Central dogma of molecular biology

Information flow in biological systems The central dogma of molecular biology was first enunciated by Francis Crick in 1958[1] and re stated in a Nature !a!er !ublished in 19"#$[%] The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by-residue transfer of sequential information. It states that information cannot be transferred back from protein to either protein or nucleic acid. In other words& 'once information gets into !rotein& it can't flow back to nucleic acid(' The dogma is a framework for understanding the transfer of se)uence information between se)uential information carrying bio!olymers& in the most common or general case& in li*ing organisms( There are + ma,or classes of such bio!olymers$ -./ and 0./ 1both nucleic acids2& and !rotein( There are +3+ 4 9 concei*able direct transfers of information that can occur between these( The dogma classes these into + grou!s of +$ + general transfers 1belie*ed to occur normally in most cells2& + special transfers 1known to occur& but only under s!ecific conditions in case of some *iruses or in a laboratory2& and + unknown transfers 1belie*ed to ne*er occur2( The general transfers describe the normal flow of biological information$ -./ can be co!ied to -./ 1-./ re!lication2& -./ information can be co!ied into m0./& 1transcri!tion2& and !roteins can be synthesi5ed using the information in m0./ as a tem!late 1translation2([%] Biological sequence information The bio!olymers -./& 0./ and !roteins& are linear !olymers 1ie$ each monomer is connected to at most two other monomers2( The se)uence of their monomers effecti*ely encodes information( The transfers of information described by the central dogma are faithful& deterministic transfers& wherein one bio!olymer's se)uence is used as a tem!late for the construction of another bio!olymer with a se)uence that is entirely de!endent on the original bio!olymer's se)uence( General transfers of biological sequential information Table of the + classes of information transfer suggested by the dogma General Special Unknown -./ 6 -./ 0./ 6 -./ !rotein 6 -./ -./ 6 0./ 0./ 6 0./ !rotein 6 0./ 0./ 6 !rotein -./ 6 !rotein !rotein 6 !rotein DNA Replication /s the final ste! in the Central -ogma& to transmit the genetic information between !arents and !rogeny& the -./ must be re!licated faithfully( 0e!lication is carried out by a com!le7 grou! of !roteins that unwind the su!erheli7& unwind the double stranded -./ heli7& and& using -./ !olymerase and its associated !roteins& co!y or re!licate the master tem!late itself so the cycle can re!eat -./ 6 0./ 6 !rotein in a new generation of cells or organisms(

ranscription

Transcri!tion is the !rocess by which the information contained in a section of -./ is transferred to a newly assembled !iece of messenger 0./ 1m0./2( It is facilitated by 0./ !olymerase and transcri!tion factors( In eukaryote cells the !rimary transcri!t 1!re m0./2 is often !rocessed further *ia alternati*e s!licing( In this !rocess& blocks of m0./ are cut out and rearranged& to !roduce different arrangements of the original se)uence( ranslation 8*entually& this mature m0./ finds its way to a ribosome& where it is translated( In !rokaryotic cells& which ha*e no nuclear com!artment& the !rocess of transcri!tion and translation may be linked together( In eukaryotic cells& the site of transcri!tion 1the cell nucleus2 is usually se!arated from the site of translation 1the cyto!lasm2& so the m0./ must be trans!orted out of the nucleus into the cyto!lasm& where it can be bound by ribosomes( The m0./ is read by the ribosome as tri!let codons& usually beginning with an /9:& or initiator methonine codon downstream of the ribosome binding site( Com!le7es of initiation factors and elongation factors bring aminoacylated transfer 0./s 1t0./s2 into the ribosome m0./ com!le7& matching