Metabolizam lipoproteina i ateroskleroza

Predavanja iz Laboratorijske dijagnostike poremeaja metabolizma

kolska 2014/2015. godina

Uloga oksidativnog stresa u nastanku

ateroskleroze
Hipoteze o nastanaku ateroskleroze
- Hipoteza odgovora na povredu (disfunkcija endotela)
-Lipidna hipoteza
-Hipoteza oksidativne modifikacije lipoproteinskih estica
- Hipoteza inflamacije

Hipoteza oksidativne modifikacije lipoproteinske

estice
Steinberg uloga oksidativno modifikovanih LDL estica u nastanku ateroskleoroze

Oksidativni status
Oksidativni status predstavlja odnos markera oksidativnog stresa i antioksidativne zatite.
Oksidativni stres predstavlja poremeaj ravnotee oksidoredukcionih procesa koji nastaje zbog
poveanog stvaranja slobodnih radikala koje elijski homeostatski mehanizmi nisu u stanju da
neutraliu.

Slobodni radikali
Slobodni radikali atomi, atomske grupe
ili molekuli sa jednim ili vie nesparenih elektrona

Slobodni radikali mogu nastati:

- gubitkom elektrona iz ne-radikala ili dodatkom elektona ne-radikalu
- raskidanjem kovalentne veze homolitika fizija
Pored slobodnih radikala u oksidoredukcionim procesima uestvuju i neradikalska jedinjenja
koja nemaju nesparen elektron ali uestvuju u reakcijama stvaranja radikala:
- Hidrogen peroksid H2O2
- Hipohlorna kiselina HOCl
- Ozon

Izvori slobodnih radikala

Izvori slobodnih radikala mogu biti egzogeni i endogeni.
Endogeni izvori slobodnih radikala
- metabolike transformacije
- metabolizam ksenobiotika
Oksidativni metaboliki procesi u kojima nastaju slobodni radikali:
- respiratorni lanac mitohondrija
- oslobaanje kiseonika u toku fagocitoze
- sinteza eikozanoida
- enzimske reakcije oksidaza i oksigenaza

Egzogeni izvori slobodnih radikala:

- jonizujue zraenje
- ultravioletna radijacija
- ultrazvuk
- duvanski dim

Izvori slobodnih radikala

O2

1O
2
Singlet kiseonik
e

HOCl

Cl

O2

O2

2H+

superoksid anjon radikal

H+

NO

HO2

OONO

hidroperoksil radikal

peroksinitril

hipohlorna kiselina

H2O2 + O2
Fe2+
Fe3+

HO + HO
hidroksil radikal

O2 + 4 H + + 4 e
2 H 2O

O2 + e
O 2.

Kiseonik je snaan oksidans u procesu oksidativne

fosforilacije u unutranjim membranama mitohondrija
u procesu oksidativne fosforilacije.

Delimina redukcija kiseonika do superoksid anjon radikala (0.4-4%)

molekulskog kiseonika.

Izvori slobodnih radikala

.

O2 + 2 e + 2 H

U mitohondrijama se O2.- prevodi u H2O2 dejstvom

H 2 O 2 enzima superoksid dizmutaze (SOD).

H2O2 se dalje u mitohondrijama prevodi do molekula vode (H2O) i O2 pomou enzima

glutation peroksidaze (GPx), a ukoliko pree u citozol, ovu reakciju katalizuje
antioksidativni enzim katalaza (CAT) .
U prisustvu jona prelaznih metala (gvoe, hrom, mangan,
plemeniti metali) H2O2 stvara vrlo reaktivne slobodne radikale
1O
(HO., HO-) i ova reakcija je poznata kao "Fentonova
reakcija.
2
Singlet kiseonik
e

H 2 O 2 +Cl
HOCl (hipohlorna kiselina
HO ) + OH
2
hidroperoksil radikal

HOCl
H + OCl

OONO

peroksinitril

hipohlorna kiselina

O2 2H
Nastali vodonik- peroksid u prisustvu
O2 jona
O 2
gvoa i bakra daje i jako potentan slobodni radikal
superoksidhipohloritni
anjon radikal
jon (OCl-) uz uee enzima mijeloperoksidaze.
H+
NO

