearnosti treba ispitati za najmanje pet
razliitih koncentracija unutar podruja. Prihvatljivost podataka iz testa linearnosti je esto
potvrivana na osnovu podataka za rikaveri koeficijenta. Koeficijent odreivanja R
2
> 0.990
72

se obino smatra kao dokaz prihvatljivog signala podataka sa regresionom linijom (Green,
1996).
Limit detekcije i limit kvantifikacije. Za HPLC limit detekcije i limit kvantifikacije moe
biti definisan u masenim ili koncentracionim jedinicama. Odreivanje c
L
i c
Q
moe biti:
- Bazirano na vizuelnoj proceni: limiti se odreuju na osnovu analize uzoraka sa
poznatom koncentracijom analita i procenjivanjem minimalnog nivoa na kome analit moe
biti pouzdano detektovan, tj. kvantifikovan sa prihvatljivom tanou.
- Bazirano na vrednosti odnosa signala prema umu: poredi se mereni signal koji potie
od uzorka sa poznatom niskom koncentracijom analita sa blank uzorkom i procenjuje se
minimalna koncentracija na kojoj analit moe biti pouzdano detektovan, tj. kvantifikovan.
Kod odreivanja c
L
vrednost odnosa signala prema umu je izmeu 3 ili 2:1, dok kod
odreivanja c
Q
je 10:1.
- Bazirano na standardnoj devijaciji signala i nagiba: c
L
i c
Q
se izraunavaju pomou
formula 41 i 42.
Nagib m se odreuje iz kalibracione prave analita. Procena S moe biti izvrena na vie
naina: bazirano na standardnoj devijaciji blanko probe ili bazirano na kalibracionoj pravoj
(standardna devijacija y-odseka).
Tanost i preciznost. Test tanosti demostrira blizinu izmeu naenih vrednosti i
vrednosti koje su prihvaene kao propisane tane vrednosti ili kao prihvaene referentne
vrednosti. Tanost moe biti demonstrirana i odreivanjem recovery vrednosti za analit koji
je dodat u realnom uzorku. Preciznost je indikator sluajnih greaka i moe biti svedena na
ponovljivost. Ponovljivost predstavlja najprostiju situaciju i ukljuuje ponavljanje analiza od
strane istog analitiara, jedno po jedno injektovanje pod istim operativnim uslovima za kratak
period vremena (Milenovi, 2010).
Ovi parametri se utvruju laboratorijskim ispitivanjem, ime se dokumentuje da je
hromatografska metoda odgovarajua za datu namenu. Zapravo to je proces koji osigurava
pouzdanost metode tokom korienja, i prema smernicama ICH (International Conference on
Harmonization) naziva se validacija metode.

73

2.5. UV/VI S SPEKTROFOTOMETRI J A

Ultraljubiasta/Vidljiva (UV/Vis) spektrofotometrija je spektroskopska metoda koja
obuhvata prouavanje apsorpcije elektromagnetnog zraenja u oblasti izmeu 200 i 800 nm
(1 nm = 10
-9
m). Kako veliki broj organskih jedinjenja ne apsorbuje u ovom delu spektra, to
UV/Vis spektrofotometrija, u poreenju sa drugim strukturnim metodama (IC, NMR, MS),
ima daleko manju primenu za strukturna odreivanja i uglavnom se korist i kao
komplementarna metoda za identifikaciju delova molekula koji apsorbuju u navedenoj
oblasti, takozvanih hromofora. Meutim, ova vrsta spektrofotometrije, tj. UV/Vis spektri
dobijeni na ovaj nain, pruaju veoma korisne informacije o strukturi ispitivanog jedinjenja.
Na primer, ona je nezamenljiva pomona (a esto i glavna) metoda za identifikaciju prirodnih
konjugovanih jedinjenja, kao to su: biljni pigmenti (karotenoidi), poliacetileni, porfirini,
flavonoidi, itd.
Pored primene za identifikaciju organskih jedinjenja, UV/Vis spektrofotometrija se
danas dosta primenjuje u kvantitativnoj analizi. Njene prednosti nad ostalim metodama su u
izuzetno velikoj osetljivosti i jednostavnom rukovanju instrumentom.

2.5.1. Apsorpcija UV/Vis zraenja

Veina standardnih spektrofotometara radi u delu elektromagnetnog spektra izmeu
200 i 800 nm. Taj deo je podeljen na blisku ultraljubiastu (200-400 nm) i vidljivu oblast
(400-800 nm). Na niim talasnim duinama (< 200 nm) nalazi se vakuumska ultraljubiasta
oblast, koja nije od interesa za strukturna odreivanja zbog apsorpcije kiseonika iz vazduha,
tako da je neophodno da uzorak bude u evakuisanom stanju.
Energetski sadraj zraenja u oblasti od 200 do 800 nm nalazi se izmeu 600 i 150
kJ/mol, to je dovoljno za pobuivanje elektrona i njihov prelazak iz osnovnih u pobuena
stanja. Zbog toga to UV/Vis zraenje apsorbuju elektroni, ova vrsta spektroskopije naziva se
jo i elektronska spektroskopija.
UV/Vis spektrofotometrija se najee koristi za kvalitativna i kvantitativna
odreivanja rastvora prelaznih metala ili konjugovanih organskih molekula. Prolaskom
zraenja iz vidljivog dela spektra kroz obojeni rastvor, joni prelaznih metala apsorbuju deo
svetlosti pri emu se pobuuju elektoni iz d-orbitale, dok se kod organskih molekula najee
pobuuju -elektroni. Najee se snimaju spektri razblaenih rastvora, a mogu se snimati i
spektri gasova ili para.
74

Kvantitativna spektrofotometrijska analiza zasniva se na Beer-ovom zakonu (A=lc),
koji kae da je apsorbanca rastvora direktno proporcionalna koncentraciji apsorbujue vrste
i debljini sloja kroz koje zraenje prolazi. Za kvantitativnu analizu je bitno da se merenja
apsorbance vre sa najveom moguom tanou i osetljivou. Da bi se to postiglo bitan je
izbor talasne duine na kojoj se merenje vri. Ona mora da ispuni nekoliko uslova:
1. da se merenjem postie maksimalna osetljivost
2. da mala promena talasne duine ne utie na reproduktivnost
3. da vai Beer-ov zakon.
Intenzitet apsorpcije zraenja definisan je Lambert-Berr-ovim zakonom:
A = log
10
(I
0
/I) = lc 2.63
-molarna apsorptivnost
l -debljina sloja (cm)
c -koncentracija apsorbujue supstance (mol/l)
A - apsorbanca
I
0
- intenzitet upadnog zraka
I - intenzitet zraka po prolsku kroz uzorak

Slika 2.40. Dijagram Lambert-Beerove apsorpcije svetlosti kroz kivetu.

75

U rastvoru koji sadri vie komponenti koje apsorbuju elektromagnetno zraenje, a
koje meusobno ne reaguju, apsorbanca ratvora jednaka je zbiru pojedinanih apsorbanci
svih komponenti.
A = A
i
= A
1
+ A
2
+ A
3
+ + A
n
2.64
Lambert-Berr-ov zakon ne vai kada:
1. rastvorak postoji u vie oblika koji su u meusobnoj ravnotei
2. rastvorak i rastvara grade asocijat
3. postoji termika ravnotea izmeu osnovnog i pobuenog stanja
4. jedinjenja fluoresciraju ili se hemijski menjaju prilikom apsorpcije zraenja
(Todorovi, 1997).

2.5.2. Snimanje UV/Vis spektra

Spektrofotometar se sastoji iz svetlosnog izvora iz koga se svetlost deli na dva
jednaka zraka (referentni i analitiki), monohromatora, detektora i ureaja za pojaavanje,
merenje i beleenje signala (pisaa). Kao izvor zraenja koristi se kombinacija volframove
(za vidljivu oblast , >375 nm) i deuterijumske lampe za blisku ultraljubiastu oblast. Kao
detektor se najee koristi fotomultiplikator (slika 2.41).

Slika 2.41. ema spektrofotometra.

Koncentracija uzorka zavisi od intenziteta apsorpcije i podeava se tako da vrh
apsorpcionog maksimuma bude u oblasti najvee tanosti, to odgovara vrednostima izmeu
76

0,2 i 0,7 jedinica apsorbancije. Najbolje je napraviti koncentrovaniji rastvor od kojeg se
postupnim razblaivanjem dobija rastvor koncentracije pogodne za spektrofotometriranje.
Pripremljeni rastvor se prebacuje u analitiku eliju (standardne debljine od 1 cm) od kvarca
(sistem propustljiv za blisku UV i vidljivu oblast) ili stakla (sistem propustljiv samo za
vidljivu oblast). Takoe se priprema i istovetna referentna elija sa istim rastvaraem. Za
vreme kontinualne promene talasne duine porede se intenziteti referentnog (I
0
) i analitikog
(I) signala. Spektar se belei pomou pisaa, najee kao zavisnost apsorbance (A) od
talasne duine ().
Svaki apsorpcioni maksimum okarakterisan je talasnom duzinom (
max
) na kojoj se
nalazi i molarnom apsorptivnou () na toj talasnoj duini. Prilikom opisivanja spektra
nekog jedinjenja ove vrednosti se obavezno navode za svaki maksimum. Pored toga, zbog
mogueg uticaja na izgled spektra, uvek se navodi i rastvara.

2.5.3. Tanost i preciznost merenja

U spektrofotometrijskoj analizi tanost i preciznost su esto ograniene sluajnom,
neodreenom grekom povezanoj sa instrumentom, nazvanom um. Odnos izmeu uma koji
je ukljuen u izmerenoj vrednosti transparencije, T (A = -logT) i greke odreivanja
koncentracije moe se izraunati iz Beer-ovog zakona:

Za konstantnu vrednost izraz se moe napisati u obliku:

u kome se moe smatrati nesigurnou (grekom) u odreivanju c, a koja je rezultat uma,
odnosno greke u merenju T. Deljenjem ove jednaine sa predhodnom dobija se izraz:

2.65
u kojem je relativna sluajna greka odreivanja T. Najbolja i najprimenljivija mera
sluajne greke jeste standardno odstupanje
koje je za instrument lako odrediti

merenjem transparencije 20 ili vie puta za neki rastvor koji apsorbuje. Ako se uvrsti

u jednainu 2.65 dobija se:

2.66
gde su
relativne standardne devijacije.

77

Greke se mogu podeliti u tri grupe:
1. One kod kojih je veliina
nezavisna od T,
srazmerna sa
i
srazmerna sa T.

Koncentraciona greka za
=k
1

Kod mnogih fotometra i spektrofotometra standardna devijacija merenja T je stalna i
nezavisna od vrednosti T. Ova vrsta sluajne greke je vezana za sam instrument. Kod
tipinih instrumenta standardna devijacija uglavnom iznosi priblino 0,003T (
=0,003T).
Na slici 2.42 vidi se da relativna standardna devijacija odreivanja koncentracije postie svoj
minimum pri apsorbanciji pribline vrednosti 0,5, a naglo se poveava kada apsorbancija
postigne vrednosti od priblino 0,1 ili vee od priblino 1,5.
=k
2

Ova vrsta sluajne greke tipina je za spektrofotometre visokog kvaliteta. Grafiki
prikaz relativne greke na slici 2.42 prikazan je krivom B. Spektrofotometrima ovog kvaliteta
mogu se meriti i vrednost apsorbancije 2,0 i vie, bez znaajne greke.
=k
3
T
Ukoliko uvrstimo izraz
=k
3
T u jednainu 2.66 videemo da je relativna standardna
devijacija obrnuto srazmerna logaritmu transparencije:

Kriva C na slici 2.42 pokazuje da se greke javljaju samo pri malim vrednostima
apsorbancije, i da se pribliavaju nuli pri velikim apsorbancijama (Skoog i sar., 1996).

78

Slika 2.42. Krive relativnih greaka za razliite kategorije instrumenentalne nesigurnosti.

79

3. EKSPERIMENTALNI DEO
80

81

3.1. MATERIJ AL

U ispitivanjima je kao materijal korieno:
- Groe tri stone sorte: Cardinal, Ribier i Muskat Hamburg i etiri vinske sorte:
Cabernet Sauvignon, Merlot, Prokupac i Vranac. Groe je poreklom iz vinograda sa
podruja June Srbije.
- Vinje tri sorte: Marela, Oblainska i Ciganica sa podruja Nike Banje
- Crvena ribizla sa podruja Nike Banje, Beograda i Velike Plane
- Malina sa podruja Nike Banje, Velike Plane i Vlasine
- Crvena i bela vina proizvoaa iz Srbije, Makedonije i Crne Gore
- Komercijalni sokovi (vinja, crna ribizla, crno groe) proizvoaa iz Srbije
- Vona vina (vinja, kupina, malina) domaa i proizvoaa iz Srbije.

3.2. APARATI I REAGENSI
3.2.1. Aparati

Prilikom ispitivanja kinetike degradacije i sadraja fenolnih komponenti kao i metalnih
jona u vou i proizvodima od voa koriena je sledea oprema:
1. HPLC sistem Agilent Technologies 1200 Series koji se sastoji od kvaternarne pumpe
G1354A, automatskog injektora G1329A, termostatiranog kolonskog dela G1316A,
UV/Vis detektora G1315D, fluorescentnog detektora G1321A kontrolisanog sa HP
Chemstation softverom, za odreivanje sadraja i ispitivanje kinetike fenolnih
jedinjenja;

82

Slika 3.1. Teni hromatograf visokih performansi (HPLC)(laboratorija Katedre za
analitiku i fiziku hemiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu).

2. UV/Vis spektrofotometar Agilent 8453 sa kivetom duine optikog puta 1 cm za
odreivanje sadraja i ispitivanje kinetike fenolnih jedinjenja;
3. ICP-OES Thermo scientific iCAP 6000 za odreivanje sadraja metalnih jona;

Slika 3.2. Optiki emisioni spektrofotometar sa induktivno kuplovanom plazmom
(laboratorija Katedre za analitiku i fiziku hemiju Prirodno-matematikog fakulteta
Univerziteta u Niu).

4. MicroMed high purity water system, TKA Wasseraufbereitungsszstem GmbH za
dobijanje demineralizovane vode,
5. Termostat Julabo MP 5A Open Bath Circulations za termostatiranje rastvora;
6. Analitika vaga Mettler Toledo AB-204-S za odmeravanje vrstih supstanci;
83

7. pH metar Hanna Instruments za merenje pH vrednosti rastvora;
8. Varijabilne automatske pipette Lab Mate
+
za pipetiranje rastvora;
9. Hronometar za merenje vremena i
10. Blender za homogenizovanje voa.

3.2.2. Reagensi

U radu su korieni sledei reagensi:
- Rastvor Folin-Ciocalteu reagensa sadri smeu fosfovolframove (H
3
PW
12
O
40
) i
fosfomolibdenske kiseline (H
3
PMo
12
O
40
) (komercijalni proizvod).
- Rastvor Na-karbonata (20%) pripremljen rastvaranjem 200 g anhidrovanog Na
2
CO
3
u
800 ml vode. Rastvor se zagreva dok se celokupna koliina soli ne rastvori. Nakon
hlaenja doda se par kristalia Na
2
CO
3
. Nakon inkubacije od 24 h rastvor se filtrira i
dopuni dejonizvanom vodom do 1L.
- Standardni rastvor galne kiseline je pripremljen na sledei nain: 50 mg galne kiseline
se rastvori u 10 ml metanola, prenese u normalni sud od 100 ml i dopuni
dejonizovanom vodom do crte. Dobijena koncentracija iznosi 5 mg/ml. Da bi se
dobila koncentracija od 0,05 mg/ml, 1 ml prethodno pripremljenog rastvora prenese
se u normalni sud od 100 ml i dopuni dejonizovanom vodom do crte.
- Radni rastvor NaNO
2
(5%), pripremljen je odmeravanjem odreene mase NaNO
2
i
rastvaranjem u dejonizovanoj vodi.
- Radni rastvor AlCl
3
(2%) pripremljen je odmeravanjem odreene mase AlCl
3
i
rastvaranjem u dejonizovanoj vodi.
- Standardni rastvor katehina: 5 mg katehina rastvoreno je u 5 ml etanola, preneto u
odmerni sud od 10 ml koji je dopunjen do crte dejonizovanom vodom. Rastvor je
koncentracije 0,5 mg/ml. 1ml ovog rastvora je prenet u normalni sud od 10 ml i
dopunjen vodom do crte, tako da je dobijen rastvor koncentracije 0,05 mg/ml. Iz ovog
rastvora je pripremljena serija razblaenja pomou koga je konstruisana kalibraciona
kriva.
- Radni rastvor Na-hidroksida, c=1 mol/L, pripremljen je odmeravanjem odreene
mase NaOH i rastvaranjem u dejonizovanoj vodi.
84

- Osnovni rastvor DPPH, c=1,0 10
-3
mol/L, pripremljen je odmeravanjem 0,0394 gr
DPPH i rastvaranjem u metanolu u normalnom sudu od 100 ml. Radni rastvor,
c=1,0 10
-4
mol/L, pravljen je pre poetka rada razblaivanjem osnovnog.
- Osnovni rastvor troloksa (c=1,0 10
-3
mol/L), pripremljen je odmeravanjem odreene
mase troloksa i rastvaranjem u metanolu.
- Rastvor kalijum-hloridnog pufera pH=1,0 pripremljen je rastvaranjem 1,86 g KCl u
980 ml dejonizovane vode podeavanjem do pH=1,0 konc. HCl i zapremine do 1L
dejonizovanom vodom.
- Rastvor natrijum-acetatnog pufera pH=4,5 pripremljen je rastvaranjem 54,43 g
CH
3
COONa 3H
2
O u 980 ml dejonizovane vode podeavanjem do pH=4,5 konc. HCl
i zapremine do 1L dejonizovanom vodom.
- Radni rastvor bifulfita pripremljen je odmeravanjem 1 g K
2
S
2
O
5
i rastvaranjem u 5 ml
dejonizovane vode.
- Radni rastvor H
2
O
2
pravljen je neposredno pre poetka rada razblaivanjem 30%
rastvora H
2
O
2
.
- Radni rastvor Cu(II) (c=1,0 10
-3
mol/L) pripremljen je rastvaranjem odreene koliine
CuCl
2
2H
2
O u dejonizovanoj vodi.
- Radni rastvor vinske kiseline (10%) pripremljen je rastvaranjem odreene koliine
H
2
C
4
H
4
O
6
u dejonizovanoj vodi.
- Korieni su i sledei sertifikovani standardi: malvidin-3-glukozid, cijanidin-3-
glukozid, kvercetim, kaemferol, katehin, epikatehin, kafena kiselina, ferulna kiselina,
p-kumarna kiselina, hlorogenska kiselina.
Sve hemikalije i rastvarai koji su korieni bili su p.a. i HPLC istoe nabavljeni od
Merck (Darmstadt, Germany) i Sigma-Aldrich (GmbH, Sterbeim, Germany).
Svi rastvori, koji se nisu mogli pripremiti kao primarni standardni rastvori,
standardizovani su poznatim metodama u cilju odreivanja tane koncentracije.
Sudovi koji su korieni prani su etanolnim rastvorom KOH, zatim rastvorom HCl (1:1),
isprani esmenskom, destilovanom i dejonizovanom vodom. Rastvori su pripremani sa
dejonizovanom vodom specifine provodljivosti 0,05 Scm
-1
.

85

3.3. METODE

3.3.1. Priprema uzoraka
Uzorci za analizu predhodno su pripremani postupkom ekstrakcije ili postupkom
mineralizacije u zavisnosti da li se u njima odreuje sadraj fenolnih komponenti ili sadraj
metalnih jona.
3.3.1.1. Postupak ekstrakcije
Odmerena je masa, predhodno blenderom homogenizovanog voa (groa ili vinje), a
zatim je dodato 20 ml 1%-tnog rastvoa HCl u metanolu. U sluaju homogenizovanog suvog
voa (crvena ribizla i malina) dodato je 20 ml rastvaraa za ekstrakciju
(aceton:voda:HCl=80:19:1, etanol:voda:HCl=80:19:1, metanol:voda:HCl=80:19:1). Nakon 2
asa stajanja na sobnoj temperaturi, odekantovan je rastvor, a vrsti ostatak je jo dva puta
ekstrahovan na ve opisani nain (20 ml i 10 ml 1% HCl u MeOH, ili rastvaraa za
ekstrakciju). Filtrat dobijen ceenjem sakupljenih ekstrakata kroz Bihnerov levak prenet je u
normalni sud od 50 ml i razblaen rastvaraem do crte. Dobijeni ekstrat je uvan na tamnom i
hladnom mestu (Iacopini i sad., 2008; Borowska i sar., 2009; Katalini i sar., 2010).

3.3.1.2. Postupak mineralizacije
Uzorak teine 15 g , predhodno homogenizovanog voa, prebaci se u porculansku
teglicu i zagreva 12 h na 50
o
C. Teglica se prebaci u pe za arenje i temperatura postepeno
poveava za po 50
o
C. Kada se dostigne temperatura od 500
o
C, zagrevanje se nastavlja na toj
temperaturi narednih 16 h. Ohlaeni uzorak se tretira sa 1 ml konc. HNO
3
i ponovo zagreva
jo 10 h u pei za arenje. Kada se uzorak prohladi rastvori se u 5% (v/v) HNO
3
, procedi i
dopuni istim rastvorom azotne kiseline do 50 ml (AOAC, 2000).

3.3.2. UV/Vis spektrofotometrijske metode
UV/Vis spektrofotometrija je primenjena za odreivanje ukupnih fenola, ukupnih
flavonoida, ukupnih antocijana, monomernih antocijana, procenta polimerne boje, radikal
skeviner kapaciteta i ukupne antioksidativne aktivnosti u ispitivanim uzorcima.

86

3.3.2.1. Odreivanje sadraja ukupnih fenolnih jedinjenja
Za odreivanje sadraja ukupnih fenola u pripremljenim uzorcima koriena je
metoda po Folin-Ciocalteu (Singleton i Rossi,1965) . Metoda se zasniva na oksidaciji
fenolnih jedinjenja pomou reagensa, odnosno rastvora Folin-Ciocalteu. Rastvor Folin-
Ciocalteu sadri smeu fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline. Ovaj reagens oksidie
fenolna jedinjenja , a sam se redukuje u smeu volfram-oksida i molibden-oksida.
Na
2
WO
4
/Na
2
MoO
4
+ Fenol (fenol-MoW
11
O
40
)
4-
3.1
Mo(VI)
(uto obojen)
+ e
-
Mo(V)
(plavo obojen)

Ratvor postaje intenzivno plave boje, iji je intenzitet srazmeran koliini fenolnih jedinjenja.
Plava boja oksida je stabilna. Intenzitet boje se meri spektrofotometrijski, na talasnoj duini
= 760 nm.
Rastvori i reagensi:
1. 20% Na
2
CO
3
,
2. Folin-Ciocalteu reagens
3. Standardni rastvor galne kiseline
Postupak:
U odmerni sud od 10 ml unosi se odreena zapremina uzorka. Nakon toga se u odmerni
sud dodaje 2,5 ml dejonizovane vode, 0,25 ml rastvora Folin-Ciocalteu i 1ml rastvora
natrijum karbonata (20%). Sud se dopuni do crte vodom i nakon 30min se meri apsorbanca
na talasnoj duini = 760 nm, u odnosu na vodu kao slepu probu.
Na osnovu izmerenih apsorbanci, sa kalibracione krive standardnog rastvora galne
kiseline odreuje se masena koncentracija (g/ml) polifenolnih jedinjenja korienjem
jednaine prave A = (0,02970,0012) c + 0,0080,0006, n=5, R
2
= 0,998), a zatim sadraj
polifenolnih jedinjenja u polaznom uzorku

izraen kao ekvivalent galne kiseline.

3.3.2.2. Odredjivanje sadraja ukupnih flavonoida
Flavonoidi i flavonglikozidi imaju osobinu da sa metalima grade odgovarajue metalne
komplekse (Jia i sar., 1999). Naroito je vaan kompleks sa Al
3+
.
87

Slika 3.3. Kompleks Al
3+
jona sa rutinom.

Koncentracija flavonoida odreena je primenom AlCl
3
kao reagensa
spektrofotometrijskom metodom.
1. 5% NaNO
2

2. 2% AlCl
3

3. 1mol/L NaOH
4. Standardni rastvor katehina (0,5 mg/L)

Postupak:
Reakciona smea je pripremljena meanjem odreene zapremine uzorka, 4 ml
dejonizovane vode i 0,3 ml 5% NaNO
2.
Nakon 5min dodato je 1,5 ml 2% AlCl
3,
nakon 5
min jo 2 ml 1mol/L NaOH i dejonizovana voda do 10 ml. Apsorbanca je merena na = 510
nm, u odnosu na dejonizovanu vodu kao slepu probu.
Na osnovu izmerenih apsorbanci, sa kalibracione krive standardnog rastvora katehina
odreuje se masena koncentracija (g/ml) flavonoida korienjem jednaine prave A
=(0,02330,0008) c + 0,0090,0002), a zatim se sadraj ukupnih flavonoida u polaznom
uzorku izraava kao ekvivalent katehina.

3.3.2.3. Odredjivanje sadraja antocijana (singl pH i pH diferencijalna
metoda)
Sa vremenom, kao i pod uticajem razliitih faktora (temperatura, kiseonik i dr.)
dolazi do degradacije monomernih antocijana, ili se povezuju meusobno ili sa drugim
prisutnim jedinjenjima, formirajui na taj nain proizvode razgradnje. Iako koliina
monomernih antocijana opada, intenzitet boje se ne menja, jer u reakcijama kondenzacije
88

nastaju obojeni kondenzovani proizvodi koji su ak i stabilniji nego monomeri (slobodni)
antocijani.
Zbog toga se kvantitativno odreivanje ukupnih antocijana (nedegradiranih monomera
i proizvoda njihove degradacije) zasniva na osobini antocijana, da pri promeni pH sredine,
reverzibilno menjaju svoju strukturu, pri emu dolazi do promena apsorpcionog spektra.
Sadraj ukupnih antocijana odreuje se singl metodom, po kojoj je izmerena
apsorbancija rastvora antocija pri pH 1,0, proporcionalna sadraju ukupnih antocijana.
Odreivanje sadraja monomernih antocijana izvodi se pH diferencijalnom metodom,
koja se zasniva na osobini monomernih antocijana da su pri pH 1,0 u obliku oksonijum jona
(crveno obojeni), dok su pri pH 4,5 antocijani u poluketalnom obliku (bezbojni) (Guisti i
Wrolstad, 2003).
Reagensi:
1. 0,025 mol/L kalijum-hloridni pufer, pH = 1,0,
2. 0,4 mol/L natrijum-acetatni pufer, pH = 4,5.
Postupak:
Odmeri se odreena zapremina uzorka i prenese u dva odmerna suda od 10 ml, koja su
zatim dopunjena puferom pH 1,0, odnosno pH 4,5. Nakon 15 min izmeri se apsorbancija na
520 nm i 700 nm (zbog korekcije zamuenja).
Koncentracija ukupnih antocijana u uzorku (c
uk
) izraunava se kao ekvivalent malvidin-
3-glukozida (ili cijanidin-3-glukozida) prema formuli:
3.2
gde su: A
uk
= (A
500
A
700)pH=1,0

M 493,5 gmol
-1
(ili 449,2 gmol
-1
) molekulska masa malvidin-3-glukozida (ili
cijanidin-3-glukozida)
F faktor razblaenja
28000 Lmol
-1
cm
-1
(ili 26900 Lmol
-1
cm
-1
) molarni koeficijent apsorpcije
malvidin-3-glukozida (ili cijanidin-3-glukozida)
l 1 cm (debljina kivete)
Koncentracija nedegradiranih monomernih antocijana (c
mon
) u uzorku izraunata je kao
ekvivalent malvidin-3-glukozida (ili cijanidin-3-glukozida) prema formuli:
89

3.3
gde je: A
mon
apsorbanca uzorka, koja je izraunata prema formuli:
A
mon
= (A
520
-A
700
)
pH 1,0
- (A
520
-A
700
)
pH 4,5
3.4

3.3.2.4. Odreivanje procenta polimerne boje
Polimerna boja u uzorcima vina odreuje se primenom metode izbeljivanja bisulfitnim
rastvorom kome podleu samo monomerni antocijani, koja je opisana od strane Guisti i
Wrolstad (2003).
Reagensi:
1. 0,025 mol/L kalijum-hloridni pufer, pH = 1,0,
2. 0,4 mol/L natrijum-acetatni pufer, pH = 4,5.
3. 20% rastvor bisulfita

Postupak:
Neophodno je pripremiti dva rastvora.
Rastvor I: odreena zapremina uzorka prenese se u odmerni sud od 10 ml i dopuni
puferom pH 1,0 do crte. Apsorbanca ne treba da bude vea od 0,8-1,0. Nakon 15 minuta
meri se apsorbanca na 420 nm, 520 nm i 700 nm.
Intenzitet boje izraunava se na osnovu podataka dobijenih za rastvor I:
Intenzitet boje = (A
420
A
700
) + (A
520
A
700
) 3.5
Rastvor II: Od rastvora I pipetom se odmeri 4,665 ml u drugi odmerni sud i dopuni sa
0,335 ml rastvora bisulfita. Nakon 15 minuta meri se apsorbanca na 420 nm, 520 nm i 700
nm.
Polimerna boja izraunava se na osnovu podataka dobijenih za rastvor II:
Polimerna boja = = (A
420
A
700
) + (A
520
A
700
) 3.6
Procenat polimerne boje dobija se deljenjem jednaine (83) sa jednainom (84) i mnoenjem
sa 100:
Procenat polimerne boje (%) = (polimerna boja / intenzitet boje) 100 3.7
90

3.3.2.5. Odreivanje radikal skeviner kapaciteta, ukupne antioksidativne
aktivnosti i antioksidativnog potencijala

Kapacitet hvatanja slobodnih radikala ispitivanih uzoraka odreen je merenjem
njihove sposobnosti da neutralie DPPH radikale (DPPH test) (Brand-Williams i sar., 1995).
Metoda se zasniva na praenju transformacije ljubiasto obojenog, stabilnog, azot-
centriranog DPPH radikala (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) u redukovanu uto obojenu formu
DPPH-H (Hayder i sar., 2004).
Postupak: Potrebno je pripremiti sledee rastvore:
1. Radni rastvor koji sadri:
- 2,5 ml rastvora DPPH
- odreena zapremina uzorka
- dopuni se MeOH do 5ml
2. Kontrolni rastvor (rastvor slepe probe) koji sadri
- 2,5 ml rastvora DPPH
- 2,5 ml MeOH
Apsorbance dobijenih rastvora odreene su spektrofotometrijski na 515 nm nakon 30 min
stajanja na sobnoj temperaturi, uz MeOH kao referentni rastvor. Sve probe su raene u tri
ponavljanja.
Kapacitet hvatanja slobodnih radikala (Radical Scavenging Capacity-RSC) raunat je na
osnovu sledee jednaine:

3.8
Na osnovu izmerenih razlika apsorbanci A=A
slepe probe
- A
uzorka
, sa kalibracione krive
standardnog rastvora troloksa odreena je ukupna antioksidativna aktivnost u mol/ml
korienjem jednaine prave (TAA= 0,1693 A - 0,0005), a zatim je ukupna antioksidativna
aktivnost u polaznom uzorku izraena kao ekvivalent troloksa. Troloks, komercijalni
sintetiki antioksisans, formule:
91

Slika 3.4. Troloks (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina).
je u vodi rastvoran derivat vitamina E.
Antioksidativni potencijal (AP) se izraunava iz odnosa:

3.9
gde je: TAA ukupna antioksidativna aktivnost
TP - ukupni fenoli

3.3.3. HPLC metoda

Tena hromatografija sa UV/Vis i fluorescentnim detektorom visoke rezolucije (High
Performance Liquid Chromatography, HPLC) primenjena je za razdvajanje i kvantifikaciju
fenolnih jedinjenja u pripremljenim uzorcima. Izvren je razvoj HPLC metode pri emu su
sledei parametri pokazali najbolje rezultate. Hromatografsko razdvajanje izvreno je na
Eclipse XDB-C18 koloni (4,6mm x 150 mm) uz sistem rastvaraa: A (H
2
O+5%HCOOH) i
B - (80%ACN+5%HCOOH+H
2
O). Razdvajanje komponenti je izvedeno primenom sledeeg
linearnog gradijenta: 0-28 min, 0.0%B; 28-35 min, 25%B; 35-40 min, 50%B; 40-45 min,
80%B, i na kraju poslednjih 10 min ponovo 0%B. Protok mobilne faze je iznosio 0,8 ml/min.
Injektovano je 5 l rastvora uzorka, automatski, korienjem autosamplera-a. Kolona je
termostatirana na temperaturi od 30
o
C.
Fenolne komponente prisutne u uzorcima su identifikovane poreenjem njihovih
retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom standarda za svaku
komponentu. Korieni su standardi: malvidin-3-glukozida, cijanidin-3-glukozida,
halogenske kiseline, p-kumarne, kafene i ferulne kiseline, katehina, epikatehina, kvercetina i
kamferola. Kvantitativno odreivanje komponenata je izvrena metodom spoljanjeg
standarda. Za svaki pojedinani standard je pripremljen osnovni rastvor standarda masene
koncentracije 1,0 mg/ml, rastvaranjem u 10% rastvoru metanola. Konstruisana je
kalibraciona kriva, za svaki standard, na osnovu dobijenih povrina u zavisnosti od masene
koncentracije standarda. Iz dobijene jednaine linearne zavisnosti izraunate su masene
92

koncentracije komponenti u uzorcima. Za komponente u uzorcima za koje nije bio dostupan
standard, kvantifikacija je izvrena na osnovu kalibracione krive, po strukturi odgovarajueg
standarda.
Sve analize su izvrene u tri ponavljanja.

3.3.4. ICP-OES metoda

ICP-OES metoda je koriena za kvalitativnu i kvantitativnu analizu uzoraka groa i
vianja na sadraj metalnih jona.
1. Multi standard Ultra scientific analztical solution USA
2. HCl (1:1)
3. Argon 5.0 (99,999% istoe)
Parametri metode:
- Snaga RF generator 1150 W
- Brzina pumpe 50 rpm
- Protok gasa za hlaenje 12 L/min
- Protok rasprivaa gasa 0,7 L/min
- Pravac posmatranja plazme aksijalni
- Vreme ispiranja 30s
- Tri probe za svaki uzorak
- Prikaz rezultata u ppm sa etiri znaajne cifre.
Za svaki element iji sadraj je bilo potrebno odrediti, formirana je metoda tako to je
izvren izbor odgovarajuih parametara metode i odabirom vie talasnih duina. U cilju
konstruisanja kalibracione prave koja daje zavisnost relativnog intenziteta signala na
odgovarajuoj talasnoj duini u funkciji od koncentracije analita, snimana je slepa proba
(dejonizovana voda) i dva rastvora standarda razliitih koncentracija dobijenih
razblaivanjem osnovnog, referentnog standarda. Za svako merenje raene su po tri probe.
93

Izbor najbolje, pa samim tim i radne talasne duine vren je na osnovu relativnog intenziteta
signala kao mere osetljivosti metode, greaka na odzivu standarda kao i na osnovu veliine
interferiranja prisutnih elemenata u ovakvom realnom uzorku.

3.3.5. Metode za odreivanje brzine reakcije

Da bi se prouila kinetika reakcija degradacije fenolnih komponenti u ispitivanim
uzorcima primenjene su spektrofotometrijska i HPLC metoda.

3.3.5.1. Kinetiko-spektrofotometrijska metoda
Eksperimentalni postupak za primenu ove metode obuhvata sledee: selektovane
zapremine svih reaktanata (H
2
O
2
, Cu(II), uzorak, vinska kiselina) i vode do ukupno sraunate
krajnje zapremine probe su odmeravane pipetiranjem u odvojene delove etvorokrake
posude. Posuda je termostatirana 5 min na odgovarajuoj temperaturi. Trenutak meanja
rastvora oznaen kao poetak reakcije, evidentiran je hronometrom. Rastvor je zatim prenet u
mernu kivetu spektrofotometra. Oitavanje apsorbance je vreno na odabranim talasnim
duinama na svakih 2,5 ili 5 min u trajanju od 40 ili 60 min, zavisno od sistema. Grafik A =
(t) predstavlja kinetiku krivu. Na taj nain je, umesto veliine dc/dt odreena njoj
proporcionalna veliina dA/dt koja je proporcionalna brzini reakcije prema jednaini:

3.10
gde je: dc promena koncentracije indikatorske supstance
molarni koeficijent apsorpcije
l debljina apsorpcionog sloja i
tg tangens ugla nagiba linearnog dela kinetike krive prema apscisnoj osi
u koordinatnom sistemu A = (t).
Za obradu kinetikih parametara primenjena je diferencijalna varijanta tangensne
metode na osnovu linearne zavisnosti apsorbance rastvora od vremena odigravanja reakcije.

94

3.3.5.2. HPLC metoda

Ekperimentalni postupak pri primeni ove metode obuhvata sledee: selektovane
zapremine svih reaktanata (H
2
O
2
, Cu(II), uzorak, vinska kiselina) i vode do ukupno sraunate
krajnje zapremine probe su odmeravane pipetiranjem u odvojene delove etvorokrake
posude. Posuda je termostatirana 5 min na odgovarajuoj temperaturi. Trenutak meanja
rastvora oznaen kao poetak reakcije evidentiran je hronometrom. Injektovano je 5 l
rastvora, a reakciona smea vraena u thermostat. Kolona je zagrejana na istoj temperaturi
kao I pripremljeni uzorak za analizu. Oitavanje povrine pika odgovarajue komponente je
vreno na talasnim duinama od 520nm za antocijane i 275nm/322nm,
Ex
/
Em
za flavan-3-
ole svakih 35 min, nakon svakog injektiranja u trajanju 180 min. Grafik c = (t) predstavljao
je kinetiku krivu. Na osnovu grafike zavisnosti je odreena veliina dc/dt.

3.3.6. Statistika obrada podataka

Svi eksperimenti su izvreni u najmanje tri ponavljanja, a rezultati predstavljeni kao
srednja vrednost. Odreena je standardna devijacija. Za pojedine parametre je uraena analiza
varijanse (ANOVA), Duncan-ov test viestrukih intervala, kao i koeficijent korelacije izmeu
parametara (Prilog).

95

4. REZULTATI
96

97

4.1. ODREIVANJE SADRAJA POLIFENOLA, METALA I
ANTI OKSI DATI VNE AKTI VNOSTI

Radi boljeg razumevanja i postavljanja mogueg mehanizma procesa degradacije
antocijana i flavan-3-ola u crvenim vinima, polifenola u belim vinima i antocijana u ceenim
sokovima vinje, crvene ribizle i maline, neophodno je dobro poznavati sastav sistema u
kome se ovi procesi prouavaju. Kako sastav vina i sokova pre svega zavisi od sastava
groa, odnosno voa to je bilo neophodno odrediti:
1. sadraj polifenola, metalnih jona i antioksidativnu aktivnost groa,
2. sadraj polifenola i antioksidativnu aktivnost crvenih vina,
3. sadraj polifenola i antioksidativnu aktivnost belih vina,
4. sadraj polifenola, metalnih jona i antioksidativnu aktivnost vinje,
5. sadraj polifenola i antioksidativnu aktivnost komercijalnih sokova,
6. sadraj polifenola i antioksidativnu aktivnost vonih vina,
7. sadraj polifenola i antioksidativnu aktivnost crvene ribizle i
8. sadraj polifenola i antioksidativnu aktivnost maline.

aktivnosti groa

Hemijski sastav groa je vrlo sloen i zavisi od sorte, ekolokih uslova, stepena
zrelosti, primenjenoj tehnici merenja, kao i brojnih drugih faktora. ak postoje razlike i u
hemijskom sastavu bobica jednog grozda. Tokom alkoholne fermentacije deo sastojaka
groa se transformie u nove sastojke koji ulaze u sastav vina, dok deo sastojaka neizmenjen
prelazi u vino. To je razlog potrebe za posebnim prouavanjem hemijskog sastava groa i
hemijskog sastava vina. Za analizu ekstrakata groa na sastav i sadraj polifenolnih
jedinjenja i njihove antioksidativne aktivnosti, primenjene su spektrofotometrijska i HPLC
metoda, dok je za odreivanje sadraja metalnih jona primenjena ICP-OES metoda.

98

4.1.1.1. Spektrofotometrijsko odreivanje polifenola i antioksidativne
aktivnosti groa

Izolovanje polifenolnih jedinjenja iz voa postie se ekstrakcijom. Najee se koriste
dve tehnike: ekstrakcija rastvaraima i ekstrakcija na vrstoj fazi (solid-phase extraction).
Koliina polifenola u ekstraktu, kao i sastav ekstrakta u velikoj meri zavisi od naina
ekstrakcije, kao i tipa i polarnosti rastvaraa. Prirodni antioksidanti iz voa se najee
ekstrahuju metanolom. Antocijani se najee ekstrahuju na hladno, metanolom ili amil-
alkoholom koji sadri malu koliinu kiselne. Takoe, pokazalo se da je metanol efikasan
ekstragens i za katehine.
U ovom radu izbor rastvaraa za ekstrakciju fenola iz groa, metanola (sa 0,1% HCl)
je prvenstveno izvren na osnovu predpostavljene efikasnosti.
Rezultati spektrofotometrijskog odreivanja sadraja ukupnih fenola, ukupnih
flavonoida i ukupnih antocijana u metanolnim ekstraktima tri stone i etiri vinske sorte
groa, pripremljenim kao to je opisano u deluu 3.3.1.1, prikazani su u tabeli 4.1. Dobijeni
rezultati preraunati su na masu polaznog uzorka.
Primenjena je Folin-Ciocalteou metoda za odreivanje sadraja ukupnih fenola.
Nedostatak metode je njena nedovoljna specifinost, jer se fenoli detektuju sa razliitom
osetljivou. Ipak, u radu je koriena ova metoda, s obzirom da je re o standardnoj metodi
za odreivanje sadraja ukupnih fenola u ispitivanim ekstraktima groa. Rezultat je izraen
kao ekvivalent galne kiseline (GAE).
Korienjem Duncan-ovog testa viestrukih intervala (tabela 4.1) jasno se uoavaju
razlike u sadraja ukupnih fenola u uzorcima groa. Crvene sorte groa kao to su Vranac,
Merlot i Cabernet Sauvignon sadre vie fenola od ruiastih sorta groa kao to je
Cardinal. Poznato je da na sadraj polifenolnih jedinjenja utie genotip, mesto i tehnika
gajenja, kao i razlike u zrelosti voa. Takoe spoljanji faktori poput svetlosti, temperature,
prisustva hranljivih materija u zemljitu mogu uticati na sastav polifenolnih jedinjenja.
Sadraj ukupnih fenola u metanolnim ekstraktima groa kree se od 142,32 mg
GAE/100g sveeg groa (sv.g.) u stonoj vrsti groa Cardinal do 173,60 mg GAE/100 g
sv.g. u vinskoj sorti groa Cabernet Sauvignon.
Dobijene vrednosti sadraja ukupnih fenola su uporedive sa literaturnim podacima,
to se moe zakljuiti iz podataka prikazanih u tabeli 4.2.

99

Tabela 4.1. Sadraj ukupnih fenola (TP), flavonoida (TF) i antocijana (TA) stonih (Cardinal,
Muscat Hamburg, Ribier) i vinskih (Prokupac, Vranac, Merlot, Cabernet Sauvignon) sorti
groa.
Sorta groa TP
1
(mg GAE/100g) TF
2
(mg CE/100g) TA
3
(mg M3GE/100g)
Cardinal 142,321,55
4
a
5
59,460,81 a 44,801,93 a
Muscat Hamburg 157,464,32 bc 101,521,42 b 85,131,70 b
Ribier 157,305,32 bc 95,521,24 b 79,101,64 c
Prokupac 156,284,93 b 105,801,68 b 88,804,58 bc
Vranac 158,561,94 bc 122,141,34 c 106,971,20 e
Merlot 169,202,69 cd 134,801,17 d 110,131,64 e
Cabernet Sauvignon 173,601,91 d 146,201,42 e 120,272,00 f
1
mg ekvivalenta galne kiseline/100g sveeg groa;
2
mg katehin ekvivalenta/100 g sveeg groa;
3

mg malvidin-3-glikozid ekvivalenta/100 g sveeg groa;
4
srednja vrednost SD (n=3);
5
brojevi
oznaeni razliitim slovima u koloni se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test
viestrukih intervala, (p<0,05).

Tabela 4.2. Literaturni podaci za koliine ukupnih fenola u grou (mg GAE/100g sveeg
groa).
Zemlja Sadraj ukupnih fenola Referenca
Srbija 142,3-173,6(n= 7) Nai rezultati
Hrvatska 73,1-348,6(n= 7) Milis i sar., 2010
panija 176, 210 (n= 2) Perez-Magarino, Gonzales-San
Jose, 2006
panija 130-360 (n = 2) Cantos, Espin, Tomas-
Barberon, 2002
United States 201,1-426,6(n= 14) Yang, Martinson, Lui, 2009
Andalusia 119,1-336,1(n = 5) Guerrero i sar., 2009a
Kina 63-182 (n = 3) Hogan i sar., 2009
Kina 250, 480 (n= 2) Yi et i sar., 2009
Georgia 140-310 (n =10) Postrana-Bonilla i sar., 2003

Rezultati spektrofotometrijskog odreivanja sadraja ukupnih flavonoida u
metanolnim ekstraktima groa, prikazani su takoe u tabeli 4.1. Sadaj flavonoida kree se
od 47,78 do 84,21% od ukupnog sadraja fenola. Ukoliko se sadraj ukupnih flavonoida
razmatra na nivou uzoraka groa, svojim najveim sadrajem se istie Cabernet Sauvignon i
100

Merlot, dok znaajne razlike izmeu Muscat Hamburga, Ribiera i Prokupca nisu uoene.
Takoe, Cardinal je pokazao najmanji sadraj ukupnih flavonoida u odnosu na sve ostale
vrste groa. Imajui u vidu veliku raznovrsnost jedinjenja koja spadaju u klasu flavonoida,
ova metoda, kao i u sluaju odreivanje ukupnih fenola pokazuje nejednaku selektivnost
prema jedinjenjima ove klase, te kao takva nije dovoljno specifina. U novije vreme, sve vie
se insistira na primeni hromatografskih metoda.
Najee koriena metoda za odreivanje ukupnih antocijana u grou je pH singl
metoda. Rezultati spektrofotometrijskog odreivanja ukupnih antocijana u ekstraktima
groa (tabela 4.1) pokazuju da je vei sadraj antocijana kod ekstrakata vinskih sorti groa
Cabernet Sauvignon, Merlot ili Vranac (od 106,97 do 120,27 mg/L) u odnosu na stone vrste
groa (od 44,80 do 85,13 mg/L). Rezultati ispitivanja sadraja ukupnih antocijana u grou
iz Srbije uglavnom su slini sa podacima koji se mogu nai u referentnoj literaturi
(Kallithraka i sar., 2009a; Kallithraka i sar. 2007). Pomenuti autori su dobili vrednosti
sadraja ukupnih antocijana za Cabernet Sauvignon (sa podruja Makedonije i Grke) od
44,85 do 253,97 mg/100g sveeg voa (sv.v.), dok su za Merlot dobili vrednost od 73,35 do
219,80 mg/100 g sv.v. Katalini i sar. (2010) su dobili manji sadraj (73,9 mg/100 g sv.v.) za
Vranac u odnosu na na rezultat (106,97 mg/100 g sv.v.).