the codon in the m0./ to the anti codon in the t0./& thereby adding the correct amino acid in the se)uence encoding the gene( /s the amino acids are linked into the growing !e!tide chain& they begin folding into the correct conformation( This folding continues until the nascent !oly!e!tide chains are released from the ribosome as a mature !rotein( In some cases the new !oly!e!tide chain re)uires additional !rocessing to make a mature !rotein( The correct folding !rocess is )uite com!le7 and may re)uire other !roteins& called cha!erone !roteins( ;ccasionally& !roteins themsel*es can be further s!liced< when this ha!!ens& the inside =discarded= section is known as an intein( Special transfers of biological sequential information Re!erse transcription

=9nusual flow of information highlighted in green( 0e*erse transcri!tion is the transfer of information from 0./ to -./ 1the re*erse of normal transcri!tion2( This is known to occur in the case of retro*iruses& such as >I?& as well as in eukaryotes& in the case of retrotrans!osons and telomere synthesis( RNA replication 0./ re!lication is the co!ying of one 0./ to another( @any *iruses re!licate this way( The en5ymes that co!y 0./ to new 0./& called 0./ de!endent 0./ !olymerases& are also found in many eukaryotes where they are in*ol*ed in 0./ silencing([+] Direct translation from DNA to protein -irect translation from -./ to !rotein has been demonstrated in a cell free system 1i(e( in a test tube2& using e7tracts from E. coli that contained ribosomes& but not intact cells( These cell fragments could e7!ress !roteins from foreign -./ tem!lates& and neomycin was found to enhance this effect( [A] [5] "et#ylation ?ariation in methylation states of -./ can alter gene e7!ression le*els significantly( @ethylation *ariation usually occurs through the action of -./ methylases( Bhen the change is heritable& it is considered e!igenetic( Bhen the change in information status is not heritable& it would be a somatic e!ity!e( The effecti*e information content has been changed by means of the actions of a !rotein or !roteins on -./& but the !rimary -./ se)uence is not altered( $rions % almost an &unknown transfer& Crions are !roteins that !ro!agate themsel*es by making conformational changes in other molecules of the same ty!e of !rotein( This change affects the beha*iour of the !rotein( In fungi this change ha!!ens from one generation to the ne7t& i(e( Crotein 6 Crotein( /lthough this re!resents a transfer of information& it is not an e7ce!tion to the central dogma& since the se)uence of the !rotein remains unchanged< but it is the e7ce!tion when you see the central dogma as describing nucleic acid as the central form of re!licati*e information 1the !rotein only hy!othesis2( $engertian eknologi DNA Rekombinan

Decara klasik analisis molekuler !rotein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam ,umlah besar( .amun& se,ak tahun 19"# an berkembang suatu teknologi yang da!at ditera!kan sebagai !endekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan mani!ulasi terhada! gen yang bertanggung ,awab atas eks!resi !rotein tertentu atau !embentukan suatu !roduk( Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan& atau dengan istilah yang lebih !o!uler rekayasa genetika& ini melibatkan u!aya !erbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering !ula dikatakan sebagai kloning gen( Eanyak definisi telah diberikan untuk mendeskri!sikan !engertian teknologi -./ rekombinan( Dalah satu di antaranya& yang mungkin !aling re!resentatif& menyebutkan bahwa teknologi -./ rekombinan adalah !embentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara !enyisi!an molekul -./ ke dalam suatu *ektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami !erbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang ber!eran sebagai sel inang( Teknologi -./ rekombinan mem!unyai dua segi manfaat( Certama& dengan mengisolasi dan mem!ela,ari masing masing gen akan di!eroleh !engetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya( Fedua& teknologi ini memungkinkan di!erolehnya !roduk gen tertentu dalam waktu lebih ce!at dan ,umlah lebih besar dari!ada !roduksi secara kon*ensional( Cada dasarnya u!aya untuk menda!atkan suatu !roduk yang diinginkan melalui teknologi -./ rekombinan melibatkan bebera!a taha!an tertentu 1:ambar 9(12( Taha!an taha!an tersebut adalah isolasi -./ genomikGkromosom yang akan diklon& !emotongan molekul -./ men,adi se,umlah fragmen dengan berbagai ukuran& isolasi -./ *ektor& !enyisi!an fragmen -./ ke dalam *ektor untuk menghasilkan molekul -./ rekombinan& transformasi sel inang menggunakan molekul -./ rekombinan& reisolasi molekul -./ rekombinan dari sel inang& dan analisis -./ rekombinan( 'solasi DNA Isolasi -./ diawali dengan !erusakan dan atau !embuangan dinding sel& yang da!at dilakukan baik dengan cara mekanis se!erti sonikasi& tekanan tinggi& beku leleh mau!un dengan cara en5imatis se!erti !emberian liso5im( Hangkah berikutnya adalah lisis sel( Eahan bahan sel yang relatif lunak da!at dengan mudah diresus!ensi di dalam medium bufer nonosmotik& sedangkan bahan bahan yang lebih kasar !erlu di!erlakukan dengan deter,en yang kuat se!erti triton I 1## atau dengan sodium dodesil sulfat 1D-D2( Cada eukariot langkah ini harus disertai dengan !erusakan membran nukleus( Detelah sel mengalami lisis& remukan remukan sel harus dibuang( Eiasanya !embuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi( Crotein yang tersisa di!resi!itasi menggunakan fenol atau !elarut organik se!erti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara en5imatis dengan !roteinase( -./ yang telah dibersihkan dari !rotein dan remukan sel masih tercam!ur dengan 0./ sehingga !erlu ditambahkan 0./se untuk membersihkan -./ dari 0./( @olekul -./ yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan !enambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kera!atan menggunakan CsCl 1lihat Eab II2( Gambar ()*) Skema ta#apan kloning gen Teknik isolasi -./ tersebut da!at dia!likasikan& baik untuk -./ genomik mau!un -./ *ektor& khususnya !lasmid( 9ntuk memilih di antara kedua macam molekul -./ ini yang akan diisolasi da!at digunakan dua !endekatan( Certama& !lasmid !ada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mem!unyai bentuk covalently closed circular 1CCC2& sedangkan -./ kromosom ,auh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mem!unyai nisbah aksial yang sangat tinggi( Cerbedaan tersebut menyebabkan -./ !lasmid ,auh lebih tahan terhada! denaturasi a!abila dibandingkan dengan -./ kromosom( ;leh karena itu& a!likasi kondisi denaturasi akan da!at memisahkan -./ !lasmid dengan -./ kromosom( Cendekatan kedua didasarkan atas !erbedaan daya sera! etidium bromid& 5at !ewarna -./ yang menyisi! atau melakukan interkalasi di sela sela basa molekul -./( -./ !lasmid akan menyera! etidium bromid ,auh lebih sedikit dari!ada ,umlah yang disera! oleh -./ kromosom !er satuan !an,angnya( -engan demikian& !erlakuan menggunakan etidium bromid akan men,adikan kera!atan

-./ kromosom lebih tinggi dari!ada kera!atan -./ !lasmid sehingga keduanya da!at di!isahkan melalui sentrifugasi kera!atan( +n,im Restriksi Taha! kedua dalam kloning gen adalah !emotongan molekul -./& baik genomik mau!un !lasmid( Cerkembangan teknik !emotongan -./ berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi -./ !ada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi *irus atau bakteriofag lambda 1l2( ?irus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli& yakni strain F dan C( Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C& maka akan di!eroleh l !rogeni 1keturunan2 yang lebih kurang sama banyaknya dengan ,umlah yang di!eroleh dari infeksi !ertama( -alam