Volumen 64, Broj 10 AKTUELNE TEME

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Strana 707 UDC: 615.015: [575:113:616-08

Nove farmakoterapijske strategije: farmakogenetika i genska terapija

New bearings in pharmacotherapeutic strategies: pharmacogenetics and gene therapy
Leposava Grbovi, Miroslav Radenkovi, Jelena oki, Ljiljana Gojkovi-Bukarica, Gordana J. Dragovi
Medicinski fakultet, Institut za farmakologiju, kliniku farmakologiju i toksikologiju, Beograd

Kljune rei: farmakologija, klinika; farmakokinetika; genom, virusni; polimorfizam; genski, leenje genima.

Key words: pharmacology, clinical; pharmacogenetics; genome, viral; polymorphism, genetic; gene therapy.

Uvod Individualne razlike u farmakolokom odgovoru bolesnika na primenjene lekove dovode do ozbiljnih klinikih problema, od kojih su najvaniji oteano leenje, neeljene reakcije na lekove i interakcije meu lekovima. Sve je vei broj dokaza da su zapaeni induvidualizmi u farmakokinetici i farmakodinamici lekova genetski determinisani i da primarno obuhvataju metabolizam lekova i transportne procese. Dosadanja saznanja bazirana na sakupljenim dokazima jasno pokazuju da rano prilagoavanje terapijskog reima genetskim osobinama bolesnika moe pomoi da se izbegnu neeljena dejstva 1. Ovakav pristup znai individualizovanu, optimalnu terapijsku primenu lekova baziranu na doznom reimu koji je prilagoen individualnom genotipu. Uzimajui u obzir injenicu da meu bolesnicima postoji znaajna razlika u odgovoru na odreenu terapiju, nije jednostavno predvideti tanu efikasnost i bezbednost primene leka. Tako na primer, da bi se postigla adekvatna kontrola krvnog pritska u leenju hipertenzije odreenog bolesnika, esto se mora isprobati vei broj lekova, kao i njihovih kombinacija. Na terapijski odgovor pojedinaca na odreeni lek utie vei broj faktora ukljuujui farmakokinetiku, starost bolesnika, etniku pripadnost, pol, kao i istovremenu primenu drugih lekova 2. I kada se svi ovi faktori uzmu u obzir, to moe biti nedovoljno za predvianje verovatnoe javljanja neeljenih dejstava, kao i efikasnosti leka kod odreenog bolesnika. Identina antihipertenzivna terapija kod dva bolesnika istih demografskih karakteristika, istog stepena teine hipertenzije i sline istorije bolesti, kod jednog bolesnika moe dovesti do eljenog snienja pritiska, a da kod drugog bude bez znaajnijeg uticaja na krvni pritisak 3. Razlike u odgovoru bolesnika na terapiju odreenim lekom primarno se mogu objasniti genetski uslovljenim razli-

kama u metabolizmu leka, njegovoj distribuciji u organizmu i ciljnim proteinima preko kojih lek ostvaruje svoje dejstvo 4. Uticaj naslednih faktora na efikasnost odreenog leka pokazan je jo 1956. godine, kada je utvreno da je u osnovi hemolitike reakcije posle primene antimalarika primakina nasledni deficit enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze 5. Dobro je poznato da genetski uslovljene razlike u sastavu citohroma P450, mogu biti u osnovi interindividualnih varijacija u koncentracijama odreenih lekova u plazmi. Ove razlike mogu imati veliki terapijski znaaj kada su u pitanju lekovi sa malom terapijskom irinom, kao sto su varfarin, fenitoin i merkaptopurin 68. Zadnjih godina posebnu panju privlai veza izmeu dejstva lekova i genetskog polimorfizma transportnih proteina, zatim ciljnih molekula preko kojih lekovi ostvaruju svoja dejstva, kao i receptora, enzima i proteina ukljuenih u intracelularnu signalnu transdukciju. Genetski uslovljene varijacije enzima koji metaboliu lekove, kao i proteina ukljuenih u transport lekova, mogu uticati na raspodelu leka u organizmu, menjajui na taj nain farmakokinetske osobine leka 911 . Izmene na nivou ciljnih proteina mogu dovesti do smanjenog afiniteta prema leku na mestu njegovog dejstva i time uticati na farmakodinamske efekte leka 12, 13. Pored ovoga, utvrena je veza i izmeu gena koji odreuju teinu bolesti i efikasnosti leka, iako nemaju direktan uticaj na farmakokinetske osobine i farmakodinamska dejstva leka. Znaaj farmakogenetike i farmakogenomike Farmakogenetika obuhvata istraivanja genetskih varijacija koje su uzrok razliitog odgovora bolesnika u toku primene istog leka 14. Farmakogenetika se, uglavnom, izjednauje sa pojmom farmakogenomika. Meutim, farmakogenetika se primarno odnosi na monogenske varijacije koje uti-

Correspondence to: Leposava Grbovi, Medicinski fakultet, Institut za farmakologiju, kliniku farmakologiju i toksikologiju, Ul. Doktora Subotia 1, 11 000 Beograd, Srbija. E-mail: gordanadragovic@yahoo.co.uuk