Slika 4.1. Antioksidativna aktivnost ispitivanih vrsta groa. Sorte groa oznaene
razliitim slovima se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih
intervala, (p<0,05).
Metoda na DPPH
radikale se iroko primenjuje pri odreivanju skeviner

kapaciteta. Antioksidansi reaguju sa stabilnim DPPH
radikalima i transformiu ih. Nivo

dekolorizacije rastvora DPPH
radikala ukazuje na skevener potencijal antioksidativnih

jedinjenja. Upravo ova metoda je primenjena za odreivanje antioksidativne aktivnosti
ekstrakata ispitivanih vrsta groa. Kao referentni antioksidans u ovom testu korien je
metanolni rastvor troloksa. Dobijeni rezultati su predstavljeni na slici 4.1. Najveu
antioksidativnu vrednost pokazuje Cabernet Sauvignon, sledi Merlot, Vranac, Muskat
101

Hamburg, Prokupac i na kraju Cardinal. Vrste koje pokazuju znatnu antioksidativnu aktivnost
imaju i veliki sadraj ukupnih fenola.
U mnogim istraivanjima (Kedge i sar., 2007) je dokazan visok stepen pozitivne
korelacije sadraja fenolnih jedinjenja groa i njihove antioksidativne aktivnosti. Da bi se
utvrdila veza izmeu antioksidativne aktivnosti metanolnih ekstrakata groa i sadraja
fenolnih jedinjenja, uraena je korelaciona analiza. Uticaj sadraja fenolnih jedinjenja na
antioksidativnu aktivnost metanolnih ekstrakata groa na DPPH
radikale, iskazan je
pozitivnom i visokom korelacijom (R
2
=0,902) (slika 4.2). Takoe, visoka korelacija postoji
izmeu ukupnih flavonoida i antioksidativne aktivnosti (R
2
=0,945) (slika 4.3) i izmeu
ukupnih antocijana i antioksidativne aktivnosti (R
2
=0,926) (slika 4.4).
140 145 150 155 160 165 170 175
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
1250
1300
1350
T
P

(
m
g
/
1
0
0
g
)
TAA (mol/100g)

Slika 4.2. Grafik korelacije sadraja ukupnih fenola i ukupne antioksidativne aktivnosti
ekstrakata ispitivanih sorti groa.

102

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350
60
80
100
120
140
160
T
F

(
m
g
/
1
0
0
g
)
TAA (mol/100g)

Slika 4.3. Grafik korelacije sadraja ukupnih flavonoida i ukupne antioksidativne aktivnosti

900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
T
A

(
m
g
/
1
0
0
g
)
TAA (mol/100g)

Slika 4.4. Grafik korelacije sadraja ukupnih antocijana i ukupne antioksidativne aktivnosti

103

4.1.1.2. HPLC odreivanje antocijana, flavan-3-ola i hidroksicimetnih
kiselina u grou

Objavljen je veliki broj HPLC metoda za odreivanje polifenolnih jedinjenja u
vonim materijalima. U osnovi, one su prilagoene za odreivanje sadraja najzastupljenijih
polifenola u jednoj biljnoj vrsti ili odreenog broja jedinjenja u razliitim matriksima.
Kvantitativno odreivanje polifenolnih jedinjenja samo po sebi predstavlja
analitiki izazov s obzirom da je procenjeno da postoji preko milion ovih jedinjenja, koja se u
vou nalaze u obliku glikozida, sa velikom raznovrsnou u boji, vrsti i nainu vezivanja
eernih ostataka.
Polifenoli apsorbuju u vidljivom i ultraljubiastom delu spektra, pa se i detekcija ovih
jedinjenja u analizi HPLC-om temelji na merenju apsorbancije ultraljubiastog i vidljivog
zraenja, pomou UV/VIS detektora. Dokazivanje ovih grupa jedinjenja nije mogue pri
samo jednoj talasnoj duini, jer svaka grupa jedinjenja ima apsorpcione maksimume pri
razliitim talasnim duinama (Prilog, slika 9.15). Antocijani imaju tipinu apsorpcionu traku
na =520 nm, flavanoli na 360 nm, hidroksicimetne kiseline na 320 nm a flavan-3-oli na 280
nm. U cilju identifikacije i kvantifikacije pojedinih grupa jedinjenja, snimaju se
hromatogrami na odgovarajuim talasnim duinama.
Na slici 4.5 je dat hromatogram za crveno groe Vranac, a u tabeli 4.3 prikazani su
rezultati odreivanja pojedinih antocujana HPLC metodom u metanolnim ekstraktima
odabranih stonih i vinskih sorti groa.
Identifikacija monomernih antocijana u ekstraktima groa vrena je na osnovu
poreenja retencionih vremena i spektara, na 520 nm sa odgovarajuim vrednostima
dobijenim za standarde (Prilog, slike 9.1 9.4).

104

Slika 4.5. HPLC hromatogram antocijana (520 nm) u ekstraktu groa Vranac: delfinidin-3-
glukozid (1); cijanidin-3-glukozid (2); petunidin-3-glukozid (3); peonidin-3-glukozid (4);
malvidin-3-glukozid (5); delfinidin-3-acetil-glukozid (6); delfinidin-3-p-kumaroil-glukozid
(7); malvidin-3-acetil-glukozid (8); cijanidin-3-p-kumaroil-glukozid (9); petunidin-3-p-
kumaroil-glukozid (10); peonidin-3-p-kumaroil-glukozid (11); malvidin-3-p-kumaroil-
glukozid (12).

Iz tabele 4.3. se moe uoiti da je u vinskim sortama groa kao i u stonoj vrsti
Ribier najzastupljeniji malvidin-3-glukozid. Ovaj podatak je u skladu sa rezultatima drugih
autora (Guerrero i sar., 2009; Ruberto i sar., 2007). Kod Cardinala najzastupljeniji
antocijanin je peonidin-3-glukozid, to se i oekivalo s obzirom da Cardinal spada u rose
sorte groa. Meutim, Muskat Hamburg sadri uporedive koliine malvidin-3-glukozida i
peonidin-3-glukozida, to je suprotno rezultatima nekih autora koji su dobili da je
najzastupljeniji peonidin-3-glukozid. Cantos i sar. (2002), ispitujui fenolni sastav sedam
sorti stonih vrsta groa pokazalo se da je u stonim sortama groa najzastupljeniji antocijan
peonidin-3-glukozid, suprotno vinskim sortama groa gde je najzastupljeniji malvidin-3-
glukozid.

105

Tabela 4.3. Sadraj antocijana (mg/100 g sveeg groa),
1,2
u stonim (Cardinal, Muscat
Hamburg, Ribier) i vinskim (Prokupac, Vranac, Merlot, Cabernet Sauvignon) sortama
groa.
Cardinal Mus.Ham Ribier Prokupac Vranac Merlot C.Sauv.
1 Dp-3-glukozid 0,53
0,08
4,11
0,35
1,84
0,09
2,47
0,18
10,19
0,72
5,36
0,12
8,29
0,09
2 Cy-3-glukozid 1,19
0,10
3,54
0,28
0,72
0,06
1,25
0,09
6,70
0,25
1,62
0,06
0,40
0,01
3 Pt-3-glukozid 0,74
0,09
4,23
0,18
2,46
0,09
2,93
0,11
11,71
0,38
5,97
0,18
4,54
0,08
4 Pn-3-glukozid 14,57
0,82
15,72
0,83
5,19
0,13
7,92
0,29
14,33
0,85
9,35
0,27
7,04
0,11
5 Mv-3-glukozid 11,17
0,94
22,23
0,92
17,67
0,52
27,64
0,98
29,14
0,92
43,97
1,18
54,47
1,17
6 Dp-3-acetil-
glukozid
nd nd nd nd 0,71
0,06
0,89
0,05
0,92
0,05
7 Dp-p-kumaroil-
glukozid
nd nd nd 1,74
0,07
2,37
0,07
1,10
0,08
0,95
0,09
8 Mv-3-acetil-
glukozid
nd nd 0,98
0,07
3,77
0,05
2,74
0,07
3,02
0,05
3,52
0,09
9 Cy-3-p-kumaroil-
glukozid
nd nd 1,19
0,09
nd 1,30
0,02
0,40
0,01
0,80
0,04
10 Pt-3-p-kumaroil-
glukozid
nd nd nd 0,83
0,06
1,57
0,03
2,30
0,06
2,85
0,10
11 Pn-3-p-kumaroil-
glukozid
2,66
0,32
1,59
0,06
3,11
0,22
2,86
0,10
2,29
0,07
2,78
0,07
2,92
0,08
12 Mv-3-p-kumaroil-
glukozid
1,64
0,12
1,08
0,05
11,51
0,63
7,27
0,08
5,17
0,09
12,94
0,32
9,90
0,42
Ukupno 32,50 52,50 44,67 58,68 88,22 89,70 96,60
1
mg malvidin-3-glukozid ekvivalenta /100 g sveeg groa;
2
srednja vrednost SD (n=3).

106

Flavan-3-oli pokazuju apsorbanciju pri =280 nm, na talasnoj duini pri kojoj
apsorbuju i ostala fenolna jedinjenja. Meutim, ova jedinjenja, za razliku od ostalih fenolnih
jedinjenja pokazuju fluorescentne osobine. Iz tog razloga fluorescentni detektor je korien za
selektivno odreivanje koncentracije katehina, epikatehina i dimera, procijanidina, B2. Na
slici 4.6 dat je hromatogram na kome su prikazani rezultati kvalitativnog i kvantitativnog
odreivanja flavan-3-ola u metanolnim ekstraktima groa.

Slika 4.6. HPLC hromatogram (275nm/322nm,
Ex
/
Em
) flavan-3-ola u ekstraktu groa
Prokupac: katehin (1); dimer procijanidina B2 (2); epikatehin (3).

Koliine katehina, epikatehina i procijanidina B2 u 7 razliitih crvenih sorti groa
prikazano je u tabeli 4.4. Katehin je prisutan u veoj koliini od epikatehina. Vranac, Merlot i
Cabernet Sauvignon su sorte groa sa najveim sadrajem katehina (3,09; 3,62 i 4,08 mg/kg
sv.v.). Dobijene vrednosti su uporedive sa literaturnim podacima. Katalini i sar. (2010) su
dobili vrednosti za sadraj katehina za Vranac i Merlot 2,05 i 3,12 mg/kg sv.v., i suprotno
naim rezultatima nisu identifikovali epikatehin.
U pogledu sadraja ukupnih flavan-3-ola, najvei sadraj je zabeleen u sortama
Vranac, Merlot i Cabernet Sauvignon. Ovaj podatak je potvren i u radu Iacopini i sar.
(2008). S obzirom na injenicu da je sadraj ovih jedinjenja znatno vei u semenima nego u
pokoici groa, to njihov sadraj u zrnu groa zavisi pre svega od dva faktora:
koncentracije ovih jedinjenja u semenima groa i odnosa ukupne teine semena i zrna
groa (Guerrero i sar., 2009). Odnos teine semena i teine zrna za Cabernet Sauvognon je
takav da obezbeuje ovoj sorti groa visok sadraj flavan-3-ola.

107

Table 4.4. Sadraj flavan-3-ola (mg/100 g sveeg groa)
1
u stonim (Cardinal, Muscat
Hamburg, Ribier) i vinskim (Prpkupac, Vranac, Merlot, Cabernet Sauvignon) sortama
groa.
Sorta groa katehin B2
2
epikatehin Ukupno
Cardinal 0,630,05 0,220,04 0,320,03 1,17
Muscat Hamburg 1,390,08 0,250,03 0,720,07 2,36
Ribier 0,460,06 0,270,05 0,380,04 1,11
Prokupac 1,170,06 0,300,05 0,920,05 2,39
Vranac 3,090,12 0,360,04 2,160,10 5,61
Merlot 3,620,10 0,260,02 1,690,09 5,57
C. Sauvignon 4,080,11 0,210,03 2,030,08 6,32
1
2
mg katehin ekvivalenta/100 g sveeg groa.

Od ispitivanih vinskih sorti groa, Prokupac je pokazao najmanji sadraj flavan-3-ola.
Do slinog podatka su doli Goevac i sar. (2010), koji su ispitivanjem ekstrakata semenki
pet crvenih sorti groa gajenih u Srbiji utvrdili da najmanji sadraj katehina i epikatehina
imaju semenke Prokupca (26,14 i 23,49 mg/100g suvih semenki), a najvei Game Noir-a
(145,04 i 91,67 mg/100 g).
Primenom HPLC metode odreene su i hidroksicimetne kiseline. Hidroksicimetne
kiseline imaju apsorpcionu traku na 320 nm. Na slici 4.7. je dat hromatogram ekstrakta
Vranca. Hidroksicimetne kiseline, prisutne u uzorcima groa, su identifikovane poreenjem
njihovih retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrima na
hromatogramu kafene, p-kumarne i ferulne kiseline. Rezultati odreivanja hidroksicimetnih
kiselina HPLC metodom u ispitivanim vrstama groa prikazani su u tabeli 4.5. Iz tabele 4.5
se vidi da najvei sadraj hidroksicimetnih kiselina ima Merlot (2,09 mg/kg sv.g.) a najmanji
Prokupac (1,01 mg/kg sv.g.). Odnos najveeg i najmanjeg sadraja hidroksicimetnih kiselina
je oko 2. Guerrero i sar. (2009) su dobili slian odnos sadraja hidroksicimetnih kiselina za
pet ispitivanih crvenih sorti groa. Isti autori su izveli zakljuak da se hidroksicimetne
kiseline sintetiu i/ili degradiraju na isti nain bez obzira na sortu groa.
108

Slika 4.7. HPLC hromatogram (320nm) hidroksicimetnih kiselina u ekstraktu groa Vranac:
t-kaftarna kiselina (1); c-kutarna kiselina (2); t-kutarna kiselina (3); kafena kiselina (4).

Tabela 4.5. Sadraj hidroksicimetnih kiselina (mg/100 g sveeg groa)
1
u stonim i vinskim
sortama groa

1
2
mg ekvivalenta kafene kiseline/100 g sveeg groa;
3
mg ekvivalenta
p-kumarne kiseline/100 g sveeg groa

t-kaftarna
kiselina
2
c-kutarna
kiselina
3
t-kutarna
kiselina
3
t-kafena
kiselina
Ukupno
Kardinal 0,680,05 0,110,03 0,320,04 0,080,01 1,200,03
Muscat Hamburg 0,980,09 0,170,02 0,380,07 0,100,01 1,630,05
Ribier 0,850,06 0,190,05 0,290,03 0,190,02 1,420,04
Prokupac 0,470,02 0,220,02 0,210,01 0,110,02 1,010,02
Vranac 0,700,05 0,110,04 0,180,02 0,300,05 1,290,04
Merlot 1,050,11 0,250,02 0,670,08 0,120,04 2,090,06
C.Sauvignon 0,820,09 0,090,01 0,580,02 0,250,02 1,740,04
109

4.1.1.3. I CP-OES odreivanje metala u grou

U grou i motu prisutni su brojni minerali. Njihova ukupna koncentracija u motu
iznosi od 3-5 g/L. U najvioj koncentraciji zastupljeni su kalijum, kalcijum i magnezijum.
Koncentracija kalijuma iznosi oko 50% ukupne koliine pepela. Koliina kalijuma i drugih
minerala znatno varira u zavisnosti od njihovih koncentracija u tlu, klimatskih uslova, uslova
proizvodnje, stadijuma zrelosti voa. U grou mogu biti prisutni i tragovi tekih metala
poput olova, ive i kadmijuma koji se obino taloe tokom vrenja. Za identifikaciju i
kvantifikaciju metala u uzorcima groa sa podruja june Srbije koriena je ICP-OES
metoda. Jako dobra osetljivost (ppb) i iroki radni opseg za mnoge elemente ine ICP-OES
skoro idealnom metodom za analizu uzoraka voa. U cilju odreivanja sadraja minerala u
ispitivanim uzorcima groa, izvrena je priprema uzoraka po proceduri prikazanoj u delu
3.2.1.2. Zatim su odreeni analitiki parametri za ispitivane elemente. U tabeli 4.6. prikazane
su odabrane talasne duine za svaki element, koeficijent korelacije i granice detekcije i
kvantifikacije c
L
i c
Q
.

Table 4.6. Karakteristike metoda kvantitativnog odreivanja ispitivanih elemenata.
Element (nm) c
L
/mg L
-1
c
Q
/mg L
-1

Korelacioni
koeficijent
Na 818,326 0,4047 1,3489 1,00000
K 766,490 0,607 2,023 0,99995
Ca 393,366 0,480 1,600 0,99040
Mg 279,553 0,360 1,201 0,99894
Fe 259,940 0,0539 0,1799 0,99992
Cu 324,754 0,1326 0,4421 0,99955
Zn 202,548 0,1138 0,3794 0,99967
Mn 257,610 0,1985 0,6619 0,99900
Cr 284,325 0,0723 0,2412 0,99987
Cd 226,502 0,0826 0,2755 0,99983
Co 230,786 0,1021 0,3405 0,99973
Pb 220,353 0,2325 0,7751 0,99864
Ni 231,604 0,1138 0,3794 0,99969

U tabelama 4.7 i 4.8 prikazan je sadraj elemenata, odreen metodom standardnog
dodatka, kao srednja vrednost plus standardna devijacija tri uzastopna merenja.
110

Kao to se iz tabela 4.7. i 4.8. vidi u uzorcima groa najzastupljeniji su alkalni (Na, K) i
zemnoalkalni (Ca, Mg) metali, dok su bioloki vani elementi (Fe, Cu, Zn, Mn) u sledeoj
grupi po zastupljenosti (tabela 4.8). Korienjem Duncan-ovog testa viestrukih intervala
jasno se uoavaju razlike u sadraju odreivanih elementa u ispitivanim uzorcima groa.
Zastupljenost ovih elemenata u Cardinalu, Muscat Hamburgu i Ribieru date su na slikama
4.8, 4.9 i 4.10.

Tabela 4.7. Sadraj makoelemenata (mg/100g seeg voa)
1
u uzorcima groa.
Metal Sorta
groa
Koliina
u uzorku
Dodato Odreeno

rikaveri
(%)
Na Ca 7,56 0,34 a
2
5,00 12,81 0,28 a 103
MH 9,81 0,39 b 5,00 14,92 0,30 b 101
Ri 11,88 0,44 c 5,00 17,40 0,34 c 104
K Ca 107,77 3,03 a 50,00 151,84 3,22 a 94
MH 106,40 2,50 a 50,00 159,22 2,82 a 103
Ri 64,50 1,40 b 50,00 110,52 1,12 b 94
Ca Ca 9,13 0,39 b 5,00 13,70 0,28 b 95
MH 8,72 0,20 b 5,00 13,40 0,24 b 96
Ri 10,15 0,65 a 5,00 15,28 0,55 a 101
Mg Ca 6,32 0,26 a 5,00 11,56 0,28 a 104
MH 5,69 0,14 b 5,00 10,78 0,22 b 102
Ri 7,30 0,22 c 5,00 12,72 0,28 c 106
1
2
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni za isti element se
signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05). Ca-Cardinal,
MH-Muskat Hamburg, Ri-Ribier.

Iz tabele 4.8. i slika 4.8- 4.10 se moe videti da je od mikroelemenata najzastupljeniji
element Fe, zatim slede Mn, Cu i Zn. Bakar i gvoe su nepoeljni u veim koncentracijama
jer katalizuju oksidaciju i izazivaju kvarenje vina. U ispitivanim stonim sortama groa bakar
se kretao u intervalu od 0,64 u Cardinalu do 0,84 mg/kg u Ribieru. Razlike u sadraju bakra u
razliitim stonim sortama groa sa istog podruja posledica su individualnih karakteristika
razliitih sorti groa, dok je sam nivo sadraja bitno uslovljen podnebljem na kome je
groe uzgajano i primenom agrotehnikih mera. Provenzano i sar. (2010) su ispitivali
korelaciju sadraja bakra u zemljitu, grou i vinu Mediteranskih vinograda. Naeno je da
zemljite sadri oko 5 mg/kg (na dubini od 20 do 40 cm), groe od 1,7 do 5 mg/kg dok se u
vinu njegov sadraj kree od 0,116 do 0,462 mg/L. Dakle, ako se uporeenje vri na nivou kg
groa/L vina, to je koliina ovog jona za oko jedan red veliine manji u vinu, ako ne doe
111

do kontaminacije iz drugih izvora u toku proizvodnje vina. Moe se oekivati da e sadraj
bakra u vinima sa podruja Srbije biti reda veliine od 0,2 do 0,4 mg/L. Istraivanja drugih
autora (Rai i sar., 1999) su pokazala da u vinima sa podruja Srbije, sadraj bakra varira u
granicama od 0,18 do 0,41 mg/L.

0.819%
4.79%
6.92%
81.7%
5.73%
Na
K
Ca
Mg
mikroelementi

a
0.644%
17.1%
5.1%
6.14%
71%
Fe
Cu
Zn
Mn
ostali

b

Slika 4.8. Zastupljenost makro- (a) i mikroelemenata (b) u Cardinalu.

0.873%
4.32%
6.62%
80.7%
7.44%
Na
K
Ca
Mg
mikroelementi

a
1.88%
15.1%
7.09%
5.98%
69.9%
Fe
Cu
Zn
Mn
ostali

b

Slika 4.9. Zastupljenost makro- (a) i mikroelemenata (b) u Muscat Hamburgu.

112

Tabela 4.8. Sadraj mikroelemenata (g/100g sveeg voa)
1
u uzorcima groa.
Metal Sorta
groa

Koliina
u uzorku

Dodato Odreeno rikaveri
(%)
Fe Ca 736,00 14,70a
2
300 1088,80 10,70a 107
MH 784,33 5,87b 300 1108,60 6,82b 103
Ri 925,67 6,52c 300 1258,88 4,68c 104
Cu Ca 63,67 1,23a 30 95,88 1,08a 103
MH 67,10 1,40b 30 98,20 1,62b 102
Ri 83,93 1,07c 30 109,82 2,04c 95
Zn Ca 52,80 1,20a 30 81,66 2,20a 98
MH 79,53 2,67b 30 106,66 1,99b 96
Ri 84,37 2,13c 30 110,64 2,50c 96
Mn Ca 177,00 3,00a 50 234,22 3,66a 104
MH 196,43 7,36b 50 250,02 6,42b 102
Ri 90,73 2,17c 50 142,88 2,88c 102
Cr Ca 6,67 0,23a 3 9,20 0,18a 93
MH 5,73 0,17b 3 8,42 0,22b 95
Ri 7,93 0,17c 3 10,42 0,28c 94
Cd Ca 0,37 0,02a 1 1,42 0,04a 113
MH 0,17 0,00b 1 1,19 0,03b 112
Ri 0,50 0,02c 1 1,57 0,01c 114
Co Ca 1,60 0,03a 1 2,70 0,03a 106
MH 1,17 0,03b 1 2,20 0,04b 103
Ri 1,10 0,02c 1 2,18 0,04c 107
Pb Ca 8,77 0,23a 5 14,20 0,28a 105
MH 11,00 0,50b 5 15,46 0,36b 95
Ri 9,43 0,37a 5 14,68 0,48a 103
Ni Ca 7,43 0,37a 3 10,22 0,22a 97
MH 8,77 0,13b 3 11,40 0,20b 96
Ri 7,53 0,37a 3 10,22 0,28a 96

1
2
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni za isti element se
signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05). Ca-Cardinal,
MH-Muskat Hamburg, Ri-Ribier.

113

1.27%
7.68%
10.7%
67.9%
12.5%
Na
K
Ca
Mg
mikroelementi

a
1.54%
7.54%
7.01%
6.98%
76.9%
Fe
Cu
Zn
Mn
ostali

b

Slika 4.10. Zastupljenost makro- (a) i mikroelemenata (b) u Ribieru.

Slini rezultati su dobijeni i za druge metalne jone. Tako su naa ispitivanja pokazala da
se sadraj hroma kree u intervalu od 57,3 do 79,3 g/kg, dok se u grou gajenom na
podruju panije ove vrednosti kreu od 2,4 do 64,6 g/kg (Cabrera-Vique i sar., 1997).

114

crvenih vina

U tabeli 4.9 prikazan je naziv, sorte groa i podruje proizvodnje ispitivanih crvenih
vina.

Tabela 4.9. Naziv, vrste groa i podruje proizvodnje ispitivanih crvenih vina.
Vino Naziv Sorte groa Podruje
1 drepceva krv Vranac, Merlot, C.Souv. Subotica- Srbija
2 Meas crni Merlot, Game, Burgundac Aleksandr. -Srbija
3 Medvea krv Prokupac, Vranac Kruevac-Srbija
4 Kratoia Kratoia Aleksandr. -Srbija
5 Merlot Merlot Subotica- Srbija
6 Game Game Kruevac-Srbija
7 Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Kruevac-Srbija
8 Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Tikve-Makedonija
9 drebac Vranac Subotica- Srbija
10 Vranac Vranac Aleksandr. -Srbija
11 Vranac Vranac Kruevac-Srbija
12 Vranac Vranac tip-Makedonija
13 Vranac Vranac Ohrid-Makedonija
14 Vranac Vranac Ovepolsko-Make.
15 Vranac Vranac Skoplje-Makedonija

Za odreivanje sadraja polifenola i antioksidativne aktivnosti ispitivanih crvenih vina
koriene su spektrofotometrijska i HPLC metoda.

115

aktivnosti crvenih vina

U tabeli 4.10. prikazani su rezultati spektrofotometrijskog odreivanja ukupnih fenola
u 15 uzoraka ispitivanih crvenih vina. Rezultati pokazuju da je najvei sadraj fenolnih
jedinjenja u vinu Medvea krv, koje je dobijeno kupaom od sorti groa Vranac i Prokupac.
Najmanji sadraj uoen je u vinu drepeva krv. Korienjem Duncan-ovog testa viestrukih
intervala jasno se uoavaju razlike izmeu sadraja ukupnih rastvorljivih fenola u ispitivanim
vrstama crvenih vina. Signifikantne razlike vina u pogledu sadraja ukupnih polifenola su
takoe date u tabeli 4.10. Ako se razlike razmatraju samo u okviru vina proizvedenih od
jedne iste vrste groa, odnosno Vranca, i uzimajui u obzir statistike parametre, vina
Vranac (Ohrid-Makedonija i Skoplje-Makedonija) to su vina sa najveim sadrajem
polifenola, dok su vina Vranac (Aleksandrovac-Srbija i Ovepolsko-Makedonija) uzorci sa
najmanjim sadrajem polifenola. Ovo potvruje injenicu da sastav i sadraj polifenolnih
jedinjenja zavisi pre svega od sorte groa, ali moe biti uslovljen i nainom uzgajanja,
klimatskim uslovima i postupkom ekstrakcije. Dobijene vrednosti sadraja ukupnih
polifenola u crvenim vinima su uporedive sa literaturnim podacima. Sadraj polifenola u
hrvatskim crvenim vinima se kree od 2809 do 3183 mg GAE/L (Katalini i sar., 2004),
italijanskim od 1365 do 3326 mg/L (Simonetti i sar., 1997), turskim od 1070 do 3410 mg/L
(Anli i sar., 2009), dok se u brazilskim kree od 3200 do 5900 mg/L (Lucena i sar., 2010).
Rezultati spektrofotometrijskog odreivanja ukupnih flavonoida u ispitivanim
crvenim vinima prikazani su u tabeli 4.10. Sadraj ukupnih flavonoida u 15 uzoraka crvenih
vina kree se od 1578.9 do 1998.4 mg CE/L, pri emu je vino Cabernet Sauvignon (Tikve-
Makedonija) najbogatije flavonoidima. Iz tabele se moe videti da je znatan udeo flavonoida
(odnos TF/TP) u ukupnom sadraju polifenola (0.63-0.73) kod crvenih vina.
Intenzitet boje vina ne zavisi samo od toga koliko e se bojenih materija ekstrahovati iz
pokoice groa, ve i koliko e se antocijana zadrati u vinu tokom uvanja. Do promene
boje crvenih vina dolazi zbog strukturnih promena antocijana (od jonizovanih antocijana,
karbiola i hinoidne veze) do kondenzovanih antocijana, pa se na osnovu njihovog
procentualnog uea u boji vina moe proceniti starost vina. Tokom uvanja vina najvei
deo antocijana sa taninima gradi stabilne tamnomrke komplekse, a manji deo se razlae pod
uticajem temperature, svetlosti, kiseonika ili se istaloi kao koloidna frakcija. Po pravilu, kod
starijih crvenih vina, apsorbanca na 520 nm se smanjuje, dok se apsorbanca na 420 nm
poveava, zbog prelaska monomernih u polimerne antocijane (Luoana, 2005). Ispitivanjem
uticaja vremena uvanja (u boci) vina na sadraj monomernih i polimernih antocijana,
Poiana i sar. (2008) su pokazali da se tokom uvanja u boci od 30 meseci, procenat
monomernih antocijana smanjio od 75,89 do 24,0, dok se u istom vremenskom periodu
procenat polimernih antocijana poveao od 11,93 do 68,51. Iz gore navedenih razloga
neophodno je odrediti posebno sadraj monomernih antocijana kao i procenat polimerne boje
u ispitivanim crvenim vinima.
116

Tabela 4.10. Sadraj ukupnih fenola (TP) i flavonoida (TF) ispitivanih crvenih vina i njihov
odnos.
Vino Naziv TP
1
(mg GAE/L) TF
2
(mg CE/L) TF/TP
1 drepeva krv 2321 81
3
a
4
1578,9 50,3 a 0,68
2 Meas crni 2738 86 bc 1802,3 68,0 bc 0,66
3 Medvea krv 3080 101 bc 1950,2 68,4 bc 0,63
4 Kratoija 2800 95 bc 1850,2 61,6 bc 0,66
5 Merlot 2620 95 ab 1762,3 59,9 abc 0,67
6 Game 2665 87 ab 1820,1 62,7 bc 0,68
7 Cabernet Souvignon 2429 82 a 1682,3 57,2 ab 0,69
8 Cabernet Sougvinon 2860 105 bc 1998,4 69,9 bc 0,70
9 drebac 2377 78 a 1580,2 50,5 a 0,66
10 Vranac 2561 84 ab 1772,3 67,3 abc 0,69
11 Vranac 2668 98 ab 1770,5 60,2 abc 0,66
12 Vranac 2525 84 ab 1720,2 59,9 ab 0,68
13 Vranac 2850 93 bc 1955,3 66,5 c 0,69
14 Vranac 2379 76 a 1735,8 57,3 abc 0,73
15 Vranac 2850 99 bc 1910,8 63,8 c 0,66
1
mg ekvivalenta galne kiseline /l vina;
2
mg katehin ekvivalenta /L vina;
3
4
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni se znaajno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test

Sadraj monomernih antocijana odreen je za vina starosti od 3 do 6 godina, prema
proceduri prikazanoj u delu 3.3.2.3. Rezultati analize pokazani su u tabeli 4.11. U istoj tabeli
prikazani su i rezultati odreivanja procenta polimerne boje, po proceduri datoj u delu
3.3.2.4. Analiza rezultata pokazuje da je najvea koncentracija monomernih antocijana
odreena u vinu Cabernet Sauvignon (br.8, godina punjenja 2007, analiza raena krajem
2009. godine), a najnia koncentracija takoe u vinu Cabernet Sauvignon (br.7, godina
punjenja 2003.). Suprotno ovim rezultatima, procenat polimerne boje je najvei u uzorku vina
7, a najmanji u uzorku vina 8. Dobijeni rezultati potvruju literaturne podatke da monomerni
antocijani tokom starenja u boci prelaze u polimerne antocijane.

117

Tabela 4.11. Sadraj monomernih antocijana (MA) i procenat polimerne boje ispitivanih
crvenih vina.
Vino Godina MA
1
(mg/L) Procenat polimerne boje
(%)
b

1 drepeva krv 2005 62,2 5,5
2
bc
3
70,4 0,9
2 Meas crni 2005 77,5 6,2 c 65,2 0,7
3 Medvea krv 2004 46,6 3,9 ab 76,9 1,2
4 Kratoija 2004 43,1 2,9 ab 77,1 1,0
5 Merlot 2004 38,8 3,2 ab 79,9 1,1
6 Game 2005 63,5 5,0 bc 70,1 0,6
7 Cabernet Souvignon 2003 30,5 2,4 a 85,5 0,8
8 Cabernet Sougvinon 2007 165,5 9,9 c 36,5 0,9
9 drebac 2005 54,1 4,5 b 72,0 1,2
10 Vranac 2005 48,5 4,2 ab 73,2 1,1
11 Vranac 2005 55,7 4,2 bc 72,9 0,7
12 Vranac 2005 63,8 5,3 bc 70,0 0,6
13 Vranac 2005 79,3 5,4 c 66,2 0,5
14 Vranac 2004 50,2 4,0 ab 80,0 1,1
15 Vranac 2005 70,3 4,8 bc 70,1 0,9
1
mg malvidin-3-glukozid ekvivalenta /L vina;
2
% polimerne boje = (polimerna boja / gustina boje) x
100;
3
3
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni se znaajno razlikuju
kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05).

Radikal skeviner kapacitet i antioksidativna aktivnost u ispitivanim uzorcima
vina je odreena primenom DPPH metode, koja je detaljno opisana u delu 3.3.2.5. Dobijeni
rezultati su dati u tabeli 4.12. Na osnovu rezultata prikazanih u tabeli 4.12. moe se zakljuiti
da ispitivana vina imaju znatan radikal skeviner kapacitet i znatnu antioksidativnu
aktivnost.
Sposobnost neutralizacije DPPH
radikala (RSC) u ispitivanim crvenim vinima kree

se u intervalu od 74,8 do 87,9%, pri emu je najveu sposobnost pokazalo vino Cabernet
Sauvignon-Tikve, Makedonija. Poreenja radi naveemo podatak da se radikal skeviner
kapacitet hrvatskih crvenih vina kree u intervalu od 72,1 do 82,65 % (Katalini i sar., 2004).
Ukupna antioksidativna aktivnost italijanskih crvenih vina kree se u intervalu od 7,8 do 19,8
mmol TE/L (Simonetti i sar., 1997), dok je za crvena vina june Afrike odreen interval od
9,51 do 12,39 mmol TE/L (De Beer i sar., 2003), to je u skladu sa naim rezultatima (13,10
15,0 mmol TE/L).
118

Antioksidativni potencijal su De Beer i sar. (2003) odreivali da bi napravili razliku
izmeu ispitivanih vina i doveli u vezu antioksidativnu aktivnost i sadraj fenola u njima. Za
pet crvenih vina dobili su da se antioksidativni potencijal kree od 4,73 za vino Ruby
Cabernet do 5,24 za Cabernet Sauvignon. Naa ispitivanja su pokazala da od 15 ispitivanih
crvenih vina najvei antioksidativni potencijal ima vino drepeva krv (5,82), odnosno vino
koje pokazuje najveu antioksidativnu aktivnost u odnosu na sadraj ukupnih fenola.
U mnogim istraivanjima (Muselik i sar., 2007; Lucena i sar., 2010) je dokazan visok
stepen pozitivne korelacije sadraja fenolnih jedinjenja i antioksidativne aktivnosti vina. Da
bi se potvrdila veza izmeu ukupne antioksidativne aktivnosti vina i sadraja ukupnih fenola,
ukupnih flavonoida i monomernih antocijana uraena je korelaciona analiza. Uticaj sadraja
fenolnih jedinjenja na antioksidativnu aktivnost crvenih vina na DPPH radikale, iskazan je
relativno dobrom korelacijom (R
2
=0,85) (slika 4.11). Analiza korelacije izmeu sadraja
ukupnih flavonoida i ukupne antioksidativne aktivnosti ispitivanih vina pokazuje koeficijent
R
2
=0,77 (slika 4.12), dok korelacija izmeu ukupnih monomernih antocijana i ukupne
antioksidativne aktivnosti pokazuje koeficijent R
2
=0,16 (slika 4.13), to se i oekivalo s
obzirom na mali sadraj monomernih antocijana (tabela 4.11) u ispitivanim crvenim vinima.
Sadraj monomernih antocijana u vinu se smanjuje sa vremenom starenjavina u boci zbog
prelaska monomernih antocijana u polimerne.

13.0 13.5 14.0 14.5 15.0
2300
2400
2500
2600
2700
2800
2900
3000
3100
T
P

(
m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)

ispitivanih crvenih vina.

119

Tabela 4.12. Radikal skevener kapacitet (RSC), ukupna antioksidativna aktivnost (TAA)
i antioksidativni potencijal (AP) ispitivanih crvenih vina.

Vino RSC (%) TAA
1
(mmol TE/L) AP
2

1 drepeva krv 77,4 0,9
3
13,5 0,36 5,82 0,72
2 Meas crni 83,7 0,8 14,6 0,48 5,33 0,63
3 Medvea krv 85,9 0,8 15,0 0,48 4,87 0,52
4 Kratoija 83,7 0,3 14,6 0,45 5,21 0,58
5 Merlot 81,8 0,8 14,3 0,47 5,46 0,67
6 Game 80,3 0,7 14,0 0,43 5,25 0,43
7 Cabernet Souvignon 78,5 0,3 13,7 0,46 5,64 0,28
8 Cabernet Sougvinon 87,9 0,2 14,3 0,46 5,00 0,62
9 drebac 74,8 0,2 13,1 0,43 5,51 0,82
10 Vranac 79,5 0,8 13,8 0,52 5,41 0,75
11 Vranac 84,6 0,5 14,7 0,48 5,53 0,67
12 Vranac 82,6 0,4 14,4 0,46 5,71 0,55
13 Vranac 83,8 0,3 14,6 0,38 5,13 0,57
14 Vranac 79,5 0,2 13,8 0,39 5,80 0,39
15 Vranac 86,3 0,7 15,0 0,40 5,28 0,48
1
mmol troloks ekvivalenta /L vina; Ukupna antioksidativna aktivnost je izraena kao ekvivalent
troloksa;
2
AP (antioksidativni potencijal) = TAA (mM trolosa) x 1000 / ukupni fenoli (mg galne
kiseline/L).

120

13.0 13.5 14.0 14.5 15.0
1500
1600
1700
1800
1900
2000
T
F

(
m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)

ispitivanih crvenih vina.

13.0 13.5 14.0 14.5 15.0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
M
A

m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)

Slika 4.13. Grafik korelacije sadraja ukupnih monomernih antocijana i ukupne
antioksidativne aktivnosti ispitivanih crvenih vina.

121

4.1.2.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola, flavan-3-ola i
hidroksicimetnih kiselina u crvenom vinu

Prema Broiillard (1982), u kiseloj sredini (vinu) antocijani se nalaze u pet, dinamiki
uravnoteenih molekulskih oblika: crveno obojeni flavilijum katjoni, ljubiaste hinoidne
baze, hinoidne baze, slabo obojene baze i halkona, to je prikazano na slici 21. Boja i sastav
vina zavise od pH. U normalnim uslovima prisutni su flavilijum katjoni i karbinol baze, dok
se hinoidne baze i halkoni javljaju pri viim temperaturama. Da bi odredili sastav i sadraj
pojedinanih antocijana primenili smo HPLC metodu.
U ispitivanim crvenim vinima identifikovani su i kvantifikovani glukozidi pet antocijana:
malvidina, cijanidina, delfinidina, petunidina i peonidina, a takoe i njihovi acetil i kumaroil
derivati.
Na slici 4.14 je dat hromatogram crvenog vina Vranac. Identifikovano je 18 jedinjenja,
meu kojima je i vitisin A. Vitisin A nastaje tokom alkoholne fermentacije reakcijom
malvidina i piruvinske kiseline, dok reakcijom malvidina i acetaldehida nastaje vitisin B. Ovi
produkti, kao i antocijani, mogu biti acilovani ili mogu formirati polimere sa taninima.

Slika 4.14. HPLC hromatogram antocijana (520 nm) u crvenom vinu Vranac: delfinidin-3-
glukozid (1); cijanidin-3-glukozid (2); petunidin-3-glukozid (3); peonidin-3-glukozid (4);
malvidin-3-glukozid (5); delfinidin-3-acetil-glukozid (6); vitisin A (7); cijanidin-3-acetil-
glukozid (8); petunidin-3-acetil-glukozid (9); Delfinidin-3-kumaroil-glukozid (10); Peonidin-
3-acetil-glukozid (11); malvidin-3-acetil-glukozid (12); cijanidin-3-kumaroil-glukozid (13);
malvidin-3-kumaroil-glukozid-cis (14); petunidin-3-kumaroil-glukozid (15); peonidin-3-p-
kumaroil-glukozid (16); malvidin-3-kumaroil-glukozid (17); malvidin-3-vinilfenol-glukozid
(18).
122

Rezultati odreivanja monomernih antocijana u vinu Merlot (br. 5, godina punjenja
2004., analiza raena krajem 2009.), Vranac (br.11, godina punjenja 2005.) i Vranac (br.15,
godina punjenja 2005.) prikazani su u tabeli 4.13. Iz tabele se moe videti da je njihov sadraj
u ispitivanim crvenim vinima mali, to je u saglasnosti sa starou vina i sa rezultatima za ista
vina dobijenih spektrofotometrijskom analizom (tabela 4.11).
Predhodni rezultati pokazuju da se hemijski sastav vina dosta razlikuje u zavisnosti od
vrste groa, godine branja, starosti vina, razliitih uslova gajenja vinove loze tj. podruja.
Da bi se objasnio uticaj razliite lokacije na sastav vina uraena je uporedna analiza vina
Vranac iz Srbije, Makedonije i Crne Gore iste godine proizvodnje 2009 (uzeta su mlada
vina) HPLC metodom. U tabeli 4.14, dat je sadraj antocijana, flavonola, flavan-3-ola i
hidroksicimetnih kiselina, dok je zastupljenost pojedinih klasa jedinjenja prema ukupnom
sadraju fenolnih jedinjenja odreenom HPLC metodom za ispitivana vina data na slikama
4.15 - 4.17 .
Tabela 4.13. Sadraj antocijana (mg/L)
1,2
u crvenim vinima odreen HPLC metodom.
Vino Merlot (5) Vranac (11) Vranac (15)
Dp-3-glukozid 1,220,02 4,750,20 3,850,09
Cy-3-glukozid 0,130,01 0,430,05 1,270,05
Pt-3-glukozid 1,520,04 4,820,18 5,720,17
Pn-3-glukozid 0,540,02 3,840,11 6,750,21
Mv-3-glukozid 15,470,15 26,520,35 33,290,56
Dp-3-acetil-glukozid 0,760,09 0,260,03 0,280,05
Cy-3-acetil-glukozid 1,090,08 0,140,02 0,380,06
Pt-3-acetil-glukozid 1,260,03 0,280,02 0,290,03
Pn-3-acetil-glukozid nd 0,780,07 1,010,18
Mv-3-acetil-glukozid 7,470,10 2,340,10 4,670,12
Dp-3-kumaroil-glukozid 0,620,05 nd 0,460,09
Cy-3-kumaroil-glukozid 0,260,01 0,100,02 0,280,07
Pt-3-kumaroil-glukozid 0,140,02 0,090,03 0,170,06
Pn-3-kumaroil-glukozid 0,160,02 0,640,05 0,840,12
Mv-3-kumaroil-glukozid 0,870,02 2,680,06 3,110,18
Mv-3-kuma.-glukozid-cis nd 0,360,03 0,430,08
Vitisin A 1,620,08 1,230,10 1,360,06
Mv-3-vinilfenol-glukozid nd 0,070,10 0,210,03
Ukupno 33,13 49,65 64,23
1
2

123

Podaci iz tabele 4.14 i slika 4.15 4.17 ukazuju na veliku zastupljenost antocijana u
mladim crvenim vinima Vranac (66,171,7%). Podaci na slikama 4.15-4.17 pokazuju da
meu antocijanima su najzastupljeniji glukozidi (82,4-84,2%), slede acetil-glukozidi (11,8-
12,7%) i na kraju kumaroil-glukozidi (3,8-5,7%). Najzastupljeniji glukozid je glukozid
malvidina, koji je prisutan sa 60,24% (srednja vrednost) u odnosu na ukupan sadraj
antocijana, najzastupljeniji acetil-glukozid je takoe malvidin-3-acetil-glukozid (9,44% u
odnosu na ukupan sadraj antocijana) i na kraju ista je situacija i sa malvidin-3-kumaroil-
glukozidom (3,87%). Zastupljenost antocijana u ispitivanim uzorcima vina Vranac sledi niz:
Mv-3-G > Mv-3-AG > Pn-3-G > Pt-3-G > Dp-3-G >Mv-3-CG
Sa izuzetkom u vinu Vranac iz Srbije gde je Mv-3-CG > Dp-3-G. Slian niz, sa uoenim
izuzetkom predloen je u referentnoj literaturi (Kallithraka i sar., 2007).
Naeno je da se sadraj flavonola u ispitivanim uzorcima vina Vranac kree u intervalu
od 18,13 do 23,60 mg/L (3,13-4,02% u odnosu na ukupni sadraj odreenih fenolnih
komponenti), to je u skladu sa rezultatima drugih autora. Rodriguez-Delgado i sar. (2002) su
pronali da su u 9 panskih mladih crvenih vina sa razliitog podruja flavonoli prisutni u
intervalu od 10,80 do 32,14 mg/L.
U grkim (Arnous i sar., 2001) i maarskim (Nikfardjam i sar., 2006) crvenim vinima
sadraj flavan-3-ola iznosi 145,9 (n=10), osnosno 182,4 (n=67), dok je u naim crvenim
vinima odreen manji sadraj i on iznosi 113,25 mg/L (n=3). Meutim, crvena vina Vranac
sadre vie hidroksicimetnih kiselina (50,29 mg/L, srednja vrednost) u odnosu na maarska
vina (12,0 mg/L), ali istovremeno manje u odnosu na grka vina (501,6 mg/L).
10.6%
19.9%
66.1%
3.43%
flavonoli
antocijani
flavan-3-oli
cimetne kiseline

a
4.9%
12.7%
82.4%
glikozidi
acetil-glikozidi
kumaroil-glukozidi

b

Slika 4.15. Zastupljenost pojedinih klasa jedinjenja (a) i antocijana u obliku glukozida, acetil
glukozida i kumaroil glukozida (b) u vinu Vranac-Srbija.

124

Tabela 4.14. Sadraj (mg/L)
1
antocijana, flavonola, flavan-3-ola i hidroksicimetnih kiselina u
crvenim vinima odreen HPLC metodom.
vino I II III
Zemlja Srbija Crna Gora Makedonija
Naziv Vranac Grnogorski vranac Makedo. crveno
Vrsta groa Vranac Vranac Vranac, Pinot Noir
Godina 2009 alk. 11,5% 2009 alk. 11,5% 2009 alk. 11,5%
Antocijani
Dp-3-glukozid 10,950,72 18,830,52 20,180,93
Cy-3-glukozid 3,250,41 4,880,11 2,850,06
Pt-3-glukozid 28,530,83 36,510,85 25,620,75
Pn-3-glukozid 29,050,62 36,540,78 30,890,99
Mv-3-glukozid 205,380,98 280,211,36 238,721,52
Vitisin A 10,580,18 9,010,82 8,370,23
Cy-3-acetil-glukozid 1,930,09 2,260,11 2,580,11
Pt-3-acetl-glukozid 5,070,11 4,690,09 3,260,18
Pn-3-acetil-glukozid 2,850,08 2,380,07 3,020,22
Mv-3-acetil-glukozid 32,730,76 45,460,78 36,580,48
Pt-3-kumaroil-glukozid 1,830,23 1,650,05 2,130,08
Pn-3-kumaroil-glukozid 1,120,12 1,380,04 1,490,06
Mv-3-kumaroil-glukozid 13,520,09 14,030,14 18,520,18
Ukupno
2
349,790,40 457,810,44 394,210,45
Flavonoli
Miricetin-3-glukozid
3
2,050,31 1,850,38 2,180,28
Kvercetin-3-glukozid
4
2,950,28 3,150,09 4,790,25
Kvercetin-3-glukuronid
4
7,230,52 9,180,52 8,280,35
Miricetin 2,650,18 1,630,08 2,390,11
Kvercetin 3,250,25 4,250,11 5,960,09
Ukupno 18,130,31 20,060,24 23,600,22
Flavan-3-oli
Katehin 62,050,92 55,380,85 76,780,62
Procijanidin-B2
5
23,780,38 30,280,73 14,500,38
Epikatehin 19,530,72 39,700,28 14,740,18
Ukupno 105,360,67 125,360,62 109,020,39
Hidroksicimetne kiseline
t-kaftarna
6
27,340,53 15,340,62 32,520,57
GRP
6
2,870,28 4,180,18 4,690,32
t-kutarna
7
17,560,18 2,450,18 9,520,25
kafena 3,120,20 6,950,22 1,030,09
p-kumarna 3,960,11 2,810,11 1,520,07
Ferulna 0,980,09 3,620,14 10,430,58
Ukupno 55,830,23 35,350,24 59,710,31
1
2
3
mg miricetin
ekvivaletna /L vina;
4
mg kvercetin ekvivalenta /L vina;
5
mg katehin ekvivalenta /L vina;
6
mg
ekvivalenta kafene kiseline/L vina;
7
mg ekvivalenta p-kumarne kiseline/L vina.