hal ini& dikatakan bahwa efficiency of plating 18;C2 dari strain C ke strain C adalah 1( .amun& ,ika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain F& maka nilai 8;C nya hanya 1# A( /rtinya& hanya ditemukan l !rogeni sebanyak 1G1#(### kali ,umlah yang diinfeksikan( Dementara itu& l yang diisolasi dari strain F mem!unyai nilai 8;C sebesar 1& baik ketika direinfeksikan !ada strain F mau!un !ada strain C( >al ini ter,adi karena adanya sistem restriksiGmodifikasi 1rGm2 !ada strain F( Cada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain F& molekul -./nya dirusak oleh en5im endonuklease restriksi yang terda!at di dalam strain F( -i sisi lain& untuk mencegah agar en5im ini tidak merusak -./nya sendiri& strain F ,uga mem!unyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi bebera!a basa !ada se,umlah urutan tertentu yang meru!akan tem!at tem!at !engenalan (recognition sites bagi en5im restriksi tersebut( -./ bakteriofag l yang mam!u bertahan dari !erusakan oleh en5im restriksi !ada siklus infeksi !ertama akan mengalami modifikasi dan mem!eroleh kekebalan terhada! en5im restrisksi tersebut( .amun& kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat !ada setia! akhir !utaran re!likasi -./( -engan demikian& bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain F ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain F akan men,adi rentan terhada! en5im restriksi( @etilasi hanya ter,adi !ada salah satu di antara kedua untai molekul -./( Eerlangsungnya metilasi ini demikian ce!atnya !ada tia! akhir re!likasi hingga molekul -./ baru hasil re!likasi tidak akan sem!at ter!otong oleh en5im restriksi( 8n5im restriksi dari strain F telah diisolasi dan banyak di!ela,ari( Delan,utnya& en5im ini dimasukkan ke dalam suatu kelom!ok en5im yang dinamakan en,im restriksi tipe '( Eanyak en5im seru!a yang ditemukan kemudian !ada berbagai s!esies bakteri lainnya( Cada tahun 19"# T(J( Felly menemukan en5im !ertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelom!ok en5im restriksi lainnya& yaitu en,im restriksi tipe ''( Ia mengisolasi en5im tersebut dari bakteri !aemophilus influen"ae strain 0d& dan se,ak saat itu ditemukan lebih dari A"5 en5im restriksi ti!e II dari berbagai s!esies dan strain bakteri( Demuanya sekarang telah men,adi salah satu kom!onen utama dalam tata ker,a rekayasa genetika( 8n5im restriksi ti!e II antara lain mem!unyai sifat sifat umum yang !enting sebagai berikut$ 1( mengenali urutan tertentu se!an,ang em!at hingga tu,uh !asang basa di dalam molekul -./ %( memotong kedua untai molekul -./ di tem!at tertentu !ada atau di dekat tem!at !engenalannya +( menghasilkan fragmen fragmen -./ dengan berbagai ukuran dan urutan basa(

Debagian besar en5im restriksi ti!e II akan mengenali dan memotong urutan !engenal yang mem!unyai sumbu simetri rotasi( :ambar 11(+ mem!erlihatkan bebera!a en5im restriksi beserta tem!at !engenalannya(

Cemberian nama ke!ada en5im restriksi mengikuti aturan sebagai berikut( >uruf !ertama adalah huruf !ertama nama genus bakteri sumber isolasi en5im& sedangkan huruf kedua dan ketiga masing masing adalah huruf !ertama dan kedua nama !etun,uk s!esies bakteri sumber tersebut( >uruf huruf tambahan& ,ika ada& berasal dari nama strain bakteri& dan angka romawi digunakan untuk membedakan en5im yang berbeda teta!i diisolasi dari s!esies yang sama( Tem!at !emotongan !ada kedua untai -./ sering kali ter!isah se,auh bebera!a !asang basa( Cemotongan -./ dengan tem!at !emotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen fragmen dengan u,ung 5K yang runcing karena masing masing untai tunggalnya men,adi tidak sama !an,ang( -ua fragmen -./ dengan u,ung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga u,ung runcing sering !ula disebut sebagai u-ung lengket (sticky end) atau u-ung ko#esif( >al itu berbeda dengan en5im restriksi se!erti >ae III& yang