ELEKTROFOREZA PROTEINA Aminokiseline proteina kao i grupe pridodate posttranslacijskom modifikacijom daju ukupni naboj proteinima.

Jedino u izoelektrinoj taki protein nemaju naboja. Izoelektrina taka proteina odreena je specifinom pH vrijednou gdje protein otputa i prima istu koliinu H jona i zato je bez naboja tj. elektroneutralan. Iz tog razloga protein e mirovati na tom mjestu (gelu) tokom elektroforeze. Inae ako se protein nae u elektrinom polju on e se slobodno kretati prema elektrodi suprotnog naelektrisanja. Proteini e se kretati razliito ovisno o njegovim fizikim karakteristikama i eksperimentalnom sistemu kojeg koristimo (o tipu elektroforeze). Brzina kretanja proteina zavisie od otpora, mase proteina, stepena kompaktnosti, poroznosti gela i viskoznosti pufera. Ukupan naboj proteina je determinisan brojem pozitivnih i negativnih naboja bonih lanaca i posttranslacijskih modifikacija,kao to su deaminacija, acetilacija, ili fosforilacija. Protein e se kretati bre ako je njegov ukupni naboj vei. Molekule slinog naboja separirae se u odnosu na masu i oblik proteina te otpor u toku kretanja. Elektroforeza proteina je rezolutna tehnika. Tokom elektroforeze moramo uspostaviti odreenu voltau koja daje snagu elektrinom polju. Izmeu elektroda se nalazi pufer koji odrava pH na konstantnom nivou i pomae da se uspostavi strujni tok izmeu elektroda. Kao pufer se obino korsiti Tris-Cl ili Tris-glicin. Tokom elektroforeze treba imati konstantnu voltau. Pritom moramo voditi rauna da ne doe do zagrijavanja gela, kako nebi izgubili (smanjili) rezo luciju (razdvojivost) proteina i smanjenje viskoznosti pufera. Materijali koji se koriste za gel ne smiju reagirati sa proteinima. Elektroforeza proteina se najee izvodi u gelu koji je mreaste forme, vrlo hidriran, posjeduje dovoljnu mehaniku stabilnost, a moemo ga formatirati u obliku vertikalnih tabli. Elektroforeza proteinamoe se odvijati i u tubama ili kapilarama. Moramo voditi rauna o postelektroforetskoj manipulaciji pri izboru gela i elektroforetskog sistema. esto je potrebno obojiti gel i vizuelizirati prisustvo i poziciju proteina na gelu, agel elektroforeza moe da na poslui i za preiavanje proteina. Poliakrilamidni gelovi su vrlo pogodni, jer skoro da nemaju interakcije sa proteinima tokom elektroforeze i obezbjeuju njihovu separaciju na osnovu njihovih fizikih, a ne hemijskih osobina. Poroznost gela moemo kontrolirati z avisno od maksimalne mase proteina koje elimo iskljuiti iz separacije. Smanjenjem gustine gela poveavamo veliinu njegovih pora, a time i prohodnost proteina sa veom molekularnom masom i obrnuto. Gelovi za proteinsku elekroforezu se formiraju polimerizacijom akrilamida. Dodavanjem manje koliine N-N-metilen bisakrilamida dolazi do formiranja unakrsnih metilenskih mostova sa dugim polimerima akrilamida. Na ovaj nain kontrolemo poroznost gela i njegovu vrstinu, kao i hemijsku inertnost. Za separaciju proteina odnos akrilamida i bis akrilamida je obino 40: 1. Takvi gelovi su pogodni za visokorezolutno razdvajanje proteina. Obino se prave poliakrilamidni gelovi 5-20 %.Uzorke proteina dodajemo u depove formirane tokom izljevanja gela. Kod obine poliakrilamidne elektroforeze (PAGE) imamo konstantan ili kontinuiran pH, ali imamo I gradijentnu elektroforezu sa razliitim pH vrijednostima u razliitim dijelovima gela.