Strana 708

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Volumen 64, Broj 10

u na dejstvo leka, dok se farmakogenomika odnosi na itav spektar gena koji u meusobnoj interakciji odreuju efikasnost i bezbednost leka 15. Na primer, farmakogenetska studija predstavlja istraivanje uticaja gena koji kodira beta-1 receptor na hipotenzivno dejstvo karvedilola 16. Sa druge strane, farmakogenomska studija obuhvata ispitivanje meusobne interakcije gena koji kodiraju CYP2D6, beta-1, beta-2 receptore, kao i njihov uticaj na terapijski efekt karvedilola 17. Danas je veina studija koje ispituju vezu izmeu gena i terapijskog odgovora na lek, u osnovi, farmakogenetska. Meutim, uzimajui u obzir veliki broj proteina koji su ukljueni u dejstvo leka, sve vie istraivaa zauzima farmakogenomski pristup, sa ciljem da razjasni uticaj genetskih varijacija na dejstvo odreenog leka. Generalno, zbog pojednostavljenja ovakvih kompleksnih istraivanja, pojmovi farmakogenetika i farmakogenomika esto se smatraju sinonimima. Cilj farmakogenetike je da optimizuje terapiju i smanji incidenciju neeljenih dejstava leka, koja su posledica razlika u genetskim profilima pojedinaca. Cilj farmakogenetiara je da na osnovu genetskih informacija izaberu lek, dozu leka i duinu trajanja terapije kako bi postigli sto bolji terapijski odgovor kod bolesnika i sveli na minimum neeljena dejstva. Rezultati farmakogenetskih studija omoguie kliniarima da na osnovu genetskih testova predvide odgovar bolesnika na odreenu terapiju, da odaberu odgovarajui lek na osnovu profila njegove DNK i da razviju nove strategije za leenje i prevenciju bolesti. Iako nekoliko godina unazad postoji veliki interes za istraivanje uticaja genskih varijacija na terapijski odgovor bolesnika, farmakogenetika nije nova oblast. Jo 1957. godine, ubrzo nakon otkria da je u osnovi toksinosti primakina genetska predispozicija, Arno Motulsky je pretpostavio da je razliit terapijski odgovor bolesnika posledica razliitog naslea 18 . Dve godine kasnije, Fredrih Vogel je prvi uveo termin farmakogenetika 19. Interesovanje za uticaj genetskih varijacija na dejstvo leka naglo je poraslo zapoinjanjem rada na Projektu genoma (Human Genome Project), 1990. godine. Cilj ovog projekta bio je da se do 2005. godine izvri mapiranje humanog genoma, to bi omoguilo bolje razumevanje genetskih faktora u nastanku i razvoju pojedinih bolesti. U cilju podsticanja daljih istraivanja, svi podaci dobijeni u toku realizacije ovog projekta stavljeni su u bazu podataka Nacionalnog instituta za biotehnoloke informacije SAD, sa besplatnim pristupom. Istraivanja podstaknuta mapiranjem genoma, ubrzala su otkria genetskih varijacija koje utiu na terapiju odreenih bolesti, kao i razvoj novih lekova u humanoj medicini. Zahvaljujui dostignuima biotehnologije, rad na mapiranju humanog genoma zavren je 2000. godine, znatno pre postavljenog roka 20. Aprila 2003. godine, 50 godina nakon to su Fransis Krik i Dejms Votson opisali dvostruki heliks DNK i dve godine pre roka, istraivai su najavili zavretak Projekta humanog genoma 21. Konana verzija sadri 99% genskih sekvencija, sa 99,99% tanosti. Nacionalni institut za istraivanja humanog genoma SAD je nakon zavretka projekta objavio svoju vizuju za budua istraivanja genoma, sa ciljem poboljanja zdravlja i dobrobiti ljudi 22. Jedan od ciljeva je razvoj leenja bolesti i

predvianje terapijskog odgovora na odreeni lek na osnovu poznavanja genoma. To bi podrazumevalo brzo i precizno odreivanje genetskih varijacija koje utiu na odgovor bolesnika na lek usavravanje tehnologije kako bi se smanjila cena tipizacije gena i adekvatna integracija genskog testiranja u terapijsku odluku. Ovakav pristup podstakao je istraivae da razvijaju novi pristup leenju bolesti baziran na poznavanju genoma, a koji zahteva dobro poznavanje genetskih faktora koji utiu na razvoj i leenje bolesti. Vrste genetskih varijacija Genetske varijacije mogu biti posledica retkih genskih defekata ili genetskog polimofrizma, koji se moe definisati kao genetske varijacije koje se u humanoj populaciji javljaju sa uestalou ne manjom od 1% 23. Tako na primer, geni koji kodiraju CYP izoenzime 2A6, 2C9, 2C19, 2D6 i 3A4 su polimorfni i u razliitim etnikim grupama uestalost funkcionalnih mutacija je preko 1% 24, 25. Nasuprot tome, retke mutacije koje su u osnovi naslednih oboljenja, kao to su cistina fibroza, hemofilija i Hantingtonova bolest, javljaju se sa incidencijom manjom od 1%. este bolesti, kao to su esencijalna hipertenzija i dijabetes melitus, u osnovi su poligenske, odnosno posledica su polimorfizma veeg broja gena od ije interakcije zavisi i pojava oboljenja. Polimorfizam gena koji kodiraju enzime ukljuene u metabolizam lekova Polimorfizam enzima ukljuenih u metabolizam lekova predstavlja prvi ispitani i dokazani primer genetskih varijacija, koje za posledicu imaju izmenjeno dejstvo i toksinost leka. Glavni enzimi prve faze metabolizma lekova su izoenzimi CYP superfamilije 26. N-acetiltransferaza, tiopurin-Smetiltransferaza i glutation-S-transferaza su primeri enzima II faze metabolizma lekova koji pokazuju genetski polimorfizam 27, 28. Do sada je kod oveka otkriveno 57 razliitih Shain Slevage Enzime (CYP) izoenzima, od ega 42 metaboliu ksenobiotike, ukljuujui lekove i endogene supstancije kakve su steroidi i prostaglandini 29. Funkcionalni genetski polimorfizam utvren je za CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP3A4/5 30, 31. Dokazan je i polimorfizam regulatornog dela gena koji kodira CYP1A2 32, ali funkcionalni znaaj ove genske varijacije tek treba da se utvrdi. Polimorfizam gena koji kodiraju transportere lekova Razliiti transmembranski proteini olakavaju transport lekova kroz sluzokou gastrointestinalnog trakta, ekskreciju putem ui i urina, kao i prolaz kroz hematoencefalnu barijeru. Genetske varijacije transportnih proteina mogu uticati na raspodelu leka, kao i na koncentraciju leka na mestu dejstva. Najbolje prouen transportni protein koji podlee polimorfizmu usled genskih varijacija je P-glikoprotein 33. On predstavlja transmembransku ATP-zavisnu efluksnu pumpu, a gen koji kodira ovaj protein podlee mutacijama koje vode razvoju rezistencije na lekove (multidrug resistance gen, MDR-1) 34. P-glikoprotein je vaan zbog svoje osobine da aktivno izbacuje iz elije antikancerske lekove i odgovoran
Grbovi L, et al. Vojnosanit Pregl 2007; 64(10): 707713.