125

5.54%
19.6%
71.7%
3.14%
flavonoli
antocijani
flavan-3-oli
cimetne kiseline

a
3.8%
12%
84.2%
glukozidi
acetil-glukozidi
kumaroil-glukozidi

b

glukozida i kumaroil glukozida (b) u vinu Vranac-Crna Gora.

10.2%
18.6%
67.2%
4.02%
flavonoli
antocijani
flavan-3-oli
cimetne kiseline

a
5.74%
11.8%
82.5%
glukozidi
acetil-glukozidi
kumaroil-glukozidi

b

glukozida i kumaroil glukozida (b) u vinu Makedonsko crveno-Makedonija.

126

belih vina

U tabeli 4.15 prikazan je naziv, sorte groa i podruje proizvodnje ispitivanih belih
vina.
Tabela 4.15. Naziv, sorte groa i podruje proizvodnje ispitivanih belih vina.
Vino Naziv(godina) Sorte groa Podruje
1 Graevina (2007) Italijanski rizling
2 Smederevka (2007) Smederevka Zapadno-
3 Chardonnay (2007) Chardonnay moravski
4 Chardonnay-Terra
Lazarica (2007)
Chardonnay region
5 Mea beli (2007) Chard., Sauvig., M. Otonel
6
7
upski rizling (2003)
Car Konstantin-
Semillon (2003)
Italij.rizling
Semillon
8 Traminac (2004) Traminac Banatski
9 Banatski rizling
(2007)
Ita.rizling, smederevka regiom
10 Muscat Otonel (2007) Muscat Otonel

Za odreivanje sadraja fenolnih jedinjenja i antioksidativne aktivnosti belih vina
koriene su spektrofotometrijska i HPLC metoda.

aktivnosti belih vina

U tabeli 4.16. su prikazani rezultati spektrofotometrijskih odreivanja ukupnih fenola u
10 ispitivanih belih vina. Kako sastav belih vina dosta zavisi i od vremena uvanja u boci, to
e se za dalju analizu u diskusiji uzimati u obzir vina koja su flairana u istoj godini. Od svih
proizvedenih vina u 2007 godini, Mea beli i Terra-Lazarica Chardonnay imaju najvei
sadraj fenolnih jedinjenja (420,6 i 358,0 mg GAE/L), potom slede Banatski Rizling,
Graevina, Chardonnay, Muscat Otonel i na kraju Smederevka. Koliina ukupnih fenola u
vinu Mea beli je signifikantno vea i razliita u odnosu na koliine fenola u ostalim
127

ispitivanim vrstama belih vina. Dobijene vrednosti sadraja ukupnih fenola u ispitivanim
belim vinima proizvedenih u Srbiji su uporedive sa literaturnim podacima datim u tabeli
4.17.

Tabela 4.16. Sadraj ukupnih fenola (TP) i flavonoida (TF) ispitivanih belih vina i njihov
odnos.
Vino Naziv TP
1
(mg GAE/L) TF
2
(mgCE/L) TF/TP
1 Graevina 268,88,0
3
b
4
46,501,16 a 0,17
2 Smederevka 238,36,6 a 45,301,29 a 0,19
3 Chardonnay 253,87,8 ab 46,291,43 a 0,18
4 Chardonnay-T.L. 358,010,2 dc 65,001,86 c 0,18
5 Mea beli 420,612,0 e 81,322,36 d 0,19
6 upski rizling 380,012,1 d 63,991,92 c 0,17
7 Semillon 261,57,8 ab 48,251,38 a 0,18
8 Traminac 270,27,9 b 50,021,55 a 0,18
9 Banatski rizling 330,29,4 c 56,291,66 b 0,17
10 Muscat Otonel 252,07,5 ab 47,881,35 a 0,18
1
mg ekvivalenta galne kiseline/L vina;
2
mg katehin ekvivalenta/L vina;
3
4
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni se znaajno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test

Rezultati spektrofotometrijskog odreivanja sadrja ukupnih flavonoida u belim
vinima, prikazani su takoe u tabeli 4.16. Sadraj ukupnih flavonoida u belim vinima kree
se od 45,30 do 81,32 mg CE/L, pri emu je i u ovom sluaju vino Mea beli bilo najbogatije
flavonoidima, dok je vino Smederevka imalo najmanji sadraj. Statistki parametri ukazuju
da se znaajno razlikuju u pogledu sadraja flavonoida vina Mea beli, Terra-Lazarica
Chardinnay, Banatski Rizling i upski rizling od ostalih belih vina. Meutim, razlike u
pogledu sadraja flavonoida ne postoje izmeu vina Graevina, Smederevka, Chardonnay,
Car Konstantin-Semijon, Traminac i Muscat Otonel. Velki broj istraivanja ukazuju da je
sadraj i sastav flavonoida genetski uslovljen, ali da i uslovi gajenja i kasnija tretiranja groa
pri proizvodnji vina u znaajnoj meri utiu na sadraj flavonoida, to se pokazalo i u ovom
sluaju. Udeo flavonoida u odnosu na sadraj ukupnih fenola belih vina kree se od 0,17 do
0,19, i znatno je manji u odnosu na crvena vina (0,63-0,73, tabela 4.10). Dobijeni rezultati su
u skladu sa rezultatima drugih autora (Katalini i sar., 2004).

128

Tabela 4.17. Literaturni podaci.
Zemlja Ukupni fenoli (mg GAE/L) Literatura
Hrvatska 161-431 (n=15) Katalinic i sar., 2008
Hrvatska 301-402 (n=4) Katalinic i sar., 2004
Hrvatska 231-273 (n=2) Budic-Leto i sar., 2002
Hrvatska
Grka
Grka
panija
panija
Italija
Italija
eka Republika
Juna Afrika
191-652 (n=3)
162-286 (n=12)
213-277 (n=5)
89-407 (n=17)
178-293 (n=5)
170-260 (n=16)
96-146 (n=3)
103-125 (n=7)
242-292 (n=4)
Rastija i sar., 2009
Salacha i sar., 2008
Roussis i sar., 2008
Fernandez-Pachon i sar., 2004
Sanchez-Moreno i sar., 1999
Stevanato i sar., 2004
Simonetti i sar., 1997
Stratil i sar., 2008
De Beer i sar., 2003

Kao to se vidi iz tebele 4.18 analiza radikal skeviner kapaciteta i
antioksidativne aktivnosti, uraena korienjem DPPH radikala upuuje da se procenat RSC
razliitih belih vina kree od 12,73 do 19,05%, odnosno TAA od 0,87 do 1,35 mmol TE/L, i
da je najvea kod vina Mea beli a najmanja kod belog vina Chaedonnay. Uvaavajui
rezultate Duncan-ovog testa viestrukih intervala, jasno se uoavaju razlike u ukupnoj
antnioksidativnoj aktivnosti izmeu ispitivanih belih vina. Katalini i sar. (2004) su odredili
da se RSC hrvatskih belih vina kree od 10,30% za Traminac do 16,16% za belo vino
Maratina. Fernandez-Pachon i sar. (2004) su za 17 panskih belih vina odredili da se
antioksidativna aktivnost kree od 0,30 do 2,68 mmol TE/L, dok su Hner i sar. (2002) za 16
nemakih belih vina odredili da se antioksidativna antivnost kree od 0,2 do 1,9 mmol TE/L,
to je u saglasnosti sa naim rezultatima (0,87 1,35 mmol TE/L).

129

Tabela 4.18. Radikal skevener kapacitet (RSC) i ukupna antioksidativna aktivnost (TAA)
ispitivanih belih vina.
Vino Naziv RSC (%) TAA
1
(mmol TE/L)
1 Graevina 14,00 0,950,02
2
ab
3
2 Smederevka 13,50 0,920,03 a
3 Chardonnay 12,73 0,870,03 a
4 Chardonnay-T.L. 16,30 1,160,05 cd
5 Mea beli 19,05 1,350,06 e
6 upski rizling 18,64 1,290,03 de
7 Semillon 12,83 0,880,03 a
8 Traminac 13,82 0,940,05 a
9 Banatski rizling 16,04 1,100,04 bc
10 Muscat Otonel 14,95 0,990,06 ab
1
mmol troloks ekvivalenta/L vina;
2
3
brojevi oznaeni razliitim
slovima u koloni se znaajno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05).

Analza korelacije izmeu koncentracije ukupnih fenola i antioksidativne aktivnosti
ispitivanih belih vina pokazuje da je koeficijent korelacije 0,938 (slika 4.18), dok je
koeficijent korelacije izmeu koncentracije ukupnih flavonoida i antioksidativne aktivnosti
takoe visok i iznosi 0,938 (slika 4.19), to je u skladu sa rezultatima drugih autora (Hner i
sar., 2002).
0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4
200
250
300
350
400
450
T
P

(
m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)

130

0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
T
F

(
m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)


4.1.3.2. HPLC odreivanje hidroksicimetnih kiselina u belom vinu

Za bela vina je karakteristino prisustvo hidroksicimetnih kiselina. Njihov sadraj je
odreen HPLC metodom. Hidroksicimetne kiseline imaju apsorpcionu traku na =320 nm.
Na slici 4.20 je dat hromatogram za belo vino Banatski rizling.
U ispitivanim belim vinima utvreno je i kvantifikovano prisustvo t-kaftarne kiselne,
GRP, t-kutarne, kafene i p-kumarne kiseline. U poreenju sa ostalim kvantifikovanim
jedinjenjima, svojim sadrajem se istie t-kaftarna kiselina (tabela 4.19), sledi t-kutarna,
kafena i na kraju p-kumarna. Nai rezultati su u saglasnosti sa rezultatima drugih autora.
Kallithraka i sar. (2009b) su u 11 belih grkih vina odredili da sadre: kafenu kiselinu (0,55
mg/L), p-kumarnu (0,18), kaftarnu (29,62), kutarnu (4,36) i ferulnu (0,32) kiselinu.

131

Tabela 4.19. Sadraj (mg/L)
1
hidroksicimetnih kiselina u belim vinima
1
srednja vrednost SD (n=3).,
2
mg ekvivalenta kafene kiseline/L vina.,
3
mg ekvivalenta p-
kumarne kiseline/L vina.

Slika 4.20. HPLC hromatogram (320 nm) hidroksicimetnih kiselina u belom vinu Banatski
rizling: t-kaftarna kiselina(1); GRP (2); t- kutarna kiselina(3); kafena kiselina (4) i p-
kumarna kiselina (5).

Vino Kafena
kiselina
p-kumarna
kiselina
t-kaftarna
kiselina
2
t-kutarna
kiselina
3
GRP
2
Chardonnay
Bant.rizling
Graevina
Traminac
Semillon
1,570,18
3,390,65
2,270,82
7,700,98
3,880,80

nd
0,620,09
0,710,08
2,020,65
1,720.06
14,711,05
43,531,51
21,961,20
7,560,85
nd
2,660,74
5,740,76
3,710,90
1,360,53
1,210,22
1,130,15
2,390,35
nd
1,910,48
4,140,52
132

aktivnosti vinje

Za odreivanje sadraja polifenola, metalnih jona i antioksidativne aktivnosti
koriene su tri sorte vianja: Marela, Ciganica i Oblainska vinja. Analiza je vrena
primenom spektrofotometrijske, HPLC i ICP-OES metoda.

aktivnosti vinje
U tabeli 4.20 su prikazani rezultati spektrofotometrijskog odredjivanja ukupnih fenola,
ukupnih flavonoida, ukupnih antocijana i antioksidativne aktivnosti ekstrakata vinji
(dobijenih po proceduri datoj u delu 3.3.1.1) za tri sezone 2008., 2009. i 2010. Dobijeni
rezultati preraunati su na masu polaznog uzorka.
Tabela 4.20. Sadraj ukupnih fenola(TP), ukupnih flavonoida (TF),ukupnih antocijana (TA) i
ukupne antioksidativne aktivnosti (TAA) ispitivanih sorti vinjanja.

Sorta 2008 2009 2010
TP
1

mg GAE/100g
sv.v.
Marela
Oblainska
Ciganica
72,050,45
5
c
6
,c
7
87,831,82 c,a 78,981,70 c,b
140,763,04 a,b 159,033,97 a,a 146,122,80 a,b
91,020,52 b,c 122,103,60 b,a 112,834,62 b,b
TF
2

mg CE/100g
sv.v.
Marela
Oblainska
Ciganica
65,511,64 b,a 65,992,86 c,a 64,382,15 c,a
75,580,79 a,c 124,510,82 a,a 110,876,55 a,b
75,861,13 a,b 87,821,84 b,a 93,705,40 b,a
TAA
3
mgC3GE/100g
sv.v.
Marela
Oblainska
Ciganica
39,021,28 b,b 48,241,67 b,a 45,241,11 c,a
54,142,06 a,c 64,430,57 a,b 81,551,78 a,a
55,761,24 a,c 62,300,98 a,b 66,721,55 b,a
TAC
4

mmol TE/100g
sv.v.
Marela
Oblainska
Ciganica
3,120,08 b,ab 3,360,11 b,a 2,870,10 b,b
3,470,07 a,a 3,800,18 ac,a 3,400,04 a,a
3,490,13 a,a 3,510,08 cb,a 3,000,16 b,b
sv.v.-svee voe,
1
mg ekvivalenta galne kiseline/100 g sveeg voa;
2
mg katehin ekvivalenta/100 g
sveeg voa;
3
mg cijanidin-3-glukozid ekvivalenta/100 g sveeg voa;
4
mmol troloks ekvivalenta/100
g sveeg voa;
5
6
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni (za jednu
grupu jedinjenja) se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala,
(p<0,05);
7
brojevi oznaeni razliitim slovima u redu (za jednu grupu jedinjenja i jednu sortu vinje u
razliitim godinama branja) se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih
intervala, (p<0,05).
133

Analizom dobijenih rezultata moe se uoiti da se sadraj ukupnih fenola u uzorcima
vinji menja u zavisnosti od vrste vinje i godine branja i kree se u granicama od 87,83 mg
GAE/100g sveeg voa (sv.v.) u vinji Marela do 159,03 mg GAE/100g sv.v. u Oblainskoj
vinji za 2009. godinu, kada su zabeleene najvee vrednosti.
Kao to se vidi iz tabele 4.20. isti je sluaj i kod ukupnih flavonoida, pa se moe rei
da je sadraj flavonoida u uzorku Oblainske vinje vea u odnosu na preostale vrste vinji.
Naime, najvei sadraj ukupnih flavonoida naena je u Oblainskoj vinji (124,51 mg
CE/100 g sv.v., za 2009.godinu) to odgovara i najveem sadraju polifenola u ovoj vrsti
vinje.
razlike u sadraju ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim vrstama vinje tokom iste sezone,
odnosno jedne sorte vinje u tri razliite sezone. Poznato je da na sadraj polifenolnih
jedinjenja utie genotip, mesto i tehnika gajenja, kao i razlike u zrelosti voa. Takoe
spoljanji faktori poput svetlosti, temperature, prisustvo hranljivih materija u zemljitu mogu
uticati na sastav polifenolnih jedinjenja. Rezultati ispitivanja sadraja ukupnih fenola u vinji
gajenoj u Srbiji uglavnom su slini sa podacima koji se mogu nai u referentnoj literaturi.
Sadraj polifenola u hrvatskoj vinji Maraska i Ciganica iznose 78,0 i 144,7 mg GAE/100g
sv.v. (Dradovi-Uzelac i sar., 2007), dok se u amerikim ova vrednost kree od 92,1 do
312,4 mg GAE/100g sv.v. (Kim i sar., 2005).
to se tie analize koncentracije monomernih antocijana po pH diferencijalnoj metodi
(opisanoj u delu 3.3.2.3), takoe se primeuje da Oblainska vinja ima vee vrednosti
koncentracije u odnosu na ostale dve vrste vinji. Sadraj monomernih antocijana se kree od
45,24 do 81,55 mg C3GE/100g sv.v., pri emu je ekstrakt Marele bio najsiromaniji
antocijanima. Kim i sar. (2005), ispitujui sadraj antocijana u etiri sorte vianja pokazali su
da se sadraj antocijana u njima kree u intervalu od 49,1 do 109,2 C3GE/100g sv.v.
Metoda na DPPH
radikale je primenjena za odreivanje antioksidativne aktivnosti

ekstrakata ispitivanih vrsta vinji. Dobijeni rezultati su predstavljeni u tabeli 4.20. Najveu
antioksidativnu vrednost pokazuje Oblainska vinja, sledi vinja Ciganica i na kraju vinja
Marela. Vrste koje pokazuju znatnu antioksidativnu aktivnost imaju i veliki sadraj ukupnih
fenola. Uvaavajui rezultate Duncan-ovog testa viestrukih intervala, jasno se uoavaju
znaajne razlike u antioksidativnoj aktivnosti izmeu Oblainske vinje i drugih ispitivanih
vrsta. Uporeenja radi, naveemo samo podatak da su Dragovi-Uzelac i sar. (2007) nali
da Maraska i Ciganica imaju vrednosti za TAA od 4,3 i 3,2 mmol TE/100g sv.v.

134

4.1.4.2. HPLC odreivanje antocijana i hidroksicimetnih kiselina u vinji

HPLC metoda je primenjena za kvalitativno i kvantitativno odreivanje antocijana i
hidroksicimetnih kiselina. Za ovo odreivanje koriena je metoda direktnog injektovanja
uzorka ekstrakata vinji. Na slici 4.21 prikazan je HPLC hromatogram ekstrakta Oblainske
vinje (berba 2010.).
Antocijani prisutni u uzorcima vinji su identifikovani poreenjem njihovih retencionih
vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom standarda za cijanidin-3-glukozida i
literaturnih podataka (Blano i sar., 2004).
U ekstraktima vinji odreeno je prisustvo i kvantifikovano etiri antocijanina: (1)
cijanidin-3-soforozid, (2) cijanidin-3-glukozil-rutinozid, (3) cijanidin-3-glukozid, (4)
cijanidin-3-rutinozid, to je u saglasnosti sa rezultatima Blando i sar. (2004). Meutim, neki
autori su pored derivata cijanidina nali jo i peonidin-3-glukozid (Kirakosyan i sar., 2009),
peonidin-3-rutinosid (Kim i sar., 2005), odnosno pelargonidin-3-glukozid i pelargonidin-3-
rutinozid (Pedesi i sar., 2010). Sadraj identifikovanih antocijana odreen HPLC metodom
prikazan je u tabeli 4.36. Sadraj monomernih antocijana u vinjama se kree od maksimalne
vrednosti 79,31 mg/100 g sv.v., koliko iznosi za Oblainsku vinju, do 40,03 mg/100 g sv.v.
za vinju Marelu. Iz tabele se moe uoiti da u svim uzorcima vinji, najzastupljeniji
antocijanin je cijanidin-3-glukozil-rutinozid. Sadraj antocijana u vinjama, odreen od
strane gore pomenutih autora kretao se od 45,57 do 98,64 mg/100g sv.v., pri emu je u svim
sluajevima cijanidin-3-glukozil-rutinozid bio najzastupljeniji antocijan.
Slika 4.21. HPLC hromatogram (520 nm) antocijanina u ekstraktu Oblainske vinje : (1)
cijanidin-3-soforozid, (2) cijanidin-3-glukozil-rutinozid, (3) cijanidin-3-glukozid, (4)
cijanidin-3-rutinozid.

135

Na slici 4.22 je dat hromatogram za ekstrakt Oblainske vinje (berba 2010) snimljen
na 320 nm. HPLC hromatogram prikazuje hidroksicimetne kiseline prisutne u uzorcima
vinji. Ove kiseline su identifikovane poreenjem njihovih retencionih vremena i spektara sa
retencionim vremenom i spektrom halogenske kiseline, p-kumarne i ferulne kiseline (Prilog,
slike 9.11-9.14).
Rezultati odreivanja hidroksicimetnih kiselina HPLC metodom u ispitivanim
vrstama vinje prikazani su u tabeli 4.21. Rezultati u tabeli pokazuju da najvei sadraj
hidroksicimetnih kiselina ima Oblainska vinja (17,23 mg/100 g sv.v.), sledi Marela (13,62
mg/100 g sv.v.) i na kraju Ciganica (11,82 mg/100 g sv.v.), pri emu je neohlorogenska
kiselina prisutna u najveoj koliini (9,37-12,64 mg/100g sv.v., odnosno 73,36-79,43%). Kim
i sar. (2005) su odredili sardaj hidroksicimetnih kiselina u 4 sorte vinji od 16,57 do 33,63
mg/100g sv.v., a procenat uea neohlorogenske kiseline kretao se od 40,67 do 89,58%.

Tabela 4.21. Sadraj (mg/100g sveg voa) antocijana i hidroksicimetnih kiselina u
ekstraktima vinjanja.
Marela Oblainska Ciganica
Antocijan
1
Cy-3-soforozid

Cy-3-glukozil-rutinozid

Cy-3-glukozid

Cy-3-rutinozid

4,930,22
4
2,960,18 8,130,36
24,730,72 62,091,95 38,421,35
0,880,09 1,310,10 1,240,11
9,490,52 12,950,78 17,131,02
Hidroksicimetne kiseline
neohlorogenska kiselina
2
derivat p-kumarne kis.
3
p-kumarna kiselina
ferulna kiselina
10,510,83 12,640,65 9,370,88
1,050,12 1,730,08 1,540,20
1,220,09 2,080,05 0,580,11
0,840,05 0,780,02 0,330,02
1
mg cijanidin-3-glukozid ekvivalenta/100 g sveeg voa;
2
mg ekvivalenta hlorogenske kiseline/100 g
sveeg voa;
3
mg ekvivalenta p-kumarne kiseline/100 g sveeg voa;
4

136

Fig. 4.22. HPLC hromatogram (320 nm) hidroksicimetnih kiselina u ekstraktu Oblainske
vinje: (1) neohlorogenska kiselina, (2) derivat p-kumarne kiseline, (3) p-kumarna kiselina,
(4) ferulna kiselina.

4.1.4.3. Promene sadraja fenolnih jedinjenja u vinji tokom zrenja

Na slici 4.23. prikazane su promene ukupnih fenola Oblainske vinje tokom zrenja
za uzorke ove vrste vinje branih u 7 razliitih faza zrenja tokom 2008, 2009 i 2010 godine.
Uoava se poveanje sadraja ukupnih fenola tokom zrenja. Sa slike se takoe moe uoiti da
se tokom prvih faza branja moe desiti da doe do opadanja ukupnog sadraja fenola. Fenoli
su veoma kompleksna jedinjenja ija se biosinteza odvija tokom celog perioda zrenja voa,
pri emu dolazi do degradacije jednih i sinteze drugih jedinjenja to uslovljava promene u
sastavu i koliini fenolnih jedinjenja. Poveanje sadraja polifenola tokom zrenja uoili su i
drugi autori (Kallay i sar., 2008; Pedesi i sar., 2007).
137

Slika 4.23. Promene sadraja ukupnih fenola tokom zrenja Oblainske vinje u : 2008; :
2009; i : 2010 godini.

Antocijani spadaju u one fenolne komponente koji se stalno stavaraju tokom zrenja,
pa se njihova koliina konstantno poveava, pri emu je zabeleeno naglo poveanje u
kasnijim fazama zrenja. Pri tome su zabeleene i izvesne anomalije u pogledu promena
sadraja antocijanina u vinji (3 i 4 faza branja, slika 4.24). Poloaj voa na stablu moe biti
uzrok ove anomalije. Voe na stablu izloeno suncu bre sazreva od voa unutar kronje
stabla. Pored toga i klimatski uslovi i period branja znatno utiu na sadraj antocijana u vou.
Najvee naglo poveanje sadraja ukupnih antocijanina je zabeleeno u 2010. godini, to se
objanjava najveom prosenom temperaturom u drugoj dekadi juna 2010. godine (tabela
4.22), odnosno, najpovoljnijim uslovima za biosintezu antocijana.

Tabela 4.22. Prosene temperature po dekadama u aprilu, maju i junu 2008, 2009 i 2010.
Sezona

April Maj Jun
I dekada II dekada I dekada II dekada I dekada II dekada
2008 10,4 13,7 12,8 17,3 18,5 20,7
2009 12,9 12,0 17,6 14,3 20,7 21,6
2010 12,9 12,0 17,1 13,9 19,0 24,5
Podaci Meteoroloke stanice, Knjaevac
1 2 3 4 5 6 7
100
110
120
130
140
150
160
TP
Faze zrenja
2008
2010
2009
138

Slika 4.24. Promene sadraja ukupnih antocijanina tokom zrenja Oblainske vinje u :
2008; : 2009; i : 2010 godini.

Generalno antioksidativna aktivnost raste tokom zrenja (slika 4.25), meutim, izmeu
antioksidativne aktivnosti i ukupnih fenola, kao i ukupnih antocijanina ne postoji direktna
korelacija, to se moe uoiti uporeenjem slika 4.23,4.24 i 4.25. Tokom zrenja razliiti
fenoli se sintetizuju, a oni imaju razliite antioksidativne aktivnosti, pa samim tim intenzitet
promene antioksidativne aktivnosti nee uvek pratiti intenzitet promene sadraja ukupnih
fenola.

slika 4.25. Promene antioksidativne aktivnosti tokom zrenja Oblainske vinje u : 2008; :
2009; i : 2010 godini.
1 2 3 4 5 6 7
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
TAA
Faze zrenja
2008
2010
2009
1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
TA
Faze zrenja
2008
2009
2010
139

HPLC metoda je iskoriena i za ispitivanje sezonskih promena sadraja pojedinanih
antocijana i hidroksicimetnih kiselina tokom zrenja. Sadraj cijanidin-3-glukozil-rutinozida i
cijanidin-3-rutinozida, kao najzastupljenijih antocijana se stalno poveava tokom zrenja (slika
4.26), pri tome se sadraj prvog antocijanina poveao za 3,2 puta, a drugog za 4,9 puta.
Pedesi i sar.. (2010) su u sluaju vinje Maraske gajene u u regionu Zadra nali da se
sadraj cijanidin-3-glukozil-rutinozida, u toku 4 faze zrenja poveao samo 1,05 puta a
cijanidin-3-rutinozida 3,3 puta, dok se u istoj sorti vinje gajene u regionu Splita, sadraj
cijanidin-3-glukozil-rutinozida poveao 4,8 a cijanidin-3-rutinozida 1,6 puta. Nai i rezutati
drugih autora potvruju da je sastav antocijana bitno uslovljen klimatskim uslovima podruja
na kome je gajeno voe i vremenom branja. Meutim, sadraj neohlorogenske kiseline se
smanjuje tokom zrenja. Ovaj podatak je i u ovom sluaju u skladu sa literaturnim podacima.
Hkkinen (2000) je u svojoj doktorskoj disertaciji naveo podatak da je koncentracija
hidroksicimetnih kiselina velika u zelenom vou, da naglo opada a zatim znatno sporije
tokom zrenja i skladitenja voa.

1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60
70
m
g
/
1
0
0
g

Faze zrenja

Slika 4.26. Promene sadraja cijanidin-3-glikozil rutinozida (), cijanidin-3-rutinozida () i
neohlorogenske kiseline () tokom zrenja.

140

4.1.4.4. I CP-OES odreivanje metala u vinji

U plodovima voa ima razliitih minerala koji se preteno nalaze u obliku soli
organskih kiselina. Ukupna koliina mineralnih materija u vou kree se od 0,15 do 0,80%, a
vinja sadri oko 0,50% mineralnih materija.
U tabeli 4.6. prikazane su odabrane talasne duine za svaki element, koeficijent
korelacije i granice detekcije i kvantifikacije c
L
i c
Q
za odreivane elemente.
Elementi koji su identifikovani i kvantifikovani u tri sorte vinje, odnosno u Oblainskoj
vinji, Mareli i Ciganici, mogu se podeliti na makroelemente (tabela 4.23) i mikroelemente
(tabela 4.24). Od makroelemenata kalijum je najzastupljeniji u svim uzorcima, za njim slede
natrijum i kalcijum, dok se magnezijum nalazi u manjoj koliini. Koliine kalijuma i
kalcijuma direktno utiu na kvalitet i uvanje plodova. Najvea vrednost kalijuma je
pronaena u Oblainskoj vinji. Ispitivane sorte vinji ne pokazuju signifikantne razlike u
pogledu sadraja kalcijuma i magnezijuma. U naim vinjama pronaene su manje koliine
K, Ca i Mg (124,20; 9,14 i 7,90 mg/100g sv.v.) a neto vee koliine Na (10,75) u odnosu na
maarske (227,09; 48,46; 18,70 i 6,25 mg/100g sv.v.)(Papp i sar., 2008).
Tabela 4.23.Sadraj maktoelemenata (mg/100g sveeg voa)
1
u uzorcima vinje.
Metal Sorta
vinje
Koliina
u uzorku
Dodato odreeno

Rikaveri
(%)
Na Ob 11,31 0,26 ac
2
5,00 16,90 0,18 ac 105
Ma 8,48 0,14 b 5,00 13,20 0,12 b 97
Ci 12,45 0,35 c 5,00 17,10 0,28 c 97
K Ob 156,96 3,07 a 50,00 210,50 4,10 a 102
Ma 117,13 1,69 b 50,00 160,201,20 b 94
Ci 98,53 1,48 c 50,00 141,62 1,52 c 93
Ca Ob 9,14 0,66 a 5,00 13,92 0,58 a 98
Ma 9,12 0,19 a 5,00 13,80 0,22 a 96
Ci 9,16 0,26 a 5,00 13,74 0,18 a 95
Mg Ob 7,62 0,12 a 5,00 13,12 0,16 a 107
Ma 8,16 0,22 a 5,00 13,32 0,28 a 102
Ci 7,93 0,27 a 5,00 12,74 0,22 a 98
1
2
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni se signifikantno razlikuju
kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05). Ob-Oblainska, Ma-Marela, Ci-
Ciganica.
141

Tabela 4.24.Sadraj mikroelemenata (g/100 g sveeg voa)
1
u uzorcima vinje.
Metal Sorta
vinje
Koliina u
uzorku
Doda-
to
Odreeno

Rikaveri
(%)
Fe Ob 807,99 3,52ab
2
300 1150,22 3,22ab 105
Ma 848,26 9,63b 300 1198,76 9,08b 106
Ci 630,66 4,28c 300 940,88 3,98c 102
Cu Ob 99,29 1,23a 30 124,22 1,08a 95
Ma 68,09 3,14b 30 97,10 2,86b 98
Ci 55,56 4,20c 30 84,66 3,80c 98
Zn Ob 71,69 1,20a 30 103,06 1,08a 102
Ma 53,46 2,35b 30 85,66 1,88b 104
Ci 65,09 2,63c 30 96,50 2,22c 102
Mn Ob 55,86 1,82a 30 84,22 2,02a 97
Ma 42,47 2,36b 30 73,44 2,56b 102
Ci 46,19 1,28b 30 77,20 1,68b 102
Cr Ob 10,59 0,32a 5 14,88 0,22a 93
Ma 6,86 0,17b 5 11,48 0,24b 94
Ci 6,09 0,09b 5 10,98 0,19b 98
Cd Ob 0,09 0,01a 1 1,10 0,03a 111
Ma 0,06 0,00b 1 1,07 0,05b 117
Ci 0,39 0,02c 1 1,42 0,03c 108
Co Ob 1,43 0.03a 3 4,34 0.04a 94
Ma 1,23 0,02b 3 4,22 0,08b 99
Ci 6,96 0,05c 3 10,08 0,12c 102
Pb Ob 3,46 0,28a 3 6,58 0,22a 103
Ma 6,93 0,62b 3 10,08 0,58b 102
Ci 7,19 0,42b 3 10,48 0,48b 104
Ni Ob 6,06 0,33a 3 8,88 0,28a 97
Ma 2,93 0,21b 3 6,12 0,22b 106
Ci 6,06 0,41a 3 9,40 0,28b 106
1
2
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni se signifikantno razlikuju
kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05). Ob-Oblainska, Ma-Marela, Ci-
Ciganica.
Mikroelementi imaju veoma vanu ulogu u mnogim procesima. Oni imaju znaajnu
ulogu u razmeni materija, a utiu i na obrazovanje proteina i ugljenih hidrata i njihove
transformacije u plodovima, porast plodova, ubrzavaju obrazovanje vitamina C i fotosintezu.
Iz tabele 4.24. se vidi da su vinje bogat izvor esencijalnih elemenata kao to su: gvoe,
142

bakar, cink i mangan. Teki metali, koji mogu imati toksine efekte, poput olova i
kadmijuma, prisutni su u vrlo malim koliinama. U pogledu sadraja najzastupljenijih
mikroelemenata vinje sa naeg podruja sadre znatno vie gvoa (762,30 u odnosu na 283
g/100g sv.v.), manje bakra (74,31 u odnosu na 175 g/100g sv.v.) i uporedive koliine cinka
(63,41 u odnosu na 70,0 g/100g sv.v.) u odnosu na vinje iz Maarske.
Zastupljenost makro i mikroelemenata u ispitivanim uzorcima vinji prikazana je na
slikama 4.27, 4.28 i 4.29.

0.567%
4.09%
4.91%
84.3%
6.08%
Na
K
Ca
Mg
mikroelementi

a
2.05%
5.29%
6.79%
9.4%
76.5%
Fe
Cu
Zn
Mn
ostali

b

Slika 4.27. Zastupljenost makro- (a) i mikroelemenata (b) u Oblainskoj vinji.
0.718%
5.67%
6.34%
81.4%
5.89%
Na
K
Ca
Mg
mikroelementi

a
2.1%
4.1%
5.26%
6.58%
82%
Fe
Cu
Zn
Mn
ostali

b

Slika 4.28. Zastupljenost makro- (a) i mikroelemenata (b) u Mareli.

143

0.639%
6.15%
7.1%
76.4%
9.66%
Na
K
Ca
Mg
mikroelementi

a
3.24%
5.6%
7.9%
6.74%
76.5%
Fe
Cu
Zn
Mn
ostali

b

Slika 4.29. Zastupljenost makro- (a) i mikroelemenata (b) u Ciganici.

144

komercijalnih sokova

Konzumiranje vinje u sveem stanju je mogue poetkom leta, kada sazreva, a tokom
godine se u ishrani koristi u zamrznutom stanju ili u vidu mnogobrojnih preraevina, kao to
su emovi, kompoti, sokovi i vona vina. S obzirom da se od svih preraevina najvie
koriste sokovi, to su predmet naeg daljeg rada bili komercijalni sokovi od vianja tri razliita
proizvoaa. Sastav fenolnih komponenti komercijalnih sokova od vianja uporeen je sa
sastavom komercijalnih sokova od crnog groa i crne ribizle, takoe tri razliita
proizvoaa. Prema deklaraciji proizvoaa komercijalni sokovi su sadrali min. 50, odnosno
52% voa.
Za odreivanje sastava i sadraja polifenolnih jedinjenja i antioksidativne aktivnosti
ispitivanih komercijalnih sokova koriene su spektrofotometrijska i HPLC metoda.

aktivnosti komercijalnih sokova

Rezultati spektrofotometrijskog odreivanja sadraja ukupnih fenola u komercijalnim
sokovima vinje, crne ribizle i crnog groa, prikazani su u tabeli 4.25. Dobijeni rezultati
preraunati su na zapreminu polaznog uzorka. Najmanji sadraj ukupnih fenola odreen je u
komercijalnim sokovima crnog groa (2182,10 2480,17 mg GAE/L), neto vei u
komercijalnih sokovima vinje (2329,97 2258,77 mg GAE/L), dok je najvei odreen u
komercijalnim sokovima crne ribizle (2698,64 2813,05 mg GAE/L). Ovo je u skladu sa
rezultatima Piljac-egarac i sar. (2009) koji su u komercijalnom soku crne ribizle (sa 25%
voa) odredili znatno vei sadraj ukupnih fenola (1919,8 mg/L) u odnosu na komercijalni
sok vinje (sa 40% voa, 1106,2 mg/L), odnosno, rezultatima Bermudez-Soto i Tomas-
Barberana (2004) koji su za komercijalne koncentrat sokove crnog groa, vinje i crne
ribizle dobili vrednosti od 11600, 13500 i 23400 mg/L fenola.

145

Tabela 4.25. Sadraj ukupnih fenola (TP), flavonoida (TF) i antocijana (TA) u komercijalnim
sokovima.
Sok

Br.
Uzorka
TP
1
(mg GAE/L)

TF
2
(mg CE/L) TA
3
(mg C3GE ili
mg M3GE/L)

Vinja
1
2
3
2329,9784,96
4
abd
5
,a
6
2480,1722,15 a,a

2428,4353,30 ac,a

510,1015,66 a,a
580,1660,20 ab,a
618,057,53 b,b
261,6116,11 a,a
503,1819,35 b,b
430,0917,71 c,c

Crna
ribizla
1
2
3
2698,6343,29 b,a
2750,0728,48 b,ab
2813,0532,21 b,a
888,9516,33 c,a
938,2813,40 c,b
975,0912,87 c,b
757,3649,93 d,a
871,0314,09 e,dc
920,9210,86 e,c

Crno
groe
1
2
3
2258,7752,18 cd,a
2182,1022,64 d,a
2250,3247,74 d,a
405,2439,55 d,a
322,129,27 d,b
378,096,77 d,ab
256,4314,10 a,a
148,926,21 f,b
220,653,97 af,c
1
mg ekvivalenta galne kiseline/L soka;
2
mg katehin ekvivalenta/L soka;
3
mg cijanidin-3-glukozid (ili
malvidin-3-glukozid za sokove od crnog groa) ekvivalenta/L soka;
4

5
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni (za sve ipitivane sokove) se signifikantno razlikuju kada
se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05);
6
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni
za sokove od istog voa se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala,
(p<0,05).

Rezultati spektrofotometrijsog odreivanja sadraja ukupnih flavonoida u ispitivanim
komercijalnim sokovima, takoe su prikazani u tabeli 4.25. Statistiki parametri ukazuju na
to da se sokovi vinje znatno razlikuju od sokova crne ribizle i crnog groa. Meutim, ako
se razlike razmatraju na nivou iste vrste soka, razlike su znatno manje izraene. Ovo
potvruje podatak, do koji su doli drugi autori, da je u prvom redu sadraj flavonoida
genetski uslovljen. Slini rezultati su dobijeni za sadraj ukupnih antocijana, koji je odreen
spektrofotometrijskom singl pH metodom, s tom razlikom to su sada mnogo vie izraene
razlike izmeu uzoraka sokova jedne vrste voa. Sadraj antocijana je dakle mnogo vie
uslovljen uslovima gajenja i vremenom branja voa. Tokom sazrevanja voa, kao to smo
pokazali, koncentracija antocijana se poveava do pune zrelosti, a poinje da opada u fazi
prezrelosti. Ova pravilnost vai za veinu voa i regiona, s tim to maksimalne koliine
antocijana variraju od vrste voa, od klime i okruenja.
Ispitivanja antioksidativne antivnosti ispitivanih komercijalnih sokova (slika 4.30) su
pokazala da najveu antioksidativnu aktivnost pokazuju sokovi crne ribizle, zatim sokovi
vinje i na kraju sokovi crnog groa. Sokovi koji pokazuju znatnu antioksidativnu aktivnost
imaju i veliki sadraj ukupnih fenola. Piljac-egarac i sar. (2009) su za sok vinje odredili
vrednost od 3,60 mmol TE/L, dok je za komercijalni sok crne ribizle odreena vrednost od
5,68 mmol TE/L.
146

Slika 4.30. Antioksidativna aktivnost ispitivanih vrsta komercijalnih sokova. Sokovi oznaeni
razliitim slovima se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih
intervala (p<0,05).

Da bi se potvrdila veza izmeu antioksidativne aktivnosti sokova i sadraja ukupnih
fenola i ukupnih antocijana uraena je korelaciona analiza. Analiza je pokazala visoku
korelaciju izmeu ukupnih fenola (R
2
=0,992) i ukupne antioksidativne aktivnosti (slika 4.31),
kao i izmeu ukupnih antocijana (R
2
=0,994) i ukupne antioksidativne aktivnosti (slika 4.32),
to je u dobroj saglasnosti sa drugih autorima (0,93 i 0,95, Bermudez-Soto i Tomas-Barberan,
2004).
6 8 10 12 14 16
2100
2200
2300
2400
2500
2600
2700
2800
2900
T
P

(
m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)

ispitivanih komercijalnih sokova.
147

6 8 10 12 14 16
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
T
A

(
m
g
/
L
)
TAA (mmol/L)

Slika 4.32. Grafik korelacije sadraja ukupnih antocijana i ukupne antioksidativne aktivnosti
ispitivanih komercijalnih sokova.

4.1.5.2. HPLC odreivanje antocijana i hidroksicimetnih kiselina u
komercijalnim sokovima

Za odreivanje antocijana i hidroksicimetnih kiselina HPLC metodom koriena je
metoda direktnog injektovanja predhodno profiltriranih uzoraka komercijalnih sokova.
U tabeli 4.26. prikazani su rezultati odreivanja antocijana HPLC metodom u uzorcima
komercijalnih sokova vinje, crne ribizle i crnog groa. Antocijani prisutni u uzorcima su
identifikovani poreenjem njihovih retencionih vremena i spektara na hromatogramu (slika
4.33) sa retencionim vremenima i spektrima na hromatogramu standard i na osnovu
literaturnih podataka.
U komercijalnim sokovima vinje identifikovana su i kvantifikovana tri glikozida
cijanidina, i to cijanidin-3-glukozil-rutinozid, cijanidin-3-glukozid i cijanidin-3-rutinozid, s
obzirom da prvi pik, koji je identifikovan kao cijanidin-3-soforozid nije kvantifikovan zbog
malog sadraja. U sokovima crvene ribizle identifikovana su i kvantifikovana po dva
glikozida cijanidina i delfinidina, dok su u sokovima crnog groa pored vitisina A odreeni
glukozidi pet antocijana: delfinidina, cijanidina, peonidina, petunidina i malvidina.
Najzastupljeniji antocijan u soku vinje je cijanidin-3-glukozil-rutinozid (zastupljen sa 79,44
- 83,84%), u soku crne ribizle delfinidin-3-rutinozid (zastupljen sa 52,40 - 54,74%), dok je u
soku crnog groa najzastupljeniji malvidin-3-glukozid (zastupljen sa 42,66 - 46,04%).
Jakobek i sar. (2007) su odredili da je u prirodnom soku vinje cijanidin-3-glukozil-rutinozid
zastupljen sa 61,4%, dok je u soku crne ribizle delfinidin-3-rutinozid zastupljen sa 43,9% a
cijanidin-3-rutinozid sa 36,0%.
148

a)
b)
c)
Slika 4.33. HPLC hromatogram (520nm) u soku a) vinje: cijanidin-3-glukozil-rutinozid (1);
cijanidin-3-glukozid (2); cijanidin-3-rutinozid; b) crne ribizle: delfinidin-3-glukozid (1);
delfinidin-3-rutinozid (2); cijanidin-3-glukozid (3); cijanidin-3-rutinozid (4) i c) crnog
groa: delfinidin-3-glukozid (1); cijanidin-3-glukozid (2); petunidin-3-glukozid (4);
malvidin-3-glukozid (5); delfinidin-3-acetil-glukozid (6); vitisin A (7).

149

Tabela 4.26. Sadraj antocijana i procenat njihove zastupljenosti u ispitivanim
komencijalnim sokovima .
Sok Sadraj
1
mg/L (%)
Vinja 1 2 3
Cy-3-glukozil-
rutinozid
2

Cy-3-glukozid

Cy-3-rutinozid
2

Ukupno

186,790,98(79,44)

6,440,08 (2,74)

41,890,92 (17,82)

235,12 (100,00)
227,881,03 (83,02)

6,430,05 (2,34)

40,180,08 (14,64)

274,49 (100,00)
208,641,72 (83,84)

7,580,21 (3,05)

32,640,52 (13,11)

248,85 (100,00)
Crna ribizla 1 2 3
Dp-3-glukozid
2

Dp-3-rutinozid
2

Cy-3-glukozid

Cy-3-rutinozid
2

Ukupno
55,221,17 (12,67)

238,491,37(54,74)

17,630,11 (4,06)

124,300,96(28,53)

435,64 (100,00)
48,521,08 (10,06)

252,682,01(52,40)

22,350,15 (4,64)

158,650,88 (32,90)

482,20 (100,00)
68,521,35 (13,36)

272,361,75(53,12)

18,930,09 (3,69)

152,921,05 (29,83)

512,73 (100,00)
Crno groe
Dp-3-glukozid
3

Cy-3-glukozid
3

Pt-3-glukozid
3

Pn-3-glukozid
3

Mv-3-glukozid

Mv-3-acetil-
glukozid
3

Vitisin A
3

Ukupno
16,640,32 (17,64)

6,510,05 (6,90)

12,500,21 (132)

14,210,35 (15,09)

40,240,58 (42,66)

1,030,03 (1,09)

3,180,10 (3,37)

94,31 (100,00)
15,320,18 (16,59)

3,480,07 (3,76)

13,680,16 (14,81)

13,990,17 (15,15)

42,520,47 (46,04)

0,980,01 (1,06)

2,390,09 (2,59)

92,36 (100,00)
17,820,22 (16,89)

5,690,11 (5,39)

15,830,22 (15,01)

12,620,32 (11,96)

48,350,63 (45,82)

1,520,05 (1,44)

3,680,07 (3,49)

105,51 (100,00)
1
2
mg cijanidin-3-glukozid ekvivalenta/L soka;
3
mg malvidin-3-glukozid
ekvivalenta/L soka.

150

Na slici 4.34 su dati hromatogrami komercijalnih sokova vinje, crne ribizle i crnog
groa snimljeni na 320 nm. Rezultati identifikacije i kvantitativnog odreivanja
hidroksicimetnih kiselina HPLC metodom u ispitivanim komercijalnim sokovima prikazani
su u tabeli 4.27. Rezultati pokazuju da najvei sadraj hidroksicimetnih kiselina imaju sokovi
vinje. Za crvene sokove najee se HPLC metodom odreuju antocijani, tako da je u
literaturi prisutno veoma malo podataka za sastav i sadraj hidroksicimetnih kiselina u njima.
Videli smo, da hidroksicimetne kiseline koje su prisutne u grou, prisutne su i u vinu, a iz
podataka tabele 4.27 moemo zakljuiti da su prisutne i u soku crnog groa. Isto vai i za
ekstrakt vinje i sok vinje (tabela 4.21 i tabela 4.27). Kako nije odreivan hemijski sastav
crne ribizle, da bi se uporedili podaci koristie se literatura. Nai rezultati pokazuju da
komercijalni sokovi crne ribizle sadre: neohlorogensku, kafenu, p-kumarnu i ferulnu
kiselinu. Hkkinen i sar. (1999a) su u crnoj ribizli identifikovali i kvantifikovali p-kumarnu,
kafenu i ferulnu kiselinu, dok su Chrzanowski i sar. (2007) pored p-kumarne, kafene i ferulne
kiseline nali i hlorogensku kiselinu.