Konc. Akrilamida u gelu 5 8 12 15 20

Separacijska mo kDa >1000 300-1000 50-300 10-80 5-30

Takve gelove nazivamo gelovi sa pH gradijentom. Gelovi sa tris-glicinom imaju pH od 8-9. Regulaciju pH gradijenta vrimo uz pomo amfolita tj. bipolarnih molekula. Kod obine poliakrilamidne elektroforeze (PAGE) imamo konstantan ili kontinuiran pH, ali imamo i gradijentnu elektroforezu sa razliitim pH vrijednostima u razliitim dijelovima gela. Takve gelove nazivamo gelovi sa pH gradijentom. Gelovi saTris-glicinom imaju pH od 8-9. Regulaciju pH gradijenta vrimo uz pomo amfolita tj. bipolarnih molekula. Nakon razdvajanja proteina gelove moemo bojiti na razliite naine. Vrlo osjetljivo bojenje male koliine proteina na gelu jeste srebro kao u sluaju odreenih vrsta glikoproteina. Proteine je mogue prenijeti na membranu blot metodom i odvojiti ih sa antitijelima. Poliakrilamid je vrlo pogodan za separaciju proteina koje trebamo u nativnom, tj. Prirodnom obliku. Ovako separirani proteini zadravaju svoju prirodnu formu i bioloki su aktivni. Tokom elektroforeze protein iz uzorka mogu meusobno da interreaguju formirajui hidrogenske veze , kao i hidrogenske veze sa solima iz pufera. Iz tog razloga stvaramo denaturirajue uslove da bi to sprijeili. Denaturirajui uslovi malo promijene naboj i oblik polipeptida tako da putuju kao monomeri koji ponovo mogu uspostaviti kvarternu strukturu u nedenaturirajuim uslovima. Za formiranje denaturirajuih uslova u gelu obino se dodaje urea. Ona posjeduje neutralni naboj. Visoka koncentracija ureje moe da disruptira hidrogenske veze i da dovede do naruavanja kvarterne, tercijarne i sekundarne structure peptide. Pored ureje za formiranje denaturirajuih uslova slui i sodijum didecil sulfat (SDS) koji sadri 12 karbonski hidrofobni lanac i polarnu sulfatnu glavu to ga ini snanim denaturantom proteinske structure.Svojim hidrofobnim dijelom reaguje sa hidrofobnom strukturom proteina naruavajui tercijernu strukturu, a svojom sulfatnom glavom ini nastali kompleks rastvorljivim u vodi. Njega najee koristimo pri separaciji proteina elijskih membrane. On proteinima daje negativan naboj tako da putuju prema anodi u elektrinom polju. IZOELEKTRINO FOKUSIRANJE Naboj proteina varira u razliitim pH sredinama to zavisi od aminokiselinske sekvence i posttranslacijskih modifikacija. U stabilni eksperimentalnim uslovima i bez veih hemijskih modifikacija izoelektrina konstanta proteina je stabilna. Nju moemo odrediti izoelektrini fokusiranjem, u formiranom stabilnom pH gradijentu. pHgradijent je veoma teko napraviti sa puferima zbog njihove difuzije prema slobodnom dijelu rastvora, zato se koriste sintetiki amfoliti koji su male molekularne mase i heteropolimeri (razliiti polimeri) oligoamino ili oligo karboksilnih kiselina. Razliitim kombinacijama amino i karboksilnih grupa moemo sintetizirati ogroman broj polimera koji posjeduju razliitu izoelektrinu konstantu. Ako taj miks amfolita