Volumen 64, Broj 10

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Strana 709

je za razvoj rezistencije prema razliitim lekovima koji se koriste u terapiji kancera 35, 36. Takoe, utvreno je da se Pglikoprotein nalazi i na velikom broju normalnih elija kakve su intestinalni enterociti, elije proksimalnih tubula bubrega, endotelne elije hematoencefalne barijere 3739. Na ovim elijama P-glikoprotein ima zatitnu ulogu, transportuje toksine supstancije ili metabolite izvan elija. P-glikoprotein utie na transport ne samo lekova koji se koriste u terapiji tumora, ve i digoksina, imunosupresiva ciklosporina i takrolimusa, antiretrovirusnih proteaznih inhibitora 4042. Poveana intestinalana ekspresija P-glikoproteina moe da ogranii resorpciju supstrata ovog transportnog proteina, smanjujui, na taj nain, njegovu bioraspoloivost i oteavajui odravanje terapijskih koncentracija u plazmi 43. Sa druge strane, smanjena ekspresija P-glikoproteina moe dovesti do porasta koncentracija odreenih lekova u plazmi iznad terapijskih i do ispoljavanja toksinosti leka. Polimorfizam gena koji kodiraju ciljne proteine za dejstvo leka Genetski polimorfizam je est meu proteinima koji predstavljaju ciljna mesta dejstva lekova, kao sto su receptori, enzimi i intracelularni glasnici. Geni koji kodiraju ove proteine mogu u sadejstvu sa genima koji odreuju farmakokinetske parametre uticati na konano dejstvo leka. Dosadanja istraivanja pokazala su da polimorfizam gena koji kodiraju pojedine enzime, receptore i intracelularne glasnike utie na odgovor pojedinaca na odreene lekove, to se reperkutuje na efikasnost i bezbednost primenjene terapije. Dobar primer za receptore je polimorfizam gena koji kodiraju adrenergike beta-receptore, jer su ovi receptori opseno ispitivani da bi se utvrdile genetske determinante odgovora pojedinaca na beta-agoniste i beta-antagoniste 44, 45. U fokusu ispitivanja su beta-1 receptori u srcu i bubrezima koji uestvuju u regulaciji krvnog pritiska. Dosadanja saznanja ukazuju da je genetski polimorfizam beta-1 receptora znaajna determinanta odgovora na beta-blokatore i da to moe biti razlog to se kod znaajnog postotka bolesnika sa hipertenzijom beta-blokatorima ne postie adekvatna redukcija krvnog pritiska 46. Najbolji primer za enzime je polimorfizam gena koji kodira angiotenzin konvertujui enzim (ACE) 47, 48. Naime, ACE-inhibitori najee su propisivani antihipertenzivni lekovi, meutim, kod 50% bolesnika ne mogu da dovedu do zadovoljavajueg snienja pritiska 49. U kompleksnom signalnom putu sistema renin-angiotenzin uestvuju brojni proteini i identifikovan je multipli genetski polimorfizam za veinu ovih proteina 50, 51. Smatra se da je u osnovi varijabilnog odgovora na ACE-inhibitore genetski polimorfizam ciljnih proteina 52, 53. Treba naglasiti da je u nastanak neeljenih dejstava lekova takoe ukljuen polimorfizam gena koji kodiraju intraelijske signalne proteine i transportere jona. Primer koji dobro ilustruje korelaciju genetskog polimorfizma i neeljenih dejstava je produenje QT-intervala izazvano lekovima i tosrades de pointes, koji su teka, po ivot opasna neeljena dejstva. Dobro je poznato da mnogi antiaritmijski lekovi mogu izazvati torsades de pointes, kao i neki nekardiovasGrbovi L, et al. Vojnosanit Pregl 2007; 64(10): 707113.

kularni lekovi (terfenadin, astemizol, grepafloksacin, cisaprid) 54, 55. Iz tog razloga bilo je od interesa identifikovati genetske markere koji predisponiraju pojedine osobe za nastanak torsades de pointes 56. Kod kongenitalnog produenja QT-intervala utvene su mutacije gena koji kodiraju proteine za formiranje kalijumskih i natrijumskih kanala u membrani kardijalnih elija 57. U toku su istraivanja iji je cilj identifikacija mutacija povezanih sa torsades de pointes koje izazivaju lekovi. Ovo bi bilo od velikog klinikog znaaja za bolesnike sa genetskom predispozicijom za torsades de pointes, jer bi se izbegli lekovi koji mogu dovesti do ove teke aritmije i bolesnici bi bili leeni alternativnom terapijom 58, 59. Genska terapija Genska terapija predstavlja nameran prenos genetskog materijala u humane somatske elije u profilaktike, terapijske ili dijagnostike svrhe 60. Dok je tehnologija za transfer gena vrlo usavrena, etiki principi vezani za ovaj postupak i dalje su predmet brojnih rasprava. Cilj genske terapije je da koriguje genske defekte i da uspostavi normalnu elijsku funkciju. Veina tehnika genske terapije treba da omogui zamenu defektnih gena onima koji normalno funkcioniu. Egzogeni geni, nazvani transgeni, mogu biti preneti u somatske (organi) ili germinativne (jajna elija, spermatozoidi) elije primaoca. Kod transfera gena u somatske elije, genetske promene se ne prenose na potomstvo. Suprotno, transfer gena u germinativne elije (to je zabranjeno u mnogim zemljama ukljuujui SAD) rezultuje genetskim alteracijama novoroenih 60. Genska terapija bolesti jedno je od najvanijih dostignua medicine, koje prua velike mogunosti za leenje kako naslednih tako i steenih bolesti. Ovom terapijom postiu se ciljne promene na nivou elija, tkiva i organa, produeno dejstvo i poboljanje terapijskog indeksa. Najvanije je da se genskom terapijom uklanja uzrok bolesti. Izuzetna dostignua u molekularnoj medicini i genetici zadnje decenije, omoguila su kliniku primenu tehnologije genskog transfera. Inicijalno, u fokusu genske terapije bile su nasledne bolesti kakve su cistina fibroza, teke imunodeficijencije, hemofilija, anemija srpastih elija, deficit adenozin deaminaze. Ispitivanja genske terapije kasnije su se proirila na steene bolesti, primarno maligne tumore i koronarnu bolest. Iako je prva studija na bolesnicima zapoela 1990. godine, tek je pre nekoliko godina postignut jasan uspeh 6163. Danas se sprovodi preko 600 klinikih studija genske terapije, od kojih se veina (63%) odnosi na terapiju karcinoma. Sistemi za transfer gena Najvea prepreka za razvoj genske terapije kao efikasne klinike metode bilo je pronalaenje pogodnog vektora koji bi preneo genetski materijal u ciljno tkivo. Iako je postignut znatan napredak i razvijeno vie sistema za prenos gena, ovaj problem i dalje predstavlja ograniavajui korak u primeni genske terapije na iri spektar oboljenja. Poeljne karakteristike idealnog vektora su da bude sposoban: da prenese i velike transgene; da in vivo omogui transdukciju aktivnih, kao i

