Professional Documents
Culture Documents
Umjetno Osjemenjavanje
Umjetno Osjemenjavanje
VETAKO OSEMENJAVANJE
Zootehnika i veterinarsko-medicinska metoda ubacivanja doza sperme u odreene delove enskog polnog trakta, primenom odreenih instrumenata i tehnika. U irokoj stoarskoj proizvodnji, vetako osemenjavanje (VO) se koristi ve vie od 50 godina. Primena ove metode, doprinela je velikom napretku intenzivne stoarske proizvodnje. Prednosti primene vetakog osemenjavanja: Bre razmnoavanje (dobijanje veeg broja potomaka) jednog genetski superiornog priplodnjaka Spreavanje irenja zaraznih bolesti Mogunost dugotrajnog uvanja sperme odreenog priplodnjaka Jednostavniji i jeftiniji transport sperme, na vee udaljenosti Iskljuen rizik transporta, adaptacije, aklimatizacije i karantiniranja priplodnjaka Znatno bolja evidencija porekla potomaka Ekonomske utede u proizvodnji, zbog potrebe znatno manjeg broja priplodnjaka Mogunost prodaje doza sperme i ekonomske koristi od toga Mogunost definisanja pola potomaka, putem sexing-a spermatozoida Mogunosti naunih istraivanja Postupci u tehnologiji vetakog osemenjavanja: 1. Uzimanje sperme od priplodnjaka se vri: (a) vetakom vaginom, (b) manuelnom fiksacijom penisa, (c) elektroejakulacijom i (d) manuelnom masaom ampula semevoda per rectum. Kontrola kvaliteta dobijenog ejakulata se vri neposredno posle uzimanja i obuhvata: (a) makroskopsku ocenu (volumen, gustina, boja, miris, prisustvo stranih primesa) i (b) mikroskopsku ocenu (ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, koncentracija spermatozoida u 1 ml ejakulata, % progresivne pokretljivosti, broj mrtvih i morfoloki abnormalnih spermatozoida, eventualno prisustvo mikroorganizama i td.). Broj spermatozoida se odreuje: hemocitometrijski ili fotometrijski. Mrtvi i morfoloki abnormalni spermatozoidi se odreuju pregledom trajnih histolokih preparata, obojenih adekvatnom metodom (po Blom-u, Supravitalno i td.). Svi opisani postupci kontrole sperme se vre u prostoriji sa oko 20-220C, dok sama sperma, instrumenti i predmeti koji dolaze u direktan kontakt sa spermom, moraju biti zagrejani na 370C.
2.
46
3.
Razreivanje ejakulata se izvodi odmah posle izvrene kontrole. Ejakulat se razreuje zbog toga da se: (a) povea njegov volumen, kako bi se mogao napraviti vei broj inseminacionih doza odreene zapremine i (b) dodaju potrebne hranljive, zatitne i druge materije, koje e produiti ivot i oplodnu sposobnost spermatozoida, tokom njihovog uvanja in vitro. Za razreivanje se koriste posebni razreivai, iji sastav i osobine zavise od vrste priplodnjaka, kao i od naina i duine uvanja razreene sperme. Formiranje inseminacionih doza se vri u zavisnosti od vrste priplodnjaka, upotrebljenog razreivaa i naina uvanja. Volumen inseminacione doze je specifian za svaku vrstu priplodnjaka. Nativna razreena sperma se razlije u odreeni broj doza, koje se stavljaju na temperaturu 170C, ako se uvaju kratkotrajno (nekoliko sati ili dana) ili se postepeno rashlauju i podvrgavaju odreenoj obradi, ako se eli njihovo dugotrajno uvanje u zamrznutom stanju (na 1960C). uvanje razreene sperme moe biti kratkotrajno (u tenom stanju) ili dugotrajno u duboko zamrznutom stanju. Bez obzira na vrstu ivotinja, primenjen razreiva, te nain i duinu uvanja, oplodna sposobnost spermatozoida je loija u spermi koja se uvala, u odnosu na onu koja se upotrebila neposredno posle uzimanja i razreivanja. Tehnika inseminacije je jedan od primarnih faktora uspeha vetakog osemenjavanja, mereno brojem (%) postignute uspene koncepcije i veliinom rezultirajueg legla. Izvodi se specijalnim instrumentima (inseminacioni kateteri, vaginalni spekulumi, inseminacione boice i sl.). Izgled i oblik ovih instrumenata zavise od vrste ivotinje za koju su namenjeni. Vrhom inseminacionog katetera se ulazi u odreen deo enskog polnog trakta (cervix, telo materice, rog materice), gde se vri deponovanje doze sperme. UZIMANJE SPERME OD PRIPLODNJAKA
4.