)

151

b)

c)

Slika 4.34. HPLC hromatogram (320nm) u soku a) vinje: neohlorogenska kiselina (1);
derivat p-kumarne kiseline (2); p-kumarna kiselina (3); ferulna kiselina (4); b) crne ribizle:
neohlorogenska kiselina (1); kafena kiselina (2); p-kumarna kiselina (3); ferulna kiselina (4)
i c) crnog groa: t-kaftarna kiselina (1); t-kutarna kiselina (2); kafena kiselina (3); p-
kumarna kiselina (4); ferulna kiselina (5).

152

Table 4.27. Sadraj hidroksicimetnih kiselina i procenat njihove zastupljenosti u ispitivanim
komencijalnim sokovima.
Sok Sadra
1
mg/L (%)
Vinja 1 2 3
Neohlorogenska
kiselina
2
p-kumarna kiselina
derivat
3

p-kumarna kiselina

Ferulna kiselina

Ukupno
65,121,08 (80,47)

11,760,09 (14,53)

3,050,05 (3,78)

0,990,01 (1,22)

80,92 (100,00)
78,391,32 (83,80)

12,520,12 (13,38)

1,580,05 (1,70)

1,050,02 (1,12)

93,54 (100,00)
58,321,05 (76,93)

14,280,18 (18,83)

2,360,02 (3,12)

0,850,02 (1,12)

75,81 (100,00)
Crna ribizla 1 2 3
Neohlorogenska
kiselina
2
Kafena kiselina

p-kumarna kiselina

Ferulna kiselina

Ukupno
3,120,06 (34,51)

4,280,11 (47,34)

1,070,07 (11,85)

0,570,02 (6,30)

9,04 (100,00)
5,830,07 (38,45)

6,380,18 (42,08)

2,030,05 (13,40)

0,920,05 (6,07)

15,16 (100,00)
3,320,10 (33,9)

3,690,12 (37,01)

1,910,08 (19,17)

1,050,03 (10,53)

9,97 (100,00)
Crno groe 1 2 3
t-kaftarna kiselina
3

t-kutarna kiselina
2

Kafena kiselina

p-kumarna kiselina

Ferulna kiselina

Ukupno
6,930,17 (33,94)

1,860,03 (9,11)

0,760,09 (3,72)

10,410,38 (50,98)

0,460,03 (2,25)

20,42 (100,00)
7,320,18 (36,09)

2,080,07 (10,25)

0,660,09 (3,25)

9,630,65 (47,50)

0,590,07 (2,91)

20,28 (100,00)
6,520,09 (28,81)

1,530,10 (6,76)

1,050,06 (4,64)

12,750,89 (56,35)

0,780,09 (3,44)

22,63 (100,00)
1
2
mg ekvivalenta hlorogenske kiseline/L soka;
3
mg ekvivalenta p-
kumarne kiseline/L soka;
3
mg ekvivalenta kafene kiseline/L soka.

153

vonih vina

U ovom delu bie prikazani rezultati odreivanja ukupnih fenola i ukupne
antioksidativne aktivnosti spektrofotometrijskom metodom, kao i sadraja antocijana,
flavonola i hidroksicimetnih kiselina odreenih HPLC metodom u vonim vinima od vianja.
Sastav i antioksidativna aktivnost vonih vina od vianja uporedie se sa sastavom i
antoksidativnom aktivnou vonih vina od kupina i malina.

aktivnosti vonih vina

Rezultati spektrofotometrijskih odreivanja ukupnih fenola i ukupne antioksidativne
aktivnosti u 12 uzoraka vonih vina prikazani su u tabeli 4.28. Rezultati pokazuju da je
najvei sadraj ukupnih fenola u vonom vinu od kupine (uzorak 1). Najmanji sadraj uoen
je u vonom vinu od malina (uzorak 2). Svi ispitivani uzorci vonih vina od vianja se
meusobno znaajno razlikuju (p<0,5), dok uzorci 1 i 4 vonih vina od kupina i uzorci 1 i 3
vonih vina od malina ne pokazuju znaajne razlike u pogledu sastava ukupnih fenola.
U pogledu sadraja ukupnih fenola naa ispitivanja su pokazala da vai niz: vona vina
od kupina > vona vina od vianja > vona vina od malina. U literaturi se mogu nai razliiti
podaci u pogledu sadraja polifenola. Za vone sokove postavljen je niz: sok vinje > sok
kupine > sok maline (Jakobek i sar. 2007a), a za voa: kupina > vinja > malina. (Jakobek i
sar., 2007b). Tukben i sar. (2010) su ispitivali 5 sorti malina i 4 sorti kupina i pri tome
utvrdili da znatno vei sadraj ukupnih fenola ima kupina, to je u skladu sa naim
rezultatima.
Analiza antioksidativne aktivnosti ispitivanih vonih vina, uraena korienjem DPPH
radikala ukazuje da se antioksidativna aktivnost kree od 3,91 do 17,74 mmol TE/L, i da je
najmanja kod vonog vina od malina (uzorak 2) a najvea kod vonog vina od kupina
(uzorak 1).

154

Tabela 4.28. Sadraj ukupnih fenola (TP) i antioksidativne aktivnosti (TAA) u vonim vinima.
Vino Broj
uzorka
TP
1
(mg GAE/l) TAA
2
(mmol TE/l)
Vinja
komercijalno
komercijalno
domae
domae
1
2
3
4
2250,2056,66
3
a
4
1533,2015,15 b
2037,7719,35 c
2651,8732,10 d
13,170,20 a
4,580,53 b
12,520,78 a
16,890,51 c
Kupina
komercijalno
komercijalno
domae
domae
1
2
3
4
2836,1744,71 a
1607,9343,54 b
2176,0725,78 c
2752,0333,93 a
17,740,95 a
10,360,38 b
12,060,53 b
17,410,51 a
Malina
komercijalno
komercijalno
domae
domae
1
2
3
4
1466,4714,18 a
1051,9010,58 b
1490,4010,06 a
1405,4030,38 c
7,910,82 a
3,910,15 b
6,050,13 c
7,100,18 ac
1
mg ekvivalenta galne kiseline/L vonog vina;
2
mmol troloks ekvivalenta/L vonog vina;
3
srednja
vrednost SD (n=3);
4
brojevi oznaeni razliitim slovima u koloni (vina od iste vrste voa) se
signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05).

Analiza korelacije izmeu sadraja ukupnih fenola i antioksidativne aktivnosti svih
ispitivanih vonih vina pokazuje da je koeficijent korelacije 0,960 (slika 4.35). Meutim,
analiza korelacije izmeu sadraja ukupnih fenola i ukupne antioksidativne aktivnosti vonih
vina od vianja pokazuje bolju korelaciju (R
2
= 0,975) u odnosu na vona vina od kupine (R
2
=
0,972) i vona vina od maline (R
2
= 0,857), to se moe videti na slikama 4.36, 4.37 i 4.38.

155

2 4 6 8 10 12 14 16 18
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
2600
2800
3000
T
P

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

ispitivanih vonih vina.

4 6 8 10 12 14 16 18
1400
1600
1800
2000
2200
2400
2600
2800
T
P

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

ispitivanih vonih vina od vianja.

156

10 11 12 13 14 15 16 17 18
1600
1800
2000
2200
2400
2600
2800
3000
T
P

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

ispitivanih vonih vina od kupina.

4 5 6 7 8
1000
1100
1200
1300
1400
1500
T
P

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

ispitivanih vonih vina od malina.

157

4.1.6.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola i hidroksicimetnih kiselina
u vonim vinima

Za vona vina od vianja, kupina i malina je karakteristino prisustvo antocijana,
jedinjenja koja daju karaktetistinu boju ovih vina. Njihov sadraj je odreen HPLC
metodom i prikazan u tabeli 4.29. Na slici 4.39 dati su hromatogrami za vona vina od
vianja, kupina i malina sa identifikovanim antocijanima. Podaci u tabeli 4.29 pokazuju da je
cijanidin-3-glukozil-rutinozid najzastupljeniji antocijanin u vonim vinima od vianja, dok je
cijanidin-3-soforozid identifikovan jedino u domaim vonim vinima (uzorci 3 i 4). U
uzorcima 1,3 i 4 vonih vina od kupina najzastupljeniji je cijanidin-3-glukozid, dok je u
uzorku 2 dominantno prisustvo cijanidin-3-ksilozida. U svim ispitivanim uzocima vonih
vina od malina predominantan je cijanidin-3-soforozid. I drugi autori su nali da su u kupini
prisutni samo derivati cijanidina i da je najzastupljeniji cijanidin-3-glukozid sa 90% (u
odnosu na ukupan sastav antocijana) (Jakobek i sar., 2007a), odnosno sa 53% (Fan-Chiang i
sar. 2005). Meutim, na osnovu literaturnih podataka moemo zakljuiti da je sastav
antocijana maline veoma razliit. U ispitivanim uzorcima vonih vina od malina naeni su
samo derivati cijanidina. Jakobek i sar. (2007a) i De Ancos i sar. (1999) su pored cijanidin-3-
soforozida, koji je najzastupljeniji i cijanidin-3-glukozida nali i pelargonidin-3-soforozid,
dok su Goiffon i sar. (1999) pored derivata cijanidina nali i derivate malvidina i delfinidina.
Analiza korelacije izmeu sadraja monomernih antocijana odreenih HPLC metodom
i ukupne antioksidativne aktivnosti odreene spektrofotometrijskom metodom pokazuje
najvei korelacioni koeficijent za vona vina od maline (R
2
= 0,985, slika 4.42), zatim sledi
korelacioni koeficijent za vona vina od kupine (R
2
= 0,929, slika 4.41), i na kraju za vona
vina od vinje (R
2
= 0,569, slika 4.40). Takoe, analiza korelacije izmeu sadraja ukupnih
monomernih antocijana i antioksidativne aktivnosti svih ispitivanih vonih vina pokazuje
zadovoljavajui koeficijent korelacije i on iznosi 0,840 (slika 4.43).

158

Tabela 4.29. Sadraj antocijana i procenat njihove zastupljenosti u ispitivanim vonim
vinima.
Vino Sadraj
1
mg/l (%)
Vinja 1 2 3 4
Cy.-3-soforozid
Cy-3-G-rutinozid
Cy-3-rutinozid
Ukupno
2
nd
3
208,51,3(74,2)
72,30,9(25,8)
80,82,2(100,0)
nd
86,81,2(80,8)
20,60,8(19,2)
107,42,0(100,0)
9,10,7(3,6)
196,11,6(77,8)
46,90,9(18,6)
252,13,2(100,0)
8,50,4(3,1)
215,31,7(76,6)
57,31,2(20,3)
281,13,3(100,0)
Kupina 1 2 3 4
Cy-3-glukozid
Cy-3-rutinozid
Cy- 3-ksilozid
Ukupno
2
403,82,0(86,7)
nd
61,91,1(13,3)
465,73,1(100,0)
35,40,2(20,3)
39,30,5(22,5)
99,71,1(57,2)
174,41,8(100,0)
209,30,7(80,6)
nd
50,30,4(19,4)
259,61,1(100,0)
305,71,8(87,7)
nd
42,80,4(12,3)
348,52,2(100,0)
Malina 1 2 3 4
Cy-3-soforozid
Cy-3-glukozid
Cy-3-rutinozid
Ukupno
2
178,91,5(69,5)
45,80,3(17,8)
32,80,3(12,7)
257,52,1(100,0)
91,81,6(88,9)
3,50,1(3,4)
7,90,2(7,7)
103,21,9(100,0)
153,71,2(73,0)
38,20,4(18,1)
18,50,3(8,9)
210,41,9(100,0)
201,51,0(83,8)
14,30,5(5,9)
24,50,3(10,3)
240,31,8(100,0)
1
2
mg cijanidin-3-glukozid ekvivalenta/L vonog vina;
3
nije odreeno.
159

Slika 4.39. HPLC hromatogram u vonom vinu od (a) vianja: cijaniding-3-soforozid (1),
cijanidin-3-glukozil-rutinozid (2) i cijanidin-3-rutinozid (3); (b) kupina: cijanidin-3-glukozid
(1), cijanidin-3-rutinzid (2) i cijaniding-3-ksilozid (3); (c) malina: cijanidin-3-soforozid (1),
cijanidin-3-glukozid (2) i cijanidin-3-rutinzid (3).

160

4 6 8 10 12 14 16 18
50
100
150
200
250
300
T
M
A

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

antioksidativne aktivnosti vonih vina od vianja.

10 11 12 13 14 15 16 17 18
150
200
250
300
350
400
450
500
T
M
A

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

antioksidativne aktivnosti vonih vina od kupina.
161

4 5 6 7 8
100
120
140
160
180
200
220
240
260
T
M
A

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

antioksidativne aktivnosti vonih vina od malina.

2 4 6 8 10 12 14 16 18
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
T
A

(
m
g
/
l
)
TAA (mmol/l)

antioksidativne aktivnosti.

162

Tabela 4.30. Sadraj flavonola u ispitivanim vonim vinima.
Vino Sadraj
1
mg/l
Vinja 1 2 3 4
Kvercetin
Kemferol
Ukupno
3,740,22
2,760,18
6,510,20
1,130,12
0,820,08
1,950,10
2,630,22
1,580,18
4,210,20
3,050,18
2,160,16
5,210,17
Kupina 1 2 3 4
Kvercetin
Kemferol
Ukupno
4,070,28
0,450,05
4,520,16
3,870.19
0,300.05
4,170,12
4,900.32
0,400,05
5,300,18
4,720,19
0,850,07
5,570,13
Malina 1 2 3 4
Kvercetin
Kemferol
Ukupno
0,980,05
nd
2
0,980,05
1,200,09
nd
1,200,09
1,320,08
nd
1,320,08
1,800,08
nd
1,800,08
1
2
nije odreeno.

U tabeli 4.30 su prikazani rezultati odreivanja flavonola (mg/L) HPLC metodom u
uzorcima vonih vina. HPLC analiza ukazuje na prisustvo kvercetina i kemferola u vonim
vinima od vianja i kupina, odnosno kvercetina u vonim vinima od malina. Miricetin nije
identifikovan u svim ispitivanim uzorcima vonih vina. Najvei sadraj flavonoida zabeleen
je u uzorcima vonih vina od kupina, zatim slede vona vina od vianja i na kraju vona vina
od malina. Isti niz u pogledu sadraja flavonola u kupini, vinji i malini nali su i drugi autori
(Jakobek i sar., 2007).
Rezultati identifikacije i kvantifikacije hidroksicimetnih kiselina u ispitivanim vonim
vinima prikazani su u tabeli 4.31. Rezultati pokazuju da najvei sadraj hidroksicimetnih
kiselina imaju vona vina od vianja (73.84 98.81 mg/L), dok su slinog sadraja vona
vina od kupina (6.42 30.94 mg/L) i vona vina od malina (9.41 28.13 mg/L).

163

Tabela 4.31. Sadraj hidroksicimetnih kiselina u ispitivanim vonim vinima.
Vino Sadraj
1
mg/l
Vinja 1 2 3 4
Neohlorogenska
2
Kafena
p-Kumarna
Ferulna
Ukupno
74,641,02
13,790,38
10,380,29
nd
3
98,810,56
60,440,90
11,520,32
1,880,22
nd
73,840,48
58,500,65
12,830,42
9,630,18
nd
80,960,42
60,720,82
9,850,30
7,380,25
nd
77,950,46
Kupina 1 2 3 4
Neohlorogenska
2
Kafena
p-Kumarna
Ferulna
Ukupno
12,390,40
7,620,36
1,080,15
nd
21,080,30
1,790,18
3,830,28
0,800,06
nd
6,420,17
13,550,23
9,860,25
2,080,12
2,680,09
28,170,17
17,820,52
8,320,35
3,010,22
1,790,10
30,940,30
Malina 1 2 3 4
Neohlorogenska
2
Kafena
p-Kumarna
Ferulna
Ukupno
22,820,83
5,310,16
nd
nd
28,130,50
nd
2,990,12
nd
6,420,18
9,410,15
12,380,45
7,380,52
1,080,15
3,280,18
24,120,32
10,630,36
6,820,24
1,850,20
1,050,16
20,350,24
1
2
mg ekvivalenta hlorogenske kiseline/L vonog vina;
3
nije odreeno.

164

crvene ribizle

Za odreivanje sadraja fenolnih jedinjenja koriena je suva crvena ribizla gajena na
trima razliitim podrujima: Nika Banja, Beograd i Velika Plana. Ekstrakcija je vrena
prema proceduri datoj u delu 3.3.1.1. u razliitim rastvaraima: aceton:voda:HCl (80:19:1),
etanol:voda:HCl (80:19:1) i metanol:voda:HCl (80:19:1). Za odreivanje sadraja ukupnih
fenola, ukupnih flavonoida i antioksidativne aktivnosti pripremljenih ekstrakata koriene su
spektrofotometrijske metode. Za odreivanje sadraja pojedinanih antocijana, flavonola,
flavan-3-ola i hidroksicimetnih kiselina koriena je HPLC metoda.

aktivnosti crvene ribizle
U tabeli 4.32 prikazani su rezultati spektrofotometrijskog odredjivanja fenola,
flavonoida i antioksidativne aktivnosti ekstrakta crvene ribizle. Ekstrakcija je vrena u
razliitim rastvaraima. Dobijeni rezultati preraunati su na masu polaznog uzorka, odnosno
suvog voa.
Sadraj ukupnih fenola u ekstraktu, kao i sastav ekstrakta u velikoj meri zavisi od naina
ekstrakcije, kao i tipa i polarnosti rastvaraa. Keinnen (2003) je koristio rastvarae: aceton,
methanol i etanol, kao apsolutne i u smei sa vodom (80% etanol, methanol i aceton). Isti
autor je pokazao da je ekstrakcija rastvaraima koji sadre vodu efikasnija od ekstrakcije
apsolutnim rastvraima. Takoe, mnogi autori su pokazali da se efikasnost ekstrakcije
poveava u prisustvu 0,1% HCl (Seeram i sar., 2006) ili 2% HCl (Jakobek i sar., 2007b). Iz
gore navedenih razloga za ekstrakciju fenolnih jedinjenja iz uzoraka suve crvene ribizle, a u
daljem radu i uzoraka suve maline, koriena je smea 80% rastvaraa (metanola, etanola ili
acetona) + 19% vode + 1% HCl.
Sadraj ukupnih fenola u acetonskim ekstraktima suve crvene ribizle kree se od 6,15
mg GAE/g suvog voa (su.v.) u crvenoj ribizli Velika Plana do 12,68 mg GAE/g su.v. u
crvenoj ribizli Beograd. Pantelidis i sar. (2007) su za dve sorte crvenih ribizli nali da
sadre 11,15 i 11,93 mg GAE/g su.v.

165

Tabela 4.32. Sadraj ukupnih fenola (TP), flavonoida (TF) i antioksidativne aktivnosti (TAA)
ekstrakata crvene ribizle u razliitim rastvaraima.
TP
1
(mg GAE/g
suvog voa)
Crvena ribizla
Niska Banja
Crvena ribizla
Beograd
Crvena ribizla
Velika Plana
Metanol 3,470,11
4
a
5
,a
6
3,960,10 a,b 3,260,06 a,ac
Etanol 3,910,14 b,a 6,570,09 b,b 3,050,10 ab,c
Aceton 7,460,09 c,a 12,680,04 c,b 6,150,12 c,c
TF
2
(mg CE/g suvog
voa)
Crvena ribizla
Niska Banja
Crvena ribizla
Beograd
Crvena ribizla
Velika Plana
Metanol 1,340,07 a,a 1,850,13 a,b 1,250,08 a,ac
Etanol 1,450,07 ab,a 1,840,07 ab,b 1,420,09 ab,ac
Aceton 2,130,08 c,a 2,610,09 c,b 1,990,14 c,ac
TAA
3
(mol TE/g
suvog voa)
Crvena ribizla
Niska Banja
Crvena ribizla
Beograd
Crvena ribizla
Velika Plana
Metanol 24,710,30 a,a 30,420,79 a,b 22,470,62 a,c
Etanol 23,220,41 ab,a 48,640,41 b,b 17,531,51 b,c
Aceton 61,111,09 c,a 104,634,62 c,b 44,111,73 c,c
1
mg ekvivalenta galne kiseline/g suvog voa;
2
mg katehin ekvivalenta/g suvog voa;
3
mmol
troloks ekvivalenta/g suvog voa;
4
5
slovima u koloni (za jednu grupu jedinjenja , za jedan uzorak u razliitim rastvaraima) se
signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05);
6
brojevi
oznaeni razliitim slovima u redu (za jednu grupu jedinjenja , za razliite uzorke u istom rastvrau)
se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05).

razlike u sadraja ukupnih fenola u uzorcima crvenih ribizli gajenih na razliitim lokacijama,
a takoe i istog uzorka crvene ribizle ekstrahovane razliitim rastvaraima. Dobijeni rezultati
pokazuju da je najefikasniji rastvara aceton. Ovaj podatak je u saglasnosti sa rezultatima
Khknen-a i sar. (2001), koji su odreivali sadraj fenola u jabuci, borovnici, brusnici i
malini u ekstraktima metanola i acetona, ili sa rezultatima Alothmana-a i sar. (2009), koji su
ispitivali sadraj fenola u tropskom vou u ekstraktima metanola, etanola i acetona.
Prikazani rezultati sadraja ukupnih flavonoida u ektraktima razliitih rastvaraa crvene
ribizle, pokazuju da njihov sadraj dosta varira u zavisnosti od lokaliteta i upotrebljenog
rastvaraa za ekstrakciju. Tako je najvea koliina flavonoida zabeleena u uzorcima sa
lokaliteta Beograda i u ekstraktu acetona (tabela 4.32). Ovi rezultati su u skladu sa
rezultatima Alothman i sar. (2009) koji su dokazali da je aceton najbolji rastvara za
166

ekstrakciju flavonoida junog voa, ali je suprotno rezultatima Jagtap i sar. (2010) koji su
pokazali da su metanol i etanol bolji estragensi od acetona.
Dobijene vrednosti za antioksidativnu aktivnost su u intervalu od 44,11 do 104,63
mol TE/g su.v. Najveu antioksidativnu vrednost pokazuje crvena ribizla - Beograd, sledi
crvena ribizla Nika Banja i na kraju crvena ribizla Velika Plana (tabela 4.32). Jakobek i
sar. (2007b) su za crvenu ribizlu odredili vrednost antioksidativne aktivnosti od 13,73 mol
TE/g su.v. Rezultati su uporedivi sa naim rezultatima, s obzirom da je odnos masa suvog
voa/masa sveeg voa najee od 0,1 do 0,2. Takoe, najvee vrednosti su zabeleene u
acetonu kao rastvarau za ekstrakciju, to je u skladu sa rezultatima drugih autora (Alothman
i sar., 2009).

4.1.7.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola, flavan-3-ola i
hidroksicimetnih kiselina u crvenoj ribizli

Kao to se moe videti sa hromatograma (slika 4.44) jasno se uoavaju izraeni
pikovi za: cijanidin-3-soforozid (1), cijanidin-3-glukozil-rutinozid (2) i cijanidin-3-glukozid.
U tabeli 4.33. prikazani su rezultati odreivanja antocijana (mg/100g suvog voa)
HPLC metodom u uzorcima crvene ribizle na 520 nm u ekstraktima metanola, etanola i
acetona. Pokazalo se da se antocijani najbolje ekstrahuju sistemom metanol + voda +
kiselina, to je u saglasnosti sa rezultatima drugih autora za crvena voa (Kajanovska i sar.
2011). Iz tabele 4.33. se moe uoiti da je u ekstraktima crvene ribizle najzastupljeniji
cijanidin-3-glukozil-rutinozid. Sadraj ukupnih monomernih antocijanina u ispitivanim
uzorcima crvene ribizle se kretao od 54,48 mg/100 g su.v. do 111,75 mg/100 g su.v. u
metanolnom ekstraktu. Khknen i sar. (2001) su u nali da crvena ribizla sadri 113 mg /100
g su.v. antocijana.

167

Slika 4.44. HPLC hromatogram antocijana (520 nm) u metanolnom ekstraktu uzorka crvene
ribizle iz Beograda: cijanidin-3- soforozid (1), cijanidin-3-glukozil-rutinozid (2), cijanidin-3-
glikozid (3).

Tabela 4.33. Sadraj (mg/100g suvog voa)
1,2
antocijana u ekstraktima crvenih ribizli u
razliitim rastvaraima.
Voe Rastvara Cy-3-
soforozid
Cy-3-
glukozil-
rutinozid
Cy-3-
glukozid
Ukupno
Crvena
ribizla
Nika Banja
Metanol
Etanol
Aceton
35,810,45
22,920,86
12,210,38
65,561,02
39,371,09
44,200,99
10,380,02
5,220,01
5,770,07
111,750,50
67,510,65
61,580,48
Crvena
ribizla
Beograd
Metanol
Etanol
Aceton
7,380,29
5,670,22
4,100,18
40,550,85
34,320,78
22,810,69
6,550,08
4,550,11
4,980,23
54,480,41
44,540,37
31,890,37
Crvena
ribizla
Velika Plana
Metanol
Etanol
Aceton
4,430,10
3,680,29
2,420,09
22,870,53
13,500,28
5,320,17
5,450,62
4,320,18
2,560,52
32,750,42
21,500,25
10,300,26
1
2
mg cijanidin-3-glukozid ekvivalenta/100 g suvog voa.
U tabeli 4.34 su prikazani rezultati odredjivanja flavonola (mg/100g suvog voa)
HPLC metodom u uzorcima crvene ribizle na 360 nm. Na slici 4.45 je dat hromatogram za
uzorak ektrakta crvene ribizle na 360 nm. HPLC analiza ekstraka crvene ribizle je ukazala na
prisustvo kvercetina i kemferola. Miricetin nije identifikovan u ispitivanim uzorcima crvene
168

ribizle. Neki autori (Mtt i sar., 2003; Hkkinen i sar., 1999b) su nali da crvena ribizla
sadri kvercetin, miricetin i kemferol, pri emu je najzastupljeniji kvercetin, dok su drugi
autori (Hkkinen i sar., 1999b) pronali samo kvercetin.

1
flavonola u ekstraktima crvenih ribizli u
Voe Rastvara Kvercetin Kemferol Ukupno
Crvena ribizla
Nika Banja
Metanol
Etanol
Aceton
2,530,12
2,280,17
7,470,32
0,570,05
0,540,07
1,620,09
3,100,08
2,820,12
9,090,20
Crvena ribizla
Beograd
Metanol
Etanol
Aceton
5,920,35
3,830,28
8,710,45
0,630,05
0,470,02
1,720,11
6,550,20
4,300,15
10,430,28
Crvena ribizla
Velika Plana
Metanol
Etanol
Aceton
8,450,62
6,790,48
8,630,37
1,920,10
1,260,05
2,530,07
10,370,36
8,050,26
11,160,22
1

U acetonskom ekstraktu crvene ribizle Nika Banja odreen je najmanji sadraj
ukupnih flavanola (9,09 mg/100 g su.v.), gde je udeo kvercetina iznosio 82,17 % od ukupne
mase flavanola, dok je u istom ekstraktu crvene ribizle Velika Plana odreen najvei
sadraj ukupnih flavanola (11,16 mg/100 g su.v.) sa udelom kvercetina od 77,33 %.
Khknen i sar. (2001) su u acetonskom ekstraktu crvene ribizle nali sadraj od 9,5 mg/100
g su.v. flavanola.
Kvalitativnom HPLC analizom ekstrakta crvene ribizle odreeno je prisustvo
katehina i epikatehina uz upotrebu fluorescentnog detektora (slika 4.46). U tabeli 4.35.
prikazani su rezultati odredjivanja flavan-3-ola (mg/100g suvog voa) HPLC metodom u
uzorcima crvene ribizle na 275/322nm (
ex
/
em
).
Sadraj ukupnih flavan-3-ola u acetonskim ekstraktima se kretao od 139,28 do
165,65 mg/100 g su.v., pri emu je ekstrakt crvene ribizle Beograd bio najbogatiji flavan-3-
olima, dok je ekstrakt crvene ribizle Velika Plana imao najmanji sadraj.

169

Slika 4.45. HPLC hromatogram flavanola (360 nm) u metanolnom ekstraktu uzorka
crvene ribizle iz Beograda: kvercetin (1), kemferol (2.)

U tabeli 4.36 prikazani su rezultati odredjivanja hidroksicimetnih kiselina (mg/100g
suvog voa) HPLC metodom u uzorcima crvene ribizle na 320 nm. Na slici 4.47 je dat
hromatogram za metanolni ekstrat crvene ribizle.

Slika 4.46. HPLC hromatogram flavan-3-ola (275/322nm ,
ex
/
em
) u metanolnom
ekstraktu uzorka crvene ribizle iz Beograda: katehin (1), epikatehin (2).
170

1
flavan-3-ola u ekstraktima crvenih ribizli u
Voe Rastvara Katehin Epikatehin Ukupno
Crvena ribizla
Nika Banja
Metanol
Etanol
Aceton
52,320,82
37,580,78
60,921,05
69,120,98
53,310,85
82,030,83
121,440,90
90,890,81
142,950,94
Crvena ribizla
Beograd
Metanol
Etanol
Aceton
58,630,62
43,720,69
67,500,46
64,621,10
47,130,97
98,470,56
123,251,17
90,850,83
165,970,51
Crvena ribizla
Velika Plana
Metanol
Etanol
Aceton
50,870,32
45,920,17
59,450,28
55,780,45
48,920,37
79,830,28
106,650,38
94,840,27
139,280,28
1

1
hidroksicimetnih kiselina u ekstraktima crvenih
ribizli u razliitim rastvaraima.
Voe Rastvara Kafena
kiselina
p-Kumarna
kiselina
Ferulna
kiselina
Ukupno
Crvena
ribizla
Nika Banja
Metanol
Etanol
Aceton
1,220,09
0,420,06
nd
2,340,12
0,920,07
2,130,09
2,430,14
0,950,05
1,120,06
5,990,12
2,290,06
3,250,07
Crvena
ribizla
Beograd
Metanol
Etanol
Aceton
1,730,12
1,350,08
1,520,05
3,030,08
1,150,05
2,920,11
1,620,07
1,280,11
1,590,22
6,380,09
3,780,08
6,030,13
Crvena
ribizla
Velika Plana
Metanol
Etanol
Aceton
2,380,21
1,050,17
0,980,09
2,730,13
0,890,08
1,080,07
4,120,28
1,890,15
2,450,17
9,230,21
3,830,13
4,510,11
1
srednja vrednost SD.
171

Slika 4.47. HPLC hromatogram hidroksicimetnih kiselina (320 nm) u metanolnom ekstraktu
uzorka crvene ribizle iz Beograda: kafena kiselina (1), p-kumarna kiselina (2) i ferulna
kiselina(3).

Hidroksicimetne kiseline prisutne u uzorcima crvenih ribizli su identifikovane
poreenjem njihovih retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom
standarda za kafenu, p-kumarnu i ferulnu kiselinu.
Rezultati pokazuju da najvei sadraj hidroksicimetnih kiselina imaju crvene ribizle sa
lokacije Velike Plane (9,23 mg/100 g su.v.), dok najmanji sadraj imaju crvene ribizle sa
lokacije Nike Banje (5,99 mg/100 g su.v.). Najzastupljenija komponenta u metanolnim
ekstraktima crvenih ribizli sa podruja Nike Banje i Beograda je p-kumarna kiselina, koja
ini od 39,1 do 47,5 % ukupnih hidroksicimetnih kiselina. Meutim, najzastupljenija
komponenta u metanolnom ekstraktu crvene ribizle sa podruja Velike Plane je ferulna
kiselina, koja ini 44,3 % ukupnih hidroksicimetnih kiselina. Dobijeni rezultati su u skladu sa
literaturnim podacima (Mtt i sar., 2003).

172

maline

Za odreivanje sadraja polifenolnih jedinjenja koriena je suva malina gajena na
trima razliitim podrujima: Velika Plana, Nika Banja i Vlasina. Ekstrakcija je vrena prema
proceduri datoj u delu 3.3.1.1 u razliitim rastvaraima aceton:voda:HCl (80:19:1),
etanol:voda:HCl (80:19:1) i metanol:voda:HCl (80:19:1). Za odreivanje sadraja ukupnih
fenola, ukupnih flavonoida i antioksidativne aktivnosti pripremljenih ekstrakata koriene su
spektrofotometrijske metode. Za odreivanje sadraja pojedinanih antocijana, flavonola i
hidroksicimetnih kiselina koriena je HPLC metoda.

aktivnosti maline

U tabeli 4.37 prikazani su rezultati spektrofotometrijskog odredjivanja fenola,
flavonoida i antioksidativne aktivnosti ekstarakta suve maline. Ekstrakcija je vrena u
razliitim rastvaraima. Dobijeni rezultati preraunati su na masu polaznog uzorka. Rezultati
pokazuju da je pri odreivanju ukupnih fenola, ukupnih flavonoida i ukupne antiokidativne
aktivnosti najbolje ekstrakciju vriti sistemom aceton:voda:HCl (80:19:1).
Analizom dobivenih rezultata moe se uoiti da se sadraj ukupnih fenola u analiziranim
uzorcima suve maline menja u zavisnosti od podruja na kojem je gajena malina i kree se od
14,36 mg GAE/g su.v. u acetonskom ekstraktu maline sa podruja Nike Banje do 16,73 mg
GAE/g su.v. u acetonskom ekstraktu maline sa podruja Vlasine. Nai rezultati su uporedivi
sa literaturnim podacima. Sadraj polifenola u 4 sorte malina gajenih u Grkoj kree se od
10,52 do 24,94 mg/g su.v. (Pantelidis i sar., 2007), odnosno u tri sorte malina gajenih u
Finskoj kree se od 27,3 do 29,9 mg/g su.v. (Khknen i sar., 2001).
Ukupni flavonoidi u acetonskim ekstraktima se kreu od 5,23 do 5,99 mg/g su.v., sa
procentnom zastupljenou od 33,53 do 37,81% u odnodu na sadraj ukupnih fenola.
Ispitivanje antioksidativne aktivnosti ekstrakata uzoraka suve maline gajenih na tri
razliita podruja su pokazala da ova vrednost u acetonu iznosi 97,5 mol TE/g su.v. i vea je
od antioksidativne aktivnosti suve ribizle (69,95 mol TE/g su.v.), to je u saglasnosti sa
literaturnim podacima (Jakobek i sar., 2007b).

173

Tabela 4.37. Sadraj ukupnih fenola (TP), flavonoida (TF) i antioksidativne aktivnosti (TAA)
ekstrakata maline u razliitim rastvaraima.
TP
1
(mg GAE/g suvog
voa)
Malina
Velika Plana
Malina
Nika Banja
Malina
Vlasina
Metanol 14,650,13
4
a
5
,a
6
13,900,30 b,a 15,620,13 c,a
Etanol 9,820,08 ac,b 8,970,11 b,b 9,920,09 c,b
Aceton 15,840,08 a,c 14,360,13 b,c 16,730,09 c,c
TF
2
(mg CE/g suvog
voa)
Malina
Velika Plana
Malina
Nika Banja
Malina
Vlasina
Metanol 4,950,11 ac,a 4,620,12 b,a 5,180,11 c,a
Etanol 4,360,18 ac,b 3,690,09 b,b 4,120,07 c,b
Aceton 5,990,15 a,c 5,230,13 b,c 5,610,08 c,c
TAA
3
(mol TE/g suvog
voa)
Malina
Velika Plana
Malina
Nika Banja
Malina
Vlasina
Metanol 90,622,25 a,a 85,372,19 b,ac 96,940,25 c,a
Etanol 57,621,17 ac,b 53,280,37 b,b 56,360,63 c,b
Aceton 100,481,03 a,c 86,500,69 b,c 105,521,03 c,c

1
mg ekvivalenta galne kiseline/g suvog voa;
2
mg katehin ekvivalenta/g suvog voa;
3
mmol
troloks ekvivalenta/g suvog voa;
4
5
slovima u koloni (za jednu grupu jedinjenja , za jedan uzorak u razliitim rastvaraima) se
signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05);
6
brojevi
oznaeni razliitim slovima u redu (za jednu grupu jedinjenja , za razliite uzorke u istom rastvrau)
se signifikantno razlikuju kada se koristi Duncan-ov test viestrukih intervala, (p<0,05).

4.1.8.2. HPLC odreivanje antocijana, flavonola i hidroksicimetnih kiselina u
malini

Kao to se moe videti sa hromatograma (slika 4.48) jasno se uoavaju izraeni pikovi
za: cijanidin-3-soforozid (1) i cijanidin-3-glukozid (2).

174

Slika 4.48. HPLC hromatogram antocijana (520 nm) u metanolnom ekstraktu uzorka maline
iz Nike Banje: cijanidin-3- soforozid (1), cijanidin-3-glukozid (2).

Iz tabele 4.38. se moe uoiti da je u ekstraktima maline najzastupljeniji cijanidin-3-
soforozid. Ovaj podatak je u skladu sa rezultatima drugih autora (Seeram i sar., 2006).
Sadraj ukupnih antocijanina u ispitivanim uzorcima maline se kretao od 29,1 mg/100 g su.v.
do 42,8 mg/100 g su.v. u metanolnom ekstraktu. Khknen i sar. (2001) su za tri sorte malina
odredili da sadre od 170 do 298 mg/100 g su.v. Nai rezultati ukazuju na znatno manji
sadraj antocijana u uzorcima suve maline, to moe biti posledica uslova gajenja ali i
postupka pripreme suvog voa.
1
antocijana u ekstraktima maline u razliitim
rastvaraima.
Uzorak

Rastvara Cy-3-
soforosid
Cy-3-glukozil-
rutinozid
Ukupno

Malina
Velika
Plana
Metanol
Etanol
Aceton
28,40.32
24,10.27
10,80.18
11,50.09
9,70.08
5,90.02
39,90.20
33,80.17
16,70.10
Malina
Nika
Banja
Metanol
Etanol
Aceton
22,30.42
22,00.45
8,60.09
6,80.04
6,20.04
3,30.03
29,10.23
28,20.24
11,90.06
Malina
Vlasina
Metanol
Etanol
Aceton
30,50.17
28,50.38
12,20.12
12,30.07
11,80.06
6,50.03
42,80.12
40,30.22
18,70.07
1
175

Slika 4.49. HPLC hromatogram flavanola (360 nm) u metanolnom ekstraktu uzorka
maline iz Nike Banje: kvercetin (1), kemferol (2).

U tabeli 4.39 prikazani su rezultati odredjivanja flavanola (mg/100g suvog voa)
HPLC metodom u uzorcima maline na 360 nm. Na slici 4.49 je dat hromatogram za uzorak
ektrakta maline na 360 nm. HPLC analiza ekstraka crvene ribizle je ukazala na prisustvo
kvercetina i kemferola. Miricetin nije identifikovan u ispitivanim uzorcima maline.

1
flavanola u ekstraktima maline u razliitim
rastvaraima.
Uzorak

Rastvara Kvercetin Kemferol Ukupno

Malina Metanol 17,220,92 1,210,12 18,430,52
Velika Etanol 16,480,95 1,130,28 17,610,61
su Plana Aceton 20,230,72 1,920,35 22,150,53
Malina Metanol 19,450,88 0,560,09 20,010,48
Nika Etanol 20,350,72 0,470,07 20,820,36
Banja Aceton 25,560,65 1,230,09 26,790,37
Malina Metanol 14,820,73 0,480,05 15,300,39
Vlasina Etanol 15,030,47 0,320,02 15,350,24
Aceton 19,300,98 0,630,03 19,930,50
1
176

U acetonskom ekstraktu maline Vlasina odreen je najmanji sadraj ukupnih
flavanola (19,93 mg/100 g su.v.), gde je udeo kvercetina iznosio 96,8% od ukupne mase
flavanola, dok je u istom ekstraktu maline Nika Banja odreen najvei sadraj ukupnih
flavanola (26,79 mg/100 g s.v.) sa udelom kvercetina od 95,41%. Veoma male koliine
kemferola, pored predominantnog kvercetina odredili su Hkkinen i sar. (1999a), dok veina
autora (Hkkinen i sar. (1999b), identifikuje i kvantifikuje samo kvercetin, i njegov sadraj je
reda veliine od 15 do 30 mg/100 g su.v.
U tabeli 4.40 prikazani su rezultati odredjivanja hidroksicinaminih kiselina (mg/100g
suvog voa) HPLC metodom u uzorcima maline na 320 nm. Na slici 4.50 je dat hromatogram
za ekstrat maline.

Slika 4.50. HPLC hromatogram hidroksicimetnih kiselina (320 nm) u metanolnom ekstraktu
uzorka maline iz Nike Banje: kafena kiselina (1), p-kumarna kiselina (2) i ferulna
kiselina(3).

Rezultati pokazuju da najvei sadraj hidroksicimetnih kiselina imaju maline sa lokacije
Velike Plane (23,44 mg/100 g su.v.), dok najmanji sadraj imaju maline sa lokacije Nike
Banje (5,99 mg/100 g su.v.). Khknen i sar. (2001) su nali da maline sadre od 16 30
mg/100 g su.v. Najzastupljenija hidroksicimetna kiselina u metanolnim ekstraktima malina je
ferulna kiselina, koja ini od 40,56 do 45,22% ukupnih hidroksicimetnih kiselina prisutnih u
suvoj malini. Jakobek i sar. (2007b) su takoe u uzorcima maline odredili prisustvo kafene
kiseline, p-kumarne kiseline i ferulne kiseline, pri emu je najzastupljenija ferulna kiselina sa
oko 36,5%.

177

Tabela 4.40. Sadraj (mg/100g svog voa)
1
hidroksicimetnih kiselina u ekstraktima maline u
Uzorak

Rastvara Kafena
kiselina
p-kumarna
kiselina
Ferulna
kiselina
Ukupno
Malina
Velika
Plana
Metanol
Etanol
Aceton
6,390,38
6,050,72
3,850,47
7,180,12
5,230,17
3,420,23
9,870,42
9,430,38
5,840,22
23,440,31
20,710,42
13,110,31
Malina
Nika
Banja
Metanol
Etanol
Aceton
2,380,09
2,300,12
1,850,08
8,110,28
6,380,37
4,140,23
8,660,18
8,610,47
6,050,32
19,150,18
17,290,32
12,040,21
Malina
Vlasina
Metanol
Etanol
Aceton
5,730,62
5,680,48
4,930,23
7,530,19
6,980,38
5,120,42
9,050,15
8,850,38
6,230,17
22,310,32
21,510,41
16,280,27
1

178

4.2. I SPI TI VANJ E KI NETI KE DEGRADACIJ E FENOLNI H
J EDI NJ ENJ A HI DROKSI L RADIKALIMA

Odrivost kvaliteta voa i proizvoda od voa je od velikog interesa, zbog njihove
iroke upotrebe, to podrazumeva sauvati njihova antioksidativna svojstva i sauvati ih od
procesa oksidacije. Direktna oksidacija izmeu kiseonika i fenola se ne moe odigrati ili je
ekstremno spora u kiselim sredinama, uglavnom zbog nepovoljnih termodinamikih uslova.
Meutim, pojedini prelazni metali, naroito gvoe i bakar mogu promeniti reakcione
mehanizme, smanjujui slobodnu energiju reakcije i poveavajui brzinu reakcije. Stoga Fe i
Cu mogu odigrati vanu ulogu u prevazilaenju nepovoljnih termodinamikih uslova i
doprineti oksidaciji voa, vina, sokova (Danilewicz, 2003).
Hidroksil radikali i druge kiseonine reaktivne vrste, uz veoma vanu ulogu bakra i
gvoa u inicijaciji neenzimske oksidacije, mogu biti osnova za razumevanje oksidacije
fenolnih jedinjenja prisutnih u vou i proizvodima od voa. U tu svrhu ispitana je:
1. kinetika degradacije antocijana crvenih vina,
2. kinetika degradacije malvidin-3-glukozida i malvidin-3-acetil-glukozida crvenih vina,
3. kinetika degradacije katahina i epikatehina crvenih vina,
4. kinetika degradacije polifenola belih vina,
5. kinetika degradacije antocijana ceenog soka vinje i
6. kinetika degradacije antocijana ceenog soka crvene ribizle i maline
hidroksil radikalima koji nastaju u sistemu Cu/H
2
O
2
u kiseloj sredini pri pH=3,5 koji je
podeen vinskom kiselinom.

degradacije antocijana crvenih vina
Kinetiko-spektrofotometrijska metoda se moe primeniti za ispitivanje kinetike
reakcije degradacije antocijana crvenih vina. Prouavanje kinetike degradacije antocijana
crvenih vina obuhvata odreivanje kinetikih i termodinamikih parametara prouavanog
sistema, a u cilju razrade nove kinetiko-spektrofotometrijske metode za odreivanje
antocijana u crvenim vinima, razvoj i validaciju metode.
Za ispitivanje kinetike degradacije antocijana u crvenom vinu uzeto je mlado vino
Vranac (Rubin-Kruevac).

179

4.2.1.1. Kinetike i termodinamike karakteristike sistema

U vidljivom delu apsorpcionog spektra crvenog vina uoava se apsorpcioni
maksimum na 520 nm, koji odgovara antocijanima (slika 4.51, kriva 1). Dodatkom H
2
O
2

dolazi do oksidacije antocijana u vinu, to dovodi do smanjenja apsorpcionog maksimuma
(slika 4.51, kriva 2). Ako se uz istu koncentraciju vodonik peroksida dodaju i Cu(II) joni,
proces oksidacije vina se znatno ubrzava (slika 4.51, kriva 3), pa se stoga moe rei da Cu(II)
joni pokazuju katalitiko dejstvo u pomenutoj reakciji oksidacije, zbog intenzivnog stvaranja
hidroksil radikala, saglasno jednaininama 2.53 i 2.54 u delu 2.3.3.

Slika 4.51. Apsorpcioni spektar: 1) vodenog rastvora vina, 2) vodenog rastvora vina+H
2
O
2
,
3) vodenog rastvora vina+H
2
O
2
+Cu(II). Koncentracije reaktanata u rastvoru: Antocijani
0.26910
-3
mol/L; H
2
O
2
0.098mol/L; Cu(II) 1,23210
-4
mol/L, pH=3,5; t = 22 0,1
o
C
180

Slika 4.52. Promena apsorbance rastvora sa vremenom za razliite temperature: - 22
0
C;
-27
0
C; -32
0
C; -37
0
C. Koncentracije reaktanata u rastvoru: Antocijani 0,17910
-3

mol/L; H
2
O
2
0.098mol/L; Cu(II) 1,23210
-4
mol/L, pH=3,5.

Oksidacijom antocijana u crvenom vinu u kiseloj sredini (pH=3,5, podeen vinskom
kiselinom), nestaje crvena boja vina i zbog toga je mogue primeniti spektrofotometrijski
postupak za praenje reakcije, odnosno meriti promena apsorbancije rastvora u funkciji
vremena odigravanja reakcije na 520 nm. Za obradu kinetikih podataka primenjena je
diferencijalna varijanta tangensne metode (Perez-Bentito i Silva, 1988), jer je zavisnost
izmeu apsorbance rastvora i vremena (t) odigravanja reakcije linearna u toku prvih 40-60
min po meanju reakcionih komponenti, a nagib kinetike krive prema apscisi (tg) je
proporcionalan brzini reakcije (slika 4.52). Za vino Vranac (Rubin, Kruevac) pH-
diferencijalnom metodom je odreeno da sadri 442,35 mg (M3GE/L) monomernih
antocijana, odnosno 0,896 mol/L.
U cilju ispitivanja kinetike i termodinamikih karakteristika reakcije degradacije
antocijana hidroksil radikalima koji nastaju u sistemu Cu(II)/H
2
O
2
, neophodno je prvo pratiti
zavisnosti brzine reakcije od koncentracije svih reaktanata (H
2
O
2
, Cu(II), antocijana u vinu
Vranac) i temperature.
Uticaj koncentracije vodonik peroksida na brzinu reakcije degradacije antocijana u vinu
prikazan je na slici 4.53. Iz slike 4.53 se vidi, da izmeu brzine reakcije (nagib kinetike
krive prema apscisi) i koncentracije vodonik peroksida postoji linearna zavisnost, te je
reakcija prvog reda u odnosu na koncentraciju H
2
O
2
za ispitivani interval koncentracije od
0,049 do 0,490 mol/L. Za dalji rad je korien rastvor H
2
O
2
koncentracije 0,098 mol/L.
0 10 20 30 40 50 60
0.80
0.82
0.84
0.86
0.88
0.90
0.92
0.94
0.96
0.98
A
t, min
181

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
t
g
o
x
1
0
2
c (H
2
O
2
) mol/L

Slika 4.53. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije H
2
O
2
. Koncentracije reaktanata u
rastvoru: Antocijani - 0.17910
-3
mol/L; Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 22 0,1
o
C.