mem!unyai tem!at !emotongan -./ !ada !osisi yang sama( Fedua fragmen hasil !emotongannya akan mem!unyai u,ung 5K yang tum!ul karena masing masing untai tunggalnya sama !an,angnya( Fragmen fragmen -./ dengan u-ung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan( Eiasanya di!erlukan !erlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen -./ dengan u,ung tum!ul& misalnya !emberian molekul linker& molekul ada!tor& atau !enambahan en5im deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homo!olimerik +K( .igasi "olekul % molekul DNA Cemotongan -./ genomik dan -./ *ektor menggunakan en5im restriksi harus menghasilkan u,ung u,ung !otongan yang kom!atibel( /rtinya& fragmen fragmen -./ genomik nantinya harus da!at disambungkan 1diligasi2 dengan -./ *ektor yang sudah berbentuk linier( /da tiga cara yang da!at digunakan untuk meligasi fragmen fragmen -./ secara in #itro( Certama& ligasi menggunakan en5im -./ ligase dari bakteri( Fedua& ligasi menggunakan -./ ligase dari sel sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag TA atau la5im disebut sebagai en5im TA ligase( Jika cara yang !ertama hanya da!at digunakan untuk meligasi u,ung u,ung lengket& cara yang kedua da!at digunakan baik !ada u,ung lengket mau!un !ada u,ung tum!ul( Dementara itu& cara yang ketiga telah disinggung di atas& yaitu !emberian en5im deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homo!olimerik +K( -engan untai tunggal semacam ini akan di!eroleh u,ung lengket buatan& yang selan,utnya da!at diligasi menggunakan -./ ligase( Duhu o!timum bagi akti*itas -./ ligase sebenarnya +"LC( /kan teta!i& !ada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara u,ung u,ung lengket akan men,adi tidak stabil dan kerusakan akibat !anas akan ter,adi !ada tem!at ikatan tersebut( ;leh karena itu& ligasi biasanya dilakukan !ada suhu antara A dan 15LC dengan waktu inkubasi 1reaksi2 yang di!er!an,ang 1sering kali hingga semalam2( Cada reaksi ligasi antara fragmen fragmen -./ genomik dan -./ *ektor& khususnya !lasmid& da!at ter,adi !eristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga !lasmid yang telah dilinierkan dengan en5im restriksi akan men,adi !lasmid sirkuler kembali( >al ini ,elas akan menurunkan efisiensi ligasi( 9ntuk meningkatkan efisiensi ligasi da!at dilakukan bebera!a cara& antara lain !enggunaan -./ dengan konsentrasi tinggi 1lebih dari 1##MgGml2& !erlakuan dengan en5im alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari u,ung 5K !ada molekul -./ yang telah ter!otong& serta !emberian molekul linker& molekul ada!tor& atau !enambahan en5im deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homo!olimerik +K se!erti telah disebutkan di atas( Transformasi Del Inang Taha! berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhada! hasil !emotongan -./ genomik dan -./ *ektor serta analisis hasil ligasi molekul molekul -./ tersebut( menggunakan teknik elektroforesis 1lihat Eab I2( Jika hasil elektroforesis menun,ukkan bahwa fragmen fragmen -./ genomik telah terligasi dengan baik !ada -./ *ektor sehingga terbentuk molekul -./ rekombinan& cam!uran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar da!at di!erbanyak dengan ce!at( -engan

sendirinya& di dalam cam!uran reaksi tersebut selain terda!at molekul -./ rekombinan& ,uga ada se,umlah fragmen -./ genomik dan -./ !lasmid yang tidak terligasi satu sama lain( Taha! memasukkan cam!uran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang dihara!kan akan mengalami !erubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul -./ rekombinan( Teknik transformasi !ertama kali dikembangkan !ada tahun 19"# oleh @( @andel dan /( >iga& yang melakukan transformasi bakteri E. coli( Debelumnya& transformasi !ada bebera!a s!esies bakteri lainnya yang mem!unyai sistem transformasi alami se!erti $acillus subtilis telah da!at dilakukan( Femam!uan transformasi $. subtilis !ada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain strain auksotrof 1tidak da!at tumbuh !ada medium minimal2 men,adi !rototrof 1da!at tumbuh !ada medium minimal2 dengan menggunakan !re!arasi -./ genomik utuh( Earu bebera!a waktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan !erantara *ektor& yang selan,utnya ,uga dikembangkan !ada transformasi E.coli( >al ter!enting yang ditemukan oleh @andel dan >iga adalah !erlakuan kalsium klorid 1CaCl %2 yang memungkinkan sel sel E. coli untuk mengambil -./ dari bakteriofag l( Cada tahun 19"% D(.