Strana 710

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Volumen 64, Broj 10

elija u mirovanju; da deluje na ciljno tkivo uz minimalno lokalno oteenje; da bude imunoloki inertan; da se integrie u genom elije ili da perzistira u eliji kao epizom unutar nukleusa; da obezbedi kontinuiranu ekspresiju; da podlee posttransdukcijskoj regulaciji; da se moe proizvoditi u velikim koliinama u komercijalne svrhe 64. Idealni vektor bi trebalo da deluje na specifine ciljne elije, bez stimulacije inflamatornog odgovora domaina. Osim toga, trebalo bi da omogui prenos gena razliite duine (duine kodiue sekvencije terapijskih gena se znatno razlikuju i trebalo bi da postoji mogunost ubacivanja regulatornih sekvenciju za transdukciju i ekspresiju) i da se integrie u hromozom elije domaina na tano odreeno mesto ili da ostane u vidu epizoma unutar nukleusa (ne sme se dopustiti da se ugradi nasumice u hromozome domaina, jer bi to znailo poremeenu kontrolu ekspresije) 65. Uslovi za iroku komercijalnu proizvodnju bi takoe trebali da postoje. Vektor sa navedenim osobinama jo uvek nije proizveden. Postojei vektorski sistemi mogu se ukratko podeliti na virusne (npr. adenovirusi, retrovirusi) ili nevirusne (npr. ogoljena DNK, lipozomi). Prednosti korienja nevirusnih vektora su sledee: smanjena imunogenost, laka iroka proizvodnja, jednostavnost korienja i neograniena veliina gena koje mogu prenositi, a nedostaci neadekvatan genski transfer i prolazna ekspresija 66, 67. Virusni vektori su trenutno najefikasniji prenosioci gena, omoguavaju produenu gensku ekspresiju, ali su vrlo imunogeni, postoji ogranienje u pogledu veliine genetskog materijala koji mogu prenositi (zbog veliine virusnog kapsida) i teko je obezbediti sigurnu proizvodnju veeg broja ovih vektora 68, 69. Do danas, primena genske terapije u leenju nekardiovaskularnih oboljenja oslanjala se pre svega na upotrebu virusnih vektora, dok su se u studijama sprovedenim na kardiovaskularnim bolestima koristili nevirusni vektori, pre svega ogoljena DNK ili lipozomi. Virusni vektori Virusi su intracelularni paraziti, najee sa specifinim afinitetom za odreeni tip elija. ivotni ciklus virusa ine dve odvojene faze: infekcija i replikacija. Tokom infekcije, virusni genom se unosi u eliju i ubrzo nakon toga stvara se vea koliina virusnih regulatornih peptida. Neto kasnije, sintetiu se i strukturni proteini, to ima za posledicu stvaranje novih virusnih partikula. Virusni vektori koji se koriste za gensku terapiju imaju izmenjen genom i sadre terapijske gene, umesto, na primer, sekvencija potrebnih za replikaciju virusa. Pojednostavljeno, aktivne regulatorne virusne sekvencije pripojene za terapijske gene unose se u eliju i formira se virusna partikula nesposobna za replikaciju, ali sposobna da prenese eljeni genski materijal u ciljnu eliju 69. Svaki virusni vektor odlikuje se posebnim osobinama koje ga ine pogodnim za terapiju odreenih bolesti. Tako na primer, da bi genska terapija za zaustavljanje rasta tumorskih elija uvoenjem gena supresora rasta bila uspena, neophodan je transfer gena u veliki broj abnormalnih elija 70. Druga strategija podrazumeva primenu gena koji nose informaciju za sintezu proteina, koji mogu vriti konverziju antitumorskih prolekova u toksine hemikalije. Uspenost terapije u