Zavisnost brzine reakcije od koncentracije Cu(II) jona je prikazana na slici 4.54. Iz ove
slike se moe videti da postoji linearna zavisnost izmeu brzine reakcije i koncentracije
Cu(II) jona te je zbog toga reakcija prvog reda u odnosu na koncentraciju Cu(II) jona, za
ispitivani interval od (0,615-6,150) 10
-4
mol/L. Za dalji rad je korien rastvor Cu(II) ija je
koncentracija u reakcionoj smei 1,23210
-4
mol/L.
Ispitivanja zavisnosti brzine reakcije degradacije antocijana u vinu od temperature
reakcione smee (slika 4.55), su pokazala da brzina reakcije raste sa poveanjem temperature.
Meutim, ako se predstavi zavisnost promene apsorbance rastvora sa vremenom pri razliitim
temperaturama, pri istim koncentracionim uslovima reaktanata (slika 4.50), uoava se da se
sa poveanjem temperature znatno smanjuje vremenski interval u kome postoji linearna
zavisnost izmeu apsorbance rastvora i vremena odigravanja reakcije. Zato je najbolje vriti
merenja i ispitivati kinetiku degradacije antocijana hidroksil radikalima pri temperaturama
manjim od 30
o
C, kada jo uvek u dovoljno dugom vremenskom intervalu postoji linearnost
182

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
t
g
o
x
1
0
2
c (Cu(II))x10
3
mol/L

Slika 4.54. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije Cu(II). Koncentracije reaktanata u
rastvoru: Antocijani - 0.17910
-3
mol/L; H
2
O
2
- 0,098 mol/L; pH=3,5; t = 22 0,1
o
C.

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
t
g

x
1
0
2
t
0
C

Slika 4.55. Zavisnost brzine reakcije od temperature. Koncentracije reaktanata u rastvoru:
Antocijani 0.17910
-3
mol/L; H
2
O
2
0,098 mol/L; Cu(II) 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5.

183

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
t
g
o
x
1
0
2
V, ml

Slika 4.56. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana. Koncentracije reaktanata u
rastvoru: H
2
O
2
0,098 mol/L; Cu(II) 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5, t = 22 0,1
o
C.

Zavisnost brzine reakcije degradacije od koncentracije antocijana u reakcionoj smei
prikazana je na slici 4.56. Razliite koncentracije antocijana su dobijene odmeravanjem
razliitih zapremina vina od 0,5 do 3,0 ml. Ukupna zapremina reakcione smee je 10 ml.
Brzina reakcije linerano raste sa poveanjem zapremine vina, odnosno koncentracije
antocijana u reakcionoj smei, te je reakcija +1 reda u odnosu na koncentraciju antocijana.
Slika 4.56. pokazuje ovu zavisnost, pri emu je odreeno da odseak prave na osu tg iznosi
0,026 10
-2
.
Na osnovu predhodno iznetih rezultata postavljena je kinetika jednaina za reakciju
degradacije antocijana crvenih vina hidroksil radikalima u kiseloj sredini (pH=3,5) pri
koncentraciji H
2
O
2
od 0,049 do 0,490 mol/L i Cu(II) od 0,615 10
-4
do 6,150 10
-4
mol/L.

4.1
Na osnovu poslednje jednaine izraunate su konstante brzine reakcije degradacije
antocijana u crvenom vinu Vranac, uzimajui vrednost molarne mase od 493 g/mol i
molarnog apsorpcionog koeficijenta od 28 000 dm
3
mol
-1
cm
-1
za malvidin-3-glukozid (tabela
4.41), kao komponente iji je sadraj dominantan u odnosu na sadraj svih ostalih antocijana
prisutnih u crvenim vinima (tabela 4.14).

184

Tabela 4.41. Konstante brzine reakcije degradacije antocijana u crvenom vinu hidroksil
radikalima na razliitim temperaturama.
t
o
C k
1
, mol
2
dm
-6
min
-1

22
27
32
37
23,490,005
1
33,910,007
49,630,010
70,310,009
1

Ukoliko se predstavi logaritam konstante brzine reakcije u funkciji reciprone vrednosti
apsolutne temperature dobija se prava prikazana na slici 4.57, iz ijeg nagiba se moe
izraunati energija aktivacije E
a
primenom jednaine (2.2):

E
a
= tg 19,14 [kJmol
-1
] 4.2

3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36 3.38 3.40
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
l
n
k
1/Tx10
3

Slika 4.57. Zavisnost ln k od reciprone vrednosti apsolutne temperature.
Ostali termodinamiki parametri, promena entalpije (H
*
), promena entropije (S
*
),
promena slobodne energije (G
*
) i pK
*
vrednost aktiviranog kompleksa izraunati su
primenom sledeih jednaina:
H
*
= E
a
nR T 4.3
gde je n molekularnost,
185

odnosno,
H
*
= E
a
R T za reakcije u rastvorima
S
*
= 19,14 (log k log T -10,3178 + H
*
/19,14 T) 4.4
G
*
= H
*
- T S
*
4.5
pK* = G
*
/19,14T 4.6
Vrednosti izraunatih termodinamikih parametara aktiviranog stanja, primenom
jednaina 4.2 4.6 prikazane su u tabeli 4.42.

Tabela 4.42. Termodinamiki parametri aktiviranog kompleksa reakcije degradacije
antocijana u crvenom vinu hidroksil radikalima na 295K.
Ea
(kJmol
-1
)
H
*

(kJmol
-1
)
S
*
(JK
-1
mol
-1
)
G
*
(kJmol
-1
)
pK
*

56,37 53,91 -35,52 64,39 11,40

4.2.1.2. Validacija kinetiko-spektroforometrijske metode za odreivanje
antocijana crvenih vina

Validacija metode izvrena je odreivanjem intervala linearnosti, limita detekcije,
limita kvantifikacije, tanosti i preciznosti metode.
Linearnost
Uticaj antocijana na brzinu reakcije praen je pri predhodno odabranim uslovima
odigravanja reakcije pri temperature od 22
o
C. Razliite koncentracije antocijana dobijene su
odmeravanjem razliitih zapremina vina Vranac, ije su koncentracije odreene metodom
unutranjeg standarda (Katelan-Macan, 2003). Tangens ugla odseka odreen je na osnovu
zavisnosti prikazane na slici 4.56, i on iznosi 0,026 10
-2
. Koncentracija antocijana u datoj
zapremini crvenog vina odreena je na osnovu zavisnosti date na slici 4.58, i na osnovu
jednaine:

4.7
gde je:
- koncentracija antocijana u uzorku

186

- koncentracija dodatog standarda (Mv-3-G)

- tanges odseka kalibracione prace za c=0

- tangens uzorka

- tangens uzorka sa standardom

Slika 4.58. Grafiki prikaz metode unutranjeg standarda.

Metodu unutranjeg standarda za odreivanje komponenti u uzorcima vina koristili su i
drugi autori (Kordi-Krape i sar. 2001). Na osnovu izraunatih vrednosti za antocijane u
reakcionoj smei, dobivena je linearna zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana u
intervalu od 21,92 do 131,52 g/ml (slika 4.59), koja se moe predstaviti jednainom:
tg = 0,001356 c
x
+ 0,02641 4.8
r = 0,998 s
o
= 0,0025

187

20 40 60 80 100 120 140
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
t
g
o

x
1
0
2

c (M3G) g/mL

Slika 4.59. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana. Koncentracije reaktanata u
rastvoru: Cu(II) 1,23210
-4
mol/L ; H
2
O
2
0,098 mol/L; pH=3,5, t = 22 0,1
o
C.

Limit detekcije i limit kvantifikacije
Limit detekcije (c
L
) i limit kvantifikacije (c
Q
) izraunat je na osnovu jednaina 2.46 i
2.47.
Dobijene vrednosti su 6,08 i 18,44 g/ml.
Preciznost i tanost metode odreivanja antocijana u crvenim vinima
Preciznost metode je odreena odmeravanjem iste zapremine vina (1,0 ml) bez i sa
dodatkom M3G (20,0; 30,0 i 50,0 g/ml) iz pet ponavljanja. Za svaku reakcionu smeu
izraunata je relativna standardna devijacija (RSD). Rezultati dobiveni statistikom obradom
podataka dati su u tabeli 4.43.

Tabela 4.43. Preciznost odreivanja antocijana u crvenim vinima.
Dodato Mv-3-G
(g/ml)
Ukupno antocijana
(g/ml)
RSD (n=5)
%
0 43,36 3,88
20,0 63,13 2,34
30,0 73,16 2,99
50,0 93,36 2,43

188

Tanost metode je definisana odnosom odreene i dodate koncentracije standardnog
rastvora Mv-3-G u istoj zapremini vina iz pet merenja. Izraunata je relativna greka, a
rezultati prikazani u tabeli 4.44.

Tabela 4.44. Tanost odreivanja antocijana u crvenim vinima.
Dodato Mv-3-G
(g/ml)
odreeno Mv-3-G
(g/ml)
RG
%
20,0 20,34 5,35
40,0 40,66 3,73
60,0 60,40 2,16

Rezultati iz tabela 4.43 i 4.44 pokazuju da se antocijani u crvenim vinima predloenom
kinetikom metodom mogu odreivati sa zadovoljavajuom preciznou i tanou.

Primena metode za odreivanje antocijana
Predloena metoda je primenjena za odreivanje sadraja antocijana u crvenim vinima.
Dobijeni rezultati su uporeeni sa rezultatima koji su dobijeni HPLC metodom. Rezultati
odreivanja antocijana u crvenim mladim vinima prikazani su u tabeli 4.45.

Tabela 4.45. Odreivanje sadraja (mg/L)
1,2
antocijana u crvenim vinima kinetiko-
spektrofotometrijskom i HPLC metodom.
Vino Kinetiko-
spektrofotometrijska
metoda
HPLC
metoda

t- test
3

F- test
3

Vranac-
Aleksandrovac
355,746,63 349,792,77 1,79 5,39
Crnogorski
Vranac
462,815,95 457,812,83 1,69 4,41
Makedonsko
crveno
399,766,00 394,212,85 1,87 4,43
1
2
mg malvidin-3-glukozid ekvivalenta/L vina;
3
tabelarne F- i t-
vrednosti pri 95%-nom nivou poverenja su 6,39 i 2,306.
189

Vrednosti F-testa i Studentovog t-testa pokazale su da nema znaajnije razlike u
rezultatima dobijenim kinetiko-spektrofotometrijskom i HPLC metodom za sve uzorake
(F
eksp.
< F
tab.
i t
eksp.
< t
tab.
), pa se moe zakljuiti da se razraena kinetiko-spektrofotometrijska
metoda moe uspeno primeniti za oreivanje sadraja antocijana u crvenim vinima.

190

4.2.2. I spitivanje kinetike reakcije degradacije antocijana crvenih
vina HPLC metodom

Efekat temperature (Verbeyst i sar., 2010, Ahmed i sar., 2004) i H
2
O
2
(zkan i sar.,
2002) na stabilnost antocijana je dobro ispitan. Meutim, istovremeni efekat Cu(II), H
2
O
2
i
temperature na stabilnost antocijana do sada nije ispitivan, a takoe i uticaj pomenutih faktora
na stabilnost najzastupljenih antocijana u vinu malvidin-3-glukozida i malvidin-3-acetil-
glukozida. U daljem radu praena je promena sadraja malvidin-3-glukozida (Mv-3-G) i
malvidin-3-acetl-glukozida (Mv-3-AG) sa vremeom pod uticajem Cu(II), H
2
O
2
i temperature
HPLC metodom.

4.2.2.1. Validacija HPLC metode za odreivanje Mv-3-G

Pri validaciji HPLC metode za odreivanje Mv-3-G vreno je odreivanje sledeih
parametara: intervala linearnosti, limita detekcije, limita kvantifikacije, tanosti i preciznosti.
Linearnost
Odreena je linearnost povrine pika za Mv-3-G prema njegovoj koncentraciji.
Rastvori za linearnost su injektovani tri puta. Rastvori standarda za linearnost odgovaraju
sadraju od 2,0 do 150 mg/L. Na slici 4.60 prikazana je linearna zavisnost odgovora pika
Mv-3-G (povrina pika) prema njegovoj koncentraciji (R
2
=0,999, nagib prave = 3,207)
Limit detekcije (c
L
Q
) izraunati su na osnovu jednaina 2.46 i
2.47. Standardna devijacija y-odseka regresione linije za kalibracionu pravu koja pokriva
podruje od 2,0 do 150 mg/L je 0,508 za Mv-3-G. Ova vrednost je koriena kao standardna
devijacija odgovora. Izraunata vrednost za c
L
je bila 0,52 mg/L, dok je za c
Q
iznosila 1,58
mg/L.

191

0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
100
200
300
400
500
P
c mg/L

Slika 4.60. Linearna zavisnost povrine pika od koncentracije Mv-3-G.

Preciznost i tanost HPLC metode
Preciznost i tanost HPLC metode odreene su za prvu koncentraciju sa kalibracione
prave iz pet uzastopnih merenja (1) i pet merenja iste koncentracije Mv-3-G u toku jednog
meseca sa vremenskim razmakom od 5 dana (2) pri istim uslovima i na istom aparatu (tabela
4.46). Relativna standardna devijacija u prvom sluaju iznosi 3,80, a u drugom 7,58%.

Tabela 4.46. Preciznost i tanost HPLC metode.
Odmereno
(g/ml)
Naeno(1)
xSD
1
g/ml
Naeno(2)
xSD
1
g/ml
RSD(1)
%
RSD(2)
%
(x-/)
100 (1)
%
(x-/)
100 (2)
%
2,0 1,990,08 2,050,16 3,80 7,58 -0,10 +2,62
1
srednja vrednost SD (n= 5).

192


Mlado crveno vino Vranac (Rubin, Kruevac), koje je korieno za ispitivanje kinetike
degradacije antocijana spektrofotometrijskom metodom, korieno je i za ispitivanje kinetike
degradacije individualnih antocijana, tanije malvidin-3-glukozida i malvidin-3-acetil-
glukozida, najzastupljenijih antocijana HPLC metodom. HPLC metodom je odreeno da
vino Vranac sadri 281,31 mg/L Mv-3-G i 44,36 mg/L Mv-3-AG.
Da bi se pratila promena antocijana HPLC metodom bio je potreban znatno dui
vremenski period (oko 180 min) u odnosu na spektrofotometrijsku metodu, pa je to bio razlog
smanjenja poetnih koncentracija H
2
O
2
i Cu(II) jona i snimanja HPLC hromatograma u toku
prvih 35 min po inektiranju. Poetne koncentracije Mv-3-G i Mv-3-AG odreene su na
osnovu povrine pikova ovih komponenti crvenog vina istog razblaenja (1:2), odnosno
140,65 mg/L Mv-3-G i 22,18 mg/L Mv-3-AG, to odgovara koncentraciji od 2,8510
-4
mol/L,
odnosno 4,49 10
-5
mol/L preraunato na molarnu masu Mv-3-G.
U cilju izuavanja kinetike degradacije antocijana snimljeni su hromatogrami sistema
vino, vino+H
2
O
2
i vino+H
2
O
2
+Cu(II) u 35 min nakon pripremanja reakcionog rastvora.
Dobijeni hromatogrami prikazani su na slici 4.28. Sa prikazanih hromatograma se uoava da
se povrine pikova za Mv-3-G (pik 1) i Mv-3-AG (pik 2) smanjuju u prisustvu H
2
O
2
, to
ukazuje na proces njihove oksidacije pod uticajem ovog oksidansa (slika 4.61, hromatogram
2). Kada se reakcionoj smei pored vodonik peroksida dodaju i Cu(II) joni, uoeno je da se
proces oksidacije znatno ubrzava (slika 4.61, hromatogram 3), to ukazuje na katalitiki
efekat Cu(II) jona u reakciji stvaranja hidroksil radikala.
Praenjem promene povrine pikova, odnosno koncentracije Mv-3-G i Mv-3-AG sa
vremenom u sistemu koji sadri vino, H
2
O
2
i Cu(II) jone, uoeno je linearno smanjenje
koncentracije sa vremenom u toku prvih 120-180 min odigravanja reakcije degradacije
(4.62), pa se mogla primeniti metoda inicijalne brzine. U cilju ispitivanja kinetike degradacije
Mv-3-G i Mv-3-AG, ispitan je uticaj koncentracije reagujuih komponenata i temperature na
brzinu reakcije degradacije. pH reakcionih smea bio je 3,5 (podeen vinskom kiselinom).
Zavisnost brzine reakcije od koncentracije vodonik-peroksida u intervalu od 4,90 do
24,48 mmol/L prikazana je na slici 4.63. Brzine reakcija rastu sa poveanjem koncentracije
ovog reaktanta, te su obe reakcije +1 reda u odnosu na H
2
O
2
u ispitivanom intervalu
koncentracija. Dalja merenja su vrena pri koncentraciji H
2
O
2
od 14,69 mmol/L.

193

Slika 4.61. Hromatogram antocijana reakcione smee 35 min nakon pripremanja: (1)
vino+voda; (2) vino+H
2
O
2
+voda; (3) vino+ H
2
O
2
+Cu(II)+voda. Pik 1- Mv-3-G, pik 2 Mv-
3-AG. Koncentracije reaktanata u rastvoru: Mv-3-G -2,8510
-4
mol/L ili Mv-3-AG - 4,4910
-
5
mol/L; Cu(II) - 1,8510
-5
mol/L; H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

194

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
0.30
c
x
1
0
3

m
o
l
/
L
t, min
1
2
3
4
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
c
x
1
0
3

m
o
l
/
L
t, min
1
2
3
4

Slika 4.62. Promena apsorbance rastvora sa vremenom za razliite temperature: - 25
0
C;
-30
0
C; -35
0
C; -40
0
C; a) za Mv-3-G, b) za Mv-3-AG. Koncentracije reaktanata u
rastvoru: Mv-3-G -2,8510
-4
-5
mol/L; Cu(II)- 1,8510
-5
mol/L;
H
2
O
2
-14,6910
-3
mol/L; pH=3,5.

5 10 15 20 25
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
c(H
2
O
2
) mmol/L
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1

2
O
2
za Mv-3-G (a) i Mv-3-AG (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: Mv-3-G - 2,85 10
-4
mol/L ili Mv-3-AG - 4,49 10
-
5
mol/L; Cu(II) - 3,0810
-5
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.
Uticaj koncentracije Cu(II) na brzinu reakcije degradacije Mv-3-G i Mv-3-AG hidroksil
radikalima je posmatran u intervalu od 0,615 10
-5
do 3,08 10
-5
mol/L (slika 4.64). Brzina
reakcija raste sa poveanjem koncentracije ovog reaktanta. Reakcije su +1 reda u odnosu na
Cu(II) u ispitivanom intervalu koncentracija. Koncentracija Cu(II) od 1,85 10
-5
mol/L je
odabrana za dalji rad.
5 10 15 20 25
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1
c(H
2
O
2
) mmol/L
195

Slika 4.64. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije Cu(II) za Mv-3-G (a) i Mv-3-AG (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: Mv-3-G - 2,8510
-4
-5
mol/L;
H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Uticaj koncentracije M3G i M3AG (odmeravanjem razliitih zapremina vina u reakcionu
smeu koja je termostatirana na zadatoj temperaturi) na brzinu reakcije degradacije praen je
pri predhodno odabranim uslovima: c(H
2
O
2
) = 14,69 mmol/L; c(Cu(II)) = 1,85 10
-5
mol/L; t
= 25 0,1
o
C. Dobijena je linearna zavisnost u intervalu koncentracija od 1,425 10
-4
do 2,850
10
-4
mol/L za Mv-3-G i 2,245 10
-5
do 4,490 10
-5
mol/L za Mv-3-AG (slika 4.65).
Brzine ispitivanih reakcija praene su pri odabranim uslovima na etiri temperature:
25, 30, 35 i 40
o
C. Dobijene zavisnosti c = (t) su za temperature od 25 i 30
o
C linearne u
celom ispitivanom vremenskom intervalu (slika 4.62), dok se na temperaturama od 35 i 40
o
C
ovaj interval smanjuje. Grafike zavisnosti brzine reakcije degradacije Mv-3-G i Mv-3-AG
od temperature prikazane su na slici 4.66.

0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1
c(Cu(II))x10
4
mol/L
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.08
0.09
0.10
0.11
0.12
0.13
0.14
0.15
0.16
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1
c(Cu(II))x10
4
mol/L
196

Slika 4.65. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije Mv-3-G (a) i Mv-3-AG (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: Cu(II) - 1,8510
-5
mol/L; H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L;
pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1
t
0
C
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
v
x
1
0
6

m
i
n
-
1
t
0
C

Slika 4.66. Zavisnost brzine reakcije od temperature za Mv-3-G (a) i Mv-3-AG (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: Mv-3-G - 2,8510
-4
-5
mol/L;
H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L; Cu(II) - 1,8510
-5
mol/L ; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Na osnovu predhodno dobijenih zavisnosti brzina reakcija degradacije Mv-3-G i Mv-3-
AG od koncentracije svakog reaktanta pojedinano, kao i odreivanog reda reakcije u odnosu
na koncentraciju svakog reaktanta pojedinano, mogu se postaviti kinetike jednaine ovih
procesa:

4.9
0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 0.26 0.28 0.30
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1
c(M3G)x10
3
mol/L
0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
0.07
0.08
0.09
0.10
0.11
0.12
v
x
1
0
6
m
i
n
-
1
c(M3AG)x10
4
mol/L
197

4.10
za interval koncentracija: H
2
O
2
= (4,90 - 24,48) 10
-3
mol/L; Cu(II) = (0,615 3,08) 10
-5

mol/L; Mv-3-G = (1,425 - 2,850) 10
-4
mol/L, odnosno Mv-3-AG = (2,245 - 4,490) 10
-
5
mol/L.
gde je: -dc/dt promena koncentracije antocijana; k
M3G
i k
M3AG
konstante brzine reakcije
degradacije Mv-3-G, odnosno Mv-3-AG.
Na osnovu kinetikih jednaina (4.9 i 4.10) izraunate su konstante brzine reakcija na
etiri razliite temperature (tabela 4.47).
Tabela 4.47. Konstante brzine reakcija degradacije Mv-3-G i Mv-3-AG u crvenom vinu
hidroksil radikalima na razliitim temperaturama.
t
0
C k
1
(Mv-3-G) mol
-2
dm
-6
min
-1
k
1
(Mv-3-AG) mol
-2
dm
-6
min
-1

25 0,951 x 10
4
0,976 x 10
4

30 1,316 x 10
4
1,369 x 10
4

35 1,884 x 10
4
1,895 x 10
4

40 2,547 x 10
4
2,649 x 10
4

1
srednja vrednost (n=5)
Energije aktivacije, a potom i ostali termodinamiki parametri reakcija degradacije
antocijana u crvenom vinu hidroksil radikalima odreeni su na osnovu vrednosti nagiba
pravih prikazanih na slici 4.67.
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
9.0
9.2
9.4
9.6
9.8
10.0
10.2
l
n
k

(
M
3
G
)
1/Tx10
3
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
9.2
9.4
9.6
9.8
10.0
10.2
l
n
k

(
M
3
A
G
)
1/Tx10
3

Slika 4.67. Zavisnost ln k od reciprone vrednosti apsolutne temperature za Mv-3-G (a) i Mv-
3-AG (b).

198

Vrednosti izraunatih termodinamikih parametara reakcija degradacije aktiviranog
kompleksa, primenom jednaina 4.2-4.6, date su u tabeli 4.48.

Tabela 4.48. Termodinamiki parametri reakcija degradacije Mv-3-G i Mv-3-AG u crvenom
vinu hidroksil radikalima na 298K.
sistem

Ea
(kJmol
-1
)
H
*

(kJmol
-1
)
S
*
(JK
-1
mol
-1
)
G
*
(kJmol
-1
)
pK
*

Mv-3-G+H
2
O
2
+Cu(II) 57,70 55,22 16,59 60,16 10,55
Mv-3-AG+H
2
O
2
+Cu(II) 57,74 55,26 16,94 60,31 10,57

199

4.2.3. I spitivanje kinetike reakcije degradacije flavan-3-ola crvenih
vina HPLC metodom

Katehini i njegovi polimeri su glavni nosioci ukusa crvenih vina. Izvori gorine i
astrigencije su pre svega monomeri katehina (Singleton i sar., 1992). Mlada crvena vina
bogatija su monomernim anrocijanima, a siromanija u taninima. Po miljenju mnogih autora
ta vina su bolji izvor antioksidanata od starih vina (Pellegrini i sad., 1998). Takoe, mnogi
autori tvrde da je korelacija izmeu sadraja antocijana i antioksidativnog potencijala crvenih
vina niska (Burns i sar., 2000), a kao snani antioksidanti navode se katehin, epikatehin i
proantocijanidoli (Anis i sar., 2002). Ispitivanjem antioksidativnog delovanja epikatehina
konstatovano je da epikatehin pod dejstvom slobodnih radikala biva konvertovan u jedinjenja
slina antocijanima, koja takoe imaju antioksidativnu funkciju. Slika 2.32 prikazuje reakciju
oksidacije katehina kiseonikom u prisustvu Cu(II) jona. Mi smo takoe ispitivali kinetiku
degradacije katehina i epikatehina da bi se potvrdilo da su oni dobri hvatai slobodnih
radikala, tanije hidroksil radikala koji nastaju u sistemu Cu(II)/H
2
O
2
. Mlado crveno vino
Vranac je korieno za ispitivanje kinetike degradacije katehina i epikatehina. HPLC
metodom je odreeno da vino Vranac sadri 25,60 mg/L katehina i 18,24 mg/L epikatehina.

4.2.3.1. Validacija HPLC metode za odreivanje katehina i epikatehina

Pri validaciji HPLC metode za odreivanje katehina i epikatehina vreno je odreivanje
sledeih parametara: intervala linearnosti, limita detekcije, limita kvantifikacije, tanosti i
preciznosti.
Linearnost
Odreena je linearnost povrine pika za katehin i epikatehin prema njihovoj
koncentraciji. Rastvori za linearnost su injektovani tri puta. Rastvori standarda za linearnost
odgovaraju sadraju od 1,0 do 30,0 mg/L za katehin i za epikatehin. Na slici 4.68 prikazana je
linearna zavisnost povrine pika katehina (R
2
=0,999, nagib prave = 4,598) i epikatehina
(R
2
=0,998, nagib prave = 4,639) prema njegovoj koncentraciji.
Limit detekcije (c
L
Q
2.47. Standardna devijacija y-odseka regresione linije za kalibracionu pravu koja pokriva
podruje od 1,0 do 30 mg/L je 0,320 za katehin i 0,393 za epikatehin. Ove vrednosti su
koriene kao standardne devijacije odgovora. Izraunate vrednosti za c
L
i c
Q
su 0,23 i 0,69
g/ml za katehin, odnosno 0,28 i 0,85 g/ml za epikatehin.
200

0 5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
120
140
P
c (C) mg/L

0 5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
120
140
160
P
c (EC) mg/L

Slika 4.68. Zavisnost povrine pika od koncentracije katehina (a) i epikatehina.

Preciznost i tanost HPLC metode
Preciznost i tanost HPLC metode odreene su za jednu koncentraciju sa kalibracione
prave iz pet uzastopnih merenja (1) i pet merenja iste koncentracije katehina, odnosno
epikatehina u toku jednog meseca sa vremenskim razmakom od 5 dana (2) pri istim uslovima
i na istom aparatu (tabela 4.49). Relativna standardna devijacija u prvom sluaju iznosi 2,18 i
2,54, a u drugom 4,43 i 4,57%.

Tabela 4.49. Preciznost i tanost HPLC metode.
Odmereno
(g/ml)
Naeno(1)
xSD
1
g/ml
Naeno(2)
xSD
1
g/ml
RSD(1)
%
RSD(2)
%
(x-/)
100 (1)
%
(x-/)
100 (2)
%
Katehin
5,0
Epikatehin
5,0

5,030,11

4,960,11

5,080,22

5,020,23

2,18

2,54

4,43

4,57

+0,52

-0,8

+1,60

+0,40
1
srednja vrednost SD (n= 5).

201


Za obradu kinetikih podataka primenjena je metoda inicijalne brzine. Promena
koncentracije katehina i epikatehina sa vremenom praena je tokom 160 min nakon
pripremanja reakcione smee, prema postupku datom u delu 3.3.5.2. Dobijene zavisnosti
c=(t) su linearne to se moe videti na slici 4.69.
U cilju ispitivanja kinetike degradacije katehina i epikatehina hidroksil radikalima
(pH=3,5 podeen vinskom kiselinom) bilo je potrebno odrediti uslove odigravanja reakcije. U
tu svrhu praena je promena brzine reakcije degradacije od koncentracije svakog reaktanta
pojedinano (H
2
O
2
, Cu(II), katehina, tj. epikatehina).
Na slici 4.70 se zapaa da su brzine reakcije degradacije katehina i epikatehina linearne
u celom ispitivanom intervalu koncentracija vodonik peroksida, tako da su obe reakcije +1
reda. Za dalji rad odabrana je koncentracija H
2
O
2
od 14,69 10
-3
mol/L.

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
2.9
3.0
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
4.0
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
c

(
C
)
x
1
0
5

m
o
l
/
L
t, min
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
c

(
E
C
)
x
1
0
5

m
o
l
/
L
t, min

Slika 4.69. Promena koncentracije katehina (a) i epikatehina sa vremenom za razliite
temperature: - 25
0
C; -35
0
C. Koncentracije reaktanata u rastvoru: katehin - 4,39 10
-
5
mol/L ili epikatehin - 3,13 10
-5
mol/L); Cu(II) - 1,8510
-5
mol/L; H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L;
pH=3,5.

202

5 10 15 20 25
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
v
x
1
0
7

m
i
n
-
1
c(H
2
O
2
)x10
3
mol/L
5 10 15 20 25
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
v
x
1
0
7

m
o
l
-
1
c(H
2
O
2
)x10
3
mol/L

2
O
2
za katehin (a) i epikatehin (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: katehin - 4,39 10
-5
-
5
mol/L); Cu(II) - 3,0810
-5
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Ispitivanjem uticaja Cu(II) jona na brzinu degradacije katehina i epikatehina (slika
4.71), vidi se da su zavisnosti brzina reakcija linearne u celom ispitivanom intervalu
koncentracija bakra, tako da su obe reakcije +1 reda. Za dalji rad je odabrana koncentracija
bakra od 1,85 10
-5
mol/L.
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
v
x
1
0
7

m
i
n
-
1
c(Cu(II))x10
4
mol/L
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
v
x
1
0
7

m
i
n
-
1
c(Cu(II))x10
4
mol/L

Slika 4.71. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije Cu(II) za katehin (a) i epikatehin (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: katehin - 4,39 10
-5
-
5
mol/L; H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Pri odabranim uslovima odigravanja reakcije, praena je zavisnost brzine reakcija
degradacije od koncentracije katehina i epikatehina (odmeravanjem razliitih zapremina vina
203

u reakcionu smeu). Na slici 4.72 je prikazana zavisnost brzine reakcije od koncentracije
katehina, odnosno epikatehina.
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
v
x
1
0
7

m
o
l
-
1
c(C)x10
5
mol/L
1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
v
x
1
0
7

m
o
l
-
1
c(EC)x10
5
mol/L

Slika 4.72. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije katehina (a) i epikatehina (b).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: Cu(II) - 1,8510
-5
mol/L; H
2
O
2
- 14,6910
-3
mol/L;
pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Na osnovu prikazanih zavisnosti izmeu brzina reakcija degradacije katehina i
epikatehina hidroksil radikalima, od koncentracije svakog reaktanta pojedinano, postavljene
su odgovarajue kinetike jednaine za oba procesa. Kinetike jednaine za reakciju
degradacije katehina, odnosno epikatehina su sledee:

4.11

4.12
gde su:
dc/dt promena koncentracije katehina, odnosno epikatehina
k
C
, k
EC
konstanta brzine reakcije degradacije katehina, odnosno epikatehina.

Na osnovu kinetikih jednaina (4.11 ,4.12) izraunate su konstante brzine reakcija na
etiri razliite temperature (tabela 4.50).

204

Tabela 4.50. Konstante brzine reakcija degradacije katehina i epikatehina u crvenom vinu
hidroksil radikalima na razliitim temperaturama.
1
srednja vrednost (n=5).

Energije aktivacije reakcija degradacije katehina i epikatehina odreene su na osnovu
vrednosti nagiba pravih prikazanih na slici 4.73.

3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
8.2
8.4
8.6
8.8
9.0
9.2
9.4
l
n

k

(
C
)
1/Tx10
3
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
8.8
9.0
9.2
9.4
9.6
9.8
l
n

k

(
E
C
)
1/Tx10
3

Slika 4.73. Zavisnost ln k od reciprone vrednosti apsolutne temperature za katehin (a) i
epikatehin (b).

Vrednost izraunatih termodinamikih parametara aktiviranog kompleksa reakcija
degradacije katehina i epikatehina hidroksil radikalima, primenom jednaina 4.2 2.6, date
su u tabeli 4.51.

t
o
C k
c
1
k
ec
1
25
30
35
40
4.29 10
3

5.91 10
3

8.08 10
3

10.45 10
3

7.27 10
3

9.58 10
3

12.35 10
3

16.38 10
3

205

Tabela 4.51. Termodinamiki parametri aktiviranih kompleksa reakcija degradacije katehina
i epikatehina u crvenom vinu hidroksil radikalima na 298
0
C.
sistem

Ea
(kJmol
-1
)
H
*

(kJmol
-1
)
S
*
(JK
-1
mol
-1
)
G
*
(kJmol
-1
)
pK
*

katehin+H
2
O
2
+Cu(II) 45,219 42,743 -31,88 52,243 9,16
epikatehin+H
2
O
2
+Cu(II) 41,42 38,941 -40,25 50,938 8,93

206

degradacije fenolnih jedinjenja belih vina

Proizvodnja belih vina zahteva velike napore da bi se izbegli kontakti sa kiseonikom
koji mogu biti tetni u smislu promene boje (potamnjivanje, brovingovanje) i eventualno
moe ugroziti kvalitet vina.
Potamnjivanje je ozbiljan problem u proizvodnji belih vina. Potamnjivanje je rezultat
serije sloenih reakcija oksidacije koje se deavaju za vreme faze obrade i prerade, starenja i
skaditenja, to doprinosi poveanju intenziteta braon boje. Ove reakcije mogu biti enzimske
i neenzimske. Neenzimska oksidacija moe da se dogodi u odsustvu aktivne polifenolne
oksidaze, rezultujui pojavu vie ili manje intenzivne braon boje i drvenaste arome zbog
formiranja pigmenata visoke molekulske mase reakcijama prikazanim na slici 2.31. Ovaj
fenomen se smatra poeljnim u sluaju desertnih vina, ali je zato nepoeljan u sluaju mladih
vina, penuastih i zrelih crvenih vina.
Dobro je poznato da reakcije koje dovode do brovingovanja belih vina zavise od
polifenolnog sastava, ali su podjednako vani i faktori koji utiu na oksidaciju polifenola kao
to su prelazni metali i prisustvo SO
2
i askorbinske kiseline.
Najvanija polifenolna jedinjenja u belim vinima, u smislu kvaliteta i sposobnosti
uestvovanja u oksido-redukcionim reakcijama, su flavanoli i hidroksicinamati. Posebno
kafena kiselina, kaftarna kiselina, kao i katehin, epikatehin i njihovi derivati za koje je
ustanovljeno da daju izvestan broj oksidacionih proizvoda, mogu se smatrati potencijalnim
agensima brovingovanja. Dokaz ovih tvrdnji su rezultati Clarka i Scollary-ja (2002), koji su
navedeni u delu 4.1.5. Takoe, Kallithraka i sar. (2009b) su prouavali promenu sastava
belih grkih vina tokom starenja u boci i primenom ubrzanog testa brovingovanja tokom 12
dana na temperaturi od 55
o
C. Pri tome su HPLC metodom ustanovili da se koncentracija
katehina tokom 9 meseci starenja u boci (odnosno tokom 12 dana testa ubrzanog
brovingovanja) smanji za 42,3% (odnosno 5,8%), epikatehina za 87,6(34,3), kaftarne kiseline
za 33,0 (4,6), ali se istovremeno poveava apsorbancija na 420 nm usled nastajanja
reakcionih proizvoda. Tokom ubrzanog brovingovanja ustanovljeno je da ovaj proces
brovingovanja prati bifazni tok, prvo naglim poveanjem i kasnije smanjenjem za 3 dana, a
zatim sledi linearno poveanje apsorbancije na 420 nm za 10 dana (Salaha i sar., 2008).
Slian tok procesa ustanovili su Perez-Zuniga i sar. (2000) testom ubrzanog brovingovanja u
toku 40 dana na 45
o
C

za est panskih belih vina.
Brovingovanje belih vina ima uticaja i na organoleptike karakteristike vina i na njihov
antioksidativni status. Ipak, za vina proizvedena u Srbiji, proces brovingovanja nije ispitan.
Za ispitivanje procesa brovingovanja belih srpskih vina u ovom radu koristien je test
ubrzanog brovingovanja hidroksil radikalima, koji do sada u ovu svrhu nije korien.

207


Brzina reakcije brovingovanja belih vina praena je spektrofotometrijski merenjem
promene apsorbancije na 420 nm tokom 40 min po pripremanju reakcione smee, po
postupku datom u delu 3.3.5.1. Ukupna zapremina reakcione smee je 5 ml. Dobijene
zavisnosti A = (t) za razliite koncentracije vina nisu linearne u celom ispitivanom
vremenskom intervalu (slika 4.74) ve pokazuju dvofazni smer: poetni period od 20 min
karakteristian je po porastu i smanjenju potamnjivanja, odnosno apsorbancije na 420 nm a
posle toga se uoava linearno poveanje apsorbance, to je u skladu sa rezultatima gore
pomenutih autora. Za obradu kinetikih podataka primenjena je diferencijalna varijanta
tangensne metode za vremenski period od 20 do 40 min odigravanja reakcije.
0 10 20 30 40
0.065
0.070
0.075
0.080
0.085
0.090
0.095
0.100
0.105
0.110
A
t, min

Slika 4.74. Promena apsorbance rastvora sa vremenom za zapremine belog vina: - 1 ml;
-2 ml; -3 ml. Koncentracije reaktanata u rastvoru: Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; H
2
O
2
- 0,098
mol/L pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

U cilju ispitivanja kinetike brovingovanja belih vina, praen je uticaj koncentracije
svih reaktanata (H
2
O
2
, Cu(II), belog vina Smederevka) i temperature na brzinu ispitivane
reakcije pri pH=3,5 (podeen vinskom kiselinom).
Kako su mnogi autori (Salacha i sar. 2008; Sioumis i sar., 2005) potvrdili visok stepen
korelacije izmeu konstante brzine reakcije brovingovanja i sadraja ukupnih polifenola belih
vina, to se i sadraj polifenola belih vina moe dovesti u direktnu vezu sa procesom
razvijanja braon boje belih vina. To je omoguilo da proces brovingovanja belih vina
hidroksil radikalima bude iskorien za razradu kinetiko-spektrofotometrijske metode za
208

odreivanje ukupnih fenola belih vina, dovodei u direktnu zavisnost brzinu reakcije od
sadraja ukupnih fenola belih vina.
Zavisnost brzine reakcije od koncentracije vodonik-peroksida u intervalu od 0,098 do
0,294 mol/L prikazana je na slici 4.75. Brzina reakcije linearno raste u celom ispitivanom
intervalu koncentracija. Koncentracija H
2
O
2
od 0,098 mol/L je odabrana za dalji rad.
Reakcija je +1 u odnosu na H
2
O
2
u ispitivanom intervalu koncentracija.
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
t
g
o
x
1
0
3
C(H
2
O
2
) mol/L

2
O
2
rastvoru: V(vina) = 3 ml; Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Uticaj koncentracije Cu(II) jona na brzinu reakcije je posmatran u intervalu od 1,232 10
-
4
do 3,696 10
-4
mol/L (slika 4.76). Brzina reakcije raste sa poveanjem koncentracije ovog
reaktanta te je reakcija +1 reda u odnosu na Cu(II) u ispitivanom intervalu koncentracija.
Koncentracija 1,232 10
-4
mol/L je odabrana za dalji rad.
Radi ispitivanja uticaja koncentracije polifenolnih jedinjenja na brzinu reakcije u
reakcionu smeu su odmeravane razliite zapremine belog vina (slika 4.77). Zavisnost brzine
reakcije od koncentracije polifenola je linearna, tako da je reakcija +1 reda.

209

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
1.00
t
g
o
x
1
0
3
c(Cu(II))x10
4
mol/L

rastvoru: V(vina) = 3 ml; H
2
O
2
- 0,098 mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
t
g
o
x
1
0
3
V, ml

Slika 4.77. Zavisnost brzine reakcije od zapremine belog vina. Koncentracije reaktanata u
rastvoru: H
2
O
2
- 0,098 mol/L, Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Na osnovu prikazanih zavisnosti izmeu brzine reakcije degradacije belih vina hidroksil
radikalima, od koncentracije svakog reaktanta pojedinano, postavljena je kinetika
jednaina procesa:
4.13
210

Pri emu je sadraj polifenola u reakcionoj smei (odgovarajue zapremine belog vina
Smederevka bez H
2
O
2
i Cu(II) jona) odreen spektrofotometrijski pomou Folin-Ciocalteu
reagensa i on se kretao u intervalu od 0,143 10
-3
do 1,14 10
-3
mol GAE/L.
Brzina ispitivane reakcije praena je pri odabranim uslovima odigravanja reakcije na
etiri temperature: 25, 30 35 i 40
o
C. Grafika zavisnost brzine reakcije od temperature
prikazana je na slici 4.78.
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
t
g
o
x
1
0
3
t
0
C

Polifenoli 0,8610
-3
mol/L; H
2
O
2
- 0,0979 mol/L, Cu(II) = 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t =
25 0,1
o
C.

Konstante brzine reakcije izraunate su na osnovu kinetike jednaine 4.13 za etiri
razliite temperature (tabela 4.52), i to su uslovne konstante brzine s obzirom da su
nepoznate vrednosti molarne mase reakcionog proizvoda (tanije reakcionih proizvoda) i
molarnog apsorpcionog koeficijenta.

Tabela 4.52. Uslovne konstante brzine reakcije degradacije polifenolnih jedinjenja belih
vina hidroksil radikalima na razliitim temperaturama.
t
o
C k
1
, mol
2
dm
-6
min
-1

25
30
35
40
5,96 10
4
8,09 10
4
10,66 10
4

12,79 10
4

1
211

Energija aktivacije reakcije izraunata je na osnovu vrednosti nagiba prave prikazane na
slici 4.49, i ona iznosi 40,02 kJmol
-1
.
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
10.9
11.0
11.1
11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
11.7
11.8
11.9
l
n

k
1/Tx10
3


ukupnih polifenola belih vina

tanosti i preciznosti metode.
Linearnost
Uticaj polifenola na brzinu reakcije praen je pri predhodno odabranim uslovima
odigravanja reakcije pri temperaturi od 25
o
C. Razliite koncentracije polifenola dobijene su
odmeravanjem razliitih zapremina belog vina, ija je koncentracija odreena metodom
unutranjeg standarda, galne kiseline od 40 g/ml. Koncentracija polifenola u odmerenoj
zapremini vina odreena je na osnovu zavisnosti date na slici 4.58 a na osnovu jednaine
(4.7), i izraena kao mg GAE/L. Tangens ugla odseka odreen je na osnovu zavisnosti
prikazane na slici 4.77, i on iznosi 0,4 10
-3
.
Na osnovu izraunatih vrednosti za polifenole u reakcionoj smei, dobijena je linearna
zavisnost u intervalu koncentracija fenola od 23,01 do 194,11 g/ml (slika 4.80), koja se
moe koristiti za odreivanje polifenola u belim vinima.
212

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
t
g
o
x
1
0
3
c mg/L

Slika 4.80. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije polifenola. Koncentracije reaktanata u
rastvoru: Cu(II) 1,23210
-4
mol/L ; H
2
O
2
0,098 mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Kalibraciona kriva na 25
o
C se moe prikazati jednainom, koja je dobijena metodom
najmanjih kvadrata.
tg = 0,00145 c
x
+ 0,408 4.14
r = 0,999 s
o
= 0,00298

Limit detekcije (c
L
Q
2.47 i oni iznose 6,77 i 20,51 g/ml
Preciznost i tanost metode
Preciznost metode je odreena odmeravanjem iste zapremine vina (0,5 ml) bez i sa
dodatkom galne kiseline (70,0 i 170,0,0 g/ml) iz pet ponavljanja. Za svaku reakcionu smeu
izraunata je relativna standardna devijacija (RSD). Rezultati dobijeni statistikom obradom

213

Tabela 4.53. Preciznost odreivanja polifenola u beliim vinima.
Dodato GA
(g/ml)
Ukupno polifenola
(g/ml)
RSD (n=5)
%
0 23,01 3,85
70,0 97,81 1,79
170,0 194,11 2,49

rastvora galne kiseline u istoj zapremini vina iz pet merenja. Izraunata je relativna greka, a

Tabela 4.54. Tanost odreivanja polifenola u belim vinima.
Dodato GA
(g/ml)
Odreeno GA
(g/ml)
RG
%
30,0 34,20 4,92
60,0 66,27 2,66
90,0 97,03 1,52

Rezultati iz tabela 4.53 i 4.54 pokazuju da se polifenoli u belim vinima predloenom
kinetikom metodom mogu odreivati sa zadovoljavajuom preciznou i tanou.
Meutim, iako je relativna greka manja od 4,92%, moemo uoiti da su vrednosti za sadraj
galne kiseline uveane za oko 10%. Razlog tome je razliito ponaanje fenolnih komponenti
u belom vinu u odnosu na galnu kiselinu kada reaguju sa hidroksil radikalima. Galna kiselina
verovatno lake podlee procesu oksidacije hidroksil radikalima, pa otuda i vee vrednosti za
brzine reakcija u reakcionim smeama gde preovladava prisustvo galne kiseline.
Primena metode za odreivanje polifenola
Predloena metoda je primenjena za odreivanje sadraja polifenola u belim vinima.
Dobijeni rezultati su uporeeni sa rezultatima dobijenih spektrofotometrijskom metodom
korienjem Folin-Ciocalteu reagensa i galne kiseline kao standarda. Rezultati odreivanja
polifenola u belim vinima prikazani su u tabeli 4.55.

214

Tabela 4.55. Odreivanje sadraja (mg/L)
1,2
ukupnih fenola u belim vinima kinetiko-
spektrofotometrijskom i pH-diferencijalnom metodom.
Vino Kinetiko-
metoda
pH-diferencijalna
metoda
t-test
3
F-test
3
Chardonny 365,237,38 372,6311,52 1,19 2,43
Mea beli 405,388,33 412,789,21 1,33 1,22
upski rizling 348,827,11 350,728,78 0,38 1,52
Smederevka 285,627,30 291,367,84 1,19 1,15
1
2
mg ekvivalenta galne kiseline/L vina;
3
tabelarne F- i t-
vrednosti pri 95%-nom niou poverenja su 6,39 i 2,306.