5.
6.
Sperma (ejakulat = zapremina sperme, koju priplodnjak izbaci u jednom skoku, ejakulaciji) se moe uzeti od priplodnjaka sledeim metodama: (a) vetakom vaginom, (b) manuelnom fiksacijom penisa, (c) elektroejakulacijom i (d) masaom akcesornih polnih lezda. Manuelna fiksacija penisa se koristi za uzimanje sperme od nerasta. Naime, pokazalo se da nerast slabije manifestuje refleks ejakulacije i daje loiji kvalitet ejakulata, ako se sperma uzima vetakom vaginom. To je zbog toga to: (a) nerast ima due trajanje ejakulacije i (b) to je, za stimulaciju refleksa ejakulacije, kod nerasta, primaran stimulus pritiska, koji nije mogue, u dovoljnoj meri, postii vetakom vaginom. Zbog toga se, posle erekcije, rukom u rukavici, vrsto hvata i stiska glans penisa, sve dok nerast ne zavri kompletnu ejakulaciju.
47
Vetaka vagina je specijalna naprava, kojom se imitiraju uslovi u vagini (temperatura, skliskost i pritisak). Ovi faktori su stimulusi za izazivanje refleksa ejakulacije kod mujaka. Temperatura (oko 39oC) se postie tako to se, u meuprostor izmeu tanke (unutranje) i debele (spoljanje) gume vetake vagine, sipa temperirana voda. Skliskost se postie tako to se unutranji zid vetake vagine namae nekom neutralom mau, dok se pritisak postie naponom vode u meuprostoru izmeu spoljanjeg i unutranjeg zida vagine. Na suprotnom kraju vetake vagine, od otvora kroz koji ulazi penis, fiksira se spermosabira. Vano je da cela vagina, a posebno spermosabira, bude zatien od uticaja spoljanje temperature i svetlosti. To se postie specijalnom navlakom. Ovom metodom se uzima sperma od bika, pastuva i ovna. Elektroejakulacija je pomona metoda, koja se koristi kada priplodnjak nije u stanju da izvri ejakulaciju primenom drugih metoda dobijanja sperme. Ova metoda se ee koristi kod malih vrsta ivotinja. Princip metode se satoji u tome, to se, kroz jednu bipolarnu elektordu, uvedenu u rektum mujaka, proputa niskofrekventna struja (5, 10 ili 15V, maksimalne jaine 200mA). Ova struja stimulie centar za ejakulaciju, koji se nalazi u lumbosakralnom delu kimene modine. Pre poetka stimulacije, mujak se dobro fiksira, a u rektum se ubaci 50 ml (ovan) ili 200 ml (bik) 1% vodenog rastvora NaCl, radi postizanja bolje provodljivosti elektrine struje. Struja se proputa u trajanju 5-6 sekundi, nekoliko puta, sa pauzama isto tolikog trajanja. Ovako dobijeni ejakulati su dobrog kvaliteta, ali imaju neto vei volumen u poreenju sa onim ejakulatima koji se dobijaju vetakom vaginom. To je posledica pojaane sekrecije vezikularnih lezda, kao odgovor na elektrini nadraaj. Masaa akcesornih polnih lezda i/ili ampula semevoda je, takoe, metod kojim se moe izazvati refleks ejakulacije, odnosno dobiti sperma od priplodnjaka. Izvodi se tako to se, rukom uvedenom u rektum, pronau i masiraju vezikularne lezde i/ili ampule semevoda. I ova metoda se koristi kod priplodnjaka koji nisu sposobni da izvre skok. Pogodna je zbog toga to nije potrebna nikakva oprema. Meutim, po pravilu, ovako dobijen ejakulat je znatno loijeg kvaliteta. Prilikom uzimanja sperme, vano je znati da bik i ovan ejakuliraju vrlo kratko (za nekoliko sekundi posle skoka), da je njihov ejakulat male zapremine (bik 8 ml, ovan 1,5 ml) i velike koncentracije, kao i da ejakuliraju kompletan ejakulat. Ejakulacija kod pastuva traje due (0,5 do 1 minut), a komponente sperme se izbacuju u frakcijama. Zapremina ejakulata pastuva je oko 70 ml. Nerast ejakulira najdue (oko 5-6 minuta), ejakulat se izbacuje u 3 frakcije, a njegova zapremina je velika (120-500 ml), ali male koncentracije.