stavimo ( u gel) u elektrino polje svaki od amfolita putuje do svoje individualne izoelektrine konstante gdje funkcionie kao lokalni pufer formirajui na taj nain pH gradijent. KAPILARNA ELEKTROFOREZA PROTEINA Elektroforeza se odvija u elektrinom polju od 300-500 V u vrlo tankim kapilarama, malog volumena, a velike povrine. Staklene kapilare imaju unutranji profil od 10-100 mikrometara. Spoljanja debljina kapilare je 300 mikrometara a tipina duina od 10-100 cm. Koliina uzorka za razdvajanje proteina je 1000 puta manja nego kod obine elektroforeze. Kapilara se moe puniti sa puferima ili PAGE ili sa linearnim unakrsno nepovezanim polimerima. S obzirom da su zidovi staklene kapilare negativno nabijeni kapilara se tretira natrijumom ili hidrogenom radi neutralizacije. Dodavanjem hidrogena vrimo hidrataciju unutranjeg sloja. Elektroforezu koristimo za odreivanje mase proteina u nativnim uslovima, zatim prouavanju aktinosti, zatim prouavanju modifikacija, determinaciji disulfidnih mostova. Radi bolje separacije koristimo vrlo esto 2D PAGE elektroforezu. MASENA SPEKTROMETRIJA Predstavlja vrlo popularnu metodu za identifikaciju i karakterizaciju proteina. Mogue je izmjeriti masu proteina iznad 100 kDa sa velikom preciznou od nekoliko daltona, a masu peptida sa preciznou od nekoliko mili daltona. Mogue je izmjeriti masu molekule prisutne u femto molnoj koliini (10-15) pa je zato pogodna za analizu molekula u tragovima. Masena spektrometrija se zasniva na karakteristikama analizirane molekule kao to su naboj i masa. Separacija molekula tokom kretanja kroz elektrino i magnetno polje vri se takoer na osnovu njihovog naboja i mase. Analizirane molekule se moraju jonizirati da bi putovale kroz navedena polja. Jonizacija se radi uklanjanjem 1 ili vie elektrona iz analizirane molekule ili dodavanjem 1 ili vie katjona (protona) analiziranoj molekuli. Analiziranu molekulu moramo dovesti u gasnu fazu, jonizirati je i pomou masenog spektrometra odrediti odnos mase i elektrinog naboja analita (m/z). Prije odreivanja mase nekog proteina izolovanog iz biolokog uzorka, moramo izvriti njegovu fragmentaciju, pa onda jonizaciju i dovoenje peptidnih fragmenata u gasnu fazu. Veina biolokih uzoraka je mjeavina brojnih komponenti pa je njihov m/z spektar vrlo kompleksan. ak i kad imamo ekstrahiran ist protein, imaemo razliit m/z spektar njegovih peptidnih fragmenata, a to emo na display-u vidjeti kao niz razliitih pikova koji predstavljaju razliite m/z vrijednosti digestiranih fragmenata proteina. Masa molekule proteina (peptida) se izraava u Da, a 1 Da predstavlja 1/12 mase C12 atoma. Nominalnu (brojnu) vrijednost mase molekule softver rauna integriranjem mase 5 biogenih elemenata (H=1,007825; C12=12,00; N14=14,003074; O16=16,00; S). METODE JONIZACIJE Veina proteina je polarna, termonestabilna i mogu se dovesti u gasnu fazu tako da ne moemo koristiti klasine metode kao to je evaporacija ili izlaganje strujama, ve moramo koristiti jae elektropulsirajue ili laserske pulsirajue zrake da bismo izvrili fragmentaciju i jonizaciju

analiziranih peptida. Metoda koju koristimo u te svrhe naziva se matrix uklopljena laserska jonizacija (matrix asociated laser desorption ionization) i elektrosprej jonizacija (ESI electrospray ionization). Ove metode su adaptirane za analizu velikih biomolekula. U sluaju MALDI metode analit je uklopljen na vrstoj podlozi u vakuumu. Matrix se izlae seriji pulsirajuih bombardiranja laserskim zrakom. Tom prilikom matriks apsorbuje energiju laserskih zraka to dovodi da jakog zagrijavanja i eksplozije matriksa koja izbacuje analiziranu materiju sa povrine nosaa matriksa. Za to vrijeme se analizirana materija jonizira, a kao takva se kree kroz jako elektrino i magnetno polje u masenom spektru. Elektrosprej jonizacija je pogodna za jonizaciju otopljenih analita. U ovakvim rastvorima proteini su odvijeni (denaturirani) i sa dodatkom protona. Tako nabijeni peptidi se izbacuju uz pomo pritiska i visoke