HOCl

Cl

H2O 2 + O 2
Fe2+
Fe3+

HO + HO
hidroksil radikal

Fentonova
reakcija

Izvori slobodnih radikala u vaskularnom

sistemu
Enzimski izvori
- NAD(P)H-oksidaze- membranski enzim
- Ksantin oksidaza
- Mijeloperoksidaza MPO i njeni produkti
- Lipooksigenaza
15,12-lipooksigenaza
5-lipooksigenaza 5-LO
fosfolipaza A2
- NOS (azot oksid sintaza) endotelna
- Inducibilna NOS iNOS

Ne-enzimski izvori
- Tranzicioni metali : Cu 2+ i Fe 3+
- Respiracija u mitohondrijama
Curenje elektrona

Oksidativna modifikacija lipoproteina

Oksidativna modifikacija lipoproteina je posledica lipidne peroksidacije koja se deava pod dejstvom
slobodnih radikala. Lipidnoj peroksidaciji su podlone pre svega nezasiene masne kiseline koje se
nalaze vezane za holesterol ili u fosfolipidima LDL estice.
Lipidna peroksidacija se odvija u tri faze:

Produkti lipidne peroksidacije su ciklini peroksidi, ciklini endoperoksidi, malondialdehid i nonenal.

Oksidativna modifikacija lipoproteina

Faze lipidne peroksidacije
1.Inicijacija
Prve reakcije u lancu

Oduzimanje H+ jona pomou ROS ( OH)

Stvaranje lipidnog radikala (LH )

Stvaranje peroksi radikala (LOO , ROO )

2. Propagacija
Oduzimanje H+ sa lipidnim

peroksil radikalom (LOO )

3. Terminacija

Interakcija radikala

ne-radikalski produkt

Faze procesa oksidativne modifikacije LDL

estice
Oksidativna modifikacija LDL estica se odvija u 4 faza:
1) Faza inicijacije
U ovoj fazi je znaajna uloga metalnih jona u zapoinjanju procesa. Tokom ove faze se
troe antioksidativne komponente LDL estica (vitamin E) lag faza
2) Faza propagacije
U ovoj fazi dolazi do oksidacije nezasienih masnih kiselina do LOOH i ovaj proces se
odvija jako brzo
3) Faza dekompenzacije
U ovoj fazi se lipidni hidroperoksidi konvertuju do reaktivnih aldehida ( malondialdehid
i 4- hidroksinonenal)
4) Fragmentacija apo B-100 i gubitak funkcije vezivanja za LDL receptore
Lizin iz apo B-100 proteina LDL estice biva zamenjen reaktivnim aldehidima usled ega
dolazi do fragmentacije apo B-100 gubi mogunost vezivanja za LDL receptore.
Modifikovana LDL estica se vezuje za scavenger receptore na makrofagama i dovodi
do akumulacije holesterola u makrofagama i stvaranja penastih elija.

Aterogene karakteristike oksidovane LDL

estice
- Oksidovani LDL stimulie hemotaksu
monocita.
- Oksidovani LDL inhibira izlazak monocita
kroz vaskularni zid.

- Oksidovani LDL biva lake preuzet od strane makrofaga koje ga akumuliraju i prelaze u penaste
elije.
- Oksidovani LDL dovodi i do disfunkcije i oteenja endotela.
- Oksidovani LDL dovodi do nekroze penastih elija, oslobaanja lizomalnih enzima i stvaranja
nekrotinog tkiva.

Antioksidativna zatita
Antioksidansi slue za neutralizaciju slobodnih radikala u organizmu. U zdravom organizmu
postoji ravnotea izmeu prooksidanasa i antioksidanasa.

