1

IDENTIFIKASI ASAM AMINO PADA SAMPEL UNKNOWN DENGAN

MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS
Kadek Anggra Suprapta
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha
Email: Dekanggra5@gmail.com
Abstract
The purpose of this lab is to compare the distribution coefficient (Rf) of various amino acids
cysteine, phenylalanine, leucine, glycine, arginine, valine, tryptophan, tyrosine, and determine
the amino acid content of the unknown samples A, B, C, D and E kromatgrafi through the paper
with the ascending technique. In this paper chromatography experiment used a mixture of n-
butanol, distilled water, and glacial acetic acid and phenol as an eluent. In this experiment,
carried out a qualitative analysis of a solution containing several amino acids. From the above
discussion, it can be concluded that: (i) In the experiment using the eluent mixture of n-butanol,
distilled water, and glacial acetic acid, cysteine, phenylalanine, leucine, glycine, arginine,
valine, tryptophan, tyrosine has Rf are respectively - also are 0.37, 0.77, 0.75; 0.24; 0.24; 0.62;
0.50; 0.40. While the Rf of the sample A, B, C, D and E respectively is 0.54; 0.72; 0.83; 0.26;
0.80, it can be identified that contain tryptophan sample A, sample B contained leucine,
phenylalanine-containing sample C, sample D containing glycine and arginine, sample E
contains phenylalanine. (Ii) In experiments using phenol eluent, Rf amino cysteine,
phenylalanine, leucine, glycine, arginine, valine, tryptophan, tyrosine respectively - also is 0.92;
0.94; 0.99; 0.90; 0, 76; 1.00; 0.70; 0.90. While the Rf of the sample A, B, C, D and E,
respectively, 0.84; 0.82; 0.89; 0.57; 0.79, it can be identified that sample A containing tyrosine
or glycine, samplesB contains arginine, sample C containing tyrosine or glycine, tryptophan-
containing sample D, sample E containing arginine.
Keywords: paper chromatography, amino acid, Rf
1. PENDAHULUAN
Kromatografi merupakan suatu metode
pemisahan yang didasarkan atas perbedaan
distribusi komponen sampel diantara dua fasa.
Kromatografi selalu melibatkan dua fasa yaitu
fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak
(mobile phase). Fasa diam dapat berupa
padatan atau cairan yang terikat pada
permukaan padatan (kertas atau adsorben),
sedangkan untuk fasa gerak dapat berupa
cairan yang disebut eluen/pelarut, atau gas
pembawa inert. Gerakan fasa gerak ini
mengakibatkan terjadinya migrasi differensial
komponen-komponen dalam sampel
(Tika,2010).
Dalam kromatografi selalu terdapat salah
satu kecenderungan sebagai berikut; (a)
kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk melarut dalam cairan; (b)
kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk melekat pada permukaan padatan halus;
(c) kecenderungan molekul-molekul
komponen untuk bereaksi secara kimia
(penukar ion); (d) kecenderungan molekul-
molekul tereklusi pada pori-pori fasa diam.
Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan
migrasi zat zat yang menyusun suatu
sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan
untuk keperluan identifikasi untuk analisis
kualitatif, penetapan kadar untuk analisis
kuantitatif, pemurnian suatu senyawa
(Soebagio,dkk.2003).
Ada beberapa macam jenis kromatografi,
salah satunya adalah kromatografi kertas.
Jenis kromatografi ini merupakan bidang
khusus kromatografi cair cair. Fasa diam
berupa lapis tipis cairan yang terserap oleh
kertas. Pengerjaannya sangat sederhana.
Penempatan satu tetes cuplikan pada ujung
kertas dan kemudian mencelupkannya ke
2
dalam pelarut (eluen) sudah cukup untuk
memisahkan komponen komponen
cuplikan.
Kromatografi kertas dapat dilakukan
secara satu dimensi ataupun dua dimensi.
Apabila macam komponen tidak terlalu
banyak, maka cara dua dimensi seringkali
dilakukan. Untuk itu diperlukan dua macam
eluen, yang satu diperlukan untuk ke satu arah
dan yang kedua diperlukan untuk ke arah lain
yang tegak lurus pada arah elusi setelah
kromatografi kertas kering.
Dalam percobaan kromatografi kertas
asam amino ini digunakan teknik ascending.
Pengamatan dalam kromatografi kertas ini
cukup sulit dilakukan mengingat asam amino
yang terlarut tidak menunjukkan warna
tertentu. Untuk mengantisipasi hal ini, maka
setelah elusi dihentikan, posisi eluen ditandai
dengan pensil kemudian kromatografi
dikeringkan dan selanjutnya disemprotkan
larutan ninhidrin. Ninhidrin akan bereaksi
dengan asam amino menghasilkan senyawa
berwarna yaitu coklat dan ungu (Tika.2010).