Vrednosti F-testa i Studentovog t-testa pokazale su da nema znaajnije razlike u
rezultatima dobijenim za sadraj ukupnih fenola u belim vinima korienjem kinetiko-
spektrofotometrijske metode i standardne spektrofotometrijske metode upotrebom Folin-
Ciocalteu reagensa (F
eksp.
< F
tab.
i t
eksp.
< t
tab.
). Dakle, predloena nova kinetiko-
spektrofotometrijska metoda moe se uspeno primeniti za odreivanje sadraja ukupnih
fenola u belim vinima.

215

degradacije antocijana soka vinje

U cilju ispitivanja kinetike degradacije antocijana u ceenom soku vinje snimljeni su
apsorpcioni spektri sistema sok+voda (0,5 ml ceenog soka, zapremina reakcionog rastvora
je 5 ml), sok+H
2
O
2
+voda i sok+H
2
O
2
+Cu(II)+voda pri pH=3,5 (podeen vinskom kiselinom)
tri minuta od pripremanja reakcione smee (slika 4.81). Na apsorpcionom spektru osnovne
apsorpcione trake antocijana u soku vinje (kriva 1) u prisustvu vodonik peroksida javlja se
znatno smanjenje apsorbancije na talasnoj duini od 520 nm (kriva 2). Smanjenje
apsorpcionog maksimuma na 520 nm se dodatno smanjuje kada se reakcionom sistemu pored
vodonik peroksida doda i Cu(II). Na osnovu svega izloenog, moe se zakljuiti da reakciju
degradacije antocijana hidroksil radikalima moe se pratiti snimanjem kinetikih krivih
A=(t) na 520 nm. Promena apsorbancije sa vremenom praena je tokom 35 min od meanja
reakcionih komponenta (po proceduri datoj u delu 3.3.5.1) i prikazana na slici 4.82. Dobijene
zavisnosti su linearne u toku prvih 20-25 min odigravanja reakcije, to je omoguilo primenu
diferencijalne varijante tangensne metode.

Slika 4.81. Apsorpcioni spektar: 1) vodenog rastvora soka vinje, 2) vodenog rastvora soka
vinje + H
2
O
2
, 3) vodenog rastvora soka vinje + H
2
O
2
+ Cu(II). Koncentracije reaktanata u
rastvoru: V(soka)-0,5 ml; H
2
O
2
- 0,059 mol/L; Cu(II) = 1,84810
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25
0,1
o
C.
216

Slika 4.82. Promena apsorpcionog spektra reakcione smee vodenog rastvora soka vinje +
H
2
O
2
+ Cu(II) sa vremenom nakon 1) 1 min; 2) 6 min; 3) 11 mim; 4) 16 min; 5) 21 min.
Koncentracije reaktanata u rastvoru: V(soka)-0,2 ml; H
2
O
2
- 0,059 mol/L; Cu(II) = 1,84810
-
4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.


Da bi se nali uslovi odigravanja reakcije degradacije i razrade kinetiko-
spektrofotometrijske metode za odreivanje antocijana, odnosno cijanidina u soku vinje
ispitan je uticaj temperature, promene koncentracije reagujuih komponenti (H
2
O
2
, Cu(II) i
cijanidina) na brzinu reakcije degradacije.
Uticaj promene koncentracije H
2
O
2
na brzinu ispitivane reakcije praen je u intervalu
od 0,019 do 0,098 mol/L (slika 4.83). Kako je zavisnost linearna u celom intervalu
koncentracije reakcija je +1 reda u odnosu na koncentraciju H
2
O
2
. Za dalji rad je odabrana
koncentracija od 0,059 mol/L.

217

0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
t
g
o
x
1
0
2
c(H
2
O
2
) mol/L

2
O
2
rastvoru: V(soka) = 0,2 ml; Cu(II) = 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Uticaj koncentracije Cu(II) jona na brzinu reakcije je posmatran u intervalu (0,616-
2,464) 10
-4
mol/L. Brzina reakcije raste sa poveanjem koncentracije jona bakra do vrednosti
od 1,232 10
-4
mol/L. U intervalu koncentracije Cu(II) jona (1,232 2.464) 10
-4
mol/L, brzina
reakcije je konstantna i reakcija je nultog reda u odnosu na ovaj reaktant(slika 4.84).
Koncentracija Cu(II) od 1,848 10
-4
mol/L je odabrana za dalji rad. Izgled zavisnosti brzine
reakcije od koncentracije Cu(II) jona potvruje literaturni podatak da cijanidin-3.glukozid
moe graditi kompleks sa Cu(II) jonima (Smyk i sar.,2008).
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
t
g
o
x
1
0
2
c(Cu(II))x10
4
mol/L

rastvoru: V(soka) = 0,2 ml; H
2
O
2
- 0,059 mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C
218

Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana, tanije cijanidina u reakcionoj
smei prikazana je na slici 4.85. Razliite koliine cijanidina su dobijene odmeravanjem
razliitih zapremina soka od 0,10 do 0,30 ml. Brzina reakcije linearno raste sa poveanjem
zapremine soka u reakcionoj smei, te je reakcija +1 reda u odnosu na koncentraciju
cijanidina. Slika 4.85 prikazuje ovu zavisnost, pri emu je odreeno da odseak ove prave na
osu tg iznosi 0,3810
-2
. Neophodno je posebno obratiti panju na ulogu Cu(II) u procesu
degradacije cijanidin-3-glukozida. Zavisnost prikazana na slici 4.84, ukazuje na mogunost
graenja kompleksa cijanidin-3-glukozida i Cu(II) jona, to je u saglasnosti sa literaturnim
podacima (Smyk i sar., 2008).
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
t
g
o
x
1
0
2
V, ml

Slika 4.85. Zavisnost brzine reakcije od antocijana. Koncentracije reaktanata u rastvoru:
V(soka) = 0,2 ml; H
2
O
2
- 0,059 mol/L; Cu(II) = 1,84810
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Na osnovu predhodno dobijenih zavisnosti brzine reakcije degradacije od koncentracije
reaktanata pojedinano, kao i odreivanog reda reakcije u odnosu na koncentraciju svakog
reaktanta pojedinano, moe se postaviti kinetika jednaina za ispitivani proces degradacije
cijanidina u soku vinje:
4.15
za interval koncentracija:
H
2
O
2
= 0,0196 0,0979 mol/L
Cu(II) = (1,232-2,464) 10
-4
mol/L
V(soka) = 0,10 0,30 ml
219

gde je: -dc/dt = promena koncentracije cijanidina
k = konstanta brzine reakcije
Brzina ispitivane reakcije praena je pri odabranim koncentracionim uslovima na etiri
temperature: 25, 30, 35 i 40
o
C. Na osnovu rezultata zavisnosti brzina reakcija od temperature
za zapreminu soka od 0,2 ml dobijen je grafik prikazan na slici 4.86.
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
t
g
o
x
1
0
2
t
0
C

V(soka) = 0,2 ml; H
2
O
2
- 0,059 mol/L; Cu(II) - 1,84810
-4
mol/L; pH=3,5.

Na osnovu kinetike jednaine 4.15 izraunate su konstante brzine reakcije na etiri
temperature uzimajui u obzir da je molarna masa cijanidin-3-glukozida 449,2 gmol
-1
,
molarni apsorpcioni koeficijent 26 900 dm
3
mol
-1
cm
-1
i da je pH-diferencijalnom metodom
odreeno da je koncentracija cijanidina u ovoj reakcionoj smei 1,410
-3
mol C3GE/L (tabela
4.56).
Tabela 4.56. Konstante brzine reakcije degradacije antocijana u soku vinje hidroksil
t
o
C k
1
, moldm
-3
min
-1

25
30
35
40
0,67 10
2
0,85 10
2
1,03 10
2

1,21 10
2

1
220

Termodinamiki parametri reakcije degradacije cijanidina hidroksil radikalima odreeni
su na osnovu nagiba prave prikazane na slici 4.87.
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
l
n

k
1/Tx10
3


Iz nagiba ove prave izraunata je energija aktivacije a potom i ostali termodinamiki
parametri, promena entalpije (H
*
*
), promena slobodne energije
(G
*
) i pK
*
vrednost graenja aktiviranog kompleksa, primenom jednaina 4.24.6. Vrednost
izraunatih termodinamikih parametara degradacije aktiviranog kompleksa dati su u tabeli
4.57.

antocijana u soku vinje hidroksil radikalima na 295K.
Ea
(kJmol
-1
)
H
*

(kJmol
-1
)
S
*
(JK
-1
mol
-1
)
G
*
(kJmol
-1
)
pK
*

30,59 28,12 -115,48 62,53 10,96

221

antocijana soka vinje

tanosti i preciznosti.
Linearnost
S obzirom da koncentracija cijanidina u uzorku vinje nije poznata, uz razliite
zapremine soka dodavana je uvek ista koliina standarda, cijanidin-3-glukozida (20,0 g/ml)
a potom na osnovu jednaine 4.7 izraunavan sadraj cijanidina u reakcionoj smei. Na slici
4.88 je data kalibraciona kriva koja je linearna u intervalu od 6,60 do 37,80 g/ml i moe se
primeniti za odreivanje antocijana u uzorcima soka od vianja.
Ova zavisnost se moe predstaviti jednainom:
tg = 0,098 c
x
+ 0,357 4.16
r = 0,989 s
o
= 0,033
Limit detekcije (c
L
Q
) odreeni su korienjem jednaina 2.46 i
2.47. Dobijene vrednosti su 1,11 i 3,37 g/ml.
5 10 15 20 25 30 35 40
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
t
g
o
x
1
0
2
c, g/ml

Slika. 4.88. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana. Koncentracije reaktanata
u rastvoru: Cu(II) 1,84810
-4
mol/L ; H
2
O
2
0,059 mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.
222

Preciznost i tanost metode odreivanja antocijana u sokovima vinje
Preciznost metode je odreena odmeravanjem iste zapremine ceenog soka vinje (0,1
ml) bez i sa dodatkom Cy-3-G (20,0; 30,0) iz pet ponavljanja. Za svaku reakcionu smeu
izraunata je relativna standardna devijacija (RSD). Rezultati dobijeni statistikom obradom

Tabela 4.58. Preciznost odreivanja antocijana u sokovima.
Dodato Cy-3-G
(g/ml)
Ukupno antocijana
(g/ml)
RSD (n=5)
%
0 6,60 1,04
20,0 25,16 0,70
30,0 37,80 2,00

rastvora Cy-3-G u istoj zapremini vina iz pet merenja. Izraunata je relativna greka, a
Tabela 4.59. Tanost odreivanja antocijana u sokovima.
Dodato Cy-3-G
(g/ml)
odreeno Cy-3-G
(g/ml)
RG
%
10,0 10,38 6,38
20,0 20,55 4,76
30,0 29,58 2,92

Rezultati iz tabela 4.58 i 4.59 pokazuju da se antocijani u ceenim sokovima vinje
predloenom kinetikom metodom mogu odreivati sa zadovoljavajuom preciznou i
tanou.

223

Na osnovu predhodno razraene kinetike metode za odreivanje antocijana, koja se
bazira na reakciji degradacije antocijana vodonik peroksidom u prisustvu Cu(II) jona i
konstruisane kalibracione krive za odreivanje antocijana u intervalu od 6,60 do 37,80 g/ml,
metoda je primenjena za odreivanje antocijana u ceenom soku tri sorte vinji: Marele,
Oblainske vinje i Ciganice.
Na slici 4.89 je prikazan apsorpcioni spektar soka vinje pri pH=1,0 i pH=4,5, koji je
posluio za odreivanje sardaja antocijana u soku vinje pH-diferencijalnom metodom, koja
je koriena kao uporedna metoda.
Rezultati odreivanja sadraja antocijana u ceenim sokovima vinji prikazani su u
tabeli 4.60. Poreenjem standardnih devijacija, i vrednosti F- i t-testa, pri 95%-nom nivou
poverenja i za dati broj stepena slobode, uoeno je da izmeu kinetike i uporedne
spektrofotometrijske metode ne postoji velika razlika u preciznosti, t
eksp.
< t
tab.
i F
eksp.
< F
tab
.
Dakle, razraena kinetiko-spektrofotometrijska metoda se moe uspeno primeniti za
odreivanje sadraja antocijana u ceenim sokovima vinje.

Slika 4.89. Apsorpcioni spektar ceenog soka vinje pri 1) pH= 1,0 i 2) pH=4,5.

224

Tabela 4.60. Odreivanje sadraj (mg/L)
1,2
antocijana u ceenim sokovima vinji kinetiko-
spektrofotometrijskom i pH-diferencijalnom metodom.
Sok Kinetiko-
metoda
pH-diferencijalna
metoda

t- test
3

F- test
3

Marela 321,984,68 328,685,18 2,15 1,22
Ciganica 577,566,45 582,356,41 1,18 0,97
Oblainska 595,914,97 602,395,16 2,02 1,08
1
2
3
tabelarne F- i t-

225

4.2.6. Kinetko-spektrofotometrijsko ispitivanje reakcije degradacije
antocijana soka crvene ribizle

U cilju ispitivanja kinetike degradacije antocijana u ceenom soku crvene ribizle
snimljeni su apsorpcioni spektri sistema sok + voda (0,4 ml soka, zapremina reakcionog
rastvora je 5 ml), sok + H
2
O
2
+ voda i sok + H
2
O
2
+ Cu(II) + voda pri pH=3,5 (podeen
vinskom kiselinom) tri minuta od pripremanja reakcione smee. Na apsorpcionom spektru
osnovne apsorpcione trake antocijana u soku crvene ribizle (kriva 1, slika 4.90) u prisustvu
vodonik peroksidom javlja se smanjenje apsorbancije na talasnoj duini od 520 nm (kriva 2).
Smanjenje apsorpcionog maksimuma na 520 nm je znatno izraenije kada se reakcionom
sistemu pored vodonik peroksida dada i Cu(II), to ukazuje na katalitiki efekat Cu(II) jona.
Na osnovu svega izloenog, moe se zakljuiti da se brzina reakcija degradacije antocijana
hidroksil radikalima moe pratiti snimanjem kinetikih krivih A=(t) na 520 nm, tokom 35
min nakon meanja reakcione smee (slika 4.91). Dobijene zavisnosti su linearne u toku prvih
20-25 min odigravanja reakcije, to je omoguilo primenu diferencijalne varijante tangensne
metode.

Slika 4.90. Apsorpcioni spektar: 1) vodenog rastvora soka crvene ribizle, 2) vodenog
rastvora soka vinje + H
2
O
2
, 3) vodenog rastvora soka vinje + H
2
O
2
+ Cu(II).
Koncentracije reaktanata u rastvoru: V(soka)-0,4 ml; H
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) = 1,23210
-
4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.
226

Slika 4.91. Promena apsorpcionog spektra reakcione smee vodenog rastvora soka crvene
ribizle + H
2
O
2
+ Cu(II) sa vremenom nakon 1) 1 min; 2) 6 min; 3) 11 min; 4) 16 min; 5) 21
min. Koncentracije reaktanata u rastvoru: V(soka)-0,5 ml; H
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) =
1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.


U cilju optimizacije uslova odigravanja reakcije degradacije i razrade kinetiko-
spektrofotometrijske metode za odreivanje cijanidina u soku crvene ribizle i drugih vrsta
voa u kojima su prisutni samo derivati cijanidina, kao to je malina, ispitan je uticaj
temperature, promene koncentracije reagujuih komponenti (H
2
O
2
, Cu(II) i antocijana),
temperature i rastvaraa na brzinu reakcije degradacije.
Uticaj koncentracije H
2
O
2
na brzinu ispitivane reakcije praen je u intervalu od 0,049
do 0,147 mol/L (slika 4.92). Kako je zavisnost linearna u celom intervalu koncentracije
reakcija je +1 reda u odnosu na koncentraciju H
2
O
2
. Za dalji rad je odabrana koncentracija od
0,098 mol/L.

227

0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
t
g
o
x
1
0
2
c(H
2
O
2
) mol/L

2
O
2
rastvoru: V(soka) = 0,5 ml; Cu(II) = 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Uticaj koncentracije Cu(II) jona na brzinu reakcije je posmatran u intervalu (0,615-
1,838) 10
-4
mol/L. Brzina reakcije raste sa poveanjem koncentracije ovog reaktanta, te je
reakcija +1 reda u odnosu na Cu(II) u celom ispitivanom intervalu koncentracije (slika 4.93).
Koncentracija Cu(II) od 1,232 10
-4
mol/L je odabrana za dalji rad.
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
t
g
o
x
1
0
2
c(Cu(II))x10
-4
mol/L

2
O
2
- 0,098 mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.
Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana u reakcionoj smei prikazana je
na slici 4.94. Razliite koliine cijanidina su dobijene odmeravanjem razliitih zapremina
soka od 0,25 do 0,75 ml (zapremina reakcionog suda je 5,0 ml). Brzina reakcije linearno raste
228

sa poveanjem zapremine soka u reakcionoj smei, te je reakcija +1 reda u odnosu na
koncentraciju cijanidina. Slika 4.88 prikazuje ovu zavisnost, pri emu je odreeno da odseak
ove prave na osu tg iznosi 0,5510
-2
.
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
t
g
o
x
1
0
2
V, ml

Slika 4.94. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana.Koncentracije reaktanata u
rastvoru: H
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) = 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25 0,1
o
C.

Na osnovu predhodno dobijenih zavisnosti brzine reakcije degradacije od koncentracije
reaktanata pojedinano, kao i odreivanog reda reakcije u odnosu na koncentraciju svakog
reaktanta pojedinano, moe se postaviti kinetika jednaina za ispitivani proces degradacije
antocijana u soku crvene ribizle:

4.17
za interval koncentracija:
H
2
O
2
= 0,0489 0,1469 mol/L
Cu(II) = (0,615-1,838) 10
-4
mol/L
V(soka) = 0,25 0,75 ml
gde je: -dc/dt = promena koncentracije cijanidina
k = konstanta brzine reakcije
229

Brzina ispitivane reakcije praena je pri odabranim koncentracionim uslovima na etiri
o
C. Na osnovu rezultata zavisnosti brzina reakcija od temperature
za zapreminu soka od 0,5 ml dobijen je grafik prikazan na slici 4.95.

24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
3,6
3,8
4,0
t
g
o
x
1
0
2
t
0
C

V(soka) = 0,5 ml; H
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5.

Na osnovu kinetike jednaine 4.17 izraunate su konstante brzine reakcije na etiri
temperature uzimajui u obzir da je molarna masa cijanidin-3-glukozida 449,2 gmol
-1
,
molarni apsorpcioni koeficijent 26 900 dm
3
mol
-1
cm
-1
i da je pH-diferencijalnom metodom
odreeno da je koncentracija cijanidina u ovoj reakcionoj smei 0,339 10
-3
mol C3GE/L
(tabela 4.61).

Tabela 4.61. Konstante brzine reakcije degradacije antocijana u soku crvene ribizle hidroksil
t
o
C k
1
, mol
2
dm
-6
min
-1

25
30
35
40
2,18 10
2
2,64 10
2
3,10 10
2

3,59 10
2

1

230

Termodinamiki parametri reakcije degradacije antocijana hidroksil radikalima
odreeni su na osnovu nagiba prave prikazane na slici 4.96.
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34 3.36
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
l
n

k
1/Tx10
3


Iz nagiba ove prave izraunata je energija aktivacije a potom i ostali termodinamiki
parametri, promena entalpije (H
*
*
), promena slobodne energije
(G
*
) i pK
*
vrednost graenja aktiviranog kompleksa, primenom jednaina 4.2-4.6. Vrednost
izraunatih termodinamikih parametara aktiviranog kompleksa reakcije degradacije
antocijana u soku crvene ribizle hidroksil radikalima dati su u tabeli 4.62.

antocijana crvene ribizle hidroksil radikalima na 295K.
Ea
(kJmol
-1
)
H
*

(kJmol
-1
)
S
*
(JK
-1
mol
-1
)
G
*
(kJmol
-1
)
pK
*

25,76 23,29 -121,92 59,61 10,45

231

4.2.6.2. Uticaj rastvaraa na brzinu reakcije degradacije antocijana hidroksil
radikalima

U ovom radu razmotren je uticaj acetona, etanola i metanola kao rastvaraa i uporeen
sa vodom kao rastvaraem. Ovi rastvarai imaju sledee vrednosti dialetrine konstante: 20,7
, 24,3 , 32,6 i 78,5 za vodu. Detaljna analiza efekta rastvaraa na brzinu reakcije zahteva ire
poznavanje teorije tenosti i upotrebu semimetrijskih metoda, zato su date samo
termodinamike karakteristike sistema u prisustvu navedenih rastvaraa.
Zavisnost brzine reakcije degradacije cijanidina u soku crvene ribizle praena je sa
promenom procentnog sastava acetona, etanola i metanola to je prikazano na slikama 4.97,
4.98 i 4.99, odakle se vidi da brzina reakcije opada sa poveanjem sadraja rastvaraa u
reakcionoj smei od 0 do 50%. Zapaeno je da najvee smanjenje brzine reakcije u prisustvu
acetona, tj. rastvaraa najmanje polarnosti.
0 10 20 30 40 50
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
t
g
o
x
1
0
2
%, v/v

Slika 4.97. Zavisnost brzine reakcije od sadraja acetona. Koncentracije reaktanata u
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25
0,1
o
C.
232

0 10 20 30 40 50
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
t
g
o
x
1
0
2
%, v/v

Slika 4.98. Zavisnost brzine reakcije od sadraja etanola. Koncentracije reaktanata u
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25
0,1
o
C.

0 10 20 30 40 50
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
t
g
o
x
1
0
2
%, v/v

Slika 4.99. Zavisnost brzine reakcije od sadraja metanola. Koncentracije reaktanata u
2
O
2
- 0,098 mol/L; Cu(II) - 1,23210
-4
mol/L; pH=3,5; t = 25
0,1
o
C.

Brzina reakcije degradacije praena je pri sadraju od 10% v/v metanola, etanola i
acetona pojedinano, pri istim reakcionim uslovima odigravanja reakcije na etiri
233

o
C. Na osnovu kinetike jednaine (4.17) izraunate su konstante
brzine reakcije na etiri razliite temperature (tabela 4.63)

Tabela 4.63. Konstante brzine reakcije degradacije antocijana u soku crvene ribizle hidroksil
radikalima na razliitim temperaturama u razliitim rastvaraima.
t
0
C k
1
(10% aceton)
mol
2
dm
-6
min
-1
k (10% etanol)
mol
2
dm
-6
min
-1

k (10% metanol)
mol
2
dm
-6
min
-1

25
30
35
40
1,82 10
2

2,44 10
2

3,02 10
2

3,69 10
2

1,89 10
2

2,37 10
2

2,84 10
2

3,51 10
2

2,03 10
2

2,47 10
2

2,94 10
2

3,41 10
2

1
Termodinamiki parametri akriviranog kompleksa reakcije degradacije odreeni su na
osnovu vrednosti nagiba pravih ln k = (1/T 10
3
) (slika 4.100, 4.101 i 4.102)(tabela 4.64)
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
6.0
l
n

k
1/Tx10
3

Slika 4.100. Zavisnost ln k od reciprone vrednosti apsolutne temperature u 10% acetonu.
234

3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
l
n

k
1/Tx10
3

Slika 4.101. Zavisnost ln k od reciprone vrednosti apsolutne temperature u 10% etanolu.
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30 3.32 3.34
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
l
n

k
1/Tx10
3

Slika 4.102. Zavisnost ln k od reciprone vrednosti apsolutne temperature u 10% metanolu.

Tabela 4.64. Termodinamike karakteristike aktiviranog kompleksa reakcije degradacije
antocijana u soku crvene ribizle hidroksil radikalima na 298 K.
Sistem
u 10%
E
a

kJmol
-1
H
*

kJmol
-1

S
*

JK
-1
mol
-1
G
*

kJmol
-1

pK
*

Metalolu
Etanolu
Acetonu
30,78
34,73
40,23
28,28
32,26
37,76
-105,86
-93,10
-74,86
59,83
60,00
60,07
10,49
10,52
10,53
235

4.2.6.3. Validacija kinetiko-spektrofotometrijske metode za odreivanje
antocijana u soku crvene ribizle i maline

tanosti i preciznosti.
Linearnost
S obzirom da koncentracija cijanidina u uzorku soka crvene ribizle nije poznata, uz
razliite zapremine soka dodavana je uvek ista koliina standrada, cijanidin-3-glukozida (10,0
g/ml) a potom na osnovu jenaine (4.7) izraunat sadraj cijanidina u reakcionoj smei. Na
slici 4.103 je data kalibraciona kriva koja je linearna u intervalu od 7,64 do 22,87 g/ml i
moe se primeniti za odreivanje antocijana u uzorcima soka u kojima su prisutni razliiti
derivati cijanidina kao to je to sluaj sa sokom crvene ribizle i maline.
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
t
g
o
x
1
0
2
c, g/ml

Slika 4.103. Zavisnost brzine reakcije od koncentracije antocijana. Koncentracije u
reaktanata u rastvoru: Cu(II) 1,23210
-4
mol/L ; H
2
O
2
0,098 mol/L; pH=3,5; t = 25
0,1
o
C.

Ova zavisnost se moe predstaviti jednainom:
tg = 0,12033 c
x
+ 0,575 4.18
r = 0,998 s
o
= 0,036

236

Limit detekcije (c
L
Q
) odreeni su korienjem jednaina 2.46 i
2.47. Dobijene vrednosti su 0,98 i 2,99 g/ml.
Preciznost i tanost metode odreivanja antocijana u sokovima crvene ribizle
Preciznost metode je odreena odmeravanjem iste zapremine ceenog soka crvene
ribizle (0,25 ml) bez i sa dodatkom Cy-3-G (8,0; 15,0) iz pet ponavljanja. Za svaku reakcionu
smeu izraunata je relativna standardna devijacija (RSD). Rezultati dobijeni statistikom
obradom podataka dati su u tabeli 4.65.
Tabela 4.65. Preciznost odreivanja antocijana u sokovima crvene ribizle.
Dodato Cy-3-G
(g/ml)
Ukupno antocijana
(g/ml)
RSD (n=5)
%
0 7,64 3,56
8,0 15,24 1,82
15,0 22,87 2,45

rastvora C3G u istoj zapremini soka iz pet merenja. Izraunata je relativna greka, a rezultati
prikazani u tabeli 4.66.
Tabela 4.66. Tanost odreivanja antocijana u sokovima crvene ribizle.
Dodato Cy-3-G
(g/ml)
odreeno Cy-3-G
(g/ml)
RG
%
5,0 5,12 7,53
10,0 10,21 5,96
15,0 14,93 2,54

Rezultati iz tabela 4.65 i 4.66. pokazuju da se antocijani u ceenim sokovima vinje
predloenom kinetikom metodom mogu odreivati sa zadovoljavajuom preciznou i
tanou.
Na osnovu predhodno razraene kinetiko-spektrofotometrijske metode za odreivanje
antocijana, koja se bazira na reakciji degradacije antocijana vodonik peroksidom u prisustvu
Cu(II) jona i konstruisane kalibracione krive za odreivanje antocijana u intervalu od 7,64 do
237

22,87 g/ml, metoda je primenjena za odreivanje antocijana u ceenim sokovima crvene
ribizle i maline gajenih na Vlasini i u Nikoj Banji.
Na slici 4.104 je prikazan apsorpcioni spektar soka maline pri pH=1,0 i pH=4,5, koji
nam je posluio za odreivanje sardaja antocijana u soku maline pH-diferencijalnom
metodom. pH-diferencijalna spektrofotometrijska metoda je koriena kao uporedna metoda.

Slika 4.104. Apsorpcioni spektar ceenog soka maline pri 1) pH= 1,0 i 2) pH=4,5.

Rezultati odreivanja sadraja antocijana u ceenim sokovima crvene ribizle i maline
prikazani su u tabeli 4.67. Poreenjem standardnih devijacija i vrednosti F- i t-testa, pri 95%-
nom nivou poverenja i za dati broj stepena slobode, uoeno je da izmeu kinetike i uporedne
spektrofotometrijske metode ne postoji velika razlika u preciznosti, t
eksp.
< t
tab.
i F
eksp.
< F
tab.

Dakle, razraena kinetiko-spektrofotometrijska metoda se moe uspeno primeniti za
odreivanje sadraja antocijana u ceenim sokovima crvene ribizle i maline.

238

Tabela 4.67. Odreivanje sadraj (mg/L)
1,2
antocijana u ceenim sokovima crvene ribizle I
maline kinetiko-spektrofotometrijskom i pH-diferencijalnom metodom.
Sok Kinetiko-
sprktrofotometrijska
metoda
pH-diferencijalna
metoda

t-test

F-test
Ribizla N.Banja 147,552,28 150,803,05 1,91 1,79
Ribizla Vlasina 163,583,36 168,204,50 1,84 1,79
Malina N.Banja 336,606,11 340,826,33 1,07 1,07
Malina Vlasina 382,655,57 386,737,08 0,89 0,87
1
2
3
tabelarne F- i t-

239

5. DISKUSIJA REZULTATA
240

241

5.1. Kinetika i mehanizam degradacije fenolnih jedinjenja hidroksil
radikalima

Ispitivanja kinetike degradacije fenolnih jedinjenja hidroksil radikalima prikazana u
ovom radu su pokazala da se proces moe predstaviti jednainom:
- za bela vina u kiseloj sredini (pH=3,5) pri koncentraciji H
2
O
2
od 0,098 do 0,294
mol/L i Cu(II) od 1,232 10
-4
do 3,696 10
-4
mol/L:

gde je - poveanje koncentracije reakcionih produkata u belom vinu (=420 nm),
- za crvena vina u kiseloj sredini (pH=3,5) pri koncentraciji H
2
O
2
od 0,049 do 0,490
-4
do 6,150 10
-4
mol/L:

gde je smanjenje koncentracije ukupnih antocijana u crvenom vinu (=520 nm),
- za malvidin-3-glukozid i malvidin-3-acetil-glukozid u crvenim vinima u kiseloj
sredini (pH=3,5) pri koncentraciji H
2
O
2
od 4,90 10
-3
do 24,48 10
-3
mol/L i Cu(II) od
0,615 10
-5
do 3,080 10
-5
mol/L:

gde je smanjenje koncentracije Mv-3-G, odnosno Mv-3-AG u crvenom vinu (
=520 nm),
- za katehin i epikatehin u crvenim vinima u kiseloj sredini (pH=3,5) pri koncentraciji
H
2
O
2
od 4,90 10
-3
do 24,48 10
-3
-5
do 3,080 10
-5
mol/L:

gde je smanjenje koncentracije katehina, odnosno epikatehina u crvenom vinu
(=275/322 nm),
- za ceene sokove od vianja u kiseloj sredini (pH=3,5) pri koncentraciji H
2
O
2
od
242

0,0196 do 0,0979 mol/L i Cu(II) < 1,232 10
-4
mol/L:

gde je smanjenje koncentracije ukupnih antocijana u ceenom soku od vianja
(=520 nm),
- za ceene sokove od crvenih ribizli i malina u kiseloj sredini (pH=3,5) pri
koncentraciji H
2
O
2
od 0,049 do 0,149 mol/L i Cu(II) od 0,615 10
-4
do 1,838 10
-4

mol/L:

gde je smanjenje koncentracije ukupnih antocijana u ceenom soku od crvenih
ribizli i malina (=520 nm).
Kinetike jednaine pokazuju da su reakcije prvog reda u odnosu na reaktatne:
fenolna jedinjenja, H
2
O
2
i Cu(II) kao katalizatora.
Mnogi sluajevi katalize u rastvorima mogu se objasniti graenjem kompleksa sa
prenosom naelektrisanja izmeu katalizatora i jednog od reaktanta. Nastajanje ovakvih
jedinjenja karakteristino je za aromatina jedinjenja (amini, fenoli), pa se moe predpostaviti
da se katalitika oksidacija fenolnih jedinjenja u ispitivanim uzorcima vri po ovom
mehanizmu.
Pri nastajanju kompleksa sa prenosom naelektrisanja dolazi do deliminog prelaza
elektrona sa jednog na drugi reaktant, i moe se oekivati da su takvi procesi praeni
poveanjem reakcione sposobnosti reaktanata. Delovanje katalizatora u smislu reakcionog
centra koji polarizuje supstrat je u vezi sa njegovim elektrofilnim osobinama, tj. sa njegovim
ponaanjem kao Luisove kiseline. Osnovni faktori koji utiu na katalitiki efekat su
jonizacioni potencijal katalizatora i mogunost graenja kompleksa sa supstratom.
Za nastajanje kompleksa sa prenosom naelektrisanja neophodno je prepokrivanje ili
slobodne orbitale reaktanta sa slobodnom ili popunjenom orbitalom katalizatora. Prirodno je
oekivati graenje takvih kompleksa u prisustvu katalizatora kakav je sluaj sa Cu(II), koji je
u ovom radu korien.
Prenos elektrona izmeu katalizatora i reaktanta moe proticati po razliitim
mehanizmima. Najee katalizator gradi kompleks sa organskim reagensom. Meutim, u
prisustvu H
2
O
2
kao oksidansa mogu nastati prelazni kompleksi tipa katalizator-organski
reagens-oksidans. Nakon prenosa naelektrisanja ovaj kompleks se razara na oksidacione
proizvode i redukovani oblik katalizatora. Redukovani oblik katalizatora dalje reaguje sa
oksidansom. Ovakav mehanizam je mogu ako se proces oksidacije redukovanog oblika
katalizatora odigrava znatno bre od predhodnih.
243

Na osnovu literaturnih podataka i eksperimentalnih rezultata mogue je predloiti
sledei mehanizam katalitikog dejstva Cu(II) u reakciji oksidacije fenolnih jedinjenja u
ispitivanim uzorcima:

5.1
to je mogue ako se proces 5.1 odigrava znatno bre od predhodnih. U ovom sluaju
direktna interakcija organskog reduktora sa vodonik peroksidom je kinetiki spreena.
Takoe je verovatno formiranje prelaznog kompleksa izmeu Cu(I) i supstrata unutar koga se
regenerie Cu(II). Verovatnou ovakve predpostavke potvruje veliki viak oksidansa u
odnosu na druge reagense.
Brzina ispitivanih reakcija bie jednaka:

Ovde imamo dve prelazne ravnotee. Koncentracije prelaznih supstanci (aktiviranih
kompleksa) izraunavamo iz konstanti ravnotea:

5.2

Ako se uzme da je koliina [
uporediva sa koliinom
, i da je
uporedivo po veliini sa , iz jednaine 5.2 nalazimo:

244

Odavde je brzina reakcije jednaka:

5.3

Shodno jednaini 5.3, red reakcije u odnosu na oba reaktante Ph i
nije ceo broj.

Meutim, ako je
, brzina reakcije definisana je izrazom:

5.4
to je u saglasnosti sa dobijenim eksperimentalnim podacima. Predloeni mehanizam pripada
prvom tipu reakcija koje se odigravaju uz obrazovanje prelaznih jedinjenja Arenijusovog tipa
(deo 2.1.3).

5.1.1. Mehanizam degradacije fenolnih jedinjenja belih vina

Rezultati spektrofotometrijske analize predstavljeni u tabeli 4.16 ukazuju da su
varijacije sadraja fenolnih jedinjenja belih vina posledica delovanja velikog broja faktora,
koji pored genetskih ukljuuju i podruje kultivisanja groa kao i mnogobrojne faktore
ivotne sredine. Najzastupljenija komponenta belog vina je kaftarna kiselina, slede
epikatehin i katehin i druge hidroksicimetne kiseline. Ukoliko bela vina dou u kontakt sa
kiseonikom promene boju zbog procesa brovingovanja. Brovingovanje belih vina zavisi od
fenolnog sastava, ali su od podjednake vanosti i faktori koji utiu na oksidaciju fenolnih
jedinjenja kao to su joni prelaznih metala u prisustvu askorbinske kiseline ili H
2
O
2
. Kao
rezultat procesa oksidacije fenolnih jedinjenja belih vina nastaju oksidacioni proizvodi, to se
moe uoiti pojavljivanjem novog apsorpcionog maksimuma na 420 nm. Za vina proizvedena
u Srbiji, razvoj brovingovanja nije ispitan. Nai rezultati su pokazali da proces
brovingovanja fenolnih jedinjenja hidroksil radikalima koji nastaju u sistemu Cu(II)/H
2
O
2
,
prati bifazni tok, prvo naglim poveanjem i kasnijim smanjenjem, a potom sledi linearno
poveanje sadraja oksidacionih produkata. Hipoteza koja moe objasniti ovakvo ponaanje
je sledea: poetno poveanje sadraja oksidacionih proizvoda moe biti pripisano formiranju
hinona nakon oksidacije kaftarne kiseline, supstrat prisutan u najveoj koliini (tabela 4.19),
245

koji zatim moe biti redukovan pomou SO
2
, koji se dodaje vinu za spreavanje procesa
oksidacije, a rezltat je bio trenutno smanjenje i opadanje potamnjivanja. Kasniji proces
polimerizacije uslovljava poveanje procesa brovingovanja i poveanje apsorpcionog
maksimuma na 420 nm.
Potvrda o predloenim mehanizmu naena je u literaturi.
Mauri (2007) je ispitivao kinetiku oksidacije fenola Fentonovim reagensom
(Fe(II)/H
2
O
2
) pri emu je odnos koncentracije Fe(II) : H
2
O
2
iznosio od 1 :5 do 1 : 1. Za
reakciju oksidacije fenola vodonik peroksidom u prisustvu Fe(II) kao katalizatora, u model
rastvoru postavio je kinetiku jednainu:

Dakle, reakcija je prvog reda u odnosu na koncentraciju fenola, dok su u odnosu na
koncentracije vodonik peroksida i Fe(II)-jona redovi pozitivni, to su i naa ispitivanje
pokazala, ali suprotno naim rezultatima redovi reakcije nisu celi brojevi.
Meutim, nai rezultati su u potpunoj saglasnosti sa rezultatima mnogih autora.
Chunxia i sar. (2005) su postavili sledeu kinetiku jednainu:

za reakciju oksidacije fenola vodonik peroksidom u prisustvu sintetisanog katalizatora koji u
svom sastavu pored bakra sadri i druge metalne jone kao to su gvoe i aluminijum. Pri
tome su odredili da energija akrivacije ovog procesa iznosi 58,37 kJ/mol. Do slinih rezultata
su doli Beltan i sar. (2001) koji su prouavali kinetiku oksidacije organskih jedinjenja
Fentonovim reagensom.
Na predlog mehanizma degradacije fenolnih jedinjenja belih vina hidroksil
radikalima predpostavlja mogunost graenja prelaznih kompleksa tipa [Ph-Cu(II)] i [Ph-
Cu(II)-H
2
O
2
]. Mogunost graenja ovakvih prelaznih jedinjenja je takoe potvreno u
literaturi. Fenoli i Cu(II) mogu da grade prelazne komplekse monodentatnog tipa
, pri tome mogu nastati mononuklerni i binuklearni kompleksi. pH

ima bitan uticaj na strukturu nagraenog kompleksa. U rastvorima sa pH<7 preovladava
kompleks stehiometrijskog sastava 1:1,

Slika 5.1. Struktura mononuklearnog kompleksa
Dok pri pH>8 mogu nastati binuklearni kompleksi:
246

Slika 5.2 . Struktura binuklearnog kompleksa
Kada se u reakcioni sistem pored fenolnih jedinjenja i Cu(II)-jona nae i vodonik
peroksid postoji mogunost graenja trojnog kompleksa reduktor-oksidans-katalizator. Za
sistem L (organski supstrat), Fe(II) i H
2
O
2
, Rivas i sar. (2001) su predloili postojanje
kompleksa:

Pri emu je konstanta brzine ove reakcije reda veliine 10
2
do 10
-4
s
-1
, to je u skladu sa
prirodom helatirajue sposobnosti fero jona. Salem i sar. (1988) su prouavajui kinetiku
degradacije vodonik peroksida u prisustvu metalnih kompleksa predpostavili postojanje
trojnog kompleksa

2+
. Kompleks sline strukture se moe predloiti za sistem
fenoli H
2
O
2
Cu(II).
Mnogobrojne studije koje se bave oksidativnim procesima fenolnih jedinjenja su
dokazale da njihovom oksidacijom nastaju odgovarajui hinoni. Pri tome su najpodloniji
oksidaciji difenoli (Toit i sar., 2006). Nastali hinoni stupaju dalje u reakcije polimerizacije
reagujui ili sa polaznim fenolnim jedinjenjem ili sa drugim fenolnim jedinjenjima, prisutnih
u sistemu pri emu nastaju uti pigmenti (slika 2.32)
Meutim, hinoni mogu reagovati i sa drugim nefenolnim jedinjenjima (askorbinska
kiselina, sulfiti, amini idr.):
247

Slika 5.3. Reakcije hinona sa nefenolnim jedinjenjima

Slika 5.4 pokazuje da se askorbinska kiselina ponaa kao zatitnik fenolnih jedinjenja od
oksidacije. Njeno delovanje se moe prikazati sledeom emom (Roberds i sar. 1999):

Slika 5.4. ema uticaja askorbinske kiseline na oksidaciju fenolnih jedinjenja

248

5.1.2. Mehanizam degradacije antocijana crvenih vina

Cilj ispitivanja sastava fenolnih komponenti, metalnih jona i antioksidativne
aktivnosti crvenih sorti groa i crvenih vina spektrofotometrijskom i HPLC metodom bio je
iznalaenje uslova i bolje upoznavanje sistema u kojem je ispitana kinetika degradacije
antocijana prisutnih u crvenim vinima. Kinetika degradacije ukupnih antocijana prisutnih u
mladim crvenim vinima ispitana je spektrofotometrijskom metodom, dok je kinetika
degradacije pojedinanih antocijana ispitana HPLC metodom.
Rezultati spektrofotometrijske analize predstavljeni u tabeli 4.11 ukazuju da je sadraj
monomernih antocijana u crvenim vinima znatno uslovljen starou vina i da znatno opada sa
vremenom uvanja u boci. Takoe, rezultati HPLC analize crvenih vina predstavljeni u tabeli
4.14 ukazuju na visok sadraj monomernih antocijana u mladim crvenim vinima. Iz tabele
4.14 se takoe moe videti da je najzastupljeniji antocijan u crvenim vinima malvidin-3-
glukozid a da potom sledi njegov derivat malvidin-3-acetil-glukozid. Dakle, najpre je
izvrena spektrofotometrijska i HPLC analiza mladog vina Vranac (Rubin- Kruevac), a
potom se pristupilo ispitivanju kinetike degradacije antocijana u njemu.
Spektar boje crvenih vina ima maksim na talasnoj duini = 520 nm (crvena boja),
zahvaljujui sadraju antocijana i njihovih flavilijum jona. Minimum apsorbancije je na
talasnoj duini = 420 nm (uta boja). Stoga je kinetika degradacije ukupnih antocijana
praena spektrofotometrijskom metodom na osnovu promene absorbancije rastvora na 520
nm, odnosno kinetika degradacije pojedinanih antocijana, tanije malvidin-3-glukozida
praena je HPLC metodom na osnovu promene povrine odgovarajuih pikova na =520 nm.
Proces degradacije antocijana crvenih vina ispitan je u uslovima testa ubrzanog
brovingovanja, odnosno u prisustvu hidroksil radikala, koji nastaje u sistemu Cu(II)/H
2
O
2
.
Lopes i sar. (2007) su ispitivali kinetiku degradacije malvidin-3-glukozida vodonik
peroksidom i postavili su hipotetiku emu ovog procesa. Isti autori su zakljuili da se isti
degradacioni proizvodi, iju su strukturu potvrdili NMR metodom, nastaju i u procesu
degradacije malvidin-3-glukozida Fentonovim reagensom. Naa ispitivanja kinetike
degradacije antocija spektrofotometrijskom i HPLC metodom pruaju dovoljno podataka da
se postavi kinetika jednaina ovog procesa. Meutim, u ovom radu nije odreena struktura
reakcionih produkata, pa su iz tog razloga pri predlaganju mogue eme formiranja
reakcionih proizvoda korieni literaturni podaci(Lopes i sar. 2007) (slika 5.5).
Na osnovu predloene eme formiranja reakcionih produkata pri oksidaciji malvidin-
3-glukozida moemo videti da se, pri pH vrednosti vina (pH 3,5) malvidin-3-glukozid
degradira na 2,4,6-trihidroksibenzaldehid, siringinu kiselinu i 8--D-glukopiranozil-2,4-
dihidroksi-6-okso-cikloheksa-2,4-dienil acetatnu kiselinu. Pri tome ovi degradacioni
proizvodi imaju apsorpcione maksimume na 290 i 330 nm, to su potvrdili i drugi autori
(Lopa i sar., 2007; Alecu i sar., 2008; Furtado i sar., 1993).
249

Ispitivanja kinetike degradacije antocijana spektrofotometrijskom i HPLC metodom
dala su mogunost i za odreivanje termodinamikih parametara. Iz tabele 4.16 se mogu
videti vrednosti ovih parametara odreenih spektrofotometrijskom metodom i oni iznose E
a
= 56,37 kJmol
-1
, H
*
= 53,91 kJmol
-1
, S
*
= -35,52 JK
-1
mol
-1
i G
*
= 64,39 kJmol
-1
.
Pozitivan znak za H
*
podrazumeva endotermno stanje izmeu aktiviranog kompleksa i
reaktanata to vodi poveanju brzine degradacije sa poveanjem temperature. Relativno mala
vrednost za S
*
podrazumeva mali znaaj ove funkcije u procesu degradacije, dok njen
negativan znak upuuje na neophodnost njenog poveanja da bi dolo do formiranja
aktiviranog kompleksa (Kechinski I sar., 2010 ).

Slika 5.5. Hipotetika ema formiranja reakcionih produkta pri oksidaciji Mv-3-G.