Antioksidansi imaju sposobnost doniranja

elektrona slobodnom radikalu !!!

elija
Podela antioksidanasa:
Po lokalizaciji
- elijski (citoplazmatski i membranski)
- Ekstracelularni

Po funkciji
- Enzimski
- Neenzimski

Hidrosolubilni
Liposolubilni

Enzimska antioksidativna zatita

Najvaniji enzimski antioksidansi su: superoksid dizmutaza (SOD), glutation peroksidaza (GPX),
katalaza, glutation reduktaza, glutation S-transferaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, hem
oksigenaza, paraoksonaza.
Superoksid dizmutaza

Izoenzimi:
- intracelularna Cu, Zn SOD (SOD I)
- mitohondrijalna Mn-SOD (SOD II)
- ekstracelularna SOD (SOD III)

Katalaza (CAT)
-uklanja H2O2 i spreava oksidativnu modifikaciju proteina i lipidnu peroksidaciju

Glutation peroksidaza (GPx)

- uklanja perokside, ak i lipidne hidroperokside

Neenzimska antioksidativna zatita

Neenzimski hidrosolubilni antioksidansi su: albumin, glutation, bilirubin vezan za albumin,
mokrana kiselina i vitamin C.

Uloga glutationa
Glutation titi membranu
eritrocita od lipidne peroksidacije
i spreava hemolizu.

Neenzimski liposolubilni antioksidansi su: vitamin E, ubihinon Q10, - karoten, likopen

i polifenoli (flavonoidi) iz crvenog vina (rezervatrol, katehin)
Francuski paradoks

Mehanizmi antioksidativne zatite

Mehanizmi antioksidativne zatite:
- Direktna zatita od ROS
Superoksid dismutaza, glutation peroksidaza, katalaza
- Nespecifini redukcioni sistemi
Glutation, vitamin C
- Zatita od lipidne peroksidacije
Glutation peroksidaza, vitamin E, karoten
- Vezivanje metala
Transferin, laktoferin, feritin, metalotionein
- Sistemi reparacije
Enzimi reparacije DNK, makrooksiproteinaze, glutation transferaza

Mehanizmi antioksidativne zatite LDL

estice

LDL estice se tite od oksidacije inkorporacijom antioksidanasa.

Inkorporacija antioksidanasa u vaskularne elije dovodi do manje oksidacije LDL estica,
manje adhezije monocita, manjeg stvaranja penastih elija, manje citotoksinosti i
poboljanja endotelne funkcije.

Laboratorijska dijagnostika oksidativnog

statusa
Markeri oksidativnog stresa
Merenje slobodnih radikala
Superoksidni anjon, vodonik peroksid, NO,
peroksinitrit
Markeri oksidacije biomolekula
Produkti lipidne peroksidacije (TBARs, lipidni
hidroperoksidi, malondialdehid, PGF2Izoprostani,konjugovani dieni, 4hidroksinonenal
Produkti hidroksilacije DNK (8-OH gvanozin)
Produkti oksidativne modifikacije proteina
(produkti nitrozilacije, karbonili, AOPP, itd)
TOS-totalni oksidantni status
OxLDL

Markeri antioksidativne zatite

- SOD
- GPX
- Katalaza
- Paraoksonaza
- Glutation
- SH grupe
- TAS-totalni antioksidativni status
- PAB- prooksidativno-antioksidativni
balans

Antiaterogena uloga HDL estica

Rezultati Framingam studije : niske koncentracije HDL holesterola- nezavisni
prediktor koronarne srane bolesti
Framingamska studije je poela 1948. godine, obuhvatala 5209 odraslih ispitanika, cilj je
procena rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti. Studija je longitudinalna, traje jo uvek
(trea generacija).
Framingam risk score procena rizika (%) za razvoj kardiovaskularnih bolesti u narednih
godina

Relativni rizik od KSB posle 4

godine

Antiaterogena uloga HDL estica

2
1

0
2,6

4,1
5,7
LDL holesterol (mmol/l)

6
1,1

5
0,6

ol
r
e
t
les L )
o
L h ol/
D
H mm
(

1,6
2
,
2

Framingamska studija
Porast nivoa HDL-H za 1% smanjuje rizik od KVB za 2-3 %

Antiaterogena uloga HDL estica

Antiaterogene uloge HDL setica:
- Reversni trasnport holesterola
- Inhibicija oksidacije LDL estica (enzim paraoksonaza 1)
- Inhibicija ekspresije adhezionih molekula
- Inhibicija agregacije trombocita
- Spreava inhibiciju azot oksid sintaze