Setiap komponen memiliki harga R
f
tertentu. Besaran R
f
ini menyatakan derajat
retensi suatu komponen dalam fasa diam. R
f
juga sering disebut faktor retensi. Harga R
f
dapat dihitung sebagai jarak yang ditempuh
oleh komponen dibagi dengan jarak yang
ditempuh eluen (fasa gerak).
dasar garis dari pelarut ditempuh yang Jarak
dasar garis dari sampel ditempuh yang Jarak
R
f

Nilai R
f
dari suatu senyawa pada sistem
kromatografi kertas tergantung pada banyak
variabel di antaranya sistem pelarut,
temperatur, lamanya elusi, dan jenis kertas.
Karena dipengaruhi oleh banyaknya variabel,
maka R
f
suatu senyawa yang sudah diketahui
dijadikan standar atau patokan untuk
menentukan R
f
senyawa lainnya.
Dalam percobaan ini, dilakukan analisa
secara kualitatif suatu larutan yang
mengandung beberapa asam amino, yang
bertujuan untuk mengetahui perbandingan
koefisien distribusi (Rf) dari berbagai asam
amina terutama glisin, leusin, metionin, tirosin
dan triptofan dan menentukan kandungan
asam amino pada sampel melalui
kromatografi kertas dengan teknik ascending.
2. METODE
Eksperimen identifikasi kandungan asam
amino pada sampel unknown dengan
menggunakan teknik kromatografi kertas ini
dilakukan pada tanggal 14 Maret 2014 yang
bertempat di Lab Kimia Organik Undiksha.
Dalam eksperimen ini digunakan alat-alat dan
bahan sebagai berikut: pipa kapiler, ruang
kromatografi, gelas kimia 250 mL, gelas
kimia 100 mL, 2 buah batang pengaduk, 1
buah spatula, 2 buah pipet tetes, 1 buah
penggaris, 1 buah gunting, dan 1 buah heater.
Sedangkan bahan yang digunakan terdiri dari
larutan elusi n-butanol, asam asetat glasial dan
akuades, kertas kromatografi, larutan glisin,
larutan leusin, larutan metionin, larutan
tirosin, larutan triptofan, larutan arginin
larutan valin, larutan fenilalanin, larutan
sampel unknown A, B, C dan D, larutan
ninhidrin, dan larutan fenol.
Prosedur kerja darlam eksperimen ini
adalah sebagai berikut:
Pembuatan Larutan Elusi
Ditambahkan sebanyak 100 mL akuades
kedalam larutan n-butanol 100 mL dan 24 mL
asam asetat glacial. Kemudian ketiga larutan
tersebut ditempatkan ke dalam corong pisah
dan dikocok.
Penyiapan Kertas Kromatografi
Disiapkan kertas kromatografi dengan
ukuran yang disesuaikan dengan wadah
kromatografi kemudian pada bagian sekitar
1,5 cm dari tepi bawah kertas ditandai dengan
pensil.
Proses Kromatografi dengan Eluen Fenol
Kertas kromatografi dengan ukuran 15 x
25 cm ditotolkan dengan larutan asam amino
standar (sistein, fenilalanin, leusin, glisin,
arginin, valin dan tryptophan) dan larutan
sampel unknown A, B, C, D dan E
menggunakan pipet kapiler. Jarak totolan
antara satu dengan yang lain adalah 1,5 cm.
Perlu diperhatikan tiap tetesan harus
dikeringkan terlebih dahulu dengan diangin-
3
anginkan sebelum tetesan berikutnya
ditotolkan. Besar noda hendaknya jangan
melebihi 0,4 cm. Kertas dijaga bersih dan
sedapatnya tidak tersentuh jari. Selanjutnya,
kertas digantungkan dalam ruang
kromatografi selama beberapa jam agar elusi
dapat berjalan. Setelah larutan elusi berjalan
kurang lebih 10 cm dari batas sampel, elusi
dihentikan dan kertas kromatografi
dikeluarkan dari ruang kromatografi.
Kemudian, batas larutan ditandai dengan
pensil dan kertas kromatografi dikeringkan
pada suhu 100-105
o
C. Setelah itu, kertas yang
telah dikeringkan disemprot dengan larutan
ninhidrin yang selanjutnya dikeringkan
kembali dalam oven. Kemudian, diukur jarak
eluen dengan jarak warna yang dibentuk.