ovom sluaju bila bi omoguena i uvoenjem gena u manji broj elija 71, 72. Trei pristup terapiji tumora podrazumeva primenu onkolitikih virusa, genetski izmenjenih virusa koji se mogu replikovati samo u tumorskim elijama. Rezultat je liza elija 73. Svi virusni vektori mogu se podeliti u dve grupe u zavisnosti od toga da li se geni koje nose integriu ili ne u genom elije domaina. Retrovirusni vektori (ukljuujui lentaviruse) pripadaju prvoj grupi, dok adenovirusni vektori ostaju u vidu epizoma unutar nukleusa elije domaina. Od svih virusnih vektora do danas su se najvie koristili retrovirusi (38%), zatim adenovirusi (25%), ali sve vie se koriste i noviji vektori kao sto su herpes simpleks i pox virusi 74. Nereplikantni virusni vektori (virusni vektori koji nisu selektivni za elije koje se replikuju) su: retrovirusi, adenovirusi, herpes simpleks virusi, pox virus, vakcinija virus i bakulovirus i ostali. Selektivni replikantni virusni vektori Primena virusnih vektora selektivnih za elije koje se brzo dele (replication-selective vectors) dobija sve vei terapijski znaaj u oblasti onkologije. Potreba za novim agensima u terapiji tumora, koji bi imali veu selektivnost za karcinomske elije, veu efikasnost, nove mehanizme dejstva (kako bi se izbegla ukrtena rezistencija sa lekovima koji se trenutno primenjuju) dovela je do razvoja nove kategorije vektora, koji mogu vriti onkolizu ciljnih elija. Poto su selektivni za elije koje se replikuju, njihovom primenom se postie vea koncentracija na mestu patolokih promena, smanjena toksinost, razliiti mehanizmi dejstva za unitavanje elija (indukcija T elija, inflamatornih citokina, toksinih proteina, kao i poveana osetljivost elija), ime se izbegava ukrtena rezistencija sa hemioterapijom ili zraenjem 75. Tokom zadnje decenije u terapiji tumora su kao virusni vektori korieni adenovirusi, herpesvirus i vakcinija. Ovoj listi mogli bi se dodati i virusi sa uroenom selektivnou za tumorske elije, kao sto su reovirus 76, autonomni parvovirusi 77, virus Newcastle oboljenja, virus vezikularnog stomatitisa 78. Selektivnost pomenutih agenasa za tumorske elije dokazana je in vivo i in vitro, nakon intraperitoneumske, intratumorske i intravenske aplikacije. Da bi se proizveo virusni vektor mora se dobro poznavati virusna replikacija, kao patogeneza bolesti. Virusni vektori moraju imati sposobnost da inficiraju kako elije koje se brzo dele, tako i one koje nisu u procesu deobe. Da bi primena vektora bila efikasna, receptori za ulazak virusa u eliju moraju biti eksprimirani na ciljnim tumorskim elijama. Nevirusni sistemi Nevirusni sistemi razvijeni su da bi se izbegli neki bezbednosni problemi vezani za primenu virusnih vektora. Oni su jednostavniji za upotrebu, laki za proizvodnju i ne generiu specifini imuni odgovor 79. Meutim, dosadanja ispitivanja nisu dala zadovoljavajui kliniki uspeh, ali se nastavlja sa istraivanjima. Nevirusni sistemi su: Ogoljena DNK (plazmidi): 1990. godine otkriveno je da egzogeni geni mogu biti eksprimirani posle direktne injeGrbovi L, et al. Vojnosanit Pregl 2007; 64(10): 707713.

Volumen 64, Broj 10

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Strana 711

kcije u mii 80. To je, na primer, dovelo do razvoja DNK vakcine koja stimulie citotoksini odgovor T-limfocita 81. Dosadanja saznanja pokazuju da je dobar genski transfer in vivo sa dugotrajnom ekspresijom u nekim tkivima, ali da je slab u ciljnim tkivima. Katjonski lipidi: to su sintetski geni dobijeni iz kompelsa DNK/lipidi 82. Oni daju dobru transfekciju ex vivo i korieni su za dobijenje CFTR (transmembranski receptor kod cistine fibroze) gena koji je unoen preko nosa i plua bolesnika sa cistinom fibrozom 83. Meutim, ekspresija gena nije bila dovoljno duga za kliniki uspeh. Progres u ovoj oblasti je mali. Molekulski konjugati (kondenzovane DNK partikule) su u razvoju 84. Genska terapija prvobitno je razmatrana u sklopu terapije monogenskih bolesti, kakva je cistina fibroza. U ovom sluaju bi mutirani gen trebalo zameniti zdravim. Meutim, da bi se to izvelo potrebno je pronai vektor koji bi izvrio zamenu gena u velikom broju elija i to bilo zauvek ili na dui vremenski period. Ovakav vektor do danas nije proizveden. Primena genske terapije u leenju kardiovaskularnih bolesti podrazumeva prepoznavanje poremeaja u kojima prolazna genska ekspresija moe biti dovoljna da koriguje poremeaj. Na primer, ekspresija gena tokom svega 23 nedelje moe biti sve to je potrebno da ubrza neovaskularizaciju ili onemogui restenozu. Osim toga, primenom gena koji kodiraju neki protein, a koji se normalno sekretuje u organizmu, moe se iskoristiti njegovo parakrino dejstvo i time prevazii potreba za unoenjem virusnih vektora u veliki broj elija. U nekoliko zadnjih godina postignut je znatan napredak u proizvodnji i obradi virusnih vektora, tako da to vie ne predstavlja glavnu prepreku u odabiru vektora za odreenu

kliniku studiju. Vektori pomenuti u tekstu usvravaju se i vrlo je verovatno da e se nastaviti sa otkriima novih agenasa poboljanih karakteristika. Od posebnog je znaaja regulacija ekspresije gena nakon njihovog unoenja putem vektora u eliju. To bi omoguilo aktivaciju transgena kada je to potrebno, odravanje njihove ekspresije tokom tano definisanog vremena i gaenje. Nije mogue oekivati da se jedan vektor moe primeniti u svim vidovima genske terapije, uzimajui u obzir osobine koje bi trebalo da poseduje. Savremeni koncept primene vektora je sledei: primena adenovirusa u terapiji tumora unoenjem gena zaduenih za onkolizu; ogoljene DNK za vakcinaciju kao i za isporuku gena za angiogenezu u leenju kardiovaskularnih poremeaja; primena AAV gena za terapiju hroninih oboljenja kakva je hemofilija. Zakljuak Slino drugim, novim terapijskim konceptima i genska terapija je puno obeavala, ali za sada je jo u razvoju. Glavni izazov ostaje unoenje pravog gena na pravo mesto, u pravu eliju i obezbeenje adekvatne ekspresije, uz minimalna neeljena dejstva. Iako se najvie radi na virusnim vektorima, smatra se da budunost genske terapije ine znatno bezbedniji nevirusni sistemi. Bilo je izvesnih promaaja u genskoj terapiji, to je dovelo do sumnje i zabrinutosti u iroj populaciji. Meutim, razvoj genske terapije je realnost, kao i injenica da ona ima svoje mesto u medicini. Vano je istai da genskoj terapiji treba pristupati sa izuzetno visokim stepenom naune, strune i etike odgovornosti, jer se ne moe iskljuiti mogunost genetskih manipulacija opasnih za ljudsko zdravlje.

