Professional Documents
Culture Documents
บทปฏิบัติการที่ 3 เทคนิคทางชีวเคมี
บทปฏิบัติการที่ 3 เทคนิคทางชีวเคมี
เทคนิ คทางชีวเคมี
1. การทำาให้เซลล์แตก
(Cell lysis)
2. การทำาไดอะไลซิส
(Dialysis)
3. โครมาโทกราฟี
(Chromatography)
4. อิเล็กโทรโฟรีซิส (Electrophoresis)
การทำาให้เซลล์แตก (Cell lysis)
ส่วนของเซลล์ท่ีตอ ้ งทำาให้แตก
เยื่อห้ม
้ เซลล์
การทำาให้เซลล์แตก มี 3 วิธี
1. ทางกายภาพ (Mechanical
Homogenization)
2. ทางเคมี (Chemical)
3. ทางชีวภาพ (Biological)
1. ทางกายภาพ (Mechanical)
1.1 Mechanical
Homogenization
Mortar and Pestle
Pestle
Homogenizer
Glass Bead
Homogenizer
ElectricalDisintegration
1.2 Thermal
Homogenizer
Freezing and Thawing
1.3High
SonicPressure Extrusing
Disintegration
1.1 Mechanical Homogenization
Mortar and
Pestle
Pestle
Homogenizer
Electrical Homogenizer Sonic Homogenizer
2. ทางเคมี (Chemical)
การแยกสารขนาดเล็กและขนาดใหญ่ออกจากกัน โดยผ่าน
สารบางชนิ ดผ่านได้ (Permeable Membrane)
มใช้แยกสารละลายเกลือแร่ออกจากสารชีวโมเลก้ลขนาดให
คลีอิก โปรตีน และคาร์โบไฮเดรต
1. ขนาดและร่ปร่าง
2. อ้ณหภ่มิ
3. เวลา
โครมาโทกราฟี (Chromatography)
Stationary Phase
Separation
Mobile Phase
Mixtu Compon
re ent
Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase
Black
Red
Yellow
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ
PC chromatogram
The final
chromatogram can be
compared with other known
mixture chromatograms to
identify sample mixes.
Compounds can be
identified by calculating Rf
(Retention).
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ
ค้ณสมบัติของค่า Rf
1. ค่า Rf ไม่มห
ี น่วย
2. ค่า Rf หาได้จากการทดลองเท่านั้ น
3. ค่า Rf มีค่าไม่เกิน 1
4. ค่า Rf ขึ้นอย่่กับชนิ ดของสารและชนิ ด
ของตัวทำาละลาย
5. ค่า Rf เป็ นค่าเฉพาะค่าคงที่ของแต่ละ
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ
1. มีสีเดียวกัน
2. มีค่า Rf เท่ากัน
3. มีระบบการทดลองเดียวกัน
าโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ
ข้อจำากัดหรือข้อเสียของวิธีโครมาโทกราฟี แบบกระดาษ
องการจะแยกออกจากกันมีความสามารถในการละลายในต
ละถ่กด่ดซับด้วยตัวด่ดซับเท่ากันไม่สามารถแยกออกจากกัน
จะเคลื่อนที่ไปพร้อมกันด้วยระยะทางเท่ากัน
วิธีแก้ไข
1. เปลี่ยนชนิ ดของตัวทำาละลาย
2. เพิ่มระยะทางของตัวด่ดซับให้ยาวขึ้น
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ (Nom-column Chromatography)
แยกสารตามความสามารถในการด่ดซับของสาร
ที่มต
ี ่อตัวกลางคำ้าจ้น
ส่วนคงที่ (Stationary Phase) อะล่มินา, ซิลิกาเจล,
แคลเซียมไฮดรอกไซด์
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase) เฮกซีน เบนซีน อีเทอร์
คลอโรฟอร์ม
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์
2) Ion-exchange Chromatography
แยกสารตามชนิ ดของ
ประจ้
ส่วนคงที่ (Stationary Phase) เรซิน
(Resin) ที่มป
ี ระจ้
เรียกว่า ตัวแลกเปลี่ยนประจ้ (Ion -
exchanger)
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase) ตัวทำา
ละลาย หรือบัฟเฟอร์
าโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Ion-exchange Chromatography
ตัวแลกเปลี่ยนประจ้ (Ion-exchanger)
ราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Ion-exchange Chromatography ---> ตัวแลกเปลี่ยนประจ้
ราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Ion-exchange Chromatography ---> ตัวแลกเปลี่ยนประจ้
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์
แยกสารตามขนาด
โมเลก้ล
ส่วนคงที่ (Stationary Phase) เจล
สังเคราะห์ (เป็ นสารพวก
Polysaccharide) เช่น Sephadex, Sepharose,
Bio-gel
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase) ตัวทำา
ละลาย หรือบัฟเฟอร์
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์
4) Affinity Chromatography
แยกสารโดยอาศัยการจับกันอย่างจำาเพาะเจาะจง
กันของสาร
เช่น แอนติเจน – แอนติบอดี, เอนไซม์- ซับส
ส่วนคงที่ (Stationary เตรต
Phase) ติดโมเลก้ล
ชนิ ดใดชนิ ดหนึ่ งเข้า กับตัวกลางคำ้าจ้น
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase) ตัวทำา
ละลายหรือบัฟเฟอร์
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์
5) Gas-Liquid Chromatography
Chromatogram
แยกสารได้ท้กชนิ ด ทั้งที่ละลายได้ในนำ้าและใน
ตัวทำาละลายอินทรีย์
ส่วนคงที่ (Stationary Phase)
คอลัมน์ขนาดเล็กแต่ยาว บรรจ้ด้วย
ตัวกลางคำ้าจ้นที่ทำาด้วยพลาสติกหรือแก้ว
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase) ตัวทำา
ละลาย
โทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> High Performance Liquid Chromatography
อิเล็กโตรโฟรีซิส (Electrophoresis)
หลักการ
เป็ นการแยกและวิเคราะห์สารชีวโมเลก้ลที่มีประจ้
ภายใต้สนามไฟฟ้ า
สารที่มป
ี ระจ้บวกจะเคลื่อนที่เข้าหาขั้วลบ ประจ้
ลบเคลื่อนที่เข้าหาขั้วบวก
โดยความเร็วในการเคลื่อนที่ของสาร
ขึ้นอย่่กับ ค่าความแรงของสนามไฟฟ้ าและ
ประจ้ส้ทธิของโมเลก้ล
หลักการทำางานของ
Electrophoresis
จ้ดเริม
่ ต้น
+ - -
-2
Catio +3 Anio
n n
ประจ้=
0
Electrophoresis
2. Environment factors
• Electric field strength
• Supporting media (pore: sieving effect)
• Running buffer
Electrophoresis
อ้ปกรณ์พื้นฐานของเทคนิ คอิเล็กโทรโฟรีซิส
1. เครื่องจ่ายกระแสไฟฟ้ า (Power
supply)
2. ตัวกลางคำ้าจ้น (Supporting
medium)
3. สารละลายบัฟเฟอร์ (Buffer
solution)
4. ภาชนะอิเล็กโทรโฟรีซส
ิ
Electrophoresis
ชนิ ดของอิเล็กโทรโฟรีซิส
1. อิเล็กโทรโฟรีซส
ิ แบบกระดาษ (Paper Electrophoresis)
2. อิเล็กโทรโฟรีซส
ิ แบบเซลล่โลสอะซิเตต (Cellulose
Electrophoresis)
3. อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบแป้ งเจล (Starch Gel
Electrophoresis)
4. อิเล็กโทรโฟรีซส
ิ แบบพอลิอะคริลไมด์เจล
(Polyacrylmide Gel Electrophoresis)
5. อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเอสดีเอส–พอลิอะคริลาไมด์เจล
(SDS-Polyacrylmide Gel Electrophoresis)
Electrophoresis
ตัวกลางคำ้าจ้นคือ กระดาษกรอง
นิ ยมใช้แยกสาร โมเลก้ลขนาดเล็ก
เช่น กรดอะมิโน เพปไทด์
เส้นสั้นๆ และนิ วคลีโอไทด์
Electrophoresis
ตัวกลางคำ้าจ้นคือ แผ่นเซลล่โลสอะ
ซิเตต
นิ ยมใช้แยกสาร โปรตีนใน
พลาสมา และซีรม
ั
Electrophoresis
ทรโฟรีซส
ิ แบบพอลิอะคริลไมด์เจล (Polyacrylmide Gel Electroph
ตัวกลางคำ้าจ้นคือ พอลิเมอร์ของอะคริลาไมด์
และ บิสอะคริลาไมด์
นิ ยมใช้แยกสาร ชีวโมเลก้ลขนาดใหญ่ เช่น
โปรตีน กรดนิ วคลีอิก
ectrophoresis ---> Polyacrylmide Gel Electrophoresis
Polyacrylamide Gels
Acrylamide polymer; very stable gel
can be made at a wide variety of
concentrations
gradient of concentrations: large variety of
pore sizes (powerful sieving effect)
Electrophoresis
5. อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเอสดีเอส–พอลิอะคริลาไมด์เจล
(SDS-Polyacrylmide Gel Electrophoresis)
ตัวกลางคำ้าจ้นคือ พอลิอะคริลาไมด์
นิ ยมใช้แยกสาร แยกโปรตีนตามความแตก
ต่างของขนาด โมเลก้ลหรือนำ้าหนั กโมเลก้ล
Electrophoresis
ตัวกลางคำ้าจ้นคือ อะกาโรสที่ต้มกับบัฟเฟอร์
ทิ้งให้เย็น ได้เป็ นเจล
นิ ยมใช้แยกสาร แยกโปรตีนขนาดใหญ่ และ
กรดนิ วคลีอิก
ectrophoresis ---> Agarose Gel Electrophoresis
Agarose Gel
purified large MW
polysaccharide (from
agar)