articulos LAS ENZIMAS TERMOESTABLES Y SUS APLICACIONES INDUSTRIALES Claudia Suarez Nufiez", Didier Alazard'? Florina Ramirez, Vives®, ‘Oscar Monroy Hermosillo” y Luis Femandez Linares" * Instituto Mexicano del Petréleo, Eje Central Lazaro Cardenas 152, C.P. 07730, México, D.F., MEXICO. Fax '5368-1400.E-mail: “fernand@imp.mx. * Laboratoire de Microbiologie IRD. Université de Provence CES/esil case 925, 163 Avenue de Luminy 13288 Marseille CEDEX 9, FRANCE. “Unversidad Autonoma Metropolitana Iztapalapa, Dpto. Biotecnologia. Resumen Una de las respuestas de los microorganismos hiperterméfilos para adaptarse a altas temperaturas, es la produccién de enzimas termoestables llamadas extremo-enzimas. Las extremo-enzimas hasta ahora purificadas incluyen hidrolasas, éxido-reductasas, proteinas redox, dihidrogenasas, hidrogenasas, esterasas, glucosa Isomerasas, alcohol deshidrogenasas, ADN polimerasas y nitrilasas. Las principales aplicaciones de las extremo-enzimas son en Ia industria del almidén, que emplea amilasas; la industria alimentaria y de detergentes que aplican las proteasas y las xilanasas que son utilizadas en el bio-blanqueo de la pulpa del papel; sin embargo, actuaimente en el dmbito comercial las termoenzimas més importantes son las ADN polimerasas, enzimas clave en la replicacién de la informacién celular presente en toda las formas de vida. EI presente trabajo proporciona un panorama general de las bacterias terméfilas, la adaptacion de las temo enzimas y su uso potencial en la industria alimentaria, quimica, farmacéutica y biotecnoldgica. Se citan las principales enzimas aisiadas de microorganismos terméfilos e hiperterméfilos y su aplicacién industrial. Abstract ‘Thermos table enzymes production is a microorganism’s response to high temperatures environmental conditions. Some extremo enzymes now purified are hydrolases, oxido-reductases, redox proteins, dehydrogenases, hydrogenases, esterases, glucose isomerases, alcohol dehydrogenases, DNA polymerases and nitrilases. Biotechnological applications of thermophilic enzymes are mainly in starch industry, which uses amylases; food and detergents industries that apply proteases and xylanases, applied in paper bleaching. Nevertheless, up to date, the more important thermo enzymes, at commercial level, are the DNA polymerases, key enzymes in ‘replication of cellular information in all life forms. The present work deals with the adaptation mechanisms and factors that stabilize macromolecules against the effect of temperature, also provides a general notion of thermophile microorganisms and their potential use in food, chemical, pharmaceutical and biotechnological industry. The main isolated enzymes of thermophiles and hyper-thermophites microorganisms and their industrial application are mentioned. BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 =4. INTRODUCCION. Los microorganismos hiperterméfilos son aquellos que tienen una temperatura Sptima de crecimiento entre 80 y 100°C. Se encuentran dentro de los dominios Bacteria y Archea y se han aislado de ambientes terrestres y marinos tanto naturales ‘como antropogénices (Brock, 1997) Estos microorganismos —_producen termoestables con actividad optima a temperaturas mayores de 70°C; algunas de estas enzimas son actives por arriba de los 100°C. La conveniencia de enzimas fa aplicacién de estos microorganismos en nuevos procesos biotecnolégicos han despertado el interés en su estudio, debido a que muchos procesos industriales se llevan acabo a temperaturas a las cuales las enzimas termolabiles pierden su actividad; mientras que jas termo enzimas presentan su optimo o mantienen ta actividad; ademas, la tolerancia a las altas temperaturas de estas enzimas les proporcionan una mayor vida media. Por otra parte a medida que la temperatura del proceso incrementa, la velocidad de la reaccién también; al aumentar 10°C Ia temperatura, la velocidad de reaccién aproximadamente se duplica, disminuyendo en consecuencia la cantidad de enzima necesaria, (Zamost ef a/, 1991). De esta forma las enzimas termoestables estén adquiriendo cada vez més importancia como biocatalizadores. Entre algunas termo enzimas utilizadas en la Podemos citar. Las _proteasas ampliamente usadas en la formulacién de industria detergentes domeésticos, el remojado en Ia industria de la piel, en la industria de alimentos (modificacion de Ia proteina de soya y ablandador de carne) y la cervecera; las celulasas tienen varias aplica ‘como la produccién de alcohol; mejoramiento de la jones, articulos Produccion de jugos; en detergentes provoca colores brillantes y suavidad, también se aplica en el lavado de mezciila; las lipasas son utllizadas en la modificaci6n especifica de triglicéridos 0 en detergentes de ropa, la AND polimerasa es ampliamente comercializada para su aplicacién en PCR, 2 HABITATS y — FILOGENIA.— DE MICROORGANISMOS EXTEMOFILOS. Los microorganismos hipertermofilos son aislados exclusivamente a temperaturas entre 80 y 118°C, condiciones que se encuentran en areas volcénicas terrestres, géisers, solfataras, sistemas hidrotermales submarinos someros, chimeneas hidrotermales llamadas fumarolas negras “black smokers’ y pozos de petréleo calentados geotérmicamente (Marsh y Nomis 1985; Stetler ef af, 1993; Fuchs 1994). En el Arbol filogenético universal (Fig. 1), la ralz indica el inicio de la evolucién a partir de un antepasado universal, tomando dos direcciones, la dei dominio Bacteria y Ia segunda formada por las Archaea = yy Eukarya, filogenéticamente mas cercanos entre si. Las Archaea son el grupo de organismos mas encontrandose rimitivos; su origen se localiza més cerca de la raiz del arbol filogenético, Io cual favorece la idea de que muchos organismos de este dominio, se desarrollaron en ambientes extremos con altas temperaturas, bajo pH y alta salinided (Brock, 1997) Los organismos hiperterméflos estan Presentes tanto en Bacterias como Arqueo bacterias, se han descrito 70 especies que divergen tanto en su filogenia como en sus propiedades fisiolégicas, agrupadas en 30 géneros y 10 ordenes . BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1articulos (Vieille y Zeikus 2001) (Tabla 1). La mayoria y constituyen la rama mas baja en la genealogia pertenecen al dominio Archaea. Thermotogales y bacteriana, Aquificales son las Unicas bacterias hiper termotilas Bacteria Archaea Eukarya Fig. 1 Arbol flogenético universal; formado por tres diferentes dominios Bacteria, Archaea y Eukarya (Brock, 1997) ‘Tabla 1. Taxonomia y caracteristicas de crecimiento de microorganismos hipertermofilos. Oren Género epee Ton 22 pH? Reforencia Bacteria Tromotogaies ——Thormologa marina oo ss0 Pion da/oa vocttane soot Sa” M Cramton thornarrs oo F weeeea! tiabpisco och ol r= ous Oe vce com Thomosnipo fears Fo a eae ees Forslebattonum nos Bo ae Mri ‘Senco ss eo peere esy Aquificales ‘Aquifex pyrophilus 95 AE 5.47.6 M — Huber et al. (1992) Macernis Pad? Be eee venient pechaon ‘Sulfolobales ‘Sulfolobus acidocaldarius 85 AE 1-8 T Brock et al (1972) Schwantes” aera shibatae 86 Grogan ef af. (1990) rete SS cae) mollis = Westone eel Metanosphaera sedula 80 AE 1-45, T Huber ef af (1989a) Motions emus & ig tes Seemann BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 9articulos ‘rierleyi 5 Biierey BBvienoy 973), Desulfurolobus —_ambivalens 95 Zig eta. (19876) Stygiolobus azoricus 89 AN 155 ‘Sogerer et a. (1981) Thermoproteales —‘Thermoproteus —_tenax 97 AN 256 [Zig eta. (1981) neutrophilus 7 Steter (1986) uzoniensis, 7 Bonch-Osmolovskaya, otal (1999), Pyrobaculum —_Islandicum 103 AN 256 © T_ Huber et al(1987) corganotrophum 103 Huber of a/(1987) aerophilum 104 AGIA 589 M_ Voki ota (1999) Thermofilum ——_pendens 9 AN 465 © TZilig etal. (19838) ‘bru 95 Stottor (1988) Desutfurococeales — Desutfurococcus mobili 95 AN 45:7 Ziligetal (1982) ‘mucosus or Zig eta. (1982) saccharovorans 97 Stetter (1986) amylolyticus a7 Bonch-Osmolovskaya etal (1985) Thermosphaera aggregans 85 AN 5. Viele y Zeikus (2001) Staphylothermus marinus 98 Fiala ota. (1986) Pyrodictiales Pyrodictium ‘occultum 10 AN Si M__ Stoter et (1983) brockii 110 Stotter ofa. (1983) ‘abyssi 10 Ploy et a (1981) Hyperthermus —_butylicus 108 Zilig eta. (1990) Pyrolobus fumani 108 AN 55. M_— Viele y Zeikus (2001) Thermodiscus —_maritimus so AN 57, M__ Stetier (1986) Aeropyrum pornix 9 AE 70 M_— Vici y Zeikus (2001) Caldococcus —_itoralis 8 AN 64 M_— Viet y Zeikus (2001) Thermococcales Termococcus —_coler o AN 47 IM. Zilig era. (19830) jitoralis: 38 Neuner ef at. (1980) stetteri 988 Meoshnichenko ota (1989), sggregans 8 AN 70 M_ Vieite y Zeikus (2007) barophilus 8 AN 70 M_ Viele y Zoikus (2007) guaymasensis BBN 72 M_ Visite y Zeikus (2003) acidaminovorans 85 = AN 90 M_ Visio y Zeikus (2001) chitonophagus 85 AN 87. M_ Vette y Zeikus (2001) barossii 825 AN 657.5 M_ Viale Zetkus (2001) profundus 8 AN 75, M_ Vicia y Zeikus (2007) hydrothermalis 85 AN 80 M_— Vieiley Zeikus (2001) alcaliphilus 100 AN 85-10 -M__ Hubery Stetter (1998) Palaeococcus —_ferrophilus 8 AN 80 M_— Vieitley Zeikus (2001) Pyrococcus furiosus 03 AN 59 M_ Fiala & Stetter (1986) woesii 403 AN 66.5 © M2ligetal (1987a) abyss! 9 AN 88 M_— Vieille y Zeikus (2001) horikoshii 88 AN 70 M_— Vieiloy Zeikus (2001) Archaeoglobales Archaeoglobus fulgidus 92 AN 557.5 M_ Stettor (1988) profundus 92 ‘Burggsaf ofa. (19900) Ferroglobus Dlecidus 85 AN 685 —-M__Hubery Stotter (1998) Methanobacteriales Methanothermus. fervidus a Stetter ofa. (1981) sociabilis 97 AN 557.5 T Lauerer etal (1986) Methanococcus thermolithotrophicus 70 Huber y Stetter (1998) Jannaschit 86 Jones of al (1983) Igneus 81 AN 57.5 M__ Burggraf etal. (1990a) —_ vulcanius 80 AN 85. M__Vieil y Zeikus (2001) 10 BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1articulos Tervens a5 M Waele y Zama 2007] infernus 65 M_— Viele y Zeus (2001) Methanopyrales __Mothanopyrus __kandleri 10 AN 557 M_Kurr otal (1991) 1: AN =anaerobio , AE= aerobio. 2: Habitat, T= terrestre; M= maritimo. 3. METABOLISMO DE MICROORGANISMOS HIPERTERMOFILOS. El metabolisme de los _microorganismos hipertermafios es diverso; _incluye ltotricos: respiracién de azufre; sulfato reduccién; metanogénesis; — respiracién (micro, acrofiicos); y desnitrifcacién, Se han deserito dos Vias catabélicas érgano tréficas en hiper-termétilos, en la primera el crecimiento de los organismos depende de un aceptor de electrones inorgénico azufre, sulfalo, tiosulfato, oxigeno y ritrato; bajo estas condiciones los compuestos son oxidados 2 CO> y la conservacién de energia es via aerobia 0 anaerobia; en la segunda peptides (proteinas, casaminodicidos, extracto de levadura, peptona y mezcta de aminodcidos), azucares; para algunos hipertermétilos el piruvato y lactato son quimio aerobia utilizan buenos substratos. No se conocen casos de foto troficos hiper-terméfilos; Schauder y Kroger, (1993) describen estos procesos de forma més detallada. 4. MECANISMOS DE ADAPTACION EN MEMBRANA A ALTAS TEMPERATURAS. Los organismos terméfilos (Bacteria y Archaea), pueden adaptarse 0 responder al estrés térmico por diferentes mecanismos de adaptacién, que se llevan a cabo a diferentes niveles: en la estructura de las proteinas, interaccién proteina- proteina, interaccién li la estructura de la membrana... Por otra parte, se tienen mecanismos como: la fluidez de la membrana, la adaptacién homeoviscosa y la teoria idos-proteinas asi como en homeofasica. De igual forma, para el crecimiento de organismos terméfilos, se requiere que las enzimas sean intrinsecamenie estables a elevadas temperaturas. Sin embargo, a pesar de las diferentes adaptaciones que han suffido los microorganismos para poder desarrollarse a temperaturas elevedas, frecuentemente presentan crecimiento lento y bajo rendimiento (Driessen et af 1996; Toiner et af. 1997; De rosa y Gambacorta 1988), * MECANISMOS: INTRINSECOS Y EXTRINSECOS QUE CONFIEREN ESTABILIDAD TERMICA A LAS PROTEINAS. La estabilidad de la mayoria de las proteinas hiper-terméfilas se lleva a cabo por mecanismos intrinsecos. La estructura normal de la proteina, formada por enlaces intramoleculares débiles que Proveen la_integridad estructural, es. complementada con modificaciones especificas que le confieren termo estabilidad. Las modificaciones ‘en proteinas pueden ser: 1) incremento en la ‘compactacién intramolecular de la proteina; 2) tamafio de las cavidades superficiales; 3) formacién de nticleos altamente apolares; 4) reduccién en la relacién superficie/volumen 0 Disminucién en el contenido de glicina (evitando el giro libre de la. proteina); interacciones electrostaticas e hidrofébicas; 7) Intercambio de aminoacidos para incrementar la hidrofobicidad intema y promover la hélice de los y 8) sustitucién de disminucion del numero y el “compactacién’; 5) ©) optimizacion de residues en alfa hélice; BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 mnaminodcidos sensibles a cambiar su estructura (cistefna); a desaminarse (asparragina y glutamico) © a suffir un dafto oxidative, por ejemplo: en la metionina (Gazerro, M. The factors involved in protein thermostability. http:pps.cryst.bbk ac. uk/assignments/projects/gazer rolproject.him 1997). Los procesos que no son parte de la estructura de la proteina; mecanismos extrinsecos, implican la acumulacién de solutos orgénicos como inositol y bifosfo glicerato y algunos ione inorganicos como potasio y sodio (Ciulla et al, 1994; Martins y Santos, 1995; Scholz ef al., 1982; Ramkrishnan, 1997) 6 ENZIMAS AISLADAS DE MICROORGANISMOS: TERMOFILOS e HIPERTERMOFILOS DE INTERES INDUSTRIAL. articulos 6.1 Amilasas. EI almidén se encuentra en muchas plantas como reserva de alimento y polisacéridos, representa la fuente de carbono y energia de varios mictoorganismos. Esta macromolécula_ esta compuesta de dos componentes de alto peso molecular, amilosa y amilo pectina. Debido a la compleja estructura del almidén se requiere de diferentes enzimas para su degradacién El tratamiento biolégico del almidén involucra la licuefaccién y sacarificacion, procesos que requieren la termo estabilidad de las enzimas. Los, microorganismos hiperterméfilos producen enzimas sacaroliticas y hemi-celuloliticas extremadamente termoestables. Algunas de las enzimas aisladas de hiperterméfilos —_presentan actividad amiloittice c-amilasa, Pululanase tipo |, Pululanase tipo Il, Glucosil-transferasa de ciclo dextrina Tabla 2. microorganismos ‘Tabla 2 Enzimas amiloliticas de Arqueas y bacterias terméfilos e hiperterméfilos. ‘organismo ‘enzima Desutfurococcus mucosus Pyrococcus furiosus Pyrococcus sp KODI Pyrococcus woese! Pyrodictium abyssi ‘Staphylothermus marinus Sulfolobus solfataricus Thermococeus celer Thermococcus profundus Thermococcus profundus Thermococeus aggregans Dictyogiomus thermophilum Thermotoga maritima MSB8 Pululanasa tipo | Fervidobacterium pennavorans Thermotoga maritima MSB& Thermus caldophilus GK24 Pululanasa tipo Il Topt °C pH opt. 100 55 100 657.5 90 65 100 55 100 5.0 100 50 90 58 80 55 80 4.06.0 100 58 90 55 85-90 70 85 60 90 60 75 55 a BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1articulos Desiilfurococcus mucosus 100 50 Pyrococcus woesei 400 60 Pyrococcus furiosus 105 60 Pyrodictium abyssi 100 80 Thermococeus celer 90 55 Thermococcus litoralis 98 55 Thermococcus hydrothermatis 95 55 Thermococcus aggregans 100 65 Ciclo dextrina glucosil- transferasa Thermoanaerobacter sp NR NR Thermoanaerobacterium NR NR thermosulturogenes Anaerobranca bogoriae 65. 40 'NR, No repertades, Adams (7993) 6.2 Celulasas. importantes aplicaciones. en _—procesos. La celulosa constituye mas del 40% de Ia biotecnolégicos: rompimiento enzimético de biomasa de las plantas, consiste de unidades de glucosa unidas por enlaces glucosidicos, aunque tiene alta afinidad por el agua es completamente insoluble; la celulosa se puede hidrolizar en glucosa a través de tres enzimas la endo-gluconasa, la exo- gluconasa y la f- glucosidasa; estas enzimas tienen varias aplicaciones biotecnolégicas, produccién de alcohol; mejora la recuperacién de jugo; en detergentes provoca colores brillantes suavidad, mejora la eliminacion de particulas de tierra; también se usan en el lavado de mezelilla, pre-tratamiento de biomasa celulésica y cultivos de forraje para mejorar la calidad del alimento y facilitar la digesti6n de los mismos; sacarificacién como la enzimatica de desechos agricolas e industriales y en la produccién de quimicos (Niehaus et al, 1999) EI xilano es una molécula heterogénea que constituye el principal compuesto polimérico de hemicelulosa. Las xilanasas tienen hoy en dia desechos agricolas para combustibles la produccién de alcohol; enzimético de alimentos animales con el fin de liberar azucares exentos de pentosas; disolucién de pulpas de celulosa para la produccién de ray6 bianqueo de pulpa de madera. A la fecha, se han encontrado microorganismos Thermotoga maritima, T neapolitana y T thermanun, hongos y levaduras que producen xilanasas y como el tratamiento termefilos como enzimas relacionadas que se activan a altas temperaturas y en amplios rangos de pH. La a-D- glucosidasa thermohidrosulfuricus presenta ambas actividades amilasa y pululanasa, ademas de liberar malto dextrinas, es de gran interés por su capacidad de convertir una amplia variedad de carbohidratos de desechos agricolas, solventes y aceites de aguas residuales (Zamost ef al. 1991). Las principales celulasas —producides por _microorganismos hiperterméfilos se presentan en la Tabla 3. aisiada de Thermoanaerobacter BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1 uyarticulos Tabla 3. Celulosas termoestables producidas por bacterias, arqueas y hongos torméfilos @ hiperterméfilos. ‘Organismo Enzima TC opt___ pH opt Endoxilanasa Pyrococcus abysst 110 55 Dictyoglomus thermophitum 85 65 Thermotoga maritima 92. 62 Thermotoga sp. strain BjSS3-B.1 105 33 Thermotoga neapolitana 85 5.5 Thermotoga thermarum 80 60 Endoglucanasa Thermotoga maritima MSB8 95 60-75 Thermotoga neapolitana 95 6.0 Exoglucanasa Thermotoga maritima 95 60-75 Thermotoga sp. strain FjSS3-B.1 ns 6.87.8 Anaeroceltum thermophilun 95 5.0-6.0 Pyrococcus furiosus 100 6.0 B-Glucosidasa Pyrococcus furiosus 102-105 Sulfolobus solfataricus 105 s3 Thermotoga maritima MSB8 7s 62 ‘Thermotoga sp. strain F}SS3-B.1 80 70 Xitanasas Paccilomyces variota 65 65 Malbranchea pulchella var. sulfurea 70 65 Talaromyces byssochlamydoides 75 5.0 Thermoascus auranticus B 5.0 (Chaetomiun thermophile var. coprophile 70 60 Myceliopthera thermophila 70 65 = Norepertade 6.3 Proteasas. Las proteasas hidrolizan las proteinas a péptidos y aminoécidos, se clasifican de acuerdo a su sitio catalitico en serinas, cisteinas, o metalo proteasas. El uso comercial de estas enzimas es muy amplio; las serinas proteasas, son resistentes a la desnaturalizacién por delergentes y a condiciones alcalinas, se usa como aditivo en detergentes domésticos, el remojado en la industria de la piel; la industria de alimentos (modificacion de Ia proteina de soya y ablandador de came) y la cervecera. La mayoria de las termo proteasas son del tipo serina, son estables a altas temperaturas, altas concentraciones de detergentes y agentes desnaturalizantes (Zamost ef af, 1991) (Tablad). 14 BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1articulos ‘Tabla 4. Proteasas estables al calor, producidas por organismos terméfilos. Desulfurococcus mucosus Serin proteasa 95 15 Pyrococeus furiosus 85 63 Thermococeus aggregans 90 70 Thermococeus celer 95 1s Thermococeus litoralis 95 95 Thermococeus stetteri 85 a5 Staphylothermus marinus 9.0 Sulfolobus solfataricus : 65-80 Fervidobacierium 80 10 pennavorans Pyrococcus furiosus Pirolisina 98 68 Pyrococcus sp. KODI Tiol proteasa 110 7 Acido proteasa ‘Sulfolobus acidocaldarius ‘Termosina 90 2.0 Sulfolobus solfataricus Carboxi-peptidasa— — = Bacillus thermoproteolyticus ‘Termo lisina - : Thermus acuaticus YT 1 Agualisina 78 10 Thermus acuaticus T351 Caldolisina 90 8 Desulfurococcus sp Archaclisina 100 8 Vibrio proteolyticus Vibriolisina 65 8 = No report 6.4 Lipasas. Recientemente se ha incrementado el interés del estudio de las lipasas por su capacidad para Como su nombre lo indica las lipasas funcionar en solventes organicos, realizando basicamente hidrolizan lipidos produciendo acidos grasos y glicerol, también participan en la acidolisis (remplazamiento de un acido graso esterificado por un Acido graso libre); trans-esterificacion (Cambio de Acidos grasos por triglicérides) y sintesis de estéres. La mayoria de estas reacciones se llevan acabo a baja actividad de agua, para prevenir la hidrdlisis de los estéres. Las lipasas son producidas principalmente por hongos (Bruce of al. 1991), reacciones de sintesis entre alcoholes y dcidos, produciendo ésteres, ademas de llevar a cabo trans-esterificaciones e inter-esterificaciones. Sin embargo las reacciones mds importantes en las cuales las lipasas estan implicadas son las quirales; de gran importancia en reacciones de quimica fina para la sintesis de puros, especialmente en el campo farmacéutico, Las lipasas son producidas principaimente por hongos (tabla 5) enantiémeros BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 Barticulos Tabla 5. Hongos productores de lipasas termoestables. ‘Organismo T FL opt. Candida antarctica 70 6.5 Candida eurvata 30-60 63 Mucor miel 10 6.8 ADN polimerasa: Les ADN polimerasas son enzimas clave en la replicacién de la informacion celular presente en toda forma de vida; sintetizan una nueva cadena de ADN en la direcci6n §' > 3' a partir de una cadena de RNA, Mas de 100 genes de ADN polimerasas se han clonado de varios organismos termofilos. perteneciente a ambos dominio, Bacteria y Archeae. (Chien ot al. 1976; Kaledin et al. 1980). Uno de los avances mds importantes en la biologia molecular en desarrollo de la reaccién en cadena de polimerasa PCR. La ADN polimerasa termoestable facilita la del ciclo en el de PCR; diferentes. polimerasas (Tabla 6), la primer ADN polimerasa, la Taq_polimerasa, se aisié de Thermus aquaticus. los ultimos afos es el automatizacion térmico procedimiento existen ‘Tabla 6. ADN polimerasas termoestables, aplicacién y organismo de origen. ‘Organismo rasa PCR Bacterias Thermus aquaticus Taq pol | * Thermus Thermophilus Tih pol + Thermus fiiformis Thi pot + Thermus flavus TH pol * Thermus caldophilus GK24_—_Tca pol + Bacillus stearothermophilus BstL pol + Thermotoga maritima Tma pol * Archaea ‘Pyrococcus woesei Pwo pol + ‘Pyrococcus furiosus Pfu pol + ‘Pyrococcus sp. GB-D Deep Vent pol + ‘Pyrococcus sp. KODI KODI po! + Thermocuceus litoralis, Vent po! + hermococcus sp. 9°N-7 9°N-7 pol + 6.6 Hidrolasas galacto-manano en monosacaridos. La f-manasa Las enzimas hiper-terméfilas B-manasa, p- tiene una amplia aplicacion en la industria de manosidasa y a-galactosidasa _extracelulares; purificadas de Thermotoga neapolitana, hidrolasas altamente termoestables @ hidrolizan el son 16 alimentos y tratamiento enzimatico del café. Recientemente en la industria petrolera se ha aplicado con galacto manasas, para la estimulacion de pozos de petroleo fa hidrélisis_ enzimatica BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1y gas. En la apiicacién de enzimas en la industria petrolera, la termo estabilidad y termo actividad son factores esenciales, debido a las condiciones de altas presiones y temperaturas en los que se encuentran los pozos (Adams y Kelly, 1995). 6.7 Otras actividades enziméticas de interés industrial. En la utilizacién microbiana de! amoniaco, intervienen enzimas capaces de catalizar su inclusién a un esqueleto carbonado. La glutamato- deshidrogenasa dependiente del NAD sintetiza ol glutamato, es la enzima més termoestable encontrada hasta ahora, su actividad no se pierde después de incubarla a 100° C por dos horas; y se increment con hidrocloruro de guanidina y algunos solventes organicos miscibles en agua, como el acetonitrile y el tetrahidrofurano. Esta enzima hiper- terméfila tiene un gran potencial de aplicacién en biosensores. Otro tipo de enzimas que se han aislado de microorganismos terméfilos, son las nitritasas; de articulos particular interés en procesos de manufactura del Papel, el tratamiento de aguas residuales y produccién de compuestos como la acrilamida, antibiéticos, agentes anti-inflamatorios y herbicidas. La aplicacién de estas enzimas en la industria ain es limitada, debido a su inestabilidad intrinseca (Cramp et al. 1997). La termolisina una metaloproteasa neutra se Utiliza en la produccién del dipéptido aspartamo, es el Unico proceso de sintesis que involucra una enzima terméfila a escala industrial. La alcoho! deshidrogenasa, aplicada en la oxidacién secundaria de alcoholes; la glucosa isomerasa o xilosa isomerasa que catalizan la Isomerizacién inversa de la D-glucosa a D-fructosa y D-xilulosa respectivamente, son ampliamente usadas en la industria de alimentos para la produccién de jarabe de maiz de alta fructosa, Las esterasas, se aplican en la biosintesis organica en solucién acuosa, catalizan la ruptura hidrolitica de ésteres, formando el acido y el alcohol correspondiente, La Tabla 7 resume el uso industrial de algunas enzimas terméfilas hiper-terméfilas. Tabla 7. Aplicacién industrial de enzimas terméfilas e hiper-terméfilas, Enzima Fuente Aplicacién Industria Hidrotasas Amilasas Hongos Pen panadera Bacterias papelera Hongos —_Fabricacién jarabe y glucosa alimentaria Bacterias _Almidonado en frio de ropa Almidén Hongos Ayuda digestiva Farmacéutica Bacterias _Eliminacién de revestimientos Textil Bacterias —_Eliminacién de manchas; detergentes _lavanderia Proteasas Honges Pan Panadera Bacterias — Eliminacion de manchas Limpieza en seco Bacterias Ablandador de carne Carnica Bacterias —_Limpieza de heridas Medicina Bacterias Eliminaci6n de revestimientos Textil Bacterias__Detergente doméstico lavanderia BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1 Mtarticulos ———___________ ‘Amilo-pululanasa a-Glucosidasa B-Glucosidasa Sucrosa e-glucohidrolasa Xilanasa «-Galactosidasa -Manasa Oxidoreductasas Piruvato oxidoreductasa Aldehido oxidoreductasa Indolpiruvato oxidoreductasa Proteinas redox Ferredoxinas rubredoxina jidrogenasas Glutamato dehidrogenasa Sulfuro dehidrogenasa ‘Alcohol dehidrogenasa Hidrogenasas Hidrogenasa Sulfo-hidrogenasa Otras Invertasa Glucosa oxidasa Glucosa isomerasa Pectinasa Renina Celulasa Lipesa Lactasa Nitriasa DNA polimerasa 18 ‘Archaea Degradacién de almidén Archaea —_Hidrélisis de maltosa Archaea _Hidrélisis de celoblosa Archaea —_Hidrdlisis de sucrosa Bacterias —_Hidrélisis de xilano Bacterias —_Hidrdlisis de galatomanano Bacterias —_Hidrélisis de manan Bacterias _Oxidacién de piruvato Archaea _Oxidacién de aldehidos Archaea Oxidacién de ariicetoacidos Archaea Transferencia de electrones ‘Archaea —_No determinada Archaea —_Oxidacién de glutamato Archaea —_Reduccién de azure Archaea —_Reduccién de aldehido Bacterias — Produccién de He Reduccién de azufre Levadura —_Relleno biando de caramelos Honges —_Eliminacién de glucosa, eliminacién de oxigeno papeles para prueba de diabetes Bacterias Jarabe de cereales rico en glucosa Hongos —_Prensado, clarificacién vino Hongos __Coagulacién de la leche Bacterias Suavizante y abnillantador de tejidos, detergente Hongos _Degradacién de las grasas Hongos Degradacién de: glucosa, lactosa y galactosa Bacterias — Degradacién de nitrlos Bacterias —_Replicacién del ADN en la reaccién en Archaea ___ cadena de la polimerasa (PCR). BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 ‘Almidén ‘Aimidén Petrolera Alimentos y Petrolera Biorreactores, Tratamiento de aguas residuales Alimenticia Confiterta Alimentaria farmacéutica Bebidas refrescantes Zumos de frutas ‘Quesera Lavanderia Lechera, lavanderia Lechera, alimentos Farmacéutica, ‘Aguas residuales Investigacién biolégica, forense.articulos La gran diversidad de arqueo bacterias y otras, logrando reducir costos y mejorar las bacterias hiper-terméfilas alsladas a partir de condiciones de procesamiento de los productos. Sin ambientes exiremos, en donde la vida pudiera embargo, el conocimiento, de nuevas especies, sus considerarse inexistente, representan una extensa enzimas y sus aplicaciones; es limitado y fuente de enzimas terméfilas. Las termoenzimas representan un gran potencial para diversas han tenido éxito en la industria farmacéutica, actividades industriales. alimentaria, de! papel y detergentes, entre muchas ibliografia ‘Adams, M. W. W. “Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 1000” Annu, Rev. Microbiol 47, 1993, Pag, 627- 658 ‘Adams, M. W.W. y Kelly, R. M. “Enzymes from microorganisms in extreme enviroments". C8EN: 18, 1995, Pag. 32.42 Bloch, E., Burggraf, S., Fiala, G., Lauerer, G., Huber, G., Huber, R., Rachel, R, Segerer, A, Stetter, K, O, y Volkl, P. “Isolation, Taxonomy and phylogeny of hypertermophilic microorganisms’ World journal of microbiology and Biotecnology 11, 1995, Pag, 26-56. Bonch-Osmolovskaya, E. A., Slesarev, A 1, Miroshnixhenko, M. L., Svetlichnaya, T. P., Alexeyev, V. A “Characteristic of Desulforucoccus amylolyticus n. Sp, @ new extreme thermophilic archaebacterium from hot volcanic vents of Kamchatka an Kunashir” Microbiologyia. 57, 1985, 78-85. Bonch-Osmolovskaya,, E. A., Miroshnixhenko, M. L, Kostrikina, N. A, Chemych, N. A., Zavarzin, G. A. “Thermoproteus uzoniensis sp. Nov., a new extremely thermophilic archaebacterium from Kamchatka continental hot springs” Arch. Microbiol. 154, 1990, Pag. 556-559. Brierley, C. L., Brierley, J. A. “A chemolithoautotrophic and thermophilic microorganism isolated from an acidic hot spring” Can. J. Microbiol. 19, 1973, Pag. 193-198, Brock, T, Brock, K. M., Bally, R. T., Weiss, R. L., "Sulfolobus: a new genus of sulfur-oxiding bacteria living at low pH and high temperature” Arch. Microbiol. 84, 1972, Pag, 54-68 Brock, T. D., Madigan, M. T. Microbiologia. Prentice Hall Hispanoamericana, S. A. México, Englewood Cliffs, 1997. Burggraf, S., Jannasch, H. W., Nicolaus, B., Stetter, K. 0. “Archaeoglobus profundus sp. Nov. Represents a new species within the sulfate-reducing archaebacteria’ Syst. Appl. Microbiol. 13, 1990b, Pag. 24-28 Burggraf, S.,, Fricke, H., neuner, A., Kristjansson, J., Rouvier, P., Mandeloo, L., Woese, ©. R., Stetter, K. 0. “Methanococcus igneus sp. Nov., @ novel hyperthermophilic methanogen from a shallow submarine hydrothermal system" Syst. Appl. Microbiol. 13, 1980*, Pag 263-269, Bruce, LZ, Henrik, K.N., and Robert, L. S. “Themostable enzimes for industrial applications" Journal of Industrial Microbiology. 8, 1991, Pag. 71-82. Chien, A, Edgar, D. B., and Trela, J. M. “Deoxyribonucleicacid polimerase from the extreme" termophile” Thermus aquaticus, J. Bacteriol, 127, 1976, Pag. 1550. BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 io—_—_—_—_— — articulos Ciulla, R. A., Burggrat, S., Stetter, O., and Robert, M. F, “Occurrence and role of di-myo- inositol-1,1"-phosphate in methanococcus igneus" Appl. Environ. Microbiol. 60, 1994, Pag, 3660-3664. Cramp, R. gilmour, M. Cowan, D.A. “Novel thermophilic bacteria producing nitrle-degrading enzymes" Microbiol 443, 1997, Pag. 2313-2320. DeRosa, M., Gambacorta, A. “The lipids of archaeabacteria” Prog. Lipid Res. 27, 1988, Pag. 153-175. Driessen, A. J. M., van de Vossenberg, J. L. C. M., Konings, W. N. “Membrane composition and ion- permeability in extemophiles’ FEMS Microbiol. Rev. 18, 1996, Pag. 130-148. Fiala, G., Stetter, K. O. "Pyrococcus furiosus sp. nov. Represents a novel genus of marine heterotrophic archae- bacteria growing optimally at 100°C" Arch. Microbiol. 145, 1986, Pag. 56-61 Fuchs, T. M. “Physiologische und molekular-biologische Unter-suchungen an neu isolierten thermoacidophilen ‘Archaeen”. Diplomarbeit, Universitat regensburg, German, 1994. Grogan, D., Palm, P., Zillig, W. “Isolate B 12, which harbours a virus-like element, represents a new species of the archaebacterial genus Sulfolobus, Sulfolobus shibatae, sp. nov." Arch. Microbiol. 184, 1990, Pag. 594- 599. Huber, G., Spinnler, C., Gambacorta, A., Stetter, K.o. “Metallosphaera sedula gen. And sp. nov., represents a ew genus of aerobic, metal-mobilizing, thermoacidophilic archeabacteria” Syst. Appl. Microbiol. 12, 19892, Pag. 38-47. Huber, G., Stelter, K. ©. “Sufolobus metallicus, sp. nov., a novel strictly chemolithoautotropic thermophilic archaeal speciesof metal mobilizers" Syst. Appl. Microbiol. 14, 1981, Pag. 372-378. Huber, R., Wilharm, T., Huber, D., Trincone, A, Burggraf, S., kénig, H., Rachel, R., Rockinger, 1, Fricke, H., Stetter, K. 0. “Aquifex pyrophilus gen... nov. sp. nov., represents @ novel group of marine hyperthermophilic hydrogen-oxidizing bacteria” Syst. Appl. Microbiol. 15, 1992, Pag. 340-354 Huber, R., Woese, C. R., Langworthy, T. A., Fricke, H., Stetter, K. ©. “Thermoshipo africanus gen. Nov., represents a new genus of thermophilic eubacteria within the Thermotogales” Syst. Appl. Microbiol, 12, 1989b, Pag. 32-37 Huber, R., Langworthy, T. A., Konig, H., Thomm, M., Woese, C. R., Sleytr, U. B., and Stelter, K. 0. "Thermotoga ‘maritima sp. nov. Represents @ new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up to 90° Archives of Microbiology 144, 1986, Pag. 324-333. Huber, R., Woese, C. R., Langworthy, T. A., Kristjannson, J.K. and Stetter, K.0 "Fervidobacterium islandicum 8p. nov. @ new extremely thermophilic eubacterium belonging to the thermotogales’ Archives of Microbiology. 154, 1990, Pag. 105-111 Huber, R., Krisijansson, J, K., and Stetler , K. 0. *Pyrobaculum gen, nov., @ new of neutrophilic, rod ~shapped archaebacteria from continental solfataras growing optimally at 100°C" Archives of Microbiology 149, 1987, Pag. 95-101 Huber, H., stetter K. ©. “Hyperthermophiles and their possible potencial in biotechnology’ J. of Biotechnology. 64, 1998, Pag. 39-52 zd BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1articulos Jannasch, H. W., Huber, R., Belkin, S., Stetter, K. ©. “Thermotoga neapolitana, sp. nov. of the extremely thermophilic, eubacterial genus Thermotoga” Arc. Microbiol. 150, 1988, Pag. 103-104 Jones, W. J., Leigh, J. A, Mayer, F., Woese, C. R., Wolfe, R. S. “Methanococcus jannaschii sp. nov., an extremely thermophilic methanogen from a submarine hydrothermal vent” Arch. Microbiol. 136, 1983, Pag. 254-261 Keledin, a. S., Sliuserenko, A. G., and Gorodetskii, S. “Isolation and propierties of DNA polymerase from extreme thermophilic bacteria Thermus aquaticus YT-1" Biokhimila, 45, 1980, Pag. 490. Kristiansson, J. K. “Thermophilic Bacteria" (Kristjansson, J. Kedit) CRC. Press Londres, 1992, Kurr, M., Huber, R., Konig, H., Jannasch, H. W., Fricke, H., Trincone, A., Kristiansson, J. K., Stetter, K. 0. “Methanopyrus Kandleri gen. and sp. nov., represents a novel group of hyperthermophilic methanogens, growing at 110°C" Arch. Microbiol. 156, 1991, Pag. 239-247 Lauerer, G., Krisijansson, J. K., Langworthy, T. A., Konig, H., Stetter, K O., Methanothermus sociabilis sp. nov, a second species within the methanothermaceae growing at 97°C. Syst. Appl. Microbiol. 8, 1986, Pag. 100- 108, Marsh, R. M. y Norris, P. R. The isolation of some thermophilic, autotropic iron- and sulfur-oxidizing bacteria, FEMS microbiol. Lett. 17, 1985, Pag. 311-316. Martins, L, and Santos, H. "Accumulation of mannosyiglycerate anddi-myo-inositol- phosphate by Pyrococcus uriosus in response to salinity and temperature” Appl. Environ. Microbiol. 61, 1995, Pag. 3299-3303 Miroshnichenko, M. L., Bonch-Osmosiovskaya, E. A., Neuner, A., Kostrikina, N. A., Chemych, N. A, Alexeyev, V. A. “Thermococcus stetteri sp. nov. A new extremely thermophilic marine sulfur-metabolizing archaebacterium" Syst. Appl. Microbiol. 12, 1989, Pag, 257-262 Neuner, A., Jannasch, H. W., Belkin, S., Stetter, K ©. “Thermococcus ltoralis sp. nov. A new species of ‘extremely thermophilic marine arcaebacteria’ Arch. Microbiol. 183, 1960, Pg. 205-207. Niehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M., and Antranikian, G. “Extremophiles as a sorce of novel enzymes for industrial application” Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 1998, Pég. 711-729. Patel, 8. K. C., Morgan, H. W., Daniel, R. M. “Fervidobacterium nodosum. Gen. nov. and spec. nov. a new ‘chemoorganotrophic caldoactive anaerobic bacterium" Arch. Microbiol. 141, 1985, Pag. 63-69. Pley, U., Schipka, J., Gambacorta, A., Jannasch, J. W., Fricke, H., Rachel, R., Stetter, K. 0., “Pyrodictium abyssi sp. nov. Represents a novel heterotrophic marine arcaeal hyperthermophile growing at 110°C” Syst. Appl Microbiol. 14, 1991, Pag. 245-253. Ramakrishnan, V., Verhagen, M. F. J. M., and Adams, M. W. W. “Characterizatio of di-myo-inositol-t,1'- phosphate in the hyperthermophilic bacterium Thermotoga mantima’ Appl. Environ. Microbiol. 63, 1987, Pag. 347-350. ‘Scholz, S., Sonnenbichler, J. Schafer, W., and Hensel, R. “Di-myo-inositol-1,1"- phosphate isolated from Pyrococcus woese”” FEBS Lett. 306, 1992, Pag. 239-242. ‘Schauder, R.. y Kroger, A. “Bacterial sulphur respiration’ Archives of Microbiology 158, 1993, Pag. 491-497. BioTecnologia 2002 Vol. 7 No.1 21articulos Segerer, A. H., Trincone, A, Gahrtz, M., Stetter, K. 0." Stygiolobus azoricus gen. and sp. nov., represents @ novel genus of anaerobic, extremely thermoacidophilic archaea of the order Sulfolobales" J. Bacteriol. 41, 1991, Pag. 495-501. Segerer, A., Neuner, A., Kristiansson, J. K., Stetter, K. ©. “Acidianus infernus gen. nov., sp. nov., and Acilanus brierleyi comb. nov., facultatively aerobic, extremely acidophilic thermophilic sulfur-metabolizing areaebacteria” J. Bacteriol. 36, 1986, Pag. 559-564. Stetter, KO. Diversity of extremely thermophilic archaebacteria In: Brock, T. D. (Ed.), Thermophiles: General, Molecular, and Applied Microbiology. Wiley, New York, 1986. Stetter, K. ©., Thon, M., Winter, J, Wildgruber, G., Huber, H., Zillig, W., Janecovie, D., K6nig, H., Palm, P., ‘Wunder, S. “Methanothermus forvidus, sp. nov., @ novel extremely thermophilic methanogen isolated from an Icelandic hot spring” Zentralbl. Far Bakteriologie und Hygienel. Abteilung Originale C2, 1981, Pag. 166- 178. Stetterr, K.O., Konig, H, and Stackebrandt, E. “Pyrodictium gen. nov., a new genus of submarine disc-shaped sulphur reducing archaebacteria growing optimally at 105°C" Systematic and Applied Microbiology 4, 1983. Pag. 535-551 Stetter, K ©. “Archaeglobus fulgidus gen. nov., 3p. nov.: a new taxon of extremely thetmophilic archeebacteria” ‘Systematic and Applied Microbiology 10, 1988, Pag. 172-173. Stetter, K. OLife at the upper temperature border. in: Frontiers of life, eds Tran Thanh Van, J., Tran Thanh Van, K., Mounolon, J.C., Schneider, J. and McKay, C. Gifsur-Yvette: Editions Frontiers. 1993. Toiner, B., Pooiman, B. y Konings, W. “Adaptation of microorganisms and their transport systems to high temperatures” Comp. Biochem. Physiol. 118, 1997, 423-428. Volkl, P., Huber, R., Drobner, E., Rachel, R., Burggrf, S.. Tricone, A. y Stetter, K. 0, “Pyrobaculum aerophitum Sp. nov. A novel nitrate-redicing hyperthermophilic archaeum" Applied and Environmental Microbiology. 59, 1993, Pag. 2918-2926 Vieille, C., and Zeikus, G. J. “Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability’ Microbiol. and Molecular Biology Rev, 65, 2001, Pag. 1-43. Windberger, E., Huber, R., Trincone, A., Fricke, H. and Stetter, K.0. "“Thermotoga Thermarum sp. nov. and Thermotoga neapolitana ocurting in African continental solfataric springs’ Archives of Microbiology, 51, 1989, Pag, 506-512 Zamost, 8. L., Nielsen, H. K., andStames,. R. L. "Thermostable enzimes for industrial applications” Journal of Industrial Microbiology. 8, 1991, Pag. 71-82. Zillig, W., Gierl, a., Schreiber, G., Wunderl, S., Janecovie, D., Stetter, K.O. y Klenk, H.P. “The archaebacterium Thermofilum pondens represents, 2 novel genus of thermophilic, anaerobic sulfur-respiring Thermoproteales* ‘Systematic and Applied Microbiology, 4, 1983a, Pag. 79-87. lig, W.,Holz, |., Janecovic, D., Klenk, H.P., Imsel, E., Trent, J., Wunder, S., Forjatz, V. H., Coutinho, RY Ferreira, T. “Hyperthermus butylicus, a hyperthermophilic sulfur-teducing aerchaebacterium that ferments peptides” Journal of Bacteriology, 172, 1990, Pag. 3959-3965. a BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1articulos Zilig, W..Holz, L, Janecovic, D., Schafer, W. Y Reiter, W. D. “The archaebacterium Thermococcus celer represents a novel genus within the thermophilic branch of the archaebacteria" Systematic and Applied Microbiology, 4, 1983b, Pag, 88-94. Zilig, W. Holz, |.Klenk, H.P., Tmet, J., Wunder, S., Janecovic, D., Imsel, E. Y Haas, B. “Pyrococcus woosei sp. nov., an ultracthermophilic marine archaebacterium, represents a novel order, Thermococcales” Systematic ‘and Applied Microbiology. 9, 1987a, Pag. 62-70. Zillg, W., Stetter, K. O., Prangishvili, C., Scahfer, W., Wunderl, S., Janecovic, D., Holz, LY Palm, P. “Desulfurococcaceae, the secon family of the extremely thermophilic, anaerobic, sulfur-respiring Thermoprotesles" Zentralblatt For Bakteriologie und Hygiene, |. Abteilung Originale C. 3, 1982, Pag. 304- 317. Zilig, W., Stetter, K. ©., Schafer, W., Janecovic, D., Wundert, S., Holz, L, y Palm. P. “Thermoproteales: a novel type of extremely thermoacidophilic anaerobic archaebacteria isolated from Icelandic solfataras" Zentralblatt Far Bakteriologie und Hygiene, 1. Abteilung Originale C. 2, 1981, Pag. 205-227. Zillg, W., Stetter, K.0., Wunder, S., Schulz, W., Priess, H., and Scholz, | “The Sulfolobus-Candariella group: Taxanomy on the basis of the structure of DNA- dependent RNA polymerases” Archives of Microbiology. 125, 1980, Pag. 259-269. Zillig, W., Yeates, S., Holz, |, Béck, A, Gropp, F y Simon, G. "Desulfurclobus ambivalens, gen. Nov. Sp. nov., an autotrophic arcaebacterium facultatively oxidizing or reducing sulfur" Systematic and Applied Microbiology, 8, 1987b, Pag. 197-203. BioTecnologia 2002 Vol. 7 No. 1 B