L I T E R A T U R A
1. Evans WE, McLeod HL. Pharmacogenomics drug disposition, drug targets, and side effects. N Engl J Med 2003; 348(6): 53849. 2. Weinshilboum R. Inheritance and drug response. N Engl J Med 2003; 348(6): 52937. 3. Turner ST, Schwartz GL, Chapman AB, Hall WD, Boerwinkle E. Antihypertensive pharmacogenetics: getting the right drug into the right patient. J Hypertens 2001; 19(1): 111. 4. Weber WW. Pharmacogenetics. New York: Oxford University Press; 1997. 5. Alving AS, Carson PE, Flanagan CL, Ickes CE. Enzymatic deficiency in primaquine-sensitive erythrocytes. Science 1956; 124(3220): 4845. 6. Aithal GP, Day CP, Kesteven PJ, Daly AK. Association of polymorphisms in the cytochrome P450 CYP2C9 with warfarin dose requirement and risk of bleeding complications. Lancet 1999; 353(9154): 7179. 7. Mamiya K, Ieiri I, Shimamoto J, Yukawa E, Imai J, Ninomiya H, et al. The effects of genetic polymorphisms of CYP2C9 and CYP2C19 on phenytoin metabolism in Japanese adult patients with epilepsy: studies in stereoselective hydroxylation and population pharmacokinetics. Epilepsia 1998; 39(12): 131723. 8. Relling MV, Hancock ML, Rivera GK, Sandlund JT, Ribeiro RC, Krynetski EY, et al. Mercaptopurine therapy intolerance and heterozygosity at the thiopurine S-methyltransferase gene locus. J Natl Cancer Inst 1999; 91(23): 20018. Grbovi L, et al. Vojnosanit Pregl 2007; 64(10): 707113. 9. Poulsen L, Arendt-Nielsen L, Brosen K, Sindrup SH. The hypoalgesic effect of tramadol in relation to CYP2D6. Clin Pharmacol Ther 1996; 60(6): 63644. 10. Romach MK, Otton SV, Somer G, Tyndale RF, Sellers EM. Cytochrome P450 2D6 and treatment of codeine dependence. J Clin Psychopharmacol 2000; 20(1): 435. 11. Furuta T, Shirai N, Takashima M, Xiao F, Hanai H, Sugimura H, et al. Effect of genotypic differences in CYP2C19 on cure rates for Helicobacter pylori infection by triple therapy with a proton pump inhibitor, amoxicillin, and clarithromycin. Clin Pharmacol Ther 2001; 69(3): 15868. 12. Johnson JA, Zineh I, Puckett BJ, McGorray SP, Yarandi HN, Pauly DF. Beta 1-adrenergic receptor polymorphisms and antihypertensive response to metoprolol. Clin Pharmacol Ther 2003; 74(1): 4452. 13. Drysdale CM, McGraw DW, Stack CB, Stephens JC, Judson RS, Nandabalan K, et al. Complex promoter and coding region beta 2-adrenergic receptor haplotypes alter receptor expression and predict in vivo responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97(19): 104838. 14. Price Evans DA. Genetic factors in drug therapy: clinical and molecular pharmacogenetics. Cambridge: Cambridge University Press; 1993. 15. Evans WE, Relling MV. Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics. Science 1999; 286(5439): 48791.

Strana 712

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Volumen 64, Broj 10

16. Liggett SB, Mialet-Perez J, Thaneemit-Chen S, Weber SA, Greene SM, Hodne D, et al. A polymorphism within a conserved beta(1)-adrenergic receptor motif alters cardiac function and beta-blocker response in human heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(30): 1128893. 17. Wuttke H, Rau T, Eschenhagen T. Genetic polymorphisms in drug metabolizing enzymes--impact on treatment with betablockers. Dtsch Med Wochenschr 2004; 129(15): 8315. (German) 18. Motulsky AG. Drug reactions enzymes, and biochemical genetics. J Am Med Assoc 1957; 165(7): 8357. 19. Vogel F. Moderne Probleme der Humangenetick. Ergebn Inn Med Kinderheilk 1959; 12: 52125. 20. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409(6822): 860921. 21. Human Genome Program. Genomics and Its Impacts on Medicine and Society: A 2003 Primer. Washington, US Department of Energy, 2003. Available from: http://www.web.oral.gov/sci/techn 22. Collins FS, Green ED, Guttmacher AE, Guyer MS; US National Human Genome Research Institute. A vision for the future of genomics research. Nature 2003; 422(6934): 83547. 23. Strachan T, Read AP. Human molecular genetics. 3rd ed. New York: Garland Science; 2004. 24. Marez D, Legrand M, Sabbagh N, Guidice JM, Spire C, Lafitte JJ, et al. Polymorphism of the cytochrome P450 CYP2D6 gene in a European population: characterization of 48 mutations and 53 alleles, their frequencies and evolution. Pharmacogenetics 1997; 7(3): 193202. 25. Andersson T, Regardh CG, Lou YC, Zhang Y, Dahl ML, Bertilsson L. Polymorphic hydroxylation of S-mephenytoin and omeprazole metabolism in Caucasian and Chinese subjects. Pharmacogenetics 1992; 2(1): 2531. 26. Wilkinson GR. Pharmacokinetics: the dynamics of drug absorption, distribution, and elimination. In: Hardman JG, Limbird LE, Gilman AG, editors. Goodman & Gilmans the pharmacological basis of therapeutics. 10th ed. New York: McGraw-Hill; 2001. p. 3143. 27. Price Evans DA. N-acetyltransferase in pharmacogenetics of drug metabolism. In: Kalow W, ed. Pharmacogenetics of drug metabolism. International encyclopedia of pharmacology and therapeutics. New York: Pergamon Press, 1992: 43: 95178. 28. Weinshilboum RM, Otterness DM, Szumlanski CL. Methylation pharmacogenetics: catechol O-methyltransferase, thiopurine methyltransferase, and histamine N-methyltransferase. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999; 39: 1952. 29. Nelson DR. Comparison of P450s from human and fugu: 420 million years of vertebrate P450 evolution. Arch Biochem Biophys 2003; 409(1): 1824. 30. Sata F, Sapone A, Elizondo G, Stocker P, Miller VP, Zheng W, et al. CYP3A4 allelic variants with amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered catalytic activity. Clin Pharmacol Ther 2000; 67(1): 4856. 31. Kuehl P, Zhang J, Lin Y, Lamba J, Assem M, Schuetz J, et al. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nat Genet 2001; 27(4): 38391. 32. Sachse C, Brockmoller J, Bauer S, Roots I. Functional significance of a C-->A polymorphism in intron 1 of the cytochrome P450 CYP1A2 gene tested with caffeine. Br J Clin Pharmacol 1999; 47(4): 4459. 33. Al-Shawi MK, Omote H. The remarkable transport mechanism of P-glycoprotein: a multidrug transporter. J Bioenerg Biomembr 2005; 37(6): 48996. 34. Hennessy M, Spiers JP. A primer on the mechanics of Pglycoprotein the multidrug transporter. Pharmacol Res 2007; 55(1): 115.