68
50
51
Metodom elektroejakulacije
Metodom manuelne masae vezikularnih lezda (A) i manuelne masae ampula semevoda (B). 52
53
Mikroskopska ocena sperme se izvodi pod svetlosnim mikroskopom i obuhvata odreivanje sledeih parametara i osobina spermatozoida: stepen (%) progresivne pokretljivosti, ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, broj ivih, mrtvih i morfoloki promenjenih, prisustvo koagulacije spermatozoida, prisustvo stranih materija (krv, gnoj, epitelne elije, neistoa) i prisustvo mikroorganizama. Progresivna pokretljivost se izraava procentom progresivno pokretnih, od ukupnog broja spermatozoida u vidnom polju. Samo progresivno pokretni spermatozoidi su sposobni za oplodnju. Spermatozoidi se mogu kretati i cirkularno, talasasto, spiralno ili mogu biti nepokretni. Progresivna pokretljivost je osobina, koja je vrlo znaajno povezana sa oplodnom sposobnou spermatozoida. Broj ivih spermatozoida se odreuje razliitim metodama brojanja: (1) metoda hemocitometrije i (2) metoda fotometrije. Prva metoda se ee koristi u praksi. Za ovu metodu je potreban svetlosni mikroskop, komorica za brojanje eritrocita (hemocitometer), melaner za eritrocite ili leukocite (zavisno od vrste ivotinja) i 3% vodeni rastvor NaCl. Postupak brojanja: Pod mikroskop se postavi hemocitometer i, na malom uveanju, se pronae mreica (komorica) za brojanje. Zatim se, u melaner uvue nativna sperma, do oznake 0,5, a 3% NaCl do oznake 11 (kod melanera za leukocite), ili do oznake 101 (kod melanera za eritrocite). Tako se, u melaneru, napravi razreenje sperme u odnosu 1:20 ili 1:200. Eritrocitarni melaner se koristi za gustu spermu (bik, ovan, jarac), a leukocitarni za retku spermu (nerast, pastuv). Palcem i srednjim prstom se zatvore krajevi melanera i promuka se nekoliko puta. Prva kap, iz kapilare melanera, se ispusti, a ostatak se ubaci izmeu pokrovne ploice i stakla hemocitometra. Objektiv mikroskopa se podesi na srednje uvelianje i broje se spermatozoidi, koji se nalaze u 5 srednjih (80 malih) kvadratia mreice. Fizioloke granine vrednosti osnovnih parametara ejakulata Volumen ejakulata BIK OVAN NERAST PASTUV PAS MAAK 5 15 ml 0,5 2,0 ml 100 500 ml 50 100 ml 1,7 21ml 0,1 0,5ml Konc. spermatozoida u 1ml ejakulata 800 2000 (x106) 1,5 4,0 (x109) 200-700 (x106) 30 800 (x106) 100 300 (x106) 110 132 (x106) Ukupan broj sptz. u ejakulatu 4,5 30 (x109) 0,75 8 (x109) 20 350 (x109) 1,5 80 (x109) 0,2 6,3 (x109) 11 66 (x106)
54
Melaner za eritrocite (A) i leukocite (B). Kapilara (1), bulbus (2) gumena cevica (3), plastina sisaljka za usta, crvena kod eritrocitarnog, a bela kod leukocitarnog melanera (4) i plastina perlica, za bolje meanje sperme i NaCl (5).
Mreica komorice za brojanje spermatozoida (levo). Spermatozoidi se broje u 5 velikih kvadrata mreice (desno).