Proses Kromatografi dengan Eluen
Campuran N-Butanol, Asam Asetat Glasial
dan Akuades
Siapkan kertas kromatografi dengan
ukuran 15 x 25 cm dan ditandai dengan pensil
1,5 cm dari tepi bawah. Kemudian, dengan
pipa kapiler ditotolkan larutan standar asam
amino dan sampel berdampingan dengan jarak
1,5 cm. Larutan ujung terletak 2 cm dari
pinggir kertas. Setelah itu, tiap-tiap tetesan
harus dikeringkan. Sedangkan besar diameter
totolan adalah 0,4 cm. Kertas kromatografi
harus bersih dan tidak boleh terkena sentuhan
jari, gunakan pinset. Proses elusi dilakukan
setelah ruang kromatografi telah jenuh oleh
uap eluen. Kemudian kertas tersebut
digantungkan dalam ruang kromatografi dan
dicelupkan tepi bawah kertas kromatografi
dalam eluen. Elusi asam amino standar dan
sampel kira-kira eluen menempuh jarak 10
cm. Elusi dihentikan dan ditandai jarak yang
ditempuh oleh eluen dengan pensil. Kertas
kromatografi selanjutnya dikeringkan pada
suhu 105-110
o
C. Kemudian kertas disemprot
dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan
kembali pada suhu 105-110
o
C selama 5 menit.
Noda-noda asam amino yang akan terlihat.
Selanjutnya dapat dihitung harga Rf-nya.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam praktikum ini digunakan
kromatografi kertas untuk mengidentifikasi
asam amino yang terdapat dalam campuran
asam amino. Teknik yang digunakan adalah
teknik ascending. Dalam praktikum ini
digunakan dua eluen yang pertama adalah
eluen fenol dan yang kedua adalah campuran
antara akuades, n-butanol dan asam asetat
glacial. Eluen dengan campuran n-butanol,
akuades dan asam asetat glacial dibuat dengan
cara mencampurkan n-butanol, akuades dan
asam asetat glacial dengan volume masing-
masing 100 mL, 100 mL dan 24 mL. Setelah
itu dilakukan pengocokan dengan
menggunakan corong pisah. Setelah
pengocokan selesai dilakukan, tampak dari
campuran ini membentuk dua lapisan yang
menandakan campuran ini tidak tercampur
secara sempurna. Air dan asam asetat dapat
bercampur secara sempurna mengingat ke dua
campuran tersebut merupakan senyawa
kovalen polar, demikian juga dengan n-
butanol dan asam asetat dapat bercampur
sempurna, ke dua-duanya sama-sama
merupakan senyawa organik Lapisan bawah
yang tidak berwarna digunakan sebagai
penjenuh ruangan kromatografi, sedangkan
lapisan atasnya digunakan sebagai eluen.
Gambar 1. Campuran n-butanol, akuades dan asam amino glasial
4
Tujuan dilakukan penambahan asam
asetat ke dalam campuran n-butanol, akuades
dan asam asetat glacial adalah untuk
mendistribusikan ke pelarut yang tidak saling
bercampur. Air dan n-butanol akan sama-
sama terdistribusi dalam larutan asam asetat
sehingga pada perbandingan volume tertentu,
diperoleh campuran yang mengandung n-
butanol - asam asetat - air dalam satu fasa.
Campuran ini bermigrasi ke seluruh kertas
sehingga komponen polar yaitu air akan
teradsorpsi pada media pendukung (kertas),
dimana komponen penyusun kertas tersebut
adalah selulosa Kemudian dilakukan juga
penjenuhan dengan tujuan mengkondisikan
agar proses kromatografi berjalan lebih cepat
karena ketika udara dalam kromatografi sudah
jenuh begitu pula dengan kertasnya maka
ketika elusi sampel dimulai fokus kerja dari n-
butanol tersebut hanyalah mengelusi
komponen sampel. Dalam hal ini, Air yaitu
pelarut polar bertindak sebagai fasa diam,
sedangkan n-butanol yaitu pelarut non-polar
bertindak sebagai fase gerak.
Setelah itu dilakukan pengujian terhadap
larutan asam amino dengan cara menotolkan
larutan itu pada kromatogram dengan
menggunakan pipa kapiler. Hal yang perlu
diperhatikan dalam proses ini adalah kertas
kromatogram sebaiknya dipegang dengan
menggunakan pinset bukan dengan tangan.
Hal ini bertujuan agar tidak mengganggu
proses kromatografi. Apabila menggunakan
tangan atau kontak dengan tangan, akan
mengganggu proses kromatografi. Keringat
yang dikeluarkan tubuh mempunyai
komponen utama zat organik seperti urea dan
minyak. Senyawa-senyawa organik tersebut
akan ikut bermigrasi sebagai fase non-polar
(gerak) sehingga akan mempengaruhi hasil
pengamatan pada proses kromatografi. Yang
kedua adalah besar noda hasil penotolan
larutan asam amino pada kromatogram
hendaknya jangan sampai melebihi 0,4 cm.
Totolan yang terlalu besar (lebih dari 0,4 cm)
menyebabkan perembesan fase gerak dan fase
diam menjadi tegas. Dengan demikian warna
terdeteksi menyebar. Setiap menotolkan
larutan yang akan diuji, keringkan totolan
tersebut baru selanjutnya menotolkan kembali
larutan lain yang akan diuji. Hal ini bertujuan
agar antara larutan satu dengan yang lain tidak
bercampur.
Kertas kromatografi ini kemudian
dimasukkan ke dua ruang kromatogram yang
pertama berisi eluen fenol dan yang kedua
berisi campuran n-butanol, akuades dan asam
asetat glasial. Ketika ruang kromatografi dan
kertas telah jenuh maka elusi dapat dimulai.
Elusi dihentikan setelah eluen bergerak
dengan menempuh jarak 10 cm. Proses yang
terjadi selama elusi adalah Eluen (fenol atau
campuran n-butanol, asam asetat dan akuades)
akan bermigrasi ke seluruh kertas. Komponen
polar dari campuran ini (air) akan teradsorpsi
pada media pendukung kertas, dimana
komponen penyusun kertas adalah selulosa.
Kemudian terjadilah suatu interaksi antara
serat-serat selulosa dengan uap air sehingga
timbul suatu kompleksitas. Dengan adanya
adsorpsi molekul air pada permukaan kertas
ini akan menghasilkan ribuan noda-noda kecil
(spot) yang teradsorpsi pada media
pendukung. Noda-noda kecil (spot) ini
kemudian dilewati oleh fasa gerak, yaitu
komponen nonpolar pada eluen (fenol dan n-
butanol) dengan arah ke atas (ascending)
sehingga pemisahan sampel campuran terjadi.
Setelah eluen bergerak dengan jarak
tempuh kurang lebih 10 cm, maka proses elusi
dihentikan dan kertas kromatografi
dikeluarkan dari ruang kromatografi.
Selanjutnya, kertas kromatografi ini
dikeringkan dalam oven dengan suhu 105
o
C.
Setelah itu dilakukan penyemprotan dengan
menggunakan laruta Ninhidrin, timbul warna
ungu kebiruan yang mengindikasikan adanya
asam amino yang terdistribusi. Dalam hal ini
terjadi reaksi antara asam amino dan
Ninhidrin.
5
Gambar 2.
O
O
OH
OH
+
O
O
OH
NH CHR
C O
O H
-CO
2
-
H
2
O
H
2
NCHROO
2
H
-H
2
O
100
o
C
Ninhidrin
O
O
-
+NH CHR
H
2
O
RCHO
+
O
O
NH
2
Ninhidrin
O
O
N
HO
O
O
-H
2
O
O
O
-
N
O
O
Gambar 3. Persamaan reaksi asam amino dengan ninhidrin
Jarak yang ditempuh oleh setiap asam
amino dari garis dasar dan jarak tempuh
pelarut/eluen diukur. Sehingga dari sini harga
R
f
dapat dihitung. R
f
merupakan perbandingan
jarak yang ditempuh oleh sampel dari garis
dasar dengan jarak yang ditempuh eluen dari
garis dasar. Harga R
f
dapat dihitung setelah
timbul noda pada kertas kromatografi. Rumus
perhitungannya adalah sebagai berikut
dasar garis dari eluen ditempuh yang Jarak
dasar garis dari komponen ditempuh yang jarak
f
R
diketohidrindilidena-
diketohidrindamida
(pigmen warna biru-ungu)
(a) Hasil kromatografi kertas dengan eluen fenol; (b) Hasil kromatografi kertas
dengan eluen fenol
(a) (b)
6
Dalam praktikum ini ada delapan asam
amino yang akan ditentukan harga R
f
nya
yaitu triptofan, leusin, tirosin, metionin,
sistein, fenilalanin, arginin, dan glisin serta
lima sampel unknown (A, B, C, D dan E) yang
akan ditentukan kandungan asam aminonya.