35. Turgut S, Yaren A, Kursunluoglu R, Turgut G. MDR1 C3435T polymorphism in patients with breast cancer. Arch Med Res 2007; 38(5): 53944. 36. Mrozikiewicz PM, Seremak-Mrozikiewicz A, Semczuk A, Landt O, Breborowicz GH, Drews K. The significance of C3435T point mutation of the MDR1 gene in endometrial cancer. Int J Gynecol Cancer 2007; 17(3): 72831. 37. Larsen UL, Hyldahl Olesen L, Guldborg Nyvold C, Eriksen J, Jakobsen P, Ostergaard M, et al. Human intestinal P-glycoprotein activity estimated by the model substrate digoxin. Scand J Clin Lab Invest 2007; 67(2): 12334. 38. Zhang WX, Chen B, Zhang W, Chen N, Yu ZC, Cai WM. Effect of MDR1 gene polymorphism on progression of end-stage renal disease. Acta Pharmacol Sin 2007; 28(4): 57983. 39. Bauer B, Hartz AM, Fricker G, Miller DS. Modulation of pglycoprotein transport function at the blood-brain barrier. Exp Biol Med (Maywood) 2005; 230(2): 11827. 40. Comets E, Verstuyft C, Lavielle M, Jaillon P, Becquemont L, Mentre F. Modelling the influence of MDR1 polymorphism on digoxin pharmacokinetic parameters. Eur J Clin Pharmacol 2007; 63(5): 43749. 41. Kotrych K, Sulikowski T, Domanski L, Bialecka M, Drozdzik M. Polymorphism in the P-glycoprotein drug transporter MDR1 gene in renal transplant patients treated with cyclosporin A in a Polish population. Pharmacol Rep 2007; 59(2): 199205. 42. la Porte CJ, Li Y, Beique L, Foster BC, Chauhan B, Garber GE, et al. The Effect of ABCB1 Polymorphism on the Pharmacokinetics of Saquinavir Alone and in Combination with Ritonavir. Clin Pharmacol Ther 2007; [Epub ahead of print] 43. Varma MV, Perumal OP, Panchagnula R. Functional role of Pglycoprotein in limiting peroral drug absorption: optimizing drug delivery. Curr Opin Chem Biol 2006; 10(4): 36773. 44. Jaillon P, Simon T. Genetic polymorphism of beta-adrenergic receptors and mortality in ischemic heart disease. Therapie 2007; 62(1): 17. (French) 45. Yuan M, Ohishi M, Ito N, Sugimoto K, Takagi T, Terai M, et al. Genetic influences of beta-adrenoceptor polymorphisms on arterial functional changes and cardiac remodeling in hypertensive patients. Hypertens Res 2006; 29(11): 87581. 46. Mialet-Perez J, Liggett SB. Pharmacogenetics of beta1-adrenergic receptors in heart failure and hypertension. Arch Mal Coeur Vaiss 2006; 99(6): 61620. 47. Muthumala A, Gable DR, Palmen J, Cooper JA, Stephens JW, Miller GJ, et al. Is the influence of variation in the ACE gene on the prospective risk of type 2 diabetes in middle aged men modified by obesity? Clin Sci (Lond) 2007; [Epub ahead of print] 48. Castellon R, Hamdi HK. Demystifying the ACE polymorphism: from genetics to biology. Curr Pharm Des 2007; 13(12): 11918. 49. Danser AH, Batenburg WW, van den Meiracker AH, Danilov SM. ACE phenotyping as a first step toward personalized medicine for ACE inhibitors. Why does ACE genotyping not predict the therapeutic efficacy of ACE inhibition? Pharmacol Ther 2007; 113(3): 60718. 50. Yu HM, Lin SG, Liu GZ, Zhang YQ, Ma WJ, Deng CY. Associations between CYP11B2 gene polymorphisms and the response to angiotensin-converting enzyme inhibitors. Clin Pharmacol Ther 2006; 79(6): 5819. 51. Franco E, Palumbo L, Crobu F, Anselmino M, Frea S, Matullo G, et al. Renin-angiotensin-aldosterone system polymorphisms: a role or a hole in occurrence and long-term prognosis of acute myocardial infarction at young age. BMC Med Genet 2007; 8: 27. 52. Su X, Lee L, Li X, Lv J, Hu Y, Zhan S, et al. Association between angiotensinogen, angiotensin II receptor genes, and blood pressure response to an angiotensin-converting enzyme inhibitor. Circulation 2007; 115(6): 72532. Grbovi L, et al. Vojnosanit Pregl 2007; 64(10): 707713.