voltae od nekoliko kV u analitiko podruje masenog aparata koji je vakumiran. Na ovaj nain fragmentirani peptidi se izbacuju u obliku sitnih kapljica gdje tokom kretanja kroz zagrijane kapilarice solcent evaporira, a joni putuju razliitom brzinom zavisno od njihovog naboja. Postoji vie vrsta masenog spektrometra, a njihov zadatak je da izvre separaciju molekula na osnovu njihovog naboja da bi se izraunala molekulska masa analita. Klasini spektrometri koriste magnetno polje i mogu vrlo precizno izmjeriti masu, ali im je slaba senzitivnost. Aktuelni su instrumenti tzv. kvadripol i jonorezonirajui maseni spektrometar koji precizno mjere vrijeme leta tj. Kretanja analita kroz elektrino polje. Ovi spektrometri se popularno zovu time of flight mass spectrometer i ovom tipu ureaja odgovara MALDI jonizacija, a ubrzanje unutar instrumenta joni dobivaju pod uticajem elektrinog polja. Onog momenta kada jon stigne do detektora rauna se brzina preenog puta od mree tj. Poetnog dijela kretanja jona. Na osnovu te brzine rauna se odnos naelektrisanja i mase analita pomou odreenih formula. Da bi se dobila to vea putanja kretanja jona koristi se elektrostatiko jonsko ogledalo koje e zakriviti elektropolje, odnosno putanju analita prema detektoru. Kada laserom izvrimo fragmentaciju i izbacivanje peptidnih fragmenata iz matriksa, fragmenti se uz pomo reetke usmjeravaju prema elektrinom polju masenog spektrometra. Peptidni fragmenti razliite veliine razliito putuju kroz elektrino polje aparata zahvaljujui njihovim razliliitim naelektrisanjima. Onog momenta kada dou do detektora softver rauna vrijeme putovanja svakog fragmenta od reetke do detektora i dobije numeriki izraz mase koju dijeli sa poznatim masama H, C, O, N, S. Na osnovu broja ovih atoma pretpostavlja broj i vrstu AK u peptidnom fragmentu, a njihov redoslijed formira na osnovu komparacije odovarajuih DNA sekvenci i navedenig AK. Elektrojonsko ogledalo aparatu slui radi poveanja duine putanje od reetke do detektora to doprinosi boljoj separaciji analiziranih fragmenata. Da bi se poboljala separacija joniziranih fragmenata napravljen je linearni kvadripol maseni filter, pa ovaj maseni spektrometar zovemo kvadripol maseni spektrometar. Ovi filteri su adaptirani za TOF (time of flight) spektrometar i lasersku pulsirajuu jonizaciju. Kvadripol maseni filter je sastavljen od 4 idealno okrugle cjevice na koje se dovodi jednosmjerna struja od 700kHz do nekoliko MHz to poboljava fokusiranje analiziranih fragmenata peptida ili drugih molekula u pravcu vakumiranog elektrinog polja aparata. Na ovaj nain se ostvaruje vea razdvojivost analiziranih materija, a poveava senzitivnost aparata. Senzitivnost znai detekcija materija u tragovima (10-15). Ovim

aparatom moemo odrediti primarnu AK sekvencu uz pomo odgovarajue nukleotidne DNA sekvence koje se kao standardi nalaze u bazi podataka spektrometra. Loa je strna to na ovaj nain se dogoditi da baza ne posjeduje informacije za novonastale mutacije i posttranslacijske modifikacije. Takoer je problem odrediti linearni raspored AK kod novoanaliziranih proteina za koje ne postoji nukleotidne sekvence u bazi. Za odreivanje sekvence proteina prije njegovog putanja kroz maseni spektrometar moemo vriti digestiju enzima na tano odreenim mjestima, npr. Upotrebom tripsina koji hidrolizira peptide na C terminalnom kraju ili na mjestima gdje se nalazi arginin i tripsin pa nakon toga moemo analizirati masu digestiranih