55
Metodom hemocitometrije se broje spermatozoidi u malom uzorku razreene sperme, a zatim se, izraunavanjem dobija broj spermatozoida u 1ml nativne sperme, odnosno u celokupnom ispitivanom ejakulatu. Postupak: 1. U melaneru se izvri razreivanje i umrtvljavanje spermatozoida. Ako se ispituje sperma nerasta ili pastuva (koja je male koncentracije), koristi se melaner za leukocite. Nativna sperma se uvue u melaner do oznake 0,5. Zatim se uvlai 3% (hipertonini) rastvor NaCl, do oznake 11. Tako se dobije razreenje nativne sperme u odnosu 1:20. Hipertonini rastvor NaCl ubija spermatozoide, kako se ne bi kretali u komorici za brojanje. Ako se ispituje sperma preivara (bik, ovan, jarac), koristi se melaner za eritrocite, jer se, u njemu, prave vea razreenja (1:100 ako se sperma uvue do oznake 1, a rastvor NaCl do oznake 101 ili 1:200 - ako se sperma uvue do oznake 0,5, a rastvor NaCl do oznake 101). Zatim se melaner promuka, posle ega se jedna kap izduva iz njegove kapilare (tu je ostao samo rastvor NaCl). Ostatak sadraja melanera se izduva ispod pokrovnog stakla, na komorici hemocitometra, postavljenoj ispod svetlosnog mikroskopa. Pod malim uveanjem mikroskopa, pronae se cela mreica komorice za brojanje. Zatim se, pod srednjim uvelianjem, u vidno polje mikroskopa, postavi jedan veliki kvadrat mreice (oivien je sa dve tanke crte). Kada se spermatozoidi potpuno umire (uginu), pristupa se njihovom brojanju u svakom od 5 odabranih (od ukupno 16) velikih kvadrata mreice. Obino se broje 4 kvadrata u uglovima i jedan u sredini, idui sleva na desno, u obliku slova Z. Broj izbrojanih spermatozoida u svakom kvadratu se zabelei. Time je postupak brojanja u hemocitometru zavren.
2.
3.
4.
5. Pristupa se izraunavanju broja spermatozoida u 1ml nativne sperme, odnosno u celokupnom ispitivanom ejakulatu. Primer izraunavanja: Ispitivan je ejakulat nerasta, zapremine 200ml (V = 200ml). U melaneru za leukocite je napravljeno razreenje nativne sperme, u odnosu 1 : 20 (r = 20). U 5 velikih kvadrata, ukupno je izbrojano 150 spermatozoida (n = 150).
56
Izraunavanje ukupnog broja (koncentracije - C) spermatozoida u 1ml nativne sperme, vri se po formuli: C = n x r x 50.000
C - ukupan broj spermatozoida u 1ml nativne sperme; n - broj spermatozoida izbrojan u 5 velikih kvadrata mreice hemocitometra; r - stepen razreenja, napravljen u melaneru; 50.000 - koeficijent komorice za brojanje.
Ako, u formuli, zamenimo vrednosti date u naem primeru, dobijamo: C = 150 x 20 x 50.000 = 3.000 x 50.000 = 15.000.000 sptz./ml. Znai: u 1ml ispitivanog nativnog ejakulata, ima 150 miliona (150 x 106) spermatozoida. Kako ispitivani ejakulat ima zapreminu 200ml, to u celom ejakulatu ima 150.000.000 x 200 = 30.000.000.000 (30 x 109) spermatozoida. Pre poetka brojanja, u uzorku nativne sperme, zagrejane na + 37oC, pod svetlosnim mikroskopom, izvri se ocena broja progresivno pokretnih spermatozoida, izraena u %, od ukupnog broja spermatozoida u vidnom polju mikroskopa. Uzmimo, da je, u naem primeru, bilo 80% progresivno pokretnih spermatozoida. Kod detaljnijih analiza kvaliteta ejakulata, moe se napraviti i trajni, obojen preparat, na kome se mogu videti morfoloki promenjeni, kao i mrtvi spermatozoidi. Za praksu je naj jednostavnije napraviti preparat bojenjem po Blom-u.