Prouavanjem referentne literature dolo se do sledeih podataka. Cisse i sar., (2009) su
ispitivali kinetiku termike degradacije antocijana u temperaturnom intervalu od 30 do 90
o
C
u sedam sokova crvene narane, dva soka kupine i etiri ekstakta ipaka. Pomenuti autori su
odredili da je energija aktivacije, entalpija i entropija aktiviranja najmanja kod sokova kupine
(E
a
= 36,99 kJmol
-1
, H
*
= 34,24 kJmol
-1
, S
*
= -232 JK
-1
mol
-1
), zatim kod ekstrakta ipka
250

(E
a
= 51,12 kJmol
-1
, H
*
= 48,31 kJmol
-1
, S
*
= -194 JK
-1
mol
-1
), a najvea za sokove crvene
narane (E
a
= 66,04 kJmol
-1
, H
*
= 63,11 kJmol
-1
, S
*
= -149 JK
-1
mol
-1
). Dalje, ispitujui
kinetiku termike degradacije antocijana u soku borovnice u inervalu od 40 do 80
o
C,
Kechinski i sar.. (2010) su odredili sledee vrednosti: E
a
= 80,42 kJmol
-1
, H
*
= 77,80 kJmol
-
1
, S
*
= -43,07 JK
-1
mol
-1
i , G
*
= 91,3 kJmol
-1
. Nae vrednosti za termodinamike parametre
procesa degradacije antocijana crvenih vina su u saglasnosti sa gore pomenutim rezultatima
drugih autora.
Kinetika termike degradacije Mv-3-G uglavnom je ispitivana u model rastvorima.
Tseng i sar.(2006) su za model rastvore koje su pripremili rastvaranjem 50 mg Mv-3-G u 1L
0,025 mol/L rastvora vinske kiseline, iji je pH=3,5 podeen 0,1 mol/L rastvorom NaOH,
dobili vrednosti energije aktivacije od 95,39 kJmol
-1
bez etanola, 102,20 kJmol
-1
u prisustvu
10%, 101,78 kJmol
-1
u prisustvu 30% i 95,09 kJmol
-1
u prisustvu 50% etanola. Radne
temperature su bile 65, 75, 85 i 95
o
C. U naem sluaju (iznose E
a
= 57,70 kJmol
-1
, H
*
=
55,22 kJmol
-1
, S
*
= 16,59 JK
-1
mol
-1
i G
*
= 60,16 kJmol
-1
), degradacija Mv-3-G je znatno
ubrzana u prisustvu sistema Cu(II)/H
2
O
2
koji snano generie hidroksil radikale, to je
potvreno znatno niom vrednou energije aktivacije.
Nai rezultati takoe pokazuju da se vrednosti enegije aktivacije i otalih
termodinamikih parametara bitno ne razlikuju za Mv-3-G i Mv-3-AG (E
a
(Mv-3-G)/E
a
(Mv-
3-AG = 0,999). Sline rezultate dobili su i Romero i Bakker (2000) koji su ispitivali kinetiku
degradacije Mv-3-G, Mv-3-AG i Mv-3-CG u model rastvoru pri pH=3,7 i pri tome dobili
sledee odnose: E
a
(Mv-3-G)/E
a
(Mv-3-AG) = 1,018 i E
a
(Mv-3-G)/E
a
(Mv-3-CG) = 0,852.
Uporeivanjem vrednosti termodinamikih parametara za degradaciju antocijana u
crvenim vinima prikazanim u tabelama 4.16 i 4.22 moemo uoiti da dolazi do promene
znaka u vrednosti za entropiju aktiviranja. Entropija aktiviranja, odreena
spektrofotometrijskom metodom odnosi se na sve antocijane prisutne u vinu, pa i na
polimerne antocijane koji takoe apsorbuju zraenje talasne duine od 520 nm. Negativne
vrednosti entropije aktiviranja, primenom spektrofotometrijske metode dobili su i drugi
autori. Meutim, primenom HPLC metode za praenje kinetike degradacije, mogla se tano
odrediti entropija aktiviranja pojedinih antocijana, tanije Mv-3-G i Mv-3-AG. S obzirom da
je dobijena pozitivna vrednost entropije, mehanizam reakcija degradacije Mv-3-G i Mv-3-AG
hidroksil radikalima je disocijativni (Mili i Sovinj, 2000), i kod ovih reakcija graenju
aktiviranog kompleksa predhodi raskidanje veza u molekulu polaznih supstanci (reaktanata).
Za ovakve reakcije karakteristina je pozitivna vrednost entropije aktivacije od oko 20 J mol
-
1
K
-1
(Krasnova, 1995).

251

5.1.3. Mehanizam degradacije antocijana ceenih sokova od vianja, crvene
ribizle i malina

Naa ispitivanja hemijskog sastava vinje, crvene ribizle i maline HPLC metodom su
pokazala da ovo voe sadri samo derivate cijanidina ( tabela 4.36, 4.41,4.44, 4.53 i 4.58).
Interakcija izmeu cianidin-3-glukozida i Cu(II)-jona je dosta prouavana. Smyk i sar.
(2008) su ispitivali interakciju Cu(II)- jona i Cy-3-G i pri tome dokazali da nastaje kompleks
steheometrijskog odnosa 1:1, sa konstantom disocijacije K= (28.000 2600) mol
-1
. Odredili
su i termodinamike parametre
= (88 6) kJ mol
-1
i
= (92 5) J mol
-1
K
-1
.
Meutim, Esparza i sar. (2004) su predloili strukturu kompleksa metal-cijanidin-3-
glukozid steheometrijskog sastava 1:2 (slika 5.6):

Slika 5.6. Struktura kompleksa metal (Me)-Cy-3-G (R, glukozid)

to se tie eme formiranja reakcionih produkata pri oksidaciji cijanidin-3-glukozida
hidroksil radikalima koji nastaju u sistemu Cu(II)/H
2
O
2
moe se predloiti slina ovoj za
malvidin-3-glukozida pri emu e se reakcioni proizvodi razlikovati u istoj meri kolika je
ralika izmeu Mv-3-G i Cy-3-G.
Ispitivanja kinetike degradacije antocijana spektrofotometrijskom metodom u
ceenim sokovima od vianja i crvene ribizle dala su mogunost i za odreivanje
termodinamikih parametara. Iz tabele 4.16 se mogu videti vrednosti ovih parametara
odreenih spektrofotometrijskom metodom za sokove od vianja i oni iznose E
a
= 30,59
kJmol
-1
, H
*
= 28,12 kJmol
-1
, S
*
= -115,48 JK
-1
mol
-1
i G
*
= 62,53 kJmol
-1
, dok iz tabele
4.62 ove vrednosti za sokove od crvene ribizle iznose E
a
= 25,76 kJmol
-1
, H
*
= 23,29 kJmol
-
1
, S
*
= -121,92 JK
-1
mol
-1
i G
*
= 59,61 kJmol
-1
. Veliina aktivacione entropije daje vanu
informaciju o mehanizmu katalitike reakcije i o strukturi aktiviranog kompleksa. Velika
negativna vrednost, koja dostie i do -120 JK
-1
mol
-1
, karakteristina je za reakcije koje
protiu graenjem kompleksa koji ukljuuje oba reagensa i katalizator istovremeno. U
252

ovakvom aktiviranom kompleksu graenje novih i raskidanje veza u molekulima polaznih
supstanci deava se istovremeno. Za ovakve reakcije karakteristina je mala vrednost energije
aktivacije (Krasnova, 1995).
Termika degradacija cijanidin-3-glukozida je ispitana za temperaturni interval od 70
do 90
o
Ci pri tome je naeno da energija aktivacije za proces degradacije cijanidin-3-
glukozida u crvenoj narani iznosi 74,6 kJmol
-1
(Cao i sar., 2009). zkan i sar. (2002)
ispitivali su kinetiku degradacije soka vinje vodonik peroksidom i pri tome odredili enetgiju
aktivacije od 47,69 kJmol
-1
pri koncentraciji H
2
O
2
od 18,61 mmol/L. Nai rezultati daju niu
vrednost energije aktivacije (30,59 kJmol
-1
) zbog znatno vee koncentracije H
2
O
2
od 58,7
mmol/L ali i u prisustvu 0,132 mmol/L Cu(II) jona.
Energija aktivacije reakcije degradacije antocijana soka crvene ribizle hidroksil
radikalima iznosi 25,76 kJmol
-1
. Kopjar i sar. (2009) su ispitivali kinetiku degradacije
antocijana soka crvene ribizle za interval temperature od 30 do 90
o
C

i pri tome odredili
vrednost energije aktivacije od 33,08 kJmol
-1
.
U soku vinje i crvene ribizle prisutni su samo derivati cijanidina. Energije aktivacije
procesa degradacije cijanidina sistemom Cu(II)/H
2
O
2
iznose 30,59 kJmol
-1
u soku vinje,
odnosno 25,76 kJmol
-1
u soku crvene ribizle. Ove razlike posledica su razliitog sastava
sokova. Uticaj matriksa na termodinamike parametre zapazili su i drugi autori. zkan i sar.
(2004) su za degradaciju askorbinske kiseline vodonik peroksidom u razliitim sokovima
odredili sledee energije aktivacije: 21,8 kJmol
-1
u soku vinje, 26,2 kJmol
-1
u soku groa,
40,3 kJmol
-1
u soku narane i ak 71,0 kJmol
-1
u soku nara.
Veina organskih reakcija se odvija u pogodnom rastvarau. Promenom rastvaraa
moemo promeniti brzinu reakcije, a kod nekih reakcija i dominantan mehanizam reakcije.
Uticaj rastvaraa na brzinu hemijske reakcije potie od razlike u stepenu solvatacije poetnih
reaktanata i aktiviranog kompleksa. Ako se posmatra brzina reakcije pri prelasku od jednog
manje polarnog do drugog vie polarnog rastvaraa zbog solvatacionih efekata mogua su
dva karakteristina sluajeva.
- Ako je solvatacija aktiviranog kompleksa dominantnija od solvatacije poetnih
reaktanata, reakcija e se ubrzati. To znai da e se energetska barijera za reakciju
smanjiti.
- Ako su molekuli reaktanta znatno vie solvatisani od molekula aktiviranog
kompleksa, tada e reakcija biti spora.
Dielektrina konstanta rastvaraa pokazuje koliko je manje meusobno privlaenje
naelektrisanih estica u njemu od njihovog privlaenja u vakuumu. Polarniji rastvara
ubrzava reakciju u smeru stvaranja estica vee polarnosti (Dondur, 1992).
Ako uporedimo podatke za energije aktiviranja u tabelama 4.62 i 4.64 uoiemo da se
reakcija degradacije bre odvija u vodi i da prisustvo metanola, etanola ili acetona smanjuje
brzinu a samim tim i poveava energiju aktivacije. Veliina poveanja energije aktivacije
253

zavisi od polarnosti rastvaraa i najvea je u acetonu kao rastvarau najmanje polarnosti.
Ovaj podatak u skladu je sa rezultatima drugih autora. Tseng i sar. (2006) su prouavajui
kinetiku degradacije malvidin-3-glukozida u model rastvoru nali da uvoenjem 10% etanola
u reakcioni sistem dolazi do poveanja energije aktivacije za 6,9 kJmol
-1
.
Analizom podataka u tabeli 4.64 moemo uoiti da se uvoenjem metanola, etanola ili
acetona u reakcioni sistem menjaju vrednosti za energije aktiviranja, entalpiju i entropiju, ali
ne i za slogodnu energiju aktiviranja. Energija aktiviranja je esto koristan podatak u
aproksimaciji brzine reakcije, meutim brzinu hemijske reakcije definie bolje promena
slobodne energije aktiviranja i delimino promena entropije aktiviranja. Kod nekih hemijskih
reakcija dolazi do poveanja promene entalpije aktiviranja, ali odgovarajue poveanje
proizvoda temperature i promene entropije aktiviranja potpuno kompenzuje tu promenu
(Gleston, 1970, st.872; Obradovi i sar. 1987, st. 169).

5.1.4. Mehanizam degradacije flavan-3-ola

Kinetiku degradacije katehina i epikatehina hidroksil radikalima koji nastaju u
sistemu Cu(II)/H
2
O
2
pratili smo u crvenom vinu Vranac (Rubin-Kruevac) HPLC metodom
na osnovu promene povrine odgovarajuih pikova (275/322 nm,
ex
/
em
) fluorescentnim
detektorom. Tabela 4.14 pokazuje da se sadraj flavan-3-ola u vinima Vranac kree od
105,36 do 125,36 mg/L.
Kinetiku oksidativne degradacije katehina u prisustvu Cu(II) prouavali su Clark i
Scollary (2002) i pri tome utvrdili da postoji direktna proporcionalnost izmeu brzine
reakcije degradacije i koncentracije Cu(II)-jona, na osnovu poveanja apsorpcionog
maksimuma na 440 nm. Oszmiamski i sar. (1996) su, takoe uoili brojne reakcione produkte
na hromatogramima snimljenim na 280 i 430 nm. Stoga, uproenu emu oksidacije katehina
bi mogli prikazati na sledei nain (slika5.7):

Slika 5.7. ema oksidacije (+)-katehina hidroksil radikalima.
254

Pri tome su mnogi autori, meu kojima su Oszmiamski i sar. (1996) potvrdili postojanje
obojenog ksantilijum katjona meu oksidacionim produktima (slika 5.8).

Slika 5.8 . Struktura ksantijijum katjona

Ispitivanja kinetike degradacije katehina i epikatehina spektrofotometrijskom
metodom u crvenim vinima dala su mogunost i za odreivanje termodinamikih parametara.
Iz tabele 4.25 se mogu videti vrednosti ovih parametara odreenih spektrofotometrijskom
metodom za katehin i oni iznose E
a
= 45,22 kJmol
-1
, H
*
= 42,74 kJmol
-1
, S
*
= -31,88 JK
-
1
mol
-1
i G
*
= 52,24 kJmol
-1
, dok ove vrednosti epikatehin iznose E
a
= 41,42 kJmol
-1
, H
*
=
38,94 kJmol
-1
, S
*
= -40,25 JK
-1
mol
-1
i G
*
= 50,94 kJmol
-1
.
Oksidacija katehina i epikatehina je uglavnom prouavana u model rastvorima vina,
tako da se veliine za termodinamike parametre nisu mogle uporediti sa literaturnnim
podacima. Li i sar. (2011) prouavajui kinetiku termike degradacije derivata katehina
(epigalokatehina galata) u aju dobili su vrednost za E
a
od 79,27 kJmol
-1
. Prisustvo vodonik
peroksida i bakra oigledno moe smanjiti energiju aktivacije i poveati brzinu reakcije, ali
pri tome ne treba zaboraviti uticaj matriksa samog uzorka.
Ulogu bakra u ovom procesu treba posebno istai, s obzirom da je, pored gvoa bio predmet
mnogih istraivanja. Osymianski i sar. (1996) su prouavali oksidaciju katehina Fe(II) jonima
u model rastvoru (0,02 mol/L kalijum-hidrogentartarat, 20% v/v etanola, pH=3,7) i pri tome
su uoili da se brzina reakcije poveava sa poveanjem koncentracije Fe(II) jona, a takoe i
apsorbancija rastvora na 430 nm. Snimanjem HPLC hromatograma dokazali su prisustvo
reakcionih produkata koji apsorbuju u oblasti 385-414 i 440-460 nm. Dolazi do formiranja
utih pigmenata koje je znatno ubrzano u prisustvu 20 mg/L Fe(II) jona. Clark i Scollary
(2002), su ispitivali oksidaciju katehina u prisustvu Cu(II) jona u model rastvoru (10 g
kalijum-hidrogentartarata u 2l 12% etanola, pH=3,20 podeen vinskom kiselinom) i pri tome
255

zapazili da se proces stvaranja utih pigmenata na
max
=440 nm znatno ubrzava u prisustvu
0,6 mg/L Cu(II) jona. Jimenez-Atienzar i sar. (2004) su prouavali kinetiku katehina u
prisustvu enzima polifenol oksidaze (pH=7) i pti tome takoe doli do podataka da se tokom
oksidacije formiraju uti pigmenti sa
max
=430 nm, i predloili da se kinetika oksidacije
katehina ispituje spektrofotometrijski na 430 nm. Kada bi se snimali hromatogrami u duem
vremenskom periodu i na talasnoj duini 430-440 nm, pojavili bi se pikovi za reakcione
produkte reakcije. Meutim, na cilj nije bio ispitati nastajanje reakcionih produkata, ve
brzinu degradacije katehina i epikatehina pratei promene povrine pikova za ove
komponente.

256

257

6. IZVOD
258

259

U ovom radu je izvreno ispitivanje kinetike degradacije fenolnih komponenti i
monomernih antocijana u crvenim i belim vinima i ceenim sokovima vinje i crvene ribizle
spektrohotometrijskom metodom, kao i kinetike degradacije malvidin-3-glukozida, malvidin-
3-acetil-glukozida, katehina i epikatehina crvenih vina HPLC metodom. Radi boljeg
poznavanja sistema u kojima se ispituju procesi degradacije, izvreno je i kvantitativno
odreivanje i identifikacija fenolnih komponenata ekstrakata groa, vinji, crvene ribizle i
maline, kao i proizvoda, vina, vonih vina i komercijalnih sokova primenom
spektrofotometrijske i HPLC metode, dok je primenom ICP-OES metode odreen sadraja
minerala u grou i vinjama.
Na osnovu prikazanih rezultata prouavanja kinetike ispitivanih reakcionih sistema, a u
cilju predlaganja mehanizma i razrade novih kinetiko-spektrofotometrijskih metoda za
odreivanje ukupnih fenola i ukupnih antocijana, mogu se izvesti sledei zakljuci:
- Prouena je kinetika i razraena je kinetiko spektrofotometrijska metoda za
odreivanje ukupnih monomernih antocijana u crvenim vinima, a na osnovu reakcije
njihove degradacije hidroksil radikalima. Brzina reakcije je praena na 520 nm na
temperaturi od 22
o
C. Diferencijalna varijanta tangensne metode koriena je za
obradu kinetikih podataka. Ispitivanjem uticaja svakog reaktanta pojedinano (H
2
O
2
,
Cu(II), crveno vino) postavljena je kinetika jednaina reakcije degradacije, a potom
izraunate konstante brzine. Iz dobijenih vrednosti konstante brzine na etiri
temperature izraunati su termodinamiki parametri: energija aktivacije (E
a
=56,37
kJmol
-1
), aktivaciona entalpija (H*=53,91 kJmol
-1
), aktivaciona entropija (S*= -
35,52 JK
-1
mol
-1
) i Gibbs-ova slobodna energija aktivacije (G*=64,39 kJmol
-1
).
Validacija metode je izvrena odreivanjem intervala linearnosti, limita detekcije,
limita kvantifikacije, tanosti i preciznosti, korienjem metode unutranjeg
standarda, malvidin-3-glukozida. Relativna standardna devijacija je manja od 3,88%.
Metoda je primenjenja za odreivanje ukupnih monomernih antocijana u mladim
crvenim vinima. Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa rezultatima odreivanja HPLC
metodom.

- Prouena je kinetika degradacije najzastupljenijih monomernih antocijana crvenih
vina malvidin-3-glukozida i malvidin-3-acetil-glukozida hidroksil radikalima pri
pH=3,5. Pri validaciji HPLC metode za odreivanje malvidin-3-glukozida odreeni su
sledei parametri: linearnost, limit detekcije, limit kvantifikacije, tanost i preciznost.
Linearnost pokriva podruje od 2 do 150 g/ml, LOD i LOQ iznose 0,52 i 1,58 g/ml.
RSD se kree od 3,80 do 7,58%. Brzina reakcije je praena na odgovarajuim
retencinim vremenima za M3G i M3AG UV-Vis detektorom na 520 nm. Za obradu
kinetikih podataka primenjena je metoda inicijalne brzine. Na osnovu zavisnosti
inicijalne brzine od koncentracije reagujuih komponenata postavljene su kinetike
jednaine, na osnovu kojih su izraunate konstante brzine na etiri temperature: 25,
30, 35 i 40
o
C. Iz dobijenih vrednosti konstanti brzina na ovim temperaturama
izraunati su termodinamiki parametri procesa degradacije M3G i M3AG hidroksil
260

radikalima. Energija aktivacije za reakcije degradacije M3G i M3AG se veoma malo
razlikuju i iznose: 57,70 i 57,74 kJmol
-1
.

- Prouena je kinetika degradacije flavan-3-ola crvenih vina, katehina i epikatehina
hidroksil radikalima pri pH=3,5. Pri validaciji HPLC za odreivanje katehina i
epikatehina odreeni su sledei parametri: linearnost, limit detekcije, limit
kvantifikacije, tanost i preciznost. Brzina reakcije je praena na odgovarajuim
retencinim vremenima za katehin i epikatehin fluorescennim detektorom pri 275/322,
ex
/
em
. LOD i LOQ su 0,23 i 0,69 g/ml za katehin, odnosno 0,28 i 0,85 g/ml za
epikatehin.Kalibracione prave pokrivaju podruje od 1 do 30 g/ml. Za obradu
kinetikih podataka primenjena je metoda inicijalne brzine. Na osnovu zavisnosti
inicijalne brzine od koncentracije reagujuih komponenata postavljene su kinetike
jednaine, na osnovu kojih su izraunate konstante brzine na etiri temperature: 25,
30, 35 i 40
o
C. Iz dobijenih vrednosti konstanti brzina na ovim temperaturama
izraunati su termodinamiki parametri procesa degradacije katehina i epikatehina
hidroksil radikalima. Energije aktivacije reakcije degradacije za katehin i epikatehin
iznose 45,22 i 42,42 kJmol
-1
.

odreivanje ukupnih fenola u belim vinima, a na osnovu reakcije njihove degradacije
hidroksil radikalima pri pH=3,5. Brzina reakcije je praena na 420 nm na temperaturi
od 25
o
C. Diferencijalna varijanta tangensne metode koriena je za obradu kinetikih
podataka. Ispitivanjem uticaja svakog reaktanta pojedinano (H
2
O
2
, Cu(II), belo vino)
postavljena je kinetika jednaina reakcije degradacije, a potom izraunate uslovne
konstante brzine. Iz dobijenih vrednosti uslovnih konstanti brzine na etiri
temperature izraunata je energija aktivacije i ona iznosi E
a
=40,02 kJmol
-1
. Validacija
metode za odreivanje ukupnih fenola je izvrena odreivanjem intervala linearnosti,
limita detekcije, limita kvantifikacije, tanosti i preciznosti, korienjem metode
unutranjeg standarda, galne kiseline. Kalibraciona prava je linearna od 23,01 do
194,11 g GAE/ml. LOD i LOQ iznose 6,77 i 20,51 g/ml. Relativna standardna
devijacija je manja od 3,85%. Metoda je primenjenja za odreivanje ukupnih fenola u
belim vinima. Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa rezultatima odreivanja
standardnom spektrofotometrijskom metodom.

odreivanje ukupnih monomernih antocijana u ceenim sokovima vinje, a na osnovu
reakcije njihove degradacije hidroksil radikalima pri pH=3,5. Brzina reakcije je
praena na 520 nm na temperaturi od 25
o
C. Diferencijalna varijanta tangensne metode
koriena je za obradu kinetikih podataka. Ispitivanjem uticaja svakog reaktanta
pojedinano (H
2
O
2
, Cu(II), crveno vino) postavljena je kinetika jednaina reakcije
degradacije, a potom izraunate konstante brzine. Iz dobijenih vrednosti konstante
brzine na etiri temperature izraunati su termodinamiki parametri: energija
aktivacije (E
a
=30,59 kJmol
-1
), aktivaciona entalpija (H*=28,12 kJmol
-1
), aktivaciona
entropija (S*= -115,48 JK
-1
mol
-1
) i Gibbs-ova slobodna energija aktivacije
261

(G*=62,53 kJmol
-1
). Validacija metode je izvrena odreivanjem intervala
linearnosti, limita detekcije, limita kvantifikacije, tanosti i preciznosti, korienjem
metode unutranjeg standarda, cijanidin-3-glukozida. Relativna standardna devijacija
je manja od 2,0%, pri emu je LOD 1,11 a LOQ 3,37 g/ml.. Metoda je primenjenja
za odreivanje ukupnih monomernih antocijana u ceenim sokovima tri sorte vini:
Marela, Ciganica i Oblainska vinja. Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa
rezultatima odreivanja standardnom spektrofotometrijskom pH diferencijalnom
metodom.

odreivanje ukupnih monomernih antocijana u ceenim sokovima crvene ribizle i
maline, a na osnovu reakcije degradacije derivata cijanidina hidroksil radikalima pri
pH=3,5. Brzina reakcije je praena na 520 nm na temperaturi od 25
o
C. Diferencijalna
varijanta tangensne metode koriena je za obradu kinetikih podataka. Ispitivanjem
uticaja svakog reaktanta pojedinano (H
2
O
2
, Cu(II), crveno vino) postavljena je
kinetika jednaina reakcije degradacije, a potom izraunate konstante brzine. Iz
dobijenih vrednosti konstante brzine na etiri temperature izraunati su
termodinamiki parametri: energija aktivacije (E
a
=25,76 kJmol
-1
), aktivaciona
entalpija (H*=23,29 kJmol
-1
), aktivaciona entropija (S*= -121,92 JK
-1
mol
-1
) i
Gibbs-ova slobodna energija (G*=59,61 kJmol
-1
). Uvoenjem 10% metanola,
etanola i acetona u reakcionu smeu, energija aktivacije se poveava na 30,78, 34,73 i
40,23 kJmol
-1
dok se Gibbs-ova slobodna energija aktivacije bitno ne menja.
Validacija metode je izvrena odreivanjem intervala linearnosti, limita detekcije,
limita kvantifikacije, tanosti i preciznosti, korienjem metode unutranjeg
standarda, cijanidin-3-glukozida. Relativna standardna devijacija je manja od 3,56%,
pri emu je LOD 0,98 a LOQ 2,99 g/ml. Metoda je primenjenja za odreivanje
ukupnih monomernih antocijana u ceenim sokovima crvene ribizle i maline gajenih
na podruju Nike Banje i Vlasine. Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa rezultatima
odreivanja standardnom spektrofotometrijskom pH diferencijalnom metodom.

- Ispitivanja kinetike degradacije fenolnih jedinjenja hidroksil radikalima su pokazala
da se procesi mogu prikazati kinetikoj jednainom koja je prvog reda u odnosu na
koncentraciju organskog supstrata, oksidansa i katalizatora. Reakcije se zasnivaju na
redoks procesima u kojima jon katalizatora (Cu
2+
) menja oksidaciono stanje u Cu
+

tokom ciklinog procesa.

262

263

7. SUMMARY
264

265

This work presents the examining of the kinetics of degradation of phenolic compounds
and monomeric anthocyanins in red and white wines and squeezed cherry and red currant
juices using spectrophotometric method, as well as the kinetics of degradation of malvidin-3-
glucoside, malvidin-3-acetyl-glucoside, catechin and epicatechin red wine using HPLC
method. For a better understanding of the system in which the processes of degradation are
examining, the identification and quantification of the phenolic components of extracts of
grape, cherry, red currant and raspberries, as well as wine products, fruit wines and
commercial juices has been performed by spectrophotometric and HPLC methods, while the
mineral content in the grapes and cherries has been determinedby using ICP-OES method.
Based on the presented results of examining the kinetics of the studied reaction systems,
the following conclusions can be deduced in order to propose mechanisms and develop new
kinetic-spectrophotometric method for determination of total phenols and total anthocyanin:
- The kinetics was investigated and the kinetic-spectrophotometric method for the
determination of amounts of total monomeric anthocyanins in the red wines was
developed. It was based on the degradation of the anthocyanins by hydroxyl radicals.
The reaction rate was monitored at 520 nm at the temperature of 22
o
C
.
A differential
variation of the tangent method was used to process the kinetic data. By examining
the impact of each reactant on the reaction rate, the kinetics equation for reaction was
given on the basis of tg dependence on the reaction compounds concentrations and
the reaction rate constant was calculated for four temperatures. According to the
reaction rate constant values for four temperatures, the thermodynamic parameters
were obtained: activation energy (E
a
=56.37 kJmol
-1
), activation enthalpy (H
*
=53.91
kJmol
-1
), activation entropy (S
*
= -35.52 JK
-1
mol
-1
) and Gibb
s energy (G
*
=64.39
kJmol
-1
). The mechanism of degradation was discussed. The method was validated for
linearity interval, limits of detection and quantification, precision and accuracy using
the method of external standard (malvidin-3-glucoside). Relative standard deviation is
< 3.88%. The method was applied to determine the total monomeric anthocyanins
amounts in young red wines. The obtained results are in accordance with the HPLC
method results.

- The kinetic degradation of predominant red wine monomeric anthocyanins, malvidin-
3-glucoside and malvidin-3-acetil-glucoside was investigated by hydroxyl radicals in
aqueous solution (pH=3.5). HPLC method was validated for linearity, limits of
detection and quantification, precision and accuracy for determination of malvidin-3-
glucoside. Relative standard deviation for the malvidin-3-glucoside concentration
interval from 2 to 150 g/ml ranges from 7.58 to 3.80 %. LOD and LOQ are 0.52 and
1.58 g/ml, respectively. The reaction rate was monitored with UV-Vis detector at the
t
R
for malvidin-3-glucoside and malvidin-3-acetil-glucoside. An initial method was
used to process the kinetic data. The impact of each reactant on the reaction rate was
examined. The kinetics equation for reaction was given on the basis of initial rate
dependence on the reaction compounds concentrations. The reaction rate constant was
calculated at temperatures 25, 30, 35 and 40
o
C. According to the reaction rate
266

constant values for four temperatures, the thermodynamic parameters were obtained
for malvidin-3-glucoside and malvidin-3-acetil-glucoside. A significant difference in
activation energy (57.70, 57.74 kJmol
-1
) was not found between malvidin-3-glucoside
and malvidin-3-acetil-glucoside. The mechanism of degradation was discussed.

- The kinetics of degradation of flavan-3-ols catechin and epicatechin by hydroxyl
radicals in aqueous solution (pH=3.5) was investigated. HPLC method was validated
for linearity, limits of detection and quantification, precision and accuracy for
determination of catechin and epicatechin. The reaction rate was monitored with
fluorescence detector at the t
R
for catechin and epicatechin. LOD and LOQ for
catechin and epicatechin are 0.23, 0.69 and 0.28, 0.85 g/ml, respectively. The
intervals of catechin and epicatechin concentrations determinable by HPLC method
cover the area from 1 to 30 g/ml, respectively. An initial method was used to process
the kinetic data. The impact of each reactant on the reaction rate was examined. The
kinetics equation for reaction was given on the basis of initial rate dependence on the
reaction compounds concentrations. The reaction rate constant was calculated at
temperatures 25, 30, 35 and 40
o
C. According to the reaction rate, constant values for
four temperatures, the thermodynamic parameters were obtained for catechin and
epicatechin. The activation energy for catechin and epicatechin are 45.22 and 42.42
kJmol
-1
. The mechanism of degradation was discussed.

- The kinetics was investigated and the kinetic-spectrophotometric method for the
determination of amounts of total polyphenols in white wines was developed. It was
based on the degradation of the polyphenols by hydroxyl radicals. The reaction rate
was monitored at 420 nm at the temperature of 25
o
C
.
A differential variation of the
tangent method was used to process the kinetic data. The impact of each reactant on
the reaction rate was examined. The kinetics equation for reaction was given on the
basis of tg dependence on the reaction compounds concentrations. The reaction rate
constant was calculated for four temperatures. According to the reaction rate constant
values for four temperatures, the activation energy (E
a
=56.37 kJmol
-1
) were obtained.
The mechanism of degradation is discussed. The method was validated for linearity,
limits of detection and quantification, precision and accuracy. The method of external
standard (gallic acid) was used. Under the selected reaction conditions, the
polyphenol concentration varied from 23.01 to 194.11 g GAE/ml. The method was
applied to determine the amounts of poliphenols in white wines. The obtained results
are in accordance with the spectrophotometric method results.

- The kinetics was investigated and the kinetic-spectrophotometric method for
determining amounts of the total monomeric anthocyanins in sour cherry juices was
developed. It was based on the degradation of the anthocyanins by hydroxyl radicals.
The reaction rate was monitored at 520 nm at the temperature of 25
o
C
.
A differential
variation of the tangent method was used to process the kinetic data. The impact of
each reactant on the reaction rate was examined. The kinetics equation for reaction
was given on the basis of tg dependence on the reaction compound concentrations.
267

The reaction rate constant was calculated for four temperatures. According to the
reaction rate, constant values for four temperatures, the thermodynamic parameters
were obtained: activation energy (E
a
=30.56 kJmol
-1
), activation enthalpy (H
*
=28.12
kJmol
-1
*
= -115.48 JK
-1
mol
-1
) and Gibb
s energy (G
*
=62.53
kJmol
-1
). The mechanism of degradation was discussed. The method was validated
for linearity, limits of detection and quantification, precision and accuracy. The
method of external standard (malvidin-3-glucoside) was used. Relative standard
deviation is < 2.0%. The method was applied to determining the amounts of
monomeric anthocyanins in the sour cherry juices derived from three cultivars:
Oblacinska, Cigancica and Marela. The obtained results are in accordance with the
spectrophotometric pH-differential method results.

- The kinetics was investigated and the kinetic-spectrophotometric method for
determining the amounts of total monomeric anthocyanins in the red currant and
raspberry juices was developed. It was based on the degradation of the anthocyanins
by hydroxyl radicals. The reaction rate was monitored at 520 nm at the temperature of
25
o
C
.
A differential variation of the tangent method was used to process the kinetic
data. The impact of each reactant on the reaction rate was examined. The kinetics
equation for reaction was given on the basis of tg dependence on the reaction
compounds concentrations. The reaction rate constant was calculated for four
temperatures. According to the reaction rate, constant values for four temperatures,
the thermodynamic parameters were obtained: activation energy (E
a
=25.76 kJmol
-1
),
activation enthalpy (H
*
=23.29 kJmol
-1
*
= -121.92 JK
-1
mol
-1
)
and Gibb
s energy (G
*
=59.61 kJmol
-1
). The mechanism of degradation was
discussed. The method was validated for linearity, limits of detection and
quantification, precision and accuracy. The method of external standard (malvidin-3-
glucoside) as used. Relative standard deviation is < 3.56%. The method was applied
to determining the amounts of monomeric anthocyanins in red currant and raspberry
juices derived from fruits growing in Niska Banja and Vlasina. The obtained results
are in accordance with the spectrophotometric pH-differential method results.

- Investigated kinetics degradation of phenolic compounds by hydroxyl radicals
sugested that the reaction was first order with respect to phenolics, Cu(II) and H
2
O
2
,
respectively. The reaction rate was first order with respect oxidant, reductant and
catalyst. The reactions are based on redox reactions in which the catalyst is an ion
changes oxidation states during a cyclic proces.

268

269

8. LITERATURA
270

271

Acworth I. N., The Handbook of Redox Biochemistry, Eds. ESA, Inc., Chelmsford, USA,
2003.
Ahmed J., Shivhare U.S., Raghavan G. S. V., Thermal degradation kinetics of anthocyanin
and visual colour of plum puree, European Food Research and Technology, 2004, 218, 525-
528.
Alecu A., Saucier C., Cretescu I., The study of catalytic Degradation of Malvidin-3-
Glucoside from Red Wines, using Molecular Absorption Spectrophotometry, Revista de
Chemie, 2008, 59(3), 314-317.
Alothman M., Bhat R., Karim A. A., Antioxidant capacity and phenolic content of selected
tropical fruits from Malaysia, extracted with defferent solvents, Food Chemistry, 2009, 115,
785-788.
Anelkovi M., Camp J. V., Meulenaer B. D., Depaemelaere G., et al., Iron-chelation
properties of phenolic acids bearing catechol and galloyl groups, Food Chemistry, 2006, 98,
23-31.
Anis A., Dimitris P. M., Panagiotis K., Correlation pf pigment and flavanol content with
antioxidant properties in selected aged region wines from Grecce, Journal of Food
Composition and Analysis, 2002, 15, 655-665.
Anli R. E., Vural N., Antioxidant Phenolic Substances of Turkish Red Wines from Different
Wine Regions, Molecules, 2009, 14, 289-297.
AOAC, Official Methods of Analysis, Association of Official Analytical Chemist,
Washington, D.C. 17
th
Edition, 2000.
Arnous A., Makris D. M., Kefalas P., Effect of Principal Polyphenolic Components in
Relation to Antioxidant Characteristics of Aged Red Wines, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2001, 49, 5736-5742.
Avery H. E., Basic Reaction Kinetics and mechanisms, Micmillan, London, 1974.
Bermudez-Soto M. J., Tomas-Barberan F. A., Evaluation of commercial red fruit juice
concentrates as ingradients for antioxidant functional juices, European Food Reseaches and
Technology, 2004, 219, 133-141.
Blando F., Gerardi C., Nicoletti I., Sour cherry (Prunus cerasus L.) Anthocyanins as
ingredients for Functional Foods, Journal of Biomedicine and Biotechology, 2004, 5, 253-
258.
Borowska E. J., Mazur b., Kopciuch R. g., Buszewski B., Polyphenol, Anthocyanin and
Resveratrol Mass Fraction and Antioxidant Properties of Clanberry Cultivars, Food
Technology and Biotechnology, 2009, 47, 56-61.
272

Boulton R. B., Singleton V. L., Bisson L. F., Kunkee R. E., Principes and Practices of
Winemaking (Chinese trans.). Beijing: China Light Industry Press, 2001.
Brand-Williams W, Cuvelier M. E, Berset C., Use of the radical method to evaluate
antioxidant activity, Lebensmittel- Wissenschaft und Technologie, 1995, 28, 25-30.
Brouillard R., Chemical Structure Anthocyanins, part 1, Anthocyanins as Food Colors, 1982.
Budic-Leto I., Lovric T., Identification of phenolic acids and changes in their content during
fermentation and ageing of white wines Posip and Rukatac, Food Technology and
Biotechnology, 2002, 40, 221-225.
Burns J., Gardner P. T., O
,
Neil J., Crawford S., et al., Relationship among antioxidant
activity, vasodilation capacity and phenolic content in red wines, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2000, 48, 220-230.
Cabrera-Vique C., Teissedre P. L., Cabania M. T., Cabanis J. C., Determination and Levels
of Chromium in French Wine and Grapes by Graphite Furance Atomic Absorption
Spectrometry, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45, 1808-1811.
Cantos E., Espin J. C., Tomas-Barberan F. A., Varietal Difference Among the Polyphenol
Profiles of Seven Table Grape Cultivars Studied by LC-DAD-MS-MS, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 2000, 50, 5691-5696.
Cao S., Lui L., Pan S., Lu Q., Xu X., A Comparison of Two Determination Methods for
Studying Degradation Kinetics of the Major Anthocyanins from Bloond Orange, Journal of
Choe E., Min D. B., Chemistry and reactions of reactive oxygen species in foods. Journal of
Food Science, 2005, 70, R142-R159.
Chrzanowski G., Sempruch C., Sprowka I., Investigation of phenolic acids in leaves of
Blackcurrant (Ribes Nigrum L.) and sour cherry (Prunus Cerasue L.), Electronic Journal of
Polish Agricultural Universities, 2007, 10, 1-6.
Chunxia C., Chenghua X., Liangrong F., Jishuan S., Fali Q., Kinetics and reaction
mechanism of phenol hzdroxzlation catalzzed by La-Cu
4
FeAlCO
3
, Science in China Ser.B
Chemistry, 2005, 48(6), 530-537.
Cisse M., Vallant F., Acosta O., Dhuique-Mayer C., Dornier M., Thermal Degradation
Kinetics of Anthocyanins from Blood Orange, Blackberry and Roselle Using the Arrhenius,
Eyring and Ball Models, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57, 6285-6291.
Clark A. C., Scollary G., Copper(II)-mediated oxidation of (+)-catechin in a model white
wine system, Australian Journal of Grape and Wine Research, 2002, 8, 186-195.
273

Comuzzo P., Tat L., Alternatives to sulfur dioxide in enology, Industrie delle Bevande, 2003,
32, 450-462.
obanovi K., Nikoli-ori E., Mutavdi B., Testovi viestrukih uporeenja, Letopis
naunih radova, 2003, 27, 66-73.
Danilowicz J. C., Review of reaction mechanisms of oxygen and proposed intermediare
reaction products in wine: Control role of iron and copper, American Journal of Enology and
Viticulture, 2003, 54, 73-85.
Danilowicz J. C., Interaction of Sulfur Dioxide, Polyphenols, and Oxygen in a Wine-Model
System: Central Role of Iron and Coper, American Journal of Enology and Viticulture, 2007,
58, 53-60.
De Beer D., Joubert E., Gelderblom W. C. A., Manley M., Antioxidant Activity of South
African Red and White Cultivar Wines: Free Radical Scavenging, Journal of Africultural
and Food Chemistry, 2003, 51, 902-909.
De Heredia J. B., Torregrosa J., Dominguez J. R., Peres J.A., Kinetic model for phenolic
compound oxidation by Fenton
,
s reagent, Chemosphere, 2001, 45, 85-90.
Dondur V., Hemijska kinetika, Fakultet za fiziku hemiju, Beograd, 1992.
Dragovi-Uzelac V., Levaj B., Bursa D., Pedesi S., et al., Total Phenolics and Antioxidant
Capacity Assays og Selected Fruits, Agriculture Conspectus Scintificus, 2007, 72, 279-284.
urevi P., uran M., Obradovi M., Opta i neorganska hemija, Prirodno-matematiki
fakultet, Kragujevac, 1997.
Erofeev B. V., Tulupov V. A., Kinetika homogenovo kataliza, Minsk, 1977
Espaza I., Salinas I., Caballero I., Santamaria C., et al., Evoluation of metal and polyphenol
content over a 1-year period vinification: sample fractionation and correlation between metals
and anthocyanins, Analytica Chimica Acta, 2004, 525, 215-224.
Fan-Chiang, H. J., Wrolstad, R. E. (2005). Anthocyanin pigment composition of blacberries,
Journal of Food Scieces, 70, C198-C202.
Farnandez-Pachan, M. S., Villano, D., Garcia-Parrilla, M. C., Troncoso, A. M. (2004).
Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition. Analitica
Chimica Acta, 513, 113-118.
Frost, A., Pearson, R., Willey, J. Kinetics and Mechanism, New York, 1961
Furtado, P., Figueiredo, P., Pina, F. (1993). Phitochemical and thermal degradation of
anthocyanins. Journal Phitochemistry Photobiology, 75, 113-116
274

Galvin C., Theze de dostorat Enologie-Ampelogie, Universite de Bordeaux II, 1993
Ghiselli A., Nardini M., Baldi A., Antioxidant activity of different phenolic fractions
separated from an Italian red wine, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46,
361-367.
Gleston S., Udbenik fizike hemije, Nauna knjiga Beograd, 1970.
Goevac D., Teevi V., Velikovi M., Vujisi Lj., Polyphenolic compounds in seeds from
same grape cultivars brown in Serbia, Journal of the Serbian Chemical Society, 2010, 75,
1641-1652.
Goiffon J., Mouly P. P., Gaydon E. M., Anthocyanic pigment determination in red fruit
juices, concentrated juices and syrups using liquid chromatography, Analytical Chemica
Acta, 1999, 382, 39-50.
Gould, K., Davies, K., Winefield, C. Anthocyanins: how should you do it and what do the
results mean? British Journal of Pharmacology, 2009, 142, 231-255.
Green, J. M., A principal guide to analytical method validation, Analytical Chemistry, 1996,
68, 305A
Guerrero R. F., Liazid A., Palma M., Puertas B., et al., Phenolic characterisation of red grapes
authochthonous to Andalusia, Food Chemistry ,2009, 112, 945-955.
Guisti M. M., Wrolstad R. E., Characterization and measurement of anthocyanins by UV-
visible spectroscopy. Current protocols in food analytical chemistry. New York: John Wiley
and Sons, 2003.
Halliwell B., How to characterize a biological antioxidant, Free Radical Research
Communications, 1990, 9, 1-32.
Hkkinen, S. Flavonols and Phenolic Acids in Berries and Berry Products, Doctoral
Dissertation, University of Kupio, 2000.
Hkkinen S., Neinonen M., Karenlampi S., Mykkanen H., et al., Screening of selected
flavonoids and phenolic acids in 19 berries, Food Research International, 1999a, 32, 345-
353.
Hkkinen S. H., Karenlampi S. O., Heinonen I. M., Mykkanen H. M., Torronen A. R.,
Content of flavonols quercetin, myrecetin, and maemferol in 25 edible berries, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 1999b, 47, 2274-2279.
Halliwell B., How to characterize a biological antioxidant, Free Radical Research
Communications, 1990, 9, 1-32.
275

Halliwell B., Gutteridge J. M. C., Free radicals in biology and medicine. 3rd ed. New York:
Oxford Univ. Press.
Hancock W. S., Choloupek R. C., Kirkland J. J. Synder L. R., Temperature as a variable in
RP-HPLC separations of peptide and protein sample: I. Optimizing the separation of a growt
hormone tryptic digest, Journal of Chomatography A, 1994, 686, 31-38.
Harbourne N., Jacquier J. C., Morgan, D. J., Lyng J. G., Determination of the degradation
kinetics of anthocyanins in a model juice system using isothermal and non-isothermal
methods, Food Chemistry, 2008, 111, 204-208.
Hogan, S. Zhang L., Janrong L., Zoecklein B., Zhou K, Antioxidant properties and bioactive
components of Norton (Vitis aestivalis) and Cabernet Franc (Vitis vinifera) wine grapes, Lwt-
Food Science and Technology, 2009, 42, 1269-1274.
Hner K., Cervellati R., Neddens C., Measurements of the in vitro antioxidant activity of
German white wines using a novel method, European Food Research and Technology, 2002,
214, 356-360.
Hu Y. Z., Jiang LJ., Generation of semiquinone radical anion and reactive oxygen (
1
O
2
, O
2
-
,
and OH) during thephotosensitization of a water-soluble perylenequinone derivative, Journal
of Photochemistry and Photobiology, 1996, 33, 51-59.
Iacopini P., Baldi M., Starchi P., Sebastiani L., Catechin, epicatechin, quercetin, rurin and
resveratrol in red grape: Content, in vitro antioxidant activity and interactions, Journal of
Food Composition and Analysis, 2008, 21, 589-598.
Jacimirski K. B., Kinetieskie metodi analiza, Himija, Moskva, 1967.
Jackson S. J., Wine science-principes and applications, Third edition, Academic press, 2008.
Jacobien K., Von Frijatag D. K., Van der Zee J., Ljzerman A. P., Radical scavenging
properties of adenoside and derivatives in vitro, Drug Development Research, 1996, 37, 48-
54.
Jagtap U. B., Panaskav S. N., Bapat V. A., Evaluation of Antioxidant Capaciyu and Phenol
Content in Jackfruit (Artocarpus heterophyllus Lam.) Fruit Pulp, Plant Foods for Human
Nutrition, 2010, 65, 99-104.
Jakobek M., eruga M., Medvidovi-Kosanovi M., Novak I., Anthocyanin content and
antioxidant activity of various red fruit juices, Deutsche Lebensmittel-rundschau, 2007a, 103,
58-64.
Jakobek M., eruga M., Novak I., Medvidovi-Kosanovi M., Flavonols, Phenolic Acids and
Antioxidant Activity of Some Red Fruits, Deutsche Lebensmittel-rundschau, 2007b, 103,
369-378.
276

Jia Z., Tang T., Wu J., The determination of flavonoids content in mulberry and scavenging
effect on superoxide radicals, Food Chemistry, 1999, 64: 555.
Jimenez-Atienzar M., Cabanes J., Gandia-Herrero F., Carcia-Carmona F., Kinetic Analysis of
catechin oxidation by polyphenol oxidase at natural pH, Biochemical and Biophisical
Research Communications, 2004, 319, 902-910.
Khknen M. P., Hopia A. I., Heinonen M., Berry Phenolics and Theit Antioxidant Activity,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49, 4076-4082.
Kajanovska M., Petrovska J., Stefova M., Comparison of Different Extraction Solvent
Mixtures for Cheracterization of Phenolic Compounds in Strawberries, Journal of
Kallay M., Steger-Mate M., Mcster-Ficzek M., Sandor G., et al., Changes of polyphenol,
anthocyanin and rutin content in sour cherry varieties during ripening, Acta Biologica
Szegediensis, 2008, 52, 217-219.
Kallithraka S., Alijal L., Makris D. P., Kefalas P., Anthocyanin profiles of major red grape
(Vitis vinifera L.) varieties cultivated in Greece and their relation ship with in vitro
antioxidant characteristics, International Journal of Food Science & Technology, 2009a, 44,
2385-2393.
Kallithraka S., Salacha M. I., Tzourou I., Changes in phenolic composition and antioxidant
activity of white wine during bottle strorage: Accelerated browning test versus bottle storage,
Food Chemistry, 2009b, 113, 500-505.
Kalithraka S., Mohdaly A. A., Markis P. D., Kefalas P., Determination of major anthocyanin
pigments in Hellenic native grape varieties (Vitis vinifera sp.) association on with antiradical
activity, Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 18, 375-386.
Karakhanov E. A., Maximov A. L., Kardasheva Y. S., Skorkin V. A. et al., Hydroxylation of
Phenol by Hydrogen Peroxide Catalyzed by Copper(II) and Iron(III) Complexes: The
Structure of the Ligand and the Selectivity of orto-Hydroxylatin, Indian Engineering and
Chemical Research, 2010, 49, 4607-4613.
Karbowiak T., Gougeon R. D., Alinc J. B., Brachains L., et al., Wine Oxidation and the Role
of Cork, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2010, 50, 20-52.
Katalinic V., Ljubenkov I., Pezo I., Generalic I., et al., Free resveratrol monomers in varietal
red and white wines from Dalmatia (Croatia), Periodicum Biologorum, 2008, 110, 77-83.
Katalini V., Moina S. S., Sktroza D., Generali I., et. al., Polyphenolic profile antioxidant
properties and antimicrobal activitz og grape skin extract of 14 Vitis vinifera vatieties grown
in Dalmatia (Croatia), Food Chemistry, 2010, 119, 715-723.
277