fragmenata. POSTTRANSLACIJSKA MODIFIKACIJA PROTEINA POSTTRANSLACIJSKA MODIFIKACIJA PROTEINA je proces hemijske modifikacije putem izrezivanja ili dodavanja odreenih peptidnih ostataka eera, lipida, funkcionalnih grupa itd. Peptidi proteina mogu biti izmjenjeni putem proteolize ili dodavanjem disulfidnih veza, kovalentnim vezivanjem fosfata, sulfata, alkil grupa i ostalih gore navedenih komponenti. Nekada se modifikacija peptida dogaa tokom translacije, kao npr. N-glikozilacija. Veina proteina prolazi kroz posttranslacijsku modifikaciju. Oko 30% proteina u elijama sisara je fosforilirana, a skoro svi cirkulirajui proteini plazme su glikozilirani. Posttranslacijskom modifikacijom mijenja se naboj, hidrofobnost, konformacija, imunoloke karakteristike, stabilnost, lokalizacija, aktivnost. Bioloke funkcije mnogih proteina zavise od njihove posttranslacijske modifikacije, kao npr. specifini oligosaharidi koji su ukljueni u L-selektin aktivne limfocite, zatim dolazi do bioloke modifikacije proteina koji uestvuju u signalnoj kaskadi zavisno od toga da li prenos signala treba iskljuiti ili ukljuiti. Ubikvitini igraju ogromnu ulogu u degradaciji intracelularnih proteina. Naravno svaka posttranslacijska modifikacija nuno ne mijenja funkcije proteina, znai da pored razumijevanja specifine strukture proteina tj. njegove aminokiselinske sekvence koja je kompatibilna sa odreenom DNK/ RNK njegovom sekvencom potrebno je odrediti i tip posttranslacijske modifikacije proteina. To je jedan od ciljeva funkcionalne genomike i proteomike. Misli se da kod ovjeka postoji oko 25 000 gena koji kodiraju priblino 1 000 000 razliitih preoteina. Doprinos nastanku tolikog broja razliitih proteina prepisuje se alternativnom splajsingu i posttranslacijskoj modifikaciji. Mjerenjem koliine mRNA (transkriptoma) moemo kvalitativno odrediti ekspresiju ali ne moemo saznati lokalizaciju proteina i potpunu posttranslacijsku modifikaciju. U svakom sluaju mRNA sekvenca nam pomae da saznamo primarnu strukturu proteina (aminokiselinski sastav) odreenog peptida u proteinu. Ovo je naroito vano u prouavanju terapeutskih proteina i za njihovu produkciju u odreenim elijskim sistemima. U ovom pogledu masena spektrometrija uz DNK/RNK analizu moe mnogo pomoi. Pored navedenih analiza od velike vanosti je dvodimenzionalna gel elektroforeza (2D ) za izdvajanje proteina iz proteinskog miksa. Pored navedenih metoda veliku pomo u prouavanju strukture i posttranslacijskih modifikacija pruaju nam proteinske baze podataka, kao i softveri za 3D modeliranje proteina. 2D gel elektroforezom moemo odrediti (detektovati) da li je dolo do proteolitikog izrezivanja

kao u sluaju N-terminalnih signalnih peptida, a preciznije podatke moe da nam prui masena spektrometrija. Pored ovih metoda za detekciju proteolitikog izrezivanja modifikacije proteina moe da nam pomogne automatsko N ili C terminalno sekvenciranje. Rezultate ovog sekvenciranja onda uporeujemo sa DNK/mRNK sekvencom da bi dobili informaciju o posttranslacijskoj modifikaciji. Odreivanje prisustva disulfidnih mostova je vrlo vano za procjenu stabilnosti trodimenzionalne strukture i bioloke aktivnosti proteina sa cisteinom, koji obezbjeuju formiranje sulfhidrilnih mostova oksidacijom SH grupa. Za odreivanje slobodnih cisteinskih ostataka koristi se hemijsko cjepanje proteina na mjestima prisustva cisteina ili masena spektrometrija. Fosforilacija je jako esta reverzibilna modifikacija dodavanja fosfatne