Volumen 64, Broj 10

VOJNOSANITETSKI PREGLED

Strana 713

53. Goldenberg I, Moss AJ, Ryan D, McNitt S, Eberly SW, Zareba W. Polymorphism in the angiotensinogen gene, hypertension, and ethnic differences in the risk of recurrent coronary events. Hypertension 2006; 48(4): 6939. 54. Dubrey SW, Grocott-Mason R. Drug-induced QT prolongation: consequences and current dilemma. Br J Hosp Med (Lond) 2007; 68(1): 501. 55. Fitzgerald PT, Ackerman MJ. Drug-induced torsades de pointes: the evolving role of pharmacogenetics. Heart Rhythm 2005; 2(2 Suppl): S307. 56. Yang P, Kanki H, Drolet B, Yang T, Wei J, Viswanathan PC, et al. Allelic variants in long-QT disease genes in patients with drugassociated torsades de pointes. Circulation 2002; 105(16): 18. 57. Modell SM, Lehmann MH. The long QT syndrome family of cardiac ion channelopathies: a HuGE review. Genet Med 2006; 8(3): 14355. 58. Aerssens J, Paulussen AD. Pharmacogenomics and acquired long QT syndrome. Pharmacogenomics 2005; 6(3): 25970. 59. Kannankeril PJ, Roden DM, Norris KJ, Whalen SP, George AL Jr, Murray KT. Genetic susceptibility to acquired long QT syndrome: pharmacologic challenge in first-degree relatives. Heart Rhythm 2005; 2(2): 13440. 60. Gene Therapy Advisory Dommittee (GTAC) Seventh Annual Report, January 2000December 2000. Available from: http://www.doh.gov.uk/genetics/gtac/gtac7thannualreport.pdf 61. Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, Blair R, Kearney M, Walsh K, et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation 1998; 97(12): 111423. 62. Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P, et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 2000; 288(5466): 66972. 63. Kay MA, Manno CS, Ragni MV, Larson PJ, Couto LB, McClelland A, et al. Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated with an AAV vector. Nat Genet 2000; 24(3): 25761. 64. Recillas-Targa F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Mol Biotechnol 2006; 34(3): 33754. 65. Anderson WF. Human gene therapy. Nature 1998; 392(6679 Suppl): 2530. 66. Li S, Huang L. Nonviral gene therapy: promises and challenges. Gene Ther 2000; 7(1): 314. 67. Gao X, Kim KS, Liu D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. AAPS J 2007; 9(1): E92104.

68. Kay MA, Glorioso JC, Naldini L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nat Med 2001; 7(1): 3340. 69. Osten P, Grinevich V, Cetin A. Viral vectors: a wide range of choices and high levels of service. Handb Exp Pharmacol 2007; (178): 177202. 70. Kimball KJ, Numnum TM, Rocconi RP, Alvarez RD. Gene therapy for ovarian cancer. Curr Oncol Rep 2006; 8(6): 4417. 71. Aghi M, Hochberg F, Breakefield XO. Prodrug activation enzymes in cancer gene therapy. J Gene Med 2000; 2(3): 14864. 72. Cao L, Kulmburg P, Veelken H, Mackensen A, Mezes B, Lindemann A, et al. Cytokine gene transfer in cancer therapy. Stem Cells 1998; 16 Suppl 1: 25160. 73. Heise C, Kirn DH. Replication-selective adenoviruses as oncolytic agents. J Clin Invest 2000; 105(7): 84751. 74. Boeckle S, Wagner E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J 2006; 8(4): E73142. 75. Lo HW, Day CP, Hung MC. Cancer-specific gene therapy. Adv Genet 2005; 54: 23555. 76. Figova K, Hrabeta J, Eckschlager T. Reovirus possible therapy of cancer. Neoplasma 2006; 53(6): 45762. 77. Srivastava A. Parvovirus vectors for human gene therapy. Curr Opin Mol Ther 2001; 3(5): 4916. 78. Coukos G, Courreges MC, Benencia F. Intraperitoneal oncolytic and tumor vaccination therapy with replication-competent recombinant virus: the herpes paradigm. Curr Gene Ther 2003; 3(2): 11325. 79. Wolff J, Lewis DL, Herweijer H, Hegge J, Hagstrom J. Non-viral approaches for gene transfer. Acta Myol 2005; 24(3): 2028. 80. Bertin S, Neves S, Pedroso de Lima M, Pierrefite-Carle V. Naked DNA and lipoplexes applications in cancer gene therapy. Bull Cancer 2007; 94(3): 24352. (French) 81. Bequet-Romero M, Ayala M, Acevedo BE, Rodriguez EG, Ocejo OL, Torrens I, et al. Prophylactic naked DNA vaccination with the human vascular endothelial growth factor induces an antitumor response in C57Bl/6 mice. Angiogenesis 2007; 10(1): 2334. 82. Pietersz GA, Tang CK, Apostolopoulos V. Structure and design of polycationic carriers for gene delivery. Mini Rev Med Chem 2006; 6(12): 128598. 83. Eastman SJ, Scheule RK. Cationic lipid:pDNA complexes for the treatment of cystic fibrosis. Curr Opin Mol Ther 1999; 1(2): 18696. 84. Flotte TR, Laube BL. Gene therapy in cystic fibrosis. Chest 2001; 120(3 Suppl): 124S131S. 85. Benns JM, Kim SW. Tailoring new gene delivery designs for specific targets. J Drug Target 2000; 8(1): 112. Rad je primljen 1. VIII 2007.

Grbovi L, et al. Vojnosanit Pregl 2007; 64(10): 707113.