Postupak bojenja preparata sperme po Blom-u: 1. Na istu staklenu predmetnu ploicu, zagrejanu na +37oC, stavi se vrlo mala kap nativne sperme (veliine iodine glave), pored nje duplo vea kap 5% vodenog rastvora nigrozina (crna histoloka boja) i troduplo vea kap 10% vodenog rastvora eozina (crvena histoloka boja). Sada se, staklena pokrovna ljuspica postavi pod uglom od oko 45o na predmetnu ploicu, pored kapi sperme i boje, pa se napravi vrlo tanak razmaz po predmetnom staklu. Boja dobrog razmaza treba da je svetlo karmin-crvena. Ovako napravljen preparat se, brzo, osui (prevlaenjem iznad plamena plamenika), ali da se ne zagaravi. Takav trajni preparat se posmatra pod svetlosnim mikroskopom. Spermatozoidi, ije su glave obojene crveno, su bili mrtvi pre poetka pravljenja preparata, jer je elijska membrana mrtvog spermatozoida propustila u citoplazmu crvenu boju eozin. elijske membrane ivih spermatozoida su selektivno propustljive i ne proputaju velike molekule eozina. Zbog toga su njihove glave, pod mikroskopom, providne (nisu obojene crveno). Mogu se videti i spermatozoidi sa razliitim anomalijama grae glave i repa, kao i spermatozoidi sa citoplazmatinom kapi (to so spermatozoidi koji nisu zavrili sazrevanje u epididimisu). Ova citoplazmatina kap moe biti postavljena na repu spermatozoida, odmah iza glave (proksimalna citoplazmatina kap) ili dalje od glave (distalna citoplazmatina kap). Spermatozoidi sa proksimalnom citoplazmatinom kapi su nezreli i nisu sposobni da izvre fertilizaciju oocita.
2.
3. 4.
57
Oblici spermatozoida i nekih elija, koji se mogu nai u spermi: Normalni spermatozoidi (A), razliiti oblici morfolokih deformacija spermatozoida (B) i razliite nenormalne elije u spermi (C): forme spermatozoida u obliku meduze (a), epitelne elije (b), okruglaste elije (c), eritrociti (d) i gnojne elije (e).
58
Fiziko-hemijske metode ocene kvaliteta sperme su: Temperaturni (hladan) ok, ocena pH vrednosti, odreivanje stepena glikolize i respiracije spermatozoida, obezbojavanje metilenskog plavog i test inkubacije. Hladan ok je test preivljavanja spermatozoida u vodenom kupatilu, na 00C, tokom 10 minuta. Procentualni odnos ivih i mrtvih spermatozoida, posle temperaturnog oka, govori o stepenu vitalnosti spermatozoida. pH vrednost sperme je specifina za svaku vrstu, ali se kree u granicama od 6,7 do 7,2 i veoma je bitna za odravanje oplodne sposobnosti spermatozoida. Vrednost respiracije, tj. potronje kiseonika i njegove konverzije u CO2, tesno je povezana sa stepenom glikolize u spermatozoidima. Obezbojavanje metilen-plavog. Potronja kiseonika, u spermi sa visokom koncentracijom vitalnih spermatozoida, znatno je via od one u spermi sa niom koncentracijom ovakvih spermatozoida. Brzina obezbojavanja metilen-plavog, kao posledica oksido-redukcijske reakcije, slui kao indirektan nain odreivanja stepena potronje kiseonika, odnosno stepena ivotne aktivnosti spermatozoida. Inkubacija spermatozoida na temperaturi od 46oC, tokom 45 minuta, poveava sve biohemijske procese spermatozoida. Tako oni bre troe kiseonik i hranljive materije iz spermalne tenosti. Odreivanjem odnosa broja ivih spermatozoida pre i posle inkubacije, meri se vitalnost, odnosno oplodna sposobnost spermatozoida. Sperma je kvalitetnija, ako se, u njoj, posle inkubacije, nae vei broj ivih spermatozoida.