Katalini V., Milo M., Modun D., Musi I., et al., Antioxidant effectiweness of selected
wines in comparison with (+)-catechin, Food Chemistry, 2004, 86, 593-600.
Kazakevich Z., Lobrutto R., HPLC for Pharmaceutical Scintists, John Wiley&Sons Inc.,
Hoboken, New Jersey, 2007.
Katelan-Macan M. Kemijska analiza u sustavu kvaliteta, kolska knjiga, Zagreb, 2003.
Kechinski C. P., Guimaraes P. V. R., Norena C. P. Z., Tessara I. C., Marczak L. D. E.,
Degradation Kinetics of Anthocyanin in Blueberry Juice during Thermal Treatment, Journal
of Food Science, 2010, 75, C173-C176.
Kedage V. V., Tilak J. C., Dixit G. B., Devasagayan T. P., Mhatre M., A study of
Antioxidant Properties of Some Varieties of Grapes (Vitis vinifera L.), Critical Reviews in
Food Science and Nutricion, 2007, 47, 175-185.
Keinanen M., Comparison of methods for the extraction of flavonoids from birch leaves (
Betula pendula Roth.) carried out using high-performance liquid chromatography, Journal of
Kim D. O., Heo H. J., Kim Z. J., Yang H. S., Lee C. Y., Sweet and Sour Cherrz Phenolcs and
Their Protective Effects on Neuronal Cells, Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2005, 53, 9921-9927.
Kirakosyan A., Sezmour, E. M., Leaner D. E. U., Kaufman P. B., Bolling S. F., Chemical
profile and antioxidant capacities of tart cherry product, Food Chemistry, 2009, 115, 20-25.
Kopjar M., Piliota V., ubari D., Bobi J., Prevention of termal degradation of red curranr
juice anthocyanins by phenolic compounds addition, Croatian Journal Food Science and
Technology, 2009, 1, 24-30.
Kordis-Krape M., Abram V., Ka M., Ferjani S., Determination of Organic Acids in
White Wines by RP-HPLC, Food Technology and Biotechnology, 2001, 39, 93-99.
Kova V., Peki B., Proantocijanidoli groa i vina, Savremena poljoprivreda, 1991, 39, 5-
17.
Krasnova K. S., Fizieskaja himija, kniga 2, Elektrohimija Himieskaja kinetika i kataliz,
Viaja kola, Moskva, 1995
Laidler K. J., Symbolism and Terminology in Chemical Kinetics, Applied Chemistry, 1981,
53, 735.
Laji S., Gruji-Injac B., Hemija prirodnih proizvoda, Tehnoloki fakultet, Novi Sad, 1998.
278

Laurie V. F., Waterhouse A. L., Oxidation of glycerol in the presence of hydrogen peroxide
and iron in model solutions and wine: Potential effects on wine color, Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 2006, 54, 4668-4673.
Leucuta S., Vlase L., Gocan S., Radu L., Fodorea C., Determination of phenolic compounds
from Geranium sanguineum by HPLC, Journal of Liquid Chromatography and Related
Technologies, 2005, 28, 3109-3117.
Li H., Wang H., Yuang C., Wang S., Wine chemistry. Beijing: Scientific Publishing
Company, 2005.
Li H., Guo A., Wang H., Mechanisms of oxidative browning of wine, Food Chemistry, 2008,
108, 1-13.
Li N., Taylor L.S., Maver L.J., Degradation Kinetics of Catechin in Green Tea Power: Effects
of Temperature and Relative Humidity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011,
59, 6082-6090.
Lopes P., Richard T., Saucier C., Teissedre P.-L., et al., Antocyanone A: A Quinone Methide
Derivative Resulting from Malvidin 3-O-Glucoside Degradation, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2007, 55, 2698-2704.
Lucena A. P. S., Nascimento R. J. B., Maciel J. A. C., Tavares J. X., Antioxidant activity and
phenolic content of selected Brazilian wines, Journal of Food Composition and Analysis,
2010, 23, 30-36.
Luoana P., Red wine quality establishing on the basis of chromatic properties, Revista de
Chimie, 2005, 56, 703-707.
Maleti E., Konti J. K., Preiner D., Jeromel A., et al., Anthocyanin profile and antioxidant
capacity of some authochthonous Croatian red wines, Journal of Food, Agriculture &
Environment, 2009, 7, 51-58.
Mtt K. R., Kamal-Eldin A., Torronen R., High-performance liquid chromatography
(HPLC) analysis of phenolic compounds in berries with diode array and electrospray
ionization mass spectrometric (MS) detection: Ribrs species, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2003, 51, 6736-6744.
Mtt K. R., Kamal-Eldin A., Mattila P. H., Gonzalez-Paramas A. M., Torronen R.,
Distribution and content of phenolic compounds in eighteen scandinavian berry species,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52, 4477-4478.
Mauri A. R., Dissertation Peroxide promoted catalztic wet air oxidation of phenolic
aqueous solution using activated carbon as catalyst Universitat Rovira i Virgili, Tarragana,
2007.
279

Milenovi D., Razvoj i validacija HPLC metoda za odreivanje rezidua aktivnih komponenti
farmaceutskih preparata, Doktorska disertacija, PMF, Ni, 2010.
Mili N., Sovilj S., Kinetiko-termodinamiki principi o mehanizmi hemijskih reakcija,
prirunik za raunske i eksperimentalne vebe, NIK, Beograd, 2000.
Milis M., Ljubenkov I., Piskernik S., Pezo I., et al., Polyphenolic profile, antioxidant
properties and antimicrobial activity of grape skin extracts of 14 Vitis vinifera grown in
Dalmatia (Croatia), Food Chemistry, 2010, 119:715-723.
Minussi C. R., Rossi M., Bologna L., Cordi L., et al., Phenolic compounds and total
antioxidant potential of comercial wines, Food Chemistry, 2003, 82, 409-416.
Monagas M., Bartolome B., Gomey-Cordoves C., Updated knowlegde about the presence of
phenolic compounds in wine, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2005, 45, 85-
118.
Muselik J., Garcio-Alonso M., Martin-Lopez M. P., emlicka,M., Rivas-Gonzalo J. C.,
Measurement of Antioxidant Activity of Wine Catechins, Procyanidins, Anthocyanins and
Pyranoanthocyanins, International Journal of Molecular Sciences, 2007, 8, 797-809.
Nikfardjam M.S.P., Mark L., Avar P., Figler M., Ohmacht R., Polyphenols, anthocyanins,
and trans-resveratrol in red wines from the Hungarian Villany region, Food Chemistry, 2006,
98, 453-462.
Obradovi M., Krsmanovi m., orevi S., Dimi G., et al., Hemijsko tehnoloki prirunik,
Hemijski i fiziki podaci i veliine, Rad, Beograd, 1987
Ohara Z., Peterson T. E., Harrison D. G., Hypercholesterolemia Increases Endothelial
Superoxide Anion Production, Journal of Clinical Investigation, 1993, 91, 2546-2551.
Ohshima H., Yoshie Y., Auriol S., Gilbert I., Antioxidant and pro-oxidant actions of
flavonoids: effects on DNA damage induced by nitric oxide, peroxynitrite and nitroxyl anion,
Free Radical Biologz and Medicine, 1998, 25, 1057-1065.
Oszmianski J., Cheynier V., Moutounet M., Iron-Cataliyed Oxidation of (+)-Catechin in
Model Systems, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44, 1712-1715.
zkan M., Kirca A., Cemeroglu B., Effects of hydrogen peroxide on the stability of ascorcic
acid during strorage in various fruit juices, Food Chemistry, 2004, 88, 591-597.
zkan M., Yemenicioglu A., Asefi N., Cemeroglu B., Degradation Kinetics of Anthocyanins
from Sour Cherry, Pomegranare and Strawberry Juices by Hydrogen Peroxide, Journal of
Food Science, 2002, 67, 525-529.
280

Pantelidis G. E., Vasilakakis M., Manganaris G. A., Diamantidis G., Antioxidant capacity,
phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries and currants,
gooseberries and Cornelian cherries, Food Chemistry, 2007, 102, 777-783.
Papp N., Szilvassy B., Szabo Z., Nyeki L., et al., Antioxidant capacitz, total phenolics and
mineral element contents in fruit of Hngarian sour cherry cultivars, International Journal of
Horticultural Science, 2008, 14, 59-64.
Pedesi S., Dragovi-Uzelac V., Levaj B., kevin D., Effect of Maturity and Geographical
Region on Anthocyanin Content of Sour Cherries (Prunus cerasus var. marasca), Food
Thechnology and Biotechnology, 2010, 48, 86-93.
Pedesi S., Levaj B., Dragovi-Uzelac V., Kos K., Physicochemical Composition, Phenolic
Content and Antioxidant Activity of Sour Cherry cv. Marasca During Ripening, Agriculturae
Conspectus Scintificus, 2007, 72, 295-300.
Pellegrini N., Simonetti P., Claudio G., Brighenti F., Pietta P., Polyphenol content and total
antioxidant activity of red wines processed by carbonic maceration, 2nd International
Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry, 1998.
Perez-Bendito D., Silva L., Kinetic Methods in Analytical Chemistry, Ellis Horwood,
Chichester, 1988.
Perez-Zuniga F. J., Abad F. B., Cartagen L. G., Kinetics of non-enzymatic oxidation reaction:
browning in white wines, European Food Research and Technology, 2000, 211, 252-256.
Pileti M. V., Mili B. Lj., ilas S. M., Organska hemija II deo, Prometej, Novi Sad, 1993.
Piljac-egarac J., Valek L., Martinez S., Belak A., Fluctuations in the Phenolic content and
antioxidant capacity of dark fruit juices in refrigerated storage, Food Chemistry, 2009, 113,
394-400.
Poiana M.A., Dobrei A., Stoin D., Ghita A., The influence of viticultural region and the
ageing process on the color structure and antioxidant profile of Cabernet Sauvignon red
wines, Journal of Food , Agriculture & Environment, 2008, 6, 104-108.
Price S. F., Breen P. J., Valladao M., Watson B. T., Cluster sun exposure and quercetin in
Pinot noir grapes and wine, American Journal of Enology and Vitriculture, 1995, 46, 187-
194.
Provenzano M. R., Bilali H., Simeone V., Base N., et al., Copper contents in grapes and
wines from a Mediterranean organic vineyarg, Food Chemistry, 2010, 122, 1338-1343.
Puka V. S., Uticaj tehnolokih faktora u proizvodnji crvenih vina na sadraj i stabilnost
katehina i njihovih oligominerala, Doktorska disertacija, Tehnoloki fakultet, Univerzitet u
Novom Sadu, 2010.
281

Rastija, V., Srecnik, G., Medic-Saric, M. (2009). Polyphenolic composition of Croatian wines
with different geographical origin. Food Chemistry. 15, 54-60.
Rai, S., Todorovi, M., Holclajter'Antunovi, I., Stoiljkovi, M. (1999). Determination og
metal traces in wine by argon stabilized d.c.arc. Frensenius Journal of Analytical Chemistry,
365, 367-370.
Revilla, E., Ryan, J. M., Martin-Ortega, G. (1998). Comparison of several producers used for
the extraction of anthoczanins from red grapes, Journal of Agricultural and Food Chemistry,
46, 4592-4597.
Riberau-Gayon J., Stonestreet E., Le dosage des anthocyanins dans le Vin rouge, Bulletin de
la Societe Chimque de France, 1965, 9, 2649.
Ribereau-Gayon P., Dubourdieu D., Doneche B., Lonvaud A., Hanbook of enology (2nd ed.).
The microbiology of wine and vinifications (Vol.2). Chichester, England: John Wiley and
Sons Ltd., 2006.
Rivas F.J., Beltran F.J., Frades J., Buxeda P., Oxidation of p-hzdroxzbenzoic acid bz Fenton
,
s
reagent, Water Research, 2001, 35(2), 387-396.
Robards K., Prenzer P. D., Tucker G., Swatsitang P., Glover W., Phenolic compounds and
their role in oxidative process in feuits, Food Chemistry, 1999, 66, 401-436.
Rodriguez-Delgado M. A., Gonzalez-Hernandez G., Conde-Gonzales J. E., Perez-Trujillo J.
P., Principal component analysis of the polyphenol content in young red winrs, Food
Chemistry, 2002, 78, 523-532.
Romero C., Bekker J., Effect of storage Temperature and Pyruvate on Kinetics of
Anthocyanin Degradation, Vitisin A Derivate Formation, and Color Characteristics of Model
Solutions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48, 2135-2141.
Roussis I.G., Lambropoulos I., Tzimas P., Gkoulioti A., Antioxidant activities of some Greek
wines and wine phenolic extracts, Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21, 614-
621.
Ruberto G., Randa A., Daquino C., Amico V., et al., Polyphenol constituents and antioxidant
activity of grape pomace extracts from five Sicilian red grape cultivars, Food Chemistry,
2007, 100, 203-210.
Salaha M. I., Kallithraka S., Tzourou I., Browing of white wines: correlation with antioxidant
characteristics, total polyphenolic composition and flavanol content, International Journal of
Food Science and Technology, 2008, 43, 1073-1077.
Salem I. A., El-Mazawi M., Zaki A. B., Kinetics and mechanisms of decomposition reaction
of hydrogen peroxide in presence of metal complexes, International Journal of Chemical
Kinetics, 2000, 32, 643-666.
282

Sanchez-Moreno C., Larrauti J. A., Saura-Calixto F., Free radical scavenging of selected red,
rose and white wines, Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79, 1301-1304.
Savi J, Savi M., Osnovi analitike hemije, Klasine metode, II izdanje, Svjetlost, Sarajevo,
1989.
Seabra R. M., Dopico-Garsia M. S., Fique A., Guerra L., et al., Principal components of
phenolics to characterize red Vinho Verde grapes: Anthocyanins or non-coloured compounds,
Talanta, 2008, 75, 1190-1202.
Seeram N. P., Adams L. S., Zhang Y., Lee R., et al., Blackberry, Black Raspberry, Blueberry,
Clanberry, Red Raspberry, and Stawberry Extracts Inhibit Growth and Stimulate Apoptosis
of Human Cancer Cell in Vitro, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54, 9329-
9339.
Shi H., Noguchi N., Niki E., Introducing natural antioxidants, U: Antioxidants in food,
Practical applications, Pokorny J., Yanishlieva N., Gordon M., Woodhead Publishing
Limited, EDS., Cambridge, England, 2001, 22-70.
Simonetti P., Pitta P., Testolin G., Polyphenol Content and Total Antioxidant Potential of
Selected Italian Wines, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45, 1152-1155.
Singleton V. L., Tannins and the qualities of wines. In: Plant Polyphenols Synthesis
Properties, Significance, R.W. Hemingway and P.E. Laks (Eds.), Premium Press, New York,
1992, 859-880.
Singleton V. L., Rossi A., Colorimetry of total phenolics with phospitomolybolic-
phosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Vitriculture, 1965, 16,
144.
Sioumis N., Kallithraka S., Tsoutsouras E., Makris D. P., Kefalas P., Browning development
in white wines: dependence on compositional parameters and impact on ant ioxidant
characteristics, European Food Research and Technology, 2005, 220, 326-330.
Sioumis N., Kallithraka S., Makris D. P., Kefalas P., Kinetics of browning onset in white
wines: influence of principal redox-active polyphenols and impact on the reducing capacity.
Food Chemistry, 2006, 94, 98-104.
Skoog D. A., West D. M., Holler F. J., Fundamentals of Analytical Chemistry, Saunders
College Publishing, Philadelphia, 1996.
Smyk B., Pliszka B., Drabent R., Interaction between Cyanidin-3-glucoside and Cu(II) ions,
Food Chemistry, 2008, 107, 1616-1622.
Stevanato R., Fabris S., Momo F., New enzymatic method for the determination of total
phenolic content in tea and wine, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52,
6287-6293.
283

Stratil P., Kuban V., Fojtova J., Comparison of the Phenolic Content and Total Antioxidant
Activity in Wines as Determined by Spectrophotometric Methods, Czech Journal of Food
Science, 2008, 26, 242-253.
Todorovi M., Optike metode instrumentalne analize, Hemijski fakultet, Beograd, 1997
Toit W. J. d., Marais J., Pretorius I.S., Toit M. d., Oxygen in must and wine A review,
South African Journal of Enology and Vitriculture, 2006, 27(1), 76-94.
Tseng K. C., Chang H. M., Wu J. S. B., Degradation kinetics of anthocyanin in ethanolic
solutions, Journal of Food Processing and Preservation, 2006, 30, 503-514.
Turkben C., Sariburun E., Demir,V., Uylaser V., Effect of Freezing and Frozgen Storage on
Phenolic Compounds of Raspberry and Blackberry Cultivars, Food Analytical Methods,
2010, 3, 144-153.
Verbeyst L., Oey I., Van der Placken I., Hendrickx A., Loey A. V., Kinetic study on the
termal and pressure degradation of anthocyanins in strawberries, Food Chemistry, 2010, 123,
269-274.
Veljkovi S., Hemijska kinetika, Nauna knjiga, Beograd, 1967.
Yair M., Concepts in Wine Chemistry, James Crum, pH.D.ed., USA, 1997.
Yi C., Shi J., Kramer J., Xue S., et al., Fatty acid composition and phenolic antioxidants of
winemaking pomace powoer, Food Chemistry, 2009, 114:570-576.

284

285

9. PRILOG
286

287

9.1. Hromatogrami i apsorpcioni spektri standarda
9.1.1 Antocijani

Slika 9.1. Hromatogram malvidin-3-glukozida.

Slika 9.2. Apsorpcioni spektar malvidin-3-glukozida na 520nm.
288

Slika 9.3. Standard pokoice groa (INRA, Montpellier, France).

Slika 9.4. Razdvajanje antocijana prema polarnosti.

289

9.1.2. Flavan-3-oli

Slika 9.5. Hromatogram katehina (275/322 nm,
ex
/
em
).

Slika 9.6. Hromatogram epikatehina (275/322 nm,
ex
/
em
).
290

Slika 9.7. Apsorpcioni spektar katehina.

Slika 9.8. Apsorpcioni spektar epikatehina.

291

9.1.3. Flavonoli

Slika 9.9. Hromatogram kvercetina na 360 nm.

Slika 9.10. Apsorpcioni spektar kvercetina.

292

9.1.4. Hidroksicimetne kiseline

Slika 9.11. Hromatogram kafene kiselina na 320 nm.

Slika 9.12. Hromatogram ferulne kiseline na 320nm.
293

Slika 9.13. Apsorpcioni spektar kafene kiseline.

Slika 9.14. Apsorpcioni spektar ferulne kiseline.

294

9.2. Statistika obrada podataka

Bez obzira na panju analitiara i preciznost instrumenta, rezultati merenja se uvek
rasipaju. Varijacije u eksperimentalnim podacima normalno su raspodeljene ako ponovljena
merenja daju Gausovu krivu. Postoji jednaka verovatnoa da e merenje biti manje ili vee
od aritmetike sredine. to je pojedinano merenje dalje od aritmetike sredine, manja je
verovatnoa njegovog ponavljanja. Ako nema sistematske greke i kako se poveava broj
merenja, aritmetika sredina tei prema (tana vrednost), a standardno odstupanje prema o.
Standardno odstupanje (standardna devijacija) neke metode uobiajeni je parametar za
odreivanje i procenjivanje veliine sluajne greke i mera je ponovljivosti rezultata. Ako je
standadrna devijacija priblino jednaka aritmetikoj sredini, ponovljivost je loa, a dobro
ponovljenim smatraju se rezultati ija je standadrna devijacija manja od 1% aritmetike
sredine.
Za vrlo veliki broj merenja standardna devijacija se izraava kao:

( )
n
x
n
i
i
=

=
1
2
o
9.1

esto se umesto standardne devijacije koristi varijansa o
2
.
U eksperimentalnim odreivanjima ne sreemo se sa velikim brojem merenja, pa se
postavlja pitanje mogu li se na takva odreivanja primeniti statistiki zakoni. Naime, za mali
broj odreivanja sluimo se aritmetikom sredinom x , a ne njenom graninom vrednou ,
od koje se razlikuje zbog uticaja sluajne greke. Zbog toga za mali broj merenja ne smemo
upotrebiti standardnu devijaciju o, nego njegovu procenu s. Kao to je aritmetika sredina
procena prave vrednosti, tako je i s procena standardne devijacije. Kako se na taj nain u
raunanje unose dve nesigurnosti, potrebno je u imeniocu jednaine umesto broja merenja n
uvstiti broj stepena slobode n-1. broj stepena slobode v oznaava broj nezavisnih odstupanja
merene vrednosti od aritmetike sredine.
Stoga je izraz za procenu standardne devijacije, koji se naziva i eksterimentalnom
standardnom devijacijom sledei:

( )
1
1
2
=

=
n
x x
s
n
i
i
9.2

Bolje je kao meru preciznosti upotrebiti relativnu standardnu devijaciju (RSD):
295

100 =
x
s
RSD
9.3

Izraz za interval pouzdanosti merene veliine je:

n
ts
x =
9.4

gde je t tabelarna vrednost koja se odreuje na osnovu stepena slobode i nivoa pouzdanosti.
Svako ispitivanje temelji se na nekoj pretpostavci koja se moe potvrditi
eksperimentom, ako se dobijene vrednosti sa njom podudaraju, ili, u protivnom odbaciti.
Retka je potpuna podudarnost eksperimentalnih podataka s hipotetikim podacima. Da bi se
ustanovilo da li je razlika izmeu dobijene i referentne vrednosti posledica sluajne ili
sistematske greke, sprovode se statistiki testovi signifikatnosti. Uz pomo statistikih
testova moe se proceniti da li je dobijena razlika statistiki signifikantna, pa hipotezu treba
odbaciti, ili se rezultat moe prihvatiti zato to je posledica sluajne greke.
Prilikom testiranja postavlja se nulta hipoteza, kojom tvrdimo da nema razlike izmeu
dobijene i referentne vrednosti. Ako se ta predpostavka potvrdi, znai da je uoena razlika
posledica sluajne greke. Verovatnoa prihvatanja ili odbacivanja hipoteze obino je p=0,05,
to znai da postoji 5%-tna verovatnoa prihvatanja greke ili odbacivanja ispravne hipoteze.
Kada elimo smanjiti taj rizik, odluujemo se za 1%-tnu verovatnou, to se oznaava sa
p=0,01.
Pri odabiru testa za reavanje statistikog problema treba uzeti u obzir prirodu
ispitivanog uzorka, nain uzorkovanja i metodu ispitivanja
Poreenje srednjih vrednosti. t-test. Rezultati analize nekog uzorka dobijeni primenom
razliitih metoda ili od strane raznih eksperimentatora po pravilu se meusobno donekle
razlikuju i nisu jednako precizni, odnosno reproduktivni. Slino kao i u predhodnom sluaju,
i ovde moemo metodama matematike statistike proveriti sa kolikom je verovatnoom
razlika izmeu dveju srednje vrednosti
1
x i
2
x dva niza rezultata znaajna, ili je
uzrokovana samo sluajnim grekama. U tu svrhu se obino primenjuje tzv.t-test (Studentov
t-test). Predhodno se mora proveriti da li postoji znaajna razlika izmeu standardnih
devijacija s
1
i s
2
dva niza rezultata (F-test). Ako je ova razlika znaajna, srednje vrednosti se
ne mogu uporeivati.
Za poreenje srednjih vrednosti pomou t-testa primenjuje se sledea jednaina:

2 1
2 1 2 1
n n
n n
s
x x
t
+
=
9.5

gde su
1
x i = srednje vrednosti dva niza rezultata
2
x
296

n
1
i n
2
= broj rezultata u svakom nizu
s = srednja standardna devijacija dva posmatrana niza rezultata.
Srednja standardna devijacija s dva niza rezultata dobija se iz odnosa

2
) ( ) (
2 1
2
1
2
2
1
1
2 1
+
+
=

= =
n n
x x x x
s
n
i
i
n
i
i

2
) 1 ( ) 1 (
2 1
2
2 2
2
1 1
+
+
=
n n
s n s n
9.6

gde je (n
1
+n
2
-2 )= broj stepena slobode.
Ako je izraunata vrednost t vea od tabelarne za izabrani nivo poverenja i za dati broj
stepena slobode v, tj.ako je t
eksp.
>t
iz tabele
, izmeu dveju srednjih vrednosti
1
x i
2
x postoji
znaajna razlika. U obrnutom sluaju, razlika meu srednjim vrednostima je beznaajna,
odnosno uzrokovana samo sluajnim grekama.
Poreenje standardnih devijacija. F-test. F-test se primenjuje za ispitivanje postojanja
znaajne razlike u preciznosti izmeu dva niza rezultata koji su dobijeni npr. primenom dveju
razliitih metoda ili od dva razna eksperimentatora. Test se zasniva na poreenju varijansa (
s
2
1
i s
2
2
) dva posmatrana niza rezultata. Veliina F je definisana odnosom:

2
2
2
1
s
s
F =
9.7

i da bi bila vea od jedinice, u brojitelj se, po dogovoru, uvek stavlja vea varijansa. Vrednost
F izraunata iz eksperimentalnih podataka se uporeuje s vrednostima F datim u tabelama za
izabrani nivo poverenja i za dati broj stepena slobode dva niza rezultata. Ako je F
eksp.
> F
iz
tabele
, izmeu dva niza rezultata postoji znaajna razlika u preciznosti (Savi i Savi, 1989).

Analiza varijanse (ANOVA). Ako se ele uporediti dve ili vie aritmetike sredine,
koristi se analiza varijanse, mona statistika tehnika, kojom se mogu odvojiti i proceniti
razliiti uzorci. Realizuje se postavljanjem nulte hipoteze i uporeivanjem aritmetikih
sredina tako da se izraunava procena varijansa unutar uzorka i procena varijansa meu
uzorcima.
U jednosmernoj (one-way, ANOVA) analizi varijanse moe proizii signifikantan
rezultat zato to se jedan prosek moe razlikovati od svih ostalih, ili se svi proseci mogu
razlikovati meusobno, to u ovom sluaju znai da se elementi prate samo po jednom
297

parametru i da elementi iz jedne grupe nisu ni u kakvoj funkcionalnoj zavisnosti od
elemenata iz ostalih grupa (Katelan-Macan, 2003).
Nulta hipoteza u ovom sluaju glasi: svi uzorci koji se porede potiu iz iste populacije
sa srednjom vrednou i standardnom devijacijom , uoene razlike potiu samo od
sluajne prirode uzoraka. Statistikim testom pokazujemo da li hipotezu treba odbaciti ili ne.
Mada se ANOVA izvodi koristei klasine softvere, bie prikazani osnovni koraci ove
analize. Uobiajeno se deli na vie manjih koraka:
- Tabela podataka. Polazi se od nekoliko grupa podataka pri emu svaka grupa (
uzorci) ima svoje elemente (podatke), (pojedinina merenja svakog uzorka) koje
zajedno treba prikazati u okviru jedne matrice (tabele) u kojoj e se svaka grupa
indeksirati sa j, a svaki element grupe indeksirati sa i. Koristei indekse mogue je
skupiti sve podatke u zajedniku tabelu, a da se podaci ne pomeaju, s obzirom da
se oznaavaju sa x
ji
. Tako tree merenje drugog uzorka oznaavamo sa x
23
.
- Srednja vrednost celog skupa (x
sr
). Sve elemente tabele saberemo i podelimo
ukupnim brojem izvrenih merenja (anaize):

9.8

- Ukupni kvadrat odstupanja (U
SS
) predstavlja disperziju celog skupa:

9.9

- Zbir kvadrata izmeu grupa (uzoraka)(T
SS
). Za svaku grupu naemo proseno
odstupanje:

9.10
Kvadriramo ovu vrednost i pomnoimo brojem elemenata u grupi:

9.11
a potom saberemo vrednosti za svaku grupu:

9.12

- Zbir kvadrata unutar grupa (P
SS
). Dobija se iz razlike ukupnog kvadrata
odstupanja (U
SS
) i zbira kvadrata izmeu grupa (T
SS
):

P
SS
= U
SS
- T
SS
9.13
298

- Varijansa izmeu grupa (T
MS
), predstavlja zbir kvadrata izmeu grupa (T
SS
)
podeljen stepenima slobode izmeu grupa. Broj stepena slobode (df) izmeu grupa
jednak je broju grupa umanjenim za jedan:

9.14
- Varijansa unutar grupa (s
p
2
), predstavlja zbor kvadrata unutar grupa (P
SS
)

podeljen brojem stepena slobode unutar grupa. Ovaj broj stepena slobode (df)
jednak je ukupnom broju elemenata umanjenom za broj kolona:

9.15
- F kolinik (F test) raunamo tako to varijansu izmeu kolona (T
MS
) podelimo
varijansom unutar kolona (S
P
2
):

9.16
Izraunato F se uporeuje sa tabelarnim za traeni nivo pouzdanosti i u sluaju
F
izraunat
> F
tabelarno
nultu hipotezu treba odbaciti. to je F kolinik vei to se grupe
vie razlikuju.

Kako bi se uporedile srednje vrednosti grupa (uzoraka) mogu se primeniti: test
najmanje znaajne razlike (LSD-test), Takijev test (Tukey-test), Dankenov (Duncan-test),
Njutan-Kelsov (Newman-Keuls) i eferov (Scheffe test). Svi navedeni testovi su
parametrijski, i u veem stepenu od F-testa su osetljivi na ispunjenje predpostavki da je
raspodela merenja normalna i da su varijanse osnovnih grupa homogene (obanovi, 2003).
Karakteristino za ove testove je da se pri utvrivanju kritine vrednosti koristi
ocenjena standardna greka razlike dve aritmetike sredine i ocenjena standardna greka
aritmetike sredine, koje su zasnovane na ocenjenoj varijansi pogreke (S
P
2
). U sluaju LSD
testa koristi se standardna greka razlike dve aritmetike sredine data sledeim izrazom:

9.17

Ukoliko se radi o nejednakom broju ponovljenih analiza.
Ili,

9.18

Ukoliko se radi o jednakom broju ponavljanja analize, tj. ako je n
1
= n
2
= = n.
299

U sluaju ostalih testova koristi se standardna greka aritmetike sredine data
izrazom:

9.19

Ukoliko se radi o jednakom broju ponavljanja analize.
Ukoliko je broj ponavljanja analize nejednak, tada se n u izrazu (9.19) zamenjuje
vrednou , koji je dat izrazom:

9.20

gde je j broj uzoraka (grupa) (Kirk, 1968).

- Test najmanje znaajne razlike (LSD test) zasnovan je na utvrivanju sledee
kritine vrednosti:

9.21
U izrazu (76)
je kritina vrednost z tablice Studentove distribucije. Ovaj test se

koristi kada je F-test znaajan i kada se ele sainiti uporeenja srednjih vrednosti uzoraka.
- Takijev test je slian LSD testu. Ovaj test ima i naziv HSD (honesty significant
defference) test. U primeni ovog testa utvruje se sledea kritina vrednost:

9.22

Vrednost
u izrazu (9.22) utvruje se iz posebnih tablica po Takiju, u zavisnosti

od broja grupa (uzoraka) i stepena slobode pogreke.

- Dankenov test (veestruki intervalni test) ima estu primenu u praktinom radu.
Kritina vrednost ovog testa utvruje se primenom sledeeg izraza (Montgomery,
1997):

(za p = 2,3,...., j) 9.23

Kritina vrednost,
, iz izraza (9.23) koristi se iz posebnih tablica po

Dankenu, u zavisnosti od stepena slobode pogreke i broja intervala sredina p =
2,3,...j. U primeni ovog testa proseci uroraka se rangiraju prema veliini. Tada se
razlika najveeg i nejmanjeg proseka uporeuje sa najmanje znaajnim intervalom
R
P
, itd. Ukoliko je razlika R
P
, ona je statistiki znaajna. Ovaj test je vrlo
efikasan i zbog toga se esto koristi.
300

301

10. BIOGRAFIJA SA BIBLIOGRAFIJOM
302

303

Biografski podaci

Milan N. Miti je roen 15.11.1983. godine u Niu. Gimnaziju Bora Stankovi
zavrio je 2002. godine u Niu. Na Odseku za hemiju, Prirodno-matematikog fakulteta
Univerziteta u Niu diplomirao je 2008. godine. Doktorske studije iz hemije, na Odseku za
hemiju Prirodno-matematikog fakulteta u Niu, upisao je kolske 2008/2009. godine i
poloio sve ispite predviene planom i programom prosenom ocenom 10,00.
Profesionalna karijera
Nakon zavretka osnovnih studija angaovan je kao istraiva na projektu Evropske
Unije, FP7-REG-POT-2007-3-01 CHROMOLAB-ANTIOXIDANT od 15.09.2008. Bio je
na strunom usavravanju od 05.11.2008. do 20.12.2008. u laboratoriji National Institute for
Agricultural Research, Montpellier, INRA, France. Decembra 2010. godine izabran je za
asistenta na Prirodno-matematikom fakultetu Univerziteta u Niu na Depertmanu za hemiju.
Bio je angaovan na vebama iz predmeta: Fizika hemija I, Fizika hemija II, Hemija na
departmanu za fiziku, Elektrohemija i Savremene elektroanalitike metode analize.
Iz doktorske disertacije Milan Miti je objavio pet radova u meunarodnim
asopisima i 11 radova saoptio na meunarodnim i domaim naunim skupovima.
Rad u vrhunskom meunarodnom asopisu M21 (8 bodova)
1. Sneana S. Miti, Mirjana V. Obradovi, Milan N. Miti, Danijela A. Kosti,
Aleksandra N. Pavlovi, Sneana B. Toi, Milan D. Stojkovi, Elemental
Composition of Various Sour Cherry and Table Grape Cultivars Using Inductively
Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry Method (ICP-OES), Food Anal.
Methods, DOI 10.1007/s12161-011-9232-2, Online First (IF=1,932)

Rad u istaknutom meunarodnom asopisu M22 (5 bodova)
2. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Zora B. Grahovac, Aleksandra N. Pavlovi,
Antioxidant Capacities and Phenolic Levels of Different Varieties of Serbian White
Wines, Molecules, 15 (3), 2016-2027, 2010. (IF=1,988)
304

Rad citiran u: Journal of Agricultural and Food Chemistry (M21, IF=2,816),
International Journal of Molecular Sciences (M21, IF=2,279), Food Bioprocess
Technology (M21, IF=3,576), Molecules (M22, IF=1,988), Journal of Medicinal Plant
Research, Journal of Applied Pharmaceutical Science, Ecotoxicologie, Zootehnie i
Tehnologii de Industrie Alimentar, i u knjizi Ida Sundari NIM M0305036, dengan
judul Identifikasi Senyawa dalam Ekstrak Etanol Biji Buah Merah (Pandanus
conoideus Lamk.)

Rad u meunarodnom asopisu M23 (3 boda)
3. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Danijela A. Kosti, Danijela . Naskovi-
oki, Ruica J. Mici, Phenolic Content and Radical Scavenging Capacity of
Commertial Red Juices, Hemijska Industrija, 65(5), 611-619, 2011. ( IF=0,137).

4. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Danijela A. Kosti, Ruica J. Mici,
Polyphenol Content and Antioxidant Activity of Sour Cherries from Serbia, Chemical
Industry and Chemical Engineering Quarterly, DOI: 10.2298/CICEQ110701046M.
(IF=0,580).

5. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Danijela A. Kosti, Ruica J. Mici, Duan
. Paunovi, Phenolic profil and antioxidant capacities of dried red currant from
Serbia, extracted with different solvent, Food Science and Biotechnology, 20(6),
1625-1631, 2011. (IF= 0,505).

Radovi saopteni na skupovima meunarodnim znaaja tampani u celini M33 (1 bod)

1. Mirjana V. Obradovi, Milan N. Miti, Aleksandra A. Pavlovi, Sneana B. Toi,
Determination of Heavly Metals in Sour Cherry Using by ICP-OES. 10th
International Multidisciplinary Scientific Geoconferences:SGEM, 2010, Vol II, 467-
470.

2. Milan N. Miti, Sneana S. Miti, Blaga C. Radovanovi, Hydroxicinnamic acids in
red Serbian wines from different varieties, XXV
th
International Conference on
Polyphenols-Polyphenols Communications 2010, Vol. 2 T5.54.574-575.

Radovi saopteni na skupovima meunarodnim znaaja tampani u izvodu M34 (0,5
bodova)

3. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Catechin in Serbian red wines, 2
nd

Symposium of Chemistry and Environment, Bar, Montenegro, Book of Abstracts, 81,
2009.
305

4. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Hydroxycinnamic acids in Serbian white
wines from different varieties, 2
nd
Symposium of Chemistry and Environment, Bar,
Montenegro, Book of Abstracts, 82, 2009.

5. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Marija Radosavljevi, Determination of
antioxidant activity in Serbian white wines, 1
st
International Congres: Engineering,
materials and management in the processing industry, Jahorina, Republic of Srpska,
Book of Abstracts, 166, 2009.

6. Mirjana V. Obradovi, Milan N. Miti, Zora B. Grahovac, Determination of total
monomeric anthocyanins in red wines, 1
st
International Congres: Engineering,
materials and management in the processing industry, Jahorina, Republic of Srpska,
Book of Abstracts, 190, 2009.

7. M. Miti, M. Obradovi, Z. Grahovac, Determination of polyphenols in wine Vranac,
8
th
Symposium Novel technologies and economic development, Leskovac, Book of
Abstracts, 58, 2009.

8. M. Miti, M. Obradovi, S. Miti, Z. Grahovac, Determination of anthocyanins in
sour cherry of different ripening stages, 8
th
Symposium Novel technologies and
economic development, Leskovac, Book of Abstracts, 78, 2009.

Radovi saopteni na skupovima nacionalnog znaaja tampani u izvodu M64 (0,2 boda)

9. Milan N. Miti, Gordana . Mileti, HPLC odreivanje anthocijana u crvenom vinu,
XLVII Savetovanje Srpskog hemijskog drutva, Beograd, AH08, 18, 2009.

10. Milan N. Miti, Odreivanje polifenola u belom vinu, XLVII Savetovanje Srpskog
hemijskog drutva, Beograd, AH09, 19, 2009.

11. Sneana S. Miti, Gordana . Mileti, Danijela A. Kosti, Milan N. Miti, Marija
Radosavljevi, Odreivanje antioksidativne aktivnosti vinje u razliitim fazama
zrenja, , XLVII Savetovanje Srpskog hemijskog drutva, Beograd, AH07, 17, 2009.
(M64)

306

Objavljeni i saopteni radovi kandidata koji nisu deo doktorske disertacije:

Rad u meunarodnom asopisu M23 (3 boda)
1. Kosti Danijela A, Miti Snezana S, Miti Milan N, Zarubica Aleksandra R,
Velickovi Jasmina M, Djordjevi Aleksandra S, Randjelovi Sasa S , Phenolic
contents, antioxidant and antimicrobial activity of Papaver rhoeas L. extracts from
Southeast Serbia, J. Med. Plant. Res., 4(17), 1727-1732, 2010 (M23, IF=0,879)

2. Ruzica Mici, Snezana Miti, Aleksandra Pavlovi, Snezana Tosi, Milan Miti,
Kinetic determination of traces of Th(IV) on the basis of its catalytic effect in
environmental water samples, J. Radioanal. Nucl. Chem., 288, 845-850, 2011 (M23,
IF=0,777)

3. Mitic Sneana S., Kosti Danijela A., Naskovi-oki Danijela C., Miti Milan N.,
Rapid and Reliable HPLC Method for the Determination of Vitamin C in
Pharmaceutical Samples,, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 10, 105-111,
2011 (M23, IF=0,528)

4. Danijela Kosti, Sneana Miti, Aleksandra Zarubica, Milan Miti, Jasmina
Velikovi, Saa Ranelovi, Content of trace metals in medicinal plants and water
extracts. Hemijska Industrija, 65(2), 165-170, 2011 (M23, IF=0,137)

5. Danijela A. Kosti, Sneana S. Miti, Gordana . Mileti, Milan N. Miti, Slavica M.
Sunari, A Kinetic-Spectrophotometric Method for Determination of Gallic Acid in
Wines, Oxidation Communication, 2011, prihvaen za objavljivanje (M23, IF=0,250).

6. Danijela A. Kosti, Sneana S. Miti, Danijela C. Naskovi-oki, Aleksandra R.
Zarubica, Milan N. Miti, Determination of bezalkonium chloride in nosal drops bz
high-performance liquid chromatography, Hemijska industrija, 2011, prihvaen za
objavljivanje (M23, IF=0,137).

7. Danijela A. Kosti, Sneana S. Miti, Jasmina B. Velikovi, Milan N. Miti, Saa S.
Ranelovi, Content of phenolic compounds, antioxidant and antimicrobial activity of
the extracts from Crataegus Oxyacantha L. Fruit from Southeast Serbia habita,
Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2011, prihvaen za objavljivanje
(M23, IF=0,528).

8. Sneana S. Miti, Aleksandra A. Pavlovi, Sneana B. Toi, Emilija T. Pecev, Milan
N. Miti, Milan B. Stojkovi, Development and application of method for
clonazepam determination based on ligand-exchange reaction, Tropical Journal of
Pharmaceutical Research, 2011, prihvaen za objavljivanje (M23, IF=0,528).
307

Rad u vodeem asopisu nacionalnog znaaja M51 (2 boda)
9. Sneana S. Miti, Aleksandra A. Pavlovi, Sneana B. Toi, Emilija T. Pecev, Milan
N. Miti, Ruica J. Mici, A kinetic method for the determination of diazepam based
on ligand-exchange reaction, Journal of Chemistry Pharmaceutical Research, 3(2),
605-611, 2011.

Radovi saopteni na skupovima meunarodnog znaaja tampani u celini M33 (1 bod)

1. Milan N. Miti, Mirjana V. Obradovi, Aleksandra A. Pavlovi, Sneana B. Toi,
Determination and Levels of Iron and Copper in Srbian White Wines, 10th
International Multidisciplinary Scientific Geoconferences:SGEM, 2010, Vol II, 965-
967. (M33).

2. Sneana S. Miti, Sneana B. Toi, Aleksandra A. Pavlovi, Milan B. Stojkovi,
Milan N. Miti, Branka Stojanovi, Alkali and Alcaline Earth Metal Content of Early
Season Vegetables of Souther Serbian Regions, 10th International Multidisciplinary
Scientific Geoconferences:SGEM, 2010, Vol II, 665-667. (M33).

3. Sneana S. Miti, Valentina V. ivanovi, Milan N. Miti, Milan B. Stojkovi,
Determination of Herbicide 2,4-D in Soil Samples bz Kinetic-spectrophotometric
Method, 10th International Multidisciplinary Scientific Geoconferences:SGEM, 2010,
Vol II, 471-472. (M33).

4. Blaga C. Radovanovi, Marko Anelkovi, Aleksandra Radovanovi, Milan N.
Miti, Determination of polyphenolic composition and antioxidant activity of grape
Vranac during ripening, XXV
th
International Conference on Polyphenols-Polyphenols
Communications 2010, Vol. 2 T5.68. 602-603. (M33)

Radovi saopteni na skupovima meunarodnog znaaja tampani u izvodu M34 (0,5
bodova)

5. S.Miti, D. Kosti, M. Miti, M. Radosavljevi, S. Toi, A. Pavlovi, Determination
of Zn in red and white wine samples by inductively coupled plasma emission
spectroscopy, 1
st
International Congres: Engineering, materials and management in
the processing industry, Jahorina, Republic of Srpska, Book of Abstracts, 176, 2009.
(M34)

308

6. B.T. Stojanovi, S.S. Miti, M.B. Stojkovi, M.N. Miti, J.LJ. Pavlovi, I.D. Rai
Mii, Heavy metal content determination in domestic peaches, Thirteenth Annual
Conference, YUCOMAT 2011, Herceg Novi, Book of Abstracts, 157, 2011

7. D. Kosti, J. Velikovi, S. Miti, M. Miti, S. Ranelovi, The content of phenolic
compouds antioxidant and antimicrobial activity of the extracts from Prunus spinosa
L. fruit from Southeast Serbia habitat, 9th Szmposium Novel Technologies and
economic development, Leskovac, BPT-11/BFT-11, 55, 2011

8. I. Rai-Mii, G. Mileti, S. Miti, M. Miti, E. Pecev-Marinkovi, A simple method
for the ampicilline determination in pharmaceuticals and human urine, Euroanalzsis
XVI, Beograd, 2011.

Kinetika Degradacije Fenolnih Jedinjenja Hidroksil Radikalima

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

Kinetika Degradacije Fenolnih Jedinjenja Hidroksil Radikalima

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Kinetika Degradacije Fenolnih Jedinjenja Hidroksil Radikalima

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Univerzitet u Niu

OH. Bakar takoe moe reagovati sa H

OH, i pri tome je mnogo

OH) sa kratkim vremenom ivota od oko 10

(za nelinearan molekul 3 stepena slobode).

, a odgovarajui sadraj energije je:

particione funkcije za molekule A i B koje se odnose po jedinici zapremine.

masa aktiviranog kompleksa. Srednje vreme promene sistema du puta je:

, du odreenog dela reakcione koordinate, . Koristei

je toplota reakcije za stvaranje aktiviranog kompleksa. Ta energija je u stvari energija

odnose se na odgovarajuu konstantu ravnotee,

, tada e ravnotena koncentracija intermedijarne

je konstanta ravnotee, tako da je brzina obrazovanja produkta

i sledi da navedeni uslov znai da e, u sluaju brze ravnotee, proces u

ima znatno veu vrednost nego odgovarajua

se naziva stacionarnom, ako se u datom reakcionom sistemu tokom

. Ako su koncentracije svih supstanci koje uestvuju u reakciji konstantne, i ne menjaju

, iz jednaine 2.25 nalazi se:

, brzina reakcije definisana je izrazom:

i B odvija ali veoma sporo (

odreujemo u uslovima ravnotee,

nalazimo iz kvazistacionarnih uslova:

, jednaina 2.28. dobija

znatno manja od 1, to jednaina 2.29. prelazi u

jednaina prelazu u oblik:

koristie se konstanta ravnitee:

, to poslednji izraz dobija oblik:

moe smatrati nepovratnim, pa se

moe zanematiti, pa se dobija izraz za brzinu reakcije:

. Pri tome dobija se:

. Brzina reakcije moe biti izraena kao:

u reakcionim uslovima treba da

/Red, a nii od oksidacionog potencijala

pomou Ox protie brzo.

) ili ariloksi radikal (

elektrona azota ili kiseonika sa -elektronskim sistemom

jona. Velika brzina stvaranja

je konstantan, tako da je brzina

- srednja vrednost odgovora slepe probe za n ispitivanja (obino n>20),

OH) je najreaktivniji od svih ROS i najodgovorniji za

). Hidroperoksil radikal nastaje u reakciji

moe nastati i reakcijom tripletnog kiseonika i atoma

moe nastati iz vode ili vodonik peroksida. Naime, pod

OH), nastao redukcijom kiseonika, sa kratkim vremenom ivota od

OH moe da oksiduje gotovo svako jedinjenje u vinu u potpunosti (Laurie i

OH mogu nastati i drugi radikali:

OH stvaraju reakcijom (7).

koje je za instrument lako odrediti

relativne standardne devijacije.

radikale se iroko primenjuje pri odreivanju skeviner

radikalima i transformiu ih. Nivo

radikala ukazuje na skevener potencijal antioksidativnih

radikala (RSC) u ispitivanim crvenim vinima kree

radikale je primenjena za odreivanje antioksidativne aktivnosti

- koncentracija antocijana u uzorku

- koncentracija dodatog standarda (Mv-3-G)

- tanges odseka kalibracione prace za c=0

- tangens uzorka sa standardom

uporedivo po veliini sa , iz jednaine 5.2 nalazimo: