DNA REKOMBINAN

Pengenalan DNA rekombinan

Pengenalan kepada metodologi
DNA rekombinan
Kegunaan kejuruteraan genetik
PENGENALAN
DNA rekombinan adalah
penyambungan semula molekul
DNA
Hasil daripada teknologi
pengklonan
Teknik yang terlibat disebut
sebagai penjuruteraan genetik

METODOLOGI DNA REKOMBINAN











DNA
rekombinan
PCR
Penjujukan
(Sequencing)
Penghibridan
(Hybridisation)
Oligonukleotida
sintetik
Pencernaan
DNA
(DNA digest)
Pengklonan
(Cloning)
Penghibridan
Penetapan DNA ke membran nilon atau
nitroselulosa
Penambahan prob bertanda radioaktif/
enzim yang akan menghibrid kepada
jujukan DNA yang diminati
Pengenalpastian DNA yang diminati pada
DNA rekombinan/klon
Rajah 10.8
Penjujukan
Penentuan jujukan nukleotida bagi
fragmen DNA, DNA rekombinan yang
terhasil, gen atau kromosom
kaedah degradasi kimia ( Maxam dan
Gilbert (1977) -Rajah 5-3
Kaedah berenzim Sanger et al. (1977)-
Rajah 5-4
Terkini kaedah berautomasi

Output of a DNA sequence from an automated sequencer
PCR
Penghasilan/amplifikasi fragmen DNA
sasaran secara berganda (eksponen) 2
n
-
2
30
- 268,435,456 molekul dsDNA
Langkah-langkah dibawah diulang
sehingga 30-40 kali :
-Denaturasi 94
o
C
-Penyepuhan 45-72
o
C
-Pemanjangan 72
o
C
Rajah 10.11
PCR
Komponen yang perlu
Templat DNA (sedikit)
Pencetus (perlu tahu jujukan)
Enzim polimerase stabil haba (Taq
polimerase)
dNTP
Mg++
Alat kitar terma
PCR- Alat kitar terma

Pencernaan DNA
Penglibatan enzim penyekat dalam
memotong DNA kepada fragmen yang
tertentu
Mengenal jujukan 4-8 bp yang spesifik
(palindrom)
Memotong DNA dwiheliks dengan spesifik
Fungsi semula jadi memusnahkan DNA
asing yang masuk dalam bakteria
Enzim Penyekat



EcoRI dari
E.coli
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
C T T A A
G G
Hujung melekit
Tindakan Enzim Penyekat



G A A T T C
C T T A A G
Jujukan PALINDROM
A A G C T T Hind III dari
T T C G A A Haemophilus
influenza

EcoRI dari
E.coli



Pengklonan
Empat proses terlibat (Rajah 10.2):
1) Pemotongan vektor dan fragmen DNA
yang mengandungi gen yang diminati
dengan enzim penyekat
2) Penyambungan vektor dan fragmen DNA
yang mengandungi gen yang diminati
bagi membentuk DNA rekombinan (DNA
ligase)

Enzim Penyambung - DNA Ligase
Membentuk ikatan fosfodiester
Tindakan DNA ligase berlawanan dengan tindakan
enzim penyekat
perlu ATP dan 5 fosfat dan 3 hidroksil
Boleh menyambung DNA berhujung melekit atau
berhujung tumpul
Lebih efisien menyambung DNA berhujung melekit

OH (P)

5-AATCGATCGTCC-
-TTAGCTAGCAGG-5
OH P
P OH
5-AATCGATCGTCC-
-TTAGCTAGCAGG-5
ATP
Ligase
- Enzim DNA ligase tidak perlu jujukan spesifik
Pengklonan
Empat proses terlibat (sambungan):
3) Memasukkan ke dalam hos iaitu
pembawa yang akan mereplikasi DNA
rekombinan (transformasi)
4) Mengenalpasti klon yang membawa DNA
rekombinan (hibridisasi/pencernaan
dengan enzim penyekat)
Contoh vektor pengklonan (Rajah 10.4 dan
10.9)
Oligonukleotida
sintetik
DNA bebenang tunggal yang disintesis
dalam makmal (Rajah 10.10)
Jujukan DNA ditentukan oleh penyelidik
mengikut keperluan ujikaji
digunakan sebagai -
- prob (penanda) dalam penghibridan
- primer dalam PCR
- proses mutagenesis terarah tapak
(Rajah 10.15)

KEGUNAAN KEJURUTERAAN
GENETIK
Kesihatan manusia: pelbagai produk
kesihatan
Pertanian dan penternakan: Tumbuhan dan
haiwan transgenik
Bioteknologi persekitaran: degradasi
pencemar
Forensik
Bioteknologi industri


Bahan terapi yang terhasil
daripada teknologi DNA
rekombinan
Protein darah,Hormon manusia, Pengatur
imun, Vaksin (Jadual 10.1)
Terapi gen:penghantar dadah, ganti gen
cacat (Sistik fibrosis,Duchenne Muscular
Dystrophy, Adenosine deaminase ,
Hemophilia, Thalassemia, Kanser
pengaturan gen: RNA Anti-erti

Pertanian
Penghasilan tumbuhan transgenik
menggunakan Agrobacterium tumefaciens
(Rajah 10.19)
Kelebihan tumbuhan transgenik
Buah lambat masak/rosak
Tumbuhan rintang penyakit
Tumbuhan rintang racun rumpai

Buah Lambat
masak
Tomato-
Flavr savr

Teknologi
Anti-erti

Bioteknologi persekitaran
Menyahtoksik logam berat
Tukar ke molekul tidak toksik e.g. CuS0
4

dan PbSO
4

Lombong dan kawasan tercemar
Kawasan perawatan bahan buangan
-Nyahtoksik bahan organik
Bioteknologi industri
Enzim
Proses membuat minuman/makanan
Detergen (protease)
Perasa, pewarna
Asid organik
Asid amino
Vitamin
Teknologi Forensik
Darah atau tisu
Perlu segar (sebaik-baiknya)
Tidak unik
DNA
Unik, lebih pasti
Analisis RFLP dan pemblotan southern
Banding DNA suspek dan mangsa
Guna enzim penyekat dan elektroforesis
PCR
membanyakkan salinan DNA
Teknologi Forensik
-pencapjarian DNA- jenayah, kemalangan,
waris
-Guna DNA berulang
-mikrosatelit/short tandem repeat
Teknologi Forensik
Teknologi Forensik

Ringkasan proses yang terlibat
dalam kejuruteraan genetik
Teknik-teknik yang disebutkan sebelum ini
adalah saling berkaitan antara satu sama
lain
Rajah 10.23

DNA, gen & kromosom