59
Svaka doza treba da ima zapreminu od 100ml razreene sperme. To znai da e, u naem primeru, ukupna zapremina 12 doza iznositi 1.200ml. Kako ejakulat, iz naeg primera, ima zapreminu 200ml nativne sperme, u njega treba da dospemo 1.000ml razreivaa. Tako smo dobili zapreminu od 1.200ml razreene sperme, koju razdelimo u 12 boica, od kojih svaka ima zapreminu 100ml razreene sperme (to su inseminacione doze). Svi postupci manipulacije sa spermom, od uzimanja do razreivanja, rade se na sobnoj temperaturi (200C ), a sve to dolazi u direktan kontakt sa spermom (spermosabira, predmetnice, pokrovne ploice, melaneri, menzure, boice za inseminacione doze i razreiva), kao i sama sperma, moraju biti zagrejani na +370C. Posle razreivanja, doze tene razreene sperme nerasta se, do inseminacije, uvaju na temperaturi +17oC. U zavisnosti od primenjenog razreivaa, doze tene razreene sperme nerasta se mogu uvati, na ovoj temperaturi, kratkotrajno (do 3 dana) ili dugotrajno (4 do 14 dana). Treba imati na umu da oplodna sposobnost spermatozoida pada sa duinom uvanja in vitro! Inseminacione doze se mogu dugotrajno uvati (vie desetina godina) dubokim zamrzavanjem u pari tenog azota, na temperaturi -196oC. Ovom metodom dubok zamrzavanja, vrlo uspeno se uvaju inseminacione doze bika, ovna i jarca, a znatno manje uspeno doze nerasta i pastuva.
Volumen doze (ml) BIK OVAN NERAST PASTUV PAS MAAK 0,25 0,50 0,02 0,05 80 - 100 12 20 0,5 8 0,05
Broj sptz. u dozi (x106) 20 30* 150 350 2000 - 5000 300 500 150 - 1000 Min. 5
Danas se prave doze sa 12 15 miliona spermatozoida. ** U sezoni se pravi znatno vei broj doza od jednog ejakulata, od onog izvan sezone parenja.
60
OPTIMALNO VREME I TEHNIKA VO Optimalno vreme osemenjavanja. Maksimalna vrednost uspene koncepcije se postie osemenjavanjem izvedenim 10-12h pre ovulacije. Kako moment ovulacije, u praktinim uslovima, nije mogue precizno odrediti na direktan nain, to se ovaj moment odreuje u odnosu na poetak estrusa. Ustanovljeno je da su poetak manifestacije standing estrusa, kao i njegovo trajanje, znaajno povezani sa momentom ovulacije. Zbog toga se optimalno vreme inseminacije odreuje na osnovu to preciznije ustanovljenog poetka standing estrusa. Kako je trajanje estrusa razliito kod vrsta razliitih ivotinja, to je i optimalno vreme osemenjavanja razliito, ali je uvek oko 12h pre ovulacije.
Trajanje estrusa KRAVA OVCA KRMAA 18-24h 24-31h 24-72h Moment ovulacije oko 10-12h posle standing estrusa blie kraju estrusa na poetku zadnje treine estrusa* KOBILA KUJA MAKA 2-9 dana 3-21 dan pros. 7 dana pri kraju estrusa unutar 5 dana posle posle poetka estrusa provocirana ovulacija! u estrusu u drugoj polovini estrusa oko 0 do 36h posle poetka estrusa** u drugoj polovini estrusa u toku estrusa Optimalno vreme VO pri kraju standing estrusa
61
Inseminacija krmae traje due, jer se: (a) ubacuje znatno vea
doza sperme (80-100 ml) i (b) ova doza se rasporeuje u oba roga uterusa, naizmeninim kontrakcijama rogova, u toku 3 do 6 minuta. Vrh katetera se uvodi do zadnje treine cervikalnog kanala, tako da se doza sperme deponuje u telo materice. Pri tome se ne koristi ni vaginalni spekulum, ni rektalna fiksacija cerviksa. Vano je da istiskivanje sperme traje onoliko dugo, koliko krmaa sama usisava spermu!
62
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Kateter za inseminaciju Vaginalni spekulum Telo cerviksa Kanal cerviksa Telo materice Rektum Mokrana beika Sinfiza pelvis
63
64
65
Oocit sa kumulusom (kumulus-oocitarni kompleks), neposredno posle aspiracije iz folikula (levo) i posle 24 sata kultivacije in vitro (zreo oocit, jer se, u perivitelusnom prostoru, nalazi prvo polarno telace) (desno).
66
67