grupe na ostatke serina, treonina ili tirozina. Ovaj proces je vrlo vaan za signalnu transdukciju, regulaciju elijskog ciklusa, stepen enzimske aktivnosti, itd. Aberantna fosforilacija je prisutna kod mnogih bolesti. to znai da je veoma vana za razumijevnje regulatornih mehanizama elije i predstavlja potencijal za lijeenje.Za detekciju fosforilacije proteina koristimo masenu spektrometriju ali i Edmanov postupak hemijskog sekvenciranja proteina. SULFATACIJA proteina se vri kovalentnim dodavanjem sulfata uz pomo sulfotransferaze. Najee na tirozinu to nazivamo tirozin O-sulfatacija. Ova modifikacija se najee odvija na transmembranskim proteinima. Misli se da je ova modifikacija kljuni modulator protein protein interakcija u razliitim biolokim procesima, ukljuujui homeostazu, aktivnost leukocita, proces proteolitikih aktivnosti i na proces sekrecije. Za determinaciju tirozin O-sulfatacije koriste se razliite metode, od radioaktivnog obiljeavanja proteina 35S izotopom, Edmanovo sekvenciranje sa 3-fluoro siretnom kiselinom, 3H oznaavanjem tirozina, HPLC, maldi masena spektrometrija, SDS-PAGE elektroforeza, itd. GLIKOZILACIJA predstavlja kovalentno vezivanje saharida za protein tokom i posttranslacije unutar ER-a. To se deava i proteinima koji ostaju u ER-u, proteinima ostalih membrana, sekretornim proteinima. Saharidi se obino dodaju na ostacima asparagina, tj na karboksiamino nitrogenu, (N-vezana glikozilacija), ili na hidroksilnoj grupi ostatka serina i treonina (O-vezana glikozilacija). Oligosaharidi mijenjaju fizike karakteristike proteina i daju im visoko hidrofilni karakter. Glikoproteini mogu postojati u razliitim izomernim i razgranatim formama to im daje vrlo kompleksnu trodimenzionalnu strukturu ali i razliite bioloke funkcije. Razliito se savijaju, imaju razliitu stabilnost, razliito doprinose elijskom povezivanju (adhezija),. Slue za supcelularnu komunikaciju, imuni odgovor, maskiranje elija raka, uestvuju pri saniranju povreda, upala, mogu biti selektivni ligandi. Postoji vie metoda za detekciju glikozilacije proteina kao to je direktna metoda, gdje putem specifinog fluorescentnog bojenja, vezivanje lecitina, ili odreivanja mase moemo detektirati ovu vrstu modifikacije proteina. Za tu svrhu koristimo 2D gel fluorescentno bojenje ili hemiluminiscenciju uz pomo peroksidaze koja je vezana za anti digoksigenin antitijela koja se vezuju za lecitin. Analizom karbohidrata moem o doi do podataka o posttranslacijskoj glikozilaciji, kao i tipu ove vrste modifikacije, zato to su dodati karbohidrati izgraeni iz svojih monomera. Ovu analizu vrimo hidrolizom uz pomo HCL, nakon ega vrimo detekciju monosaharida, kao npr. sa jonoizmjenjivakom

hromatografijom uz pomo fluorescentnog getektora. Na ovaj nain moemo izvriti i kvantifikaciju karbohidratnih monomera. N-vezanu glikozilaciju moemo detektirati enzimatskim putem postupno detekcijom visokomanoznih oligosaharida i odreivanjem kompleksa oligosaharida. Oligosaharidi se najee veu za asparagin obino N-glikane odvajamo od proteina, N-specifinim enzimom asparagin amidazom koja izrezuje asparagin vezane oligosaharide glikoproteina, koje daje analiziramo razliitim hromatografskim protokolima ili direktno masenom spektrometrijom. O-vezanu glikozilaciju karakteriziramo masenom spektrometrijom. eeri se dodaju na hidroksilnim grupama tirozina i serina. Obino se dodaju disaharidi ili razgranati trisaharidi. Za hidroksilne grupe se esto dodaje