( Cohen dan kawan kawannya menemukan bahwa sel sel yang di!erlakukan dengan CaCl % da!at ,uga mengambil -./ !lasmid( Frekuensi transformasi tertinggi akan di!eroleh ,ika sel bakteri dan -./ dicam!ur di dalam larutan CaCl % !ada suhu # hingga 5LC( Cerlakuan ke,ut !anas antara +" dan A5LC selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah !encam!uran -./ dengan larutan CaCl % tersebut da!at meningkatkan frekuensi transformasi teta!i tidak terlalu esensial( @olekul -./ berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya dari!ada molekul -./ kecil( @ekanisme transformasi belum se!enuhnya da!at di,elaskan( .amun& setidak tidaknya transformasi melibatkan taha! taha! berikut ini( @olekul CaCl % akan menyebabkan sel sel bakteri membengkak dan membentuk sfero!las yang kehilangan !rotein !eri!lasmiknya sehingga dinding sel men,adi bocor( -./ yang ditambahkan ke dalam cam!uran ini akan membentuk kom!leks resisten -.ase dengan ion ion Ca%N yang terikat !ada !ermukaan sel( Fom!leks ini kemudian diambil oleh sel selama !erlakuan ke,ut !anas diberikan(
Seleksi ransforman dan Seleksi Rekombinan ;leh karena -./ yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya -./ rekombinan& maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa -./ rekombinan( Delan,utnya& di antara sel sel transforman yang membawa -./ rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk menda!atkan sel yang -./ rekombinannya membawa fragmen sisi!an atau gen yang diinginkan( Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci !ada !en,elasan tentang !lasmid 1lihat Eab II2( Cada dasarnya ada tiga kemungkinan yang da!at ter,adi setelah transformasi dilakukan& yaitu 112 sel inang tidak dimasuki -./ a!a !un atau berarti transformasi gagal& 1%2 sel inang dimasuki *ektor religasi atau berarti ligasi gagal& dan 1+2 sel inang dimasuki *ektor rekombinan denganGtan!a fragmen sisi!an atau gen yang diinginkan( 9ntuk membedakan antara kemungkinan !ertama dan kedua dilihat !erubahan sifat yang ter,adi !ada sel inang( Jika sel inang mem!erlihatkan dua sifat marker *ektor& maka da!at di!astikan bahwa kemungkinan kedualah yang ter,adi( Delan,utnya& untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat !ula !erubahan sifat yang ter,adi !ada sel inang( Jika sel inang hanya mem!erlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker *ektor& maka da!at di!astikan bahwa kemungkinan ketigalah yang ter,adi(

Deleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen !elacak (probe & yang !embuatannya dilakukan secara in #itro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction /$CR0( Cen,elasan lebih rinci tentang teknik CC0 da!at dilihat !ada Eab III( Celacakan fragmen yang diinginkan antara lain da!at dilakukan melalui cara yang dinamakan #ibridisasi koloni 1lihat Eab I2( Foloni koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon& dilisis agar isi selnya keluar& dibersihkan !rotein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa -./nya sa,a( Delan,utnya& dilakukan fiksasi -./ dan !erendaman di dalam larutan !elacak( Cosisi !osisi -./ yang terhibridisasi oleh fragmen !elacak dicocokkan dengan !osisi koloni !ada kultur awal (master plate ( -engan demikian& kita bisa menentukan koloni koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan