proteina, peptida, aminokarboksilnih kiselina, oligonukleotida i drugih molekula s

nabojem. 'Eluiranje se postie ponitavanjem jonskih interakcija promjenom jonske

jakosti ili promjenom pH proteina.
afirsitetna kromatografi ja - se zasniva na sposobnosti proteina da veu odreene
male molekule. Molekula supstrata odabranog enzima se vee kovalentno za odreeni
nosa (stacionarna faza), koji se stavi u kolonu. Tako se iz proteinske otopine koja se
proputa kroz kolonu sa odreenom stacionarnom fazom vee samo pripadni enzim.
kromatografi ja iskljuenjem - stacionarna faza je polisaharidni gel koji djeluje kao
molekulsko sito. Unutar estica gela nalaze se vodom ispunjene upljine u koje mogu
prodrijeti samo male molekule i one srednje veliine, a velike su iskljuene. Kada se gel
ispire otapalima, molekule koje su prodrle u upljine difuzijom opet mogu izai.
kiralna kromatografi ja - koristi se za odjeljivanje enantiomera na kiralnoj
stacionarnoj fazi u koloni. Kada se smjesa dva enantiomera propusti kroz kolonu jedan
enantiomer e bolje prijanjati (razliite interakcije koje nastaju zbog jedinstvene
prostorne orjentacije molekule enantiomera) od drugog na stacionarnu fazu te e se tako
odijeliti iz smjese.
3.5.1. Tankoslojrsa kromatografija
Odjeljivanje se kod TLC (engl. Thin Layer Chromatographv) temelji na adsorpciji ili
razdjeljenju. Najee se koristi adsorpcijska kromatografija na tankom sloju adsorbensa
(stacionarna faza) nanesenom na staklenu plou. Debljina sloja adsorbensa ovisi o namjeni
kromatografije. Kao adsorbensi preteno se upotrebljavaju silikagel, aluminijev oksid i dr.
Najjednostavnija izvedba je tzv. "uzlazna kromatografi ja", slike 25 i 26.
Tankoslojnom kromatografijom moe se doznati broj komponenti u smjesi. Upotrebljava
se i za praenje reakcije (nestajanje reaktanata i stvaranje produkata). Tankoslojnom
kromatografijom moe se pronai otapalo optimalne polamosti za razdvajanje komponenti
kromatografijom na stupcu. Moe se upotrebljavati i u preparativne svrhe, gdje se upotrebljavaju
preparativne ploe s debljim, slojem krutog adsorbensa. Nakon nanoenja, razvijanja i detekcije
zone s komponentama od interesa, slojevi na kojima se nalaze pojedine komponente se odijele s
ploe i ekstrahiraju pogodnim otapalom.
Osnovne faze rada kod tankoslojne kromatografije su:
(a) Nanoenje uzorka
Uzorak se otopi u otapalu s niskim vrelitem, otopina se tokasto nanese kapilarom na
startnu liniju koja je udaljena 1,5 - 2 em od ruba ploice i osui; mrlja treba biti to manja*
Startna linija ne smije biti uronjena u razvija kada se ploica stavi u kadu za kromatografiju.
(b) Razvijanje fcromatograma
Ploica se postavi u kadu za kromatografiju s pogodnim razvijaem (mobilna faza).
Pomou kapilarnih sila mobilna faza die se uz ploicu i eluira sastojke smjese; ova faza naziva
se razvijanje kromatograma. Korisno je prethodno uroniti komad filter-papira (veliine ploice) u
razvij a, kako hi se prostor u kadi za kromatografiju zasitio parama razvijaa (zbog dizanja
razvijaa kapilarnim silama uz papir). Nakon izvlaenja ploice iz kade olovkom se oznai
poloaj otapala (frontna linija) i zatim se ploica osui.
r
- front
. start
otapalo
Slika 25. Razvijanje kromatograma
(c) Obrada kromatograma
Mrlje obojenih tvari razdijeljene du ploice se mogu vidjeti na dnevnom svjetlu.
Bezbojne tvari se promatraju pod ultraljubiastim svjetlom (ukoliko sadre pogodne skupine) ili
se detektiraju pomou odreenih reagensa ("izazivanje kromatograma"). Osnovni kriterij za
i
i t
identifikaciju pojedinog spoja je njegova pokretljivost na tankome sloju, to se izraava pomou
Rf vrijednosti; to -je omjer prijeenog puta tvari (x) i prijeenog puta otapala (y): Rp =x l y.
Primjeri prorauna Rf vrijednosti (slika 26): Rf (1) =34 / 60 =0,57; Rf(2) =22 i 60 =0,37;
i =54 / 60 =0,9.
TLC ploica u
poetku razvijanja
TLC ploica nakon TLC ploica nakon
razvijanja razvijanja i suenja
odreivanje Rp
vrijednosti
Slika 26, Tankoslojna uzlazna kromatografija
Postupak radai
Na komerci j al noj pl oici za tankosl oj nu kromatografi j u sa sl oj em si l i kagel a pri stupi se
nanoenj u uzorka (a), razvi j anj u kromat ograma (b), te obradi kromat ograma (c).
Uzorak za tankosl oj nu kromatografi j u j e smj esa boj a i to 10 mg sudan bl ack
(Fl uka) i 20 mg sudan red (Fl uka) otopl j eni h u 1 m l smj ese p et r o l et er : et i l -acet at = 7 :
3 (v/v). St aci onarna f aza j e si l i kagel nanesen u sloju (0,2 mm) na stakl enu ili alumi ni j sku
ploicu (Merck), a mobi l na f aza j e smj esa pet r ol et er : et i l -acet at = 7 : 3 (v/v).
3.5.2. Kromatografija na stupcu
Dok se tankoslojna kromatografija (TLC) upotrebljava preteno za identifikaciju sastojaka
smjese (analitika kromatografija), kromatografija na stupcu (CC, engl. Column
56
Chromatographv) rabi se za njihovo odjeljivanje (preparativna kromatografija). To je preteno
adsorpcijska kromatografija u kojoj se kao stacionarna faza upotrebljavaju najee silikagel ili
aluminijev oksid, a mobilna faza protjee kolonom utjecajem gravitacije ili razlike tlakova,
Kromatografija na stupcu moe biti i kiralna ukoliko se upotrijebi kiralna stacionarna faza, te
tada moe posluiti za odjeljivanje racemine smjese. Takoer i ostale vrste kromatografije (s
razliitim mehanizmima razdvajanja) se mogu provoditi kao kromatografija na stupcu.
Osnovni dio aparature za kromatografiju na stupcu je vertikalna staklena cijev (kolona, I)
odreenog promjera i visine (slika 27). Na dnu cijevi se nalazi ploica od sinteriranog stakla,
koja zadrava stupac sorbensa i pipac za reguliranje protoka razvijaa (mobilna faza). Lijevak za
dokapavanje (2) spojen je na gornji dio kolone, a slui za dodavanje razvijaa (mobilna faza).
Osim aktivnosti sorbensa, za uspjeno odjeljivanje, veoma je vana njegova granulacija, visina
stupca u koloni, protok i polamost razvijaa, temperatura i si.
Kod asorpcijske kromatografije na stupcu, nakon nanoenja uzorka na vrh stupca u
koloni, proputa se razvija odreenom brzinom. Tvari se asorbiraju na stacionarnu fazu
(sorbens), a razvija (eluens) otapa tvari i ispire ih (eluira) sa stupca sorbensa. Kapljevina koja
izlazi iz kolone .naziva se eluaf Tvar se .raspodjeljuje izmeu eluensa i sorbensa, to znai da se
dio tvari otopi, u razvij au, a dio tvari, ostane adsorbiran na stupcu. Kak o se razvij a kree, odnosi
otopljenu tvar, ravnotea se poremeti, i kako hi se ponovno uspostavila otapa se nova koliina
tvari u svjee pristiglom otapalu. S druge strane razvij a odnosi tvar u dio stupca sorbensa na
kojem jo nema adsorbirane tvari, pa se ravnotea uspostavlja adsorbiranjem dijela tvari na
stacionarnu fazu, Razliite tvari imaju razliite koeficijente razdiobe, putuju razliitim brzinama
stupcem i na tome se temelji razdvajanje komponenti. Brzina putovanja ovisi o jakosti vezivanja
tvari na sorbens i topljivosti te tvari u mobilnoj fazi.
Kruti sorbens je obino polaran (npr. silikagel) i zato utjecajem nepolame mobilne faze
nepolame tvari putuju bre, dok e polarne ostati vezane za stacionarni] fazu. Dakle sa stupca
polarnog sorbensa redovito se uklanjaju najprije nepolame tvari, tako eluiranje obino kree s
nepolarnim otapalom, a zatim se postepeno poveanjem polarnosti eluiraju polarne tvari (tablica
2). U "eluotropnom nizu1*su poredana uobiajena otapala po rastuoj polarnosti (tablica 1).
Tablica L Kratki eluotropni niz
Ot apalo....................... Pol arnost
petroleter
cikloheksan
tetraklorugljik
benzen
dietil-eter
etil-acetat
piri din
aceton
etanol
voda
Tablica 2 Brzina eluiranja nekih tvari
Tvar ..............................Brzi na el ui ranj a
ugljikovodici
olefini 4%
eteri
halogenalkani
aromatski spoj evi
ketoni
aldehidi
esteri
alkoholi
amini
karboksiIne kiseline

Osnovne faze rada za adsorpcijsku kromatografiju na stupcu su:

a) Priprema stupca u koloni
Na ploicu od sinteriranog stakla na dnu staklene kolone (ili ukoliko je nema) stavi se
tanki sloj vate ili samljevenog filtar-papira. U kolonu se najprije doda nekoliko mililitara
razvi jaa, a zatim se paljivo, kroz lijevak, dodaje sorbens (stacionarna faza) koji je prethodno
suspendiran u istom razvijau. Masa potrebnog sorbensa ovisi o koliini i sloenosti tvari u
smjesi, a obino mora biti 25 - 30 puta vea od mase smjese. Kolona treba biti jednoliko
napunjena, bez mjehuria zraka, kako hi protok razvijaa bio svugdje jednak. Pipao na dnu
kolone tijekom pripreme stupca mora biti otvoren, kako bi stalan protok razvi jaa osigurao
homogeniziranje i zbijanje sloja sorbensa. Ukoliko je potrebno staklena kolona se moe lagano
potresati kako bi se izdvojili mjehurii zraka. Stupac u koloni je formiran kada vie nema
promjene u njegovoj visini tijekom prolaza razvijaa, a gornji sloj sorbensa je homogen i
kompaktan. Tijekom formiranja stupca u koloni, stupac nikada ne smije ostati suh (bez razvij aa)
zbog ulaska zraka u stupac.
b) Nanoenje uzorka.
Uzorak otopljen u 1- 2 ml, razvij aa se dodaje na vrh kolone uz pomo duge kapilare ili
pipete. Pri tome treba paziti da se to manje uzorka zaostane na stijenkama staklene kolone.
Ukoliko nije mogue nai pogodno otapalo za uzorak (koje nee smetati kromatografskom
procesu), tada se uzorak moe otopiti u malom volumenu metanola ili etanola, te mu se doda
nekoliko grama silikagela. Zatim se otapalo upari na rotacijskom vakuum uparivau i tako se
uzorak adsorbira na silikagel. Tako adsorbirani uzorak se doda preko suhog lijevka na vrh
pripremljenog stupca sorbensa u koloni. Pri tome gornji dio kolone treba potresati, kako bi se
uklonili mjehurii zraka. Uzorak mora biti homogeno rasporeen na vrhu kolone. Nakon
nanoenja uzorka, doda se malo razvij aa, te se iznad uzorka sta vi tanki sloj inertnog materijala
(npr, pijesak, komadi vate) kako daljni dodatak razvijaa ne bi poremetio homogenost
nanesenog uzorka.
ej Eluiranje
Nakon nanoenja uzorka kolona se do vrha ispuni razvijaem (eluens), te se lijevak za
dokapavanje s razvijaem postavi iznad kolone. Podeavanjem pipca na dnu kolone regulira se
59
- r
protok razvijaa, koji obino iznosi 1- 2 inL u minuti. Eiuat se hvata u malim volumenima (5 -
10 mL) u razliitim predlocima (epruvete ili Erlenmeverove tikvice) ili preko kolektora frakcija.
Stupac u koloni nikad nesmije ostati suh to se osigurava dovoljnim volumenom razvijaa iznad
stupca u koloni. Svaka sakupljena frakcija se moe analizirati tankoslojnom kromatografijom
(TLC) kako bi se odabrala frakcija ili frakcije s interesantnim spojem. Kroniatografija na stupcu
uvijek se koristi samo za preparativne svrhe.
PostMBK rada:
Pri prema stupca u koloni (a) se vri do homogene i kompakt ne visi ne stupca si l i kagel a
od 1 5 - 2 0 cm, pazei pritom da i znad stupca si l i kagel a uvi jek postoji odreeni vol umen
razvi j aa. Koristi se kol ona promj era 0,7 cm i visi ne 40 cm. Zat i m se pal j i vo pi petom
doda 0,1 mL uzorka na vrh stupca si l i kagel a (nanoenj e uzorka (b)). Sada se na vrh
stakl ene kol one postavi l i j evak sa razvi j aem i podesi protok razvi j aa (0,5 - 1 mL/mi n)
otvaranj em pi pca na dnu kol one (el ui ranj e (c)). Frakci j e se hvataj u u Erl enmayerovi m
ti kvi cama, kao odi j el j eni spoj evi to ukazuj e razliito oboj enj e frakci j a.
Uzorak: smj esa 10 mg sudan bl ack i 20 mg sudan red otopl j eni h u 1 mL
razvi j aa (pet rol et er : et i l -acet at = 7 : 3 (v/v)). Uzorak j e t amno modro oboj en.
St aci onarna f aza j e si l i kagel granul aci j e 0,2 - 0,5 mm, prethodno akti vi ran 15 min na
110 C u sui oni ku.
3,5.3. Plinska kromatografi ja
Plinska kromatografija (engl. Gas Chromatographv, GC) je najee koritena tehnika
odjeljivanja smjesa hlapljivih spojeva. Uzorci za plinsko-kromatografsku analizu moraju biti
hlapljivi (kako bi trenutno isparili u injektoru) i stabilni na temperaturi zagrijavanja
kromatografske kolone. Inertni plin nositelj (mobilna faza) eluira sastojke smjese koji se
odjeljuju na koloni i odlaze do detektora. Plinski kromatograf (slika 28) se sastoji od:
plina nositelja (inertni plin, obino Me. Ar i N2) s regulatorom tlaka i mjeraem protoka
injekcijskog bloka (injektor - sustav za utrcavanje uzorka najee pomou
mikrolitarske trcaljke),
kromatografske kolone sa stacionarnom fazom u termostatiranom prostoru,
60