Berdasarkan hasil eksperimen dan rumus di
atas, maka dapat dibuat tabel sebagai berikut:
Tabel 1. Jarak tempuh komponen dan eluen serta nilai R
f
Sampel
Eluen Fenol
Eluen Campuran n-Butanol, Akuades, dan
Asam Asetat Glasial
Jarak
Tempuh
Komponen
(cm)
Jarak
Tempuh
Eluen (cm)
R
f
Jarak Tempuh
Komponen (cm)
Jarak
Tempuh
Eluen
(cm)
R
f
Sistein 10,5 11,4 0,92 3,7 10 0,37
Fenilalanin 10,7 11,4 0,94 7,7 10 0,77
Leusin 11,3 11,4 0,99 7,5 10 0,75
Glisin 10,3 11,4 0,90 2,4 10 0,24
Arginin 8,7 11,4 0,76 2,4 10 0,24
Valin 11,4 11,4 1,00 6,2 10 0,62
Tryptophan 8 11,4 0,70 5 10 0,50
Tyrosin 10,3 11,4 0,90 4 10 0,40
A 10,6 12,6 0,84 5,4 10 0,54
B 10,4 12,6 0,82 7,2 10 0,72
C 11,2 12,6 0,89 8,3 10 0,83
D 7,2 12,6 0,57 2,6 10 0,26
E 10 12,6 0,79 8 10 0,8
Dari tabel di atas, dengan
membandingkan nilai R
f
dari larutan asam
amino standar dengan sampel A, B, C, D dan
E, maka kandungan asam amino yang
terkandung di dalam sampel A, B, C, D dan E
dapat ditentukan. Dari tabel di atas dengan
menggunakan eluen eluen campuran n-
butanol, akuades lalu membandingkan nilai
Rfnya dengan sampel, maka dapat
diidentifikasi bahwa sampel A mengandung
tryptophan, sampel B mengandung leusin,
sampel C mengandung fenilalanin, sampel D
mengandung glisin dan arginin, sampel E
mengandung fenilalanin.
Sedangkan dengan menggunakan eluen
fenol lalu membandingkan nilai Rfnya dengan
sampel, maka dapat diidentifikasi bahwa
sampel A mengandung tyrosin atau glisin,
sampel B mengandung arginin, sampel C
mengandung tirosin atau glisin, sampel D
mengandung triptophan, sampel E
mengandung arginin.
4. SIMPULAN
Dari pembahasan di atas, maka
dapat disimpulkan bahwa: (i) Pada percobaan
dengan menggunakan eluen campuran n-
butanol, akuades, dan asam asetat glasial,
asam amino sistein, fenilalanin, leusin, glisin,
arginin, valin, tryptophan, tirosin memiliki
harga R
f
yang berturut turut yaitu 0,37;
0,77; 0,75; 0,24; 0,24; 0,62; 0,50; 0,40.
Sedangkan harga R
f
dari sampel A, B, C, D
dan E berturut-turut yaitu 0,54; 0,72; 0,83;
0,26; 0,80, maka dapat diidentifikasi bahwa
sampel A mengandung tryptophan, sampel B
mengandung leusin, sampel C mengandung
fenilalanin, sampel D mengandung glisin dan
arginin, sampel E mengandung fenilalanin.
(ii) Pada percobaan dengan menggunakan
eluen fenol, harga R
f
amino sistein,
fenilalanin, leusin, glisin, arginin, valin,
tryptophan, tirosin berturut turut adalah
0,92; 0,94; 0,99; 0,90; 0,76; 1,00; 0,70; 0,90.
Sedangkan harga R
f
dari sampel A, B, C, D
dan E berturut-turut adalah 0,84; 0,82; 0,89;
7
0,57; 0,79, maka dapat diidentifikasi bahwa
sampel A mengandung tyrosin atau glisin,
sampel B mengandung arginin, sampel C
mengandung tirosin atau glisin, sampel D
mengandung triptophan, sampel E
mengandung arginin.
5. UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
dosen pengampu mata kuliah Praktikum
Biokimia, Kadek Dewi Wirmandianthy, S.Pd
selaku asisten dosen, dan I Dewa Subamia
selaku laboran di Jurusan Pendidikan Kimia
atas masukan dan sarannya sehingga
percobaan ini dapat dilaksanakan dengan baik.
6. REFERENSI
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun praktikum
Biokimia. Singaraja: Universitas
Pendidikan Ganesha
Chairil Anwar, dkk. 1994. Pengantar
Praktikum Kimia Organik.
Yogyakarta: Departemen Pendidikan
dan Kebudayaan
Thenawijaya, Maggy. 1982. Dasar-Dasar
Biokimia jilid 1. Jakarta: Erlangga
Redhana. 2010. Penuntun Pratikum Biokimia.
Singaraja: Universitas Pendidikan
Ganesha