Antiaterogena uloga HDL estica

Struktura HDL estica
HDL je lipoprotein velike gustine koji
sadri 50% apolipoproteina, apo AI i
apo AII.
50% lipidi
fosfolipidi 27%
holesterol 20%
trigliceridi 3%
HDL estice se sintetiu u jetri i intestinumu, u nascentnoj, diskoidnoj pre- formi
koja se ugavnom sastoji od apolipoproteina i fosfolipida.
pre -HDL
Diskoidni HDL

Reversni transport holesterola

HDL estica ostvaruje svoju ateriprotektivnu ulogu tako to preuzima holesterol iz perifernih
elija, makrofaga i taj holesterol vraa u jetru gde se on metabolie u une kiseline i izluuje
putem ui.
- mesto sinteze nascentnog, diskoidnog HDL-a (hepatociti i intestinum)
- metabolizam u cirkulaciji
- metabolizam u jetri
- put izluivanja: jetra i bubrezi
Reversni transport holesterola se odvija u 4 faza:
- Preuzimanje holestrola iz perifernih elija vezivanjem HDL estica pomou apo AI
Efluks holesterola se odvija pomou ABC A1 transportera
(ATP vezujui kasetni transporter klase A1)

- Esterifikacija holesterola u holesterol estre (LCAT)

- Indirektan transport holesterol estara u jetru putem transfera na lipoproteine koji su bogati
trigliceridima (CETP)
- Direktan transport holesterol estara u jetru vezivanjem za SR BI receptore

Reversni transport holesterola

HDL SUBFRAKCIJE

pre-

Lp A-I

Lp A-I:A-II

Gustina
(kg/L)
Gustina (kg/L)

1,063

HDL 2b

1,125

HDL 2 fenotip

HDL 2a

HDL 3a

HDL 3 fenotip
male, guste HDL estice

HDL 3b
1,210

HDL 3c
7,2

7,8

8,2

8,8
Dijametar (nm)

Dijametar (nm)

9,7

12

Mehanizmi regulacije metabolizma lipoproteina

U regulaciji metabolizma lipoproteina vanu ulogu imaju transkripcioni faktori (SREBP) i
transkripcioni faktori koji se aktiviraju vezivanjem odgovarajuih liganada (LXR, PPAR, RXR).
PPAR Peroxisome Proliferator Activated Receptor
(receptori koji se aktiviraju proliferacijom peroksizoma)
PPAR su nuklearni transkripcioni faktori koji utiu na modulaciju genske ekspresije proteina
i enzima koji uestvuju u homeostazi lipida.
Aktiviraju se vezivanjem liganada.
Endogeni ligandi: masne kiseline, eikozanoidi, oksisteroli
Egzogeni ligandi: lekovi (fibrati)
Postoje tri osnovna subtipa PPAR receptora:
PPAR- alfa (jetra)
PPAR gama (adipozno tkivo)
PPAR delta (miino tkivo)

Mehanizmi regulacije metabolizma lipoproteina

Struktura PPAR alfa transkripcionog faktora

PPAR-alfa transkripcioni faktor se sastoji iz tri domena:
- Ligand vezujui domen
- Domen dimerizacije
- DNK vezujui domen (Cinkovi prsti)

Aktivacija PPAR alfa receptora

Aktivacija PPAR- alfa receptora se odvija u dve faze:
- Prva faza
Vezivanje endogenih i egzogenih liganada
Heterodimerizacija sa drugim transkripcionim faktorom RXR (retinoid X receptor)

Aktivacija PPAR alfa receptora

Aktivacija PPAR- alfa receptora se odvija u dve faze:
- Druga faza
Prepoznavanje gena u hepatocitima od strane heterodimera PPAR-RXR
PPRE- PPAR responsive element sekvenca nukleotida na molekuli DNK koju prepoznaje
DNK vezujui domen strukture PPAR-alfa
AGGTCA-AGGTCA

Uticaj PPAR-alfa transkripcionih faktora na

metabolizam lipoproteina
Metabolizam HDL estica je regulisan pomou PPAR-alfa transkripcionih faktora koji utiu na
ekspresiju gena za sintezu apo AI, apo AII, ABC A1, LPL i SRB I u hepatocitima.

Na matabolizam VLDL estica utiu tako to u hepatocitima stimuliu beta-oksidaciju masnih

kiselina, smanjuje se koncentracija slobodnih masnih kiselina a time i sinteza VLDL estica.
PPAR-alfa inhibiraju sintezu apo CIII, inhibitora lipoproteinske lipaze, poveava se uklanjanje
VLDL estica , to posledino smanjuje i broj malih, gustih LDL estica.

Mehanizam dejstva fibrata

Fibrati su lekovi koji se koriste u terapiji hiperholesterolemije. Mehanizam dejstva je poveana
sinteza enzima LPL, inhibicija sinteze apo CIII i poveana sinteza apo AII, preko
PPAR alfa transkripcionih faktora.

Dislipidemije - Dislipoproteinemije
Hiperlipoproteinemije
Ciljevi ispitivanja lipidnog statusa
- Postavljanje dijagnoze dislipidemije
- Procena rizika za nastanak kardiovaskularne bolesti
- Primena terapije za leenje dislipidemija

Klasifikacija dislipidemija
- Klasifikacija po Fredericksonu
- beta klasifikacija
- WHO klasifikacija
-Hiperlipoproteinemije i Hipolipoproteinemije
-Disbetalipoproteinemije i Disalfalipoproteinemija
- Poremeaji u egzogenom, endogenom metabolizmu ili reversnom
transportu holesterola
Etioloka podela hiperlipoproteinemija
- Primarne (genetski uslovljene)
- Sekundarne ( nastale kao posledica neke druge bolesti)
- Kombinovane

Nedostaci: ne obuhvata sve dislipoproteinemije (samo hiperbetalipoproteinemije)

ne ukazuje na etiologiju bolesti
ne obuhvata hipolipoproteinemije

Dislipidemije Dislipoproteinemije
Primarne
Hiperhilomikronemija
Hiperholesterolemija *
Disbetalipoproteinemija *
Hipertrigliceridemija *
Genetski defekti na nivou:
Apolipoproteina
Receptora
Enzima
Transportera

Sekundarne
1.Metabolike bolesti: DM tip I i DM Tip II
2.Poremeaji funkcije organa:
jetre, bubrega, tireoideje
3.Dejstvo lekova
4.Gojaznost
5. Socijalne navike: fizika neaktivnost,
puenje, aterogena ishrana, itd

Kombinovane hiperlipidemije *
* rana i vrlo izraena ateroskleroza, naroito koronarnih krvnih sudova

Primarne dislipidemije
Poremeaji vezani za LDL estice
Hiperbetalipoproteinemije
poveana koncenbtracija LDL-holesterola
Porodina hiperholesterolemija
- defekt LDL receptora (poremeaj sinteze LDL receptora). LDL estice ne mogu da se
metaboliu, koncentracija LDL- holesterola je jako visoka
- defekt u primarnoj strukturi apo B-100 (na poziciji 3500 glutamin zamenjen argininom)
Familijarna apo B-3500 hiperholesterolemija

Poremeaji vezani za HDL estice

Hipoalfalipoproteinemije
niske koncentracije HDL-holesterola, poveani aterogeni rizik
uzroci: genski defekti na nivou apo AI, enzimima (LCAT) i transporteru ABC A1.

Familijarna hiperholesterolemija

Laboratorijska dijagnostika dislipidemija

Lipidni staus podrazumeva odreivanje sledeih parametara:
- koncentracija ukupnog holesterola
- koncentracja triglicerida
- koncentracija LDL-holesterola
- koncentracija HDL-holesterola
Odreivanje apolipoproteina obuhvata:
- koncentracija apo AI ( antiaterogeni apolipoprotein)
- koncentracija apo B-100 (aterogeni apolipoprotein)

Aterogeni indeksi:
-ukupan holesterol/HDL-holesterol
- LDL-holesterol/HDL-holesterol
- Apo B/Apo A
- Trigliceridi/HDL-holesterol
- Non HDL-holesterol: ukupan holesterol - HDL-holesterol

LDL i HDL subfrakcije u proceni rizika od KVB

Aterogenost LDL estica se moe proceniti sledeim
laboratorijskim odreivanjima:
- Koncentracija LDL-holesterola
- Koncentracija apolipoproteina B-100
- Veliina LDL estica
- Koncentracija holesterola i apo B-100 u LDL subfrakcijama

LDL SUBFRAKCIJE
Gustina (kg/L)
Gustina
(kg/L)

1,019

LDL I

LDL fenotip A

LDL II
1,038

LDL fenotip B
male, guste LDL estice

LDL III
LDL IV

1,063
22,0

24,2

25,5
27,2
Dijametar (nm)

28,5

Dijametar (nm)

Nizak
rizik

Visok
rizik

LDL subfrakcije

Nain obeleavanja:
mali gusti LDL
LDL1, LDL2, LDL3, LDL4
fenotip A i fenotip B
LDL I, LDL II, LDL III i LDL IV

Gustina (kg/L)

Razdvajanje LDL subfrakcija i HDL subfrakcija

- ultracentrifugiranje (razdvajanje na osnovu gustine)
- elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (gradijent gel elektroforeza)
- nuklearna magnetna rezonanca

Fenotip A dominiraju velike LDL estice

Fenotip B - dominiraju male LDL estice
Diferencijacija fenotipova - dijametar estica
> 25,5 nm fenotip A
< 25,5 nm fenotip B

Dijametar (nm)

LDL subfrakcije
Na ekspresiju LDL B fenotpia utiu sledei faktori:
- genetski faktor (autozomalno-dominantno nasleivanje) 35-45%
- pol (ene pre menopauze pod manjim rizikom, 5-10%)
- abdominalna gojaznost
- hipertrigliceridemija
- rezistencija na insulin
Aterogenost malih, gustih LDL estica

LDL SUBFRAKCIJE KAO POTENCIJALNI

BIOMARKERI ATEROSKLEROZE

Kliniki znaaj
Male, guste LDL i HDL estice doprinose razvoju ateroskleroze
nezavisno od drugih faktora rizika
Nema zvaninih preporuka za rutinsko odreivanje LDL i HDL
subfrakcija
Ispitivanje LDL i HDL subfrakcija za procenu
rezidualnog rizika i praenje progresije
ateroskleroze.

Principi razdvajanja LDL subfrakcija

1.gustina
ultracentrifugiranje

4. sastav apolipoproteina
imunohemijske metode

2. naelektrisanje
hemijska precipitacija
elektroforeza na agarozi
3. veliina i naelektrisanje
gradijent gel elektroforeza
hromatografske tehnike

5. lipidni sastav
NMR spektroskopija

Lipoprotein a - Lp (a)
Lp (a) je lipoprotein izuzetno bogat holesterolom. Sastoji se iz dve strukturne komponente
apolipoproteina (a) koji je preko disulfidnog mosta vezan za apo B iz LDL estice.

Apolipoprotein (a) ima specifinu strukturu

kringl.
LDL estice i Lp (a) razliit metabolizam
- obrnuta korelacija Lp (a) koncentracije i veliine
apo (a)
Lp (a) se sintetie u jetri a na povrini hepatocita se
udruuje sa apo B.
Elektroforetski se izdvaja kao pre beta lipoproteinska frakcija.

Lipoprotein a kao faktor rizika za razvoj

kardiovaskularnih bolesti
Strukturna analogija sa plazminogenom
Lp(a) vezuje metabolizam lipida sa vaskularnom trombozom i fibrinolizom
Lp(a) inhibira lizu ugruka i smanjuje aktivaciju plazminogena
pomou aktivatora tkivnog plazminogena
Kliniki znaaj odreivanja Lp(a)
Proaterogena i protrombogena aktivnost Lp(a)
Funkcionalni znaaj jo uvek nije jasan.
Nezavisni prediktor koronarne bolesti
Rizine vrednosti > 300 mg/L
Genetski polimorfizam apo (a)
Lp(a) je polimorfan u veliini i ima vie izomera.
Koncentracija Lp(a) je genetski uslovljena, postoji veza genotipa i koncentracije Lp(a)