N-acetil glukozamin. To predstavlja temporarnu, privremenu modifikaciju kod proteina koji uestvuju u transkripciji, translaciji, nuklearnom transportu i elijskoj signalizaciji. Mnogi proteini nukleusa, citoskeleta, citoplazme, membrana se vrlo esto modificiraju na hidroksilnim ostacima serina i treonina kovalentnim vezivanjem O-vezanim N-acetil glukozamina (monosaharida). Ovo je karakteristino za mnoge elijske procese kao to su prepoznvanje nutrijenta, protozomalna degradacija, stiavanje gena. Ovaj tip promjene je povezan sa kancerom neurodegenerativnim bolestima i dijabetesom. Nekoliko metoda nam moe posluiti za detekciju ove modifikacije, kao to je masena spektrometrija, kapilarna elektroforeza, HPLC separacija, digestija specifinih glikozida itd. Mnogi proteini elijske membrane viih i niih eukariota sadre kompleksne glikolipidne strukture kao to je glikozilfosfatidilinozitol koji se vee na C terminusu proteina. Njihova funkciija je privrivanje unutranjih struktura za plazmamembranu. Ovi proteini su ukljueni u signalni put epitelijalnih elija, zatim signalnu transdukciju elija, imuni odgovor, patologiju infektivnih bolesti. Prvo dolazi do sinteze glikozilfosfatidilinozitola, koji se potom transportuje do proteina . Za analizu ove modifikacije se koristi izdvajanje membranskih proteina i izrezivanje GPI uz pomo fosfatidil inozitol specifine fosfolipaze C. Kasnija identifikacija se vri uz pomo masene spektrometrije. Modifikacija proteina masnim kiselinama se dogaa kod brojnih eukariota te proteina virusa. Masne kiseline se kovalentno dodaju proteinima na odreenom dijelu membrane, obino enzimskim putem, kako na N tako i na C terminusu, te na ostacima cisteina membranskih proteina. Koriste se razliite metode za detekciju lipidne modifikacije kao to su gasna hromatografija , masena spektrometrija, HPLC itd. esta posttranslacijska modifikacija je acetilacija i metilacija koja se deava na nitrogenu (Nmetilaciju) ili atomu kiseonika (O-metilacija), te na nukleofilnim bonim lancima mijenjajui hidrofobnost ili proteinski naboj. N-metilacija je trajna, i deava se na lizinu, histidinu, argininu, glutaminu i ostacima asparagina, dok O-metilacija na ostacima glutamina i asparagina. Metilacija se moe desiti i na cisteinu, argininu, i glutaminu. N-metilaciju moemo detektirati aminokiselinskom analizom uz obiljeavanje N-metil aminokiselinskih ostataka koji su stabilni u uslovima hidolize, dok O-karboksimetil aminokiseline su osjetljive na uslove hidrolize, pa ih tako ne moemo detektirati. Najbolja metoda za detekciju metilacije proteina jeste masena spektrometrija. N-terminalna acetilacija se sree kod 80-90% proteina viih eukariota ali je

nepoznat bioloki znaaj ove acetilacije. Primjeena je N-acetilacija lizina kod histona i faktora transkripcije. Ubikvitacija je kovalentna modifikacija proteina dodavanjem polipeptida ubikvitina koji ima 76 aminokiselina (8kDa) na aminogrupu lizina celularnih proteina. Vrlo je esta i znaajna za ubikvitin-proteozom sistem. Monoubikvitacija igra znaajnu ulogu u regulaciji elijskih procesa kao to su elijska dioba, diferencijacija, signalna transdukcija. Aberantna ubikvitacija je povezana sa neurodegenerativnim bolestima i patolokim inflamatornim te malignim procesima. Masena spektrometrija predstavlja dobru metodu za detekciju ubikvitiranih proteina, a za histidin vezanu ubikvitaciju moemo koristiti nikl afinitetnu hromatografiju nakon digestije tih proteina tripsinom.