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Ion Exchange Chromatography
Ion Exchange Chromatography
Ion Exchange Chromatography
Chromatography
Principles and Methods
18-1114-21
Edition AA
Ion Exchange
Chromatography
Principles and Methods
ISBN 91 970490-3-4
Contents
1.
Introduction ............................................................................................9
2.
3.
4.
5.
SOURCE ................................................................................................34
Properties ......................................................................................37
Chemical stability ....................................................................37
Flow rate..................................................................................38
Capacity ..................................................................................40
Recovery..................................................................................40
Reproducibility ........................................................................41
Availability ....................................................................................41
6.
7.
Capacity ..................................................................................59
Flow rate..................................................................................60
Availability ....................................................................................60
8.
9.
BioProcess
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Assured long term supply of large batches, on time and with the right quality.
Full technical and regulatory support to assist in process validation.
Scaleable performance from bench top to production hall.
Compatible large scale columns and equipment.
Well documented cleaning and sanitization methods.
Media shown to perform well in real downstream applications from Capture to
Polishing, from synthetic oligonucleotides to recombinant proteins.
High and reliable productivity in the production hall.
Media that fulfill the above described criteria are labelled with the BioProcess Media
symbol in Chapter 3.
1. Introduction
Adsorption chromatography depends upon interactions of different types between
solute molecules and ligands immobilized on a chromatography matrix. The first
type of interaction to be successfully employed for the separation of macromolecules was that between charged solute molecules and oppositely charged moieties
covalently linked to a chromatography matrix. The technique of ion exchange
chromatography is based on this interaction.
Ion exchange is probably the most frequently used chromatographic technique for
the separation and purification of proteins, polypeptides, nucleic acids, polynucleotides, and other charged biomolecules (1). The reasons for the success of ion
exchange are its widespread applicability, its high resolving power, its high capacity, and the simplicity and controllability of the method.
This handbook is designed as an introduction to the principles of ion exchange
chromatography and as a practical guide to the use of the media available from
Amersham Biosciences. The handbook is illustrated with examples of different types
of biological molecules which have been separated using ion exchange chromatography and different ways the technique can be used. For information on specific
separations, the reader is recommended to consult the original literature.
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The first stage is equilibration in which the ion exchanger is brought to a starting
state, in terms of pH and ionic strength, which allows the binding of the desired
solute molecules. The exchanger groups are associated at this time with exchangeable counter-ions (usually simple anions or cations, such as chloride or sodium).
The second stage is sample application and adsorption, in which solute molecules
carrying the appropriate charge displace counter-ions and bind reversibly to the
gel. Unbound substances can be washed out from the exchanger bed using starting
buffer.
In the third stage, substances are removed from the column by changing to elution
conditions unfavourable for ionic bonding of the solute molecules. This normally
involves increasing the ionic strength of the eluting buffer or changing its pH. In
Figure 1 desorption is achieved by the introduction of an increasing salt concentration gradient and solute molecules are released from the column in the order of
their strengths of binding, the most weakly bound substances being eluted first.
10
The fourth and fifth stages are the removal from the column of substances not eluted under the previous experimental conditions and re-equilibration at the starting
conditions for the next purification.
Separation is obtained since different substances have different degrees of interaction with the ion exchanger due to differences in their charges, charge densities
and distribution of charge on their surfaces. These interactions can be controlled
by varying conditions such as ionic strength and pH. The differences in charge
properties of biological compounds are often considerable, and since ion exchange
chromatography is capable of separating species with very minor differences in
properties, e.g. two proteins differing by only one charged amino acid, it is a very
powerful separation technique.
In ion exchange chromatography one can choose whether to bind the substances
of interest and allow the contaminants to pass through the column, or to bind the
contaminants and allow the substance of interest to pass through. Generally, the
first method is more useful since it allows a greater degree of fractionation and
concentrates the substances of interest.
The conditions under which substances are bound (or free) are discussed in detail
in the sections dealing with choice of experimental conditions, Chapter 9. In addition to the ion exchange effect, other types of binding may occur. These effects are
small and are mainly due to van der Waals forces and non-polar interactions.
Ion exchange separations may be carried out in a column, by a batch procedure or
by expanded bed adsorption. All three methodologies are performed in the stages
of equilibration, sample adsorption etc. described previously.
The matrix
An ion exchanger consists of an insoluble matrix to which charged groups have
been covalently bound. The charged groups are associated with mobile counterions. These counter-ions can be reversibly exchanged with other ions of the same
charge without altering the matrix.
It is possible to have both positively and negatively charged exchangers (Fig. 2).
Positively charged exchangers have negatively charged counter-ions (anions) available for exchange and are called anion exchangers. Negatively charged exchangers have positively charged counter-ions (cations) and are termed cation exchangers.
The matrix may be based on inorganic compounds, synthetic resins or polysaccharides. The characteristics of the matrix determine its chromatographic properties
such as efficiency, capacity and recovery as well as its chemical stability, mechanical
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strength and flow properties. The nature of the matrix will also affect its behaviour towards biological substances and the maintenance of biological activity.
The first ion exchangers were synthetic resins designed for applications such as
demineralisation, water treatment, and recovery of ions from wastes. Such ion
exchangers consist of hydrophobic polymer matrices highly substituted with ionic
groups, and have very high capacities for small ions. Due to their low permeability
these matrices have low capacities for proteins and other macromolecules. In addition, the extremely high charge density gives very strong binding and the hydrophobic matrix tends to denature labile biological materials. Thus despite their
excellent flow properties and capacities for small ions, these types of ion exchanger are unsuitable for use with biological samples.
The first ion exchangers designed for use with biological substances were the cellulose ion exchangers developed by Peterson and Sober (2). Because of the hydrophilic nature of cellulose, these exchangers had little tendency to denature proteins.
Unfortunately, many cellulose ion exchangers had low capacities (otherwise the
cellulose became soluble in water) and had poor flow properties due to their irregular shape.
Ion exchangers based on dextran (Sephadex), followed by those based on agarose
(Sepharose CL-6B) and cross-linked cellulose (DEAE Sephacel) were the first ion
exchange matrices to combine a spherical form with high porosity, leading to
improved flow properties and high capacities for macromolecules. Subsequently,
developments in gel technology have enabled this macroporosity to be extended to
the highly cross-linked agarose based media such as Sepharose High Performance,
Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads, and the synthetic polymer matrices,
MonoBeads, and SOURCE. These modern media enable fast, high capacity, high
resolution ion exchange chromatography to be carried out at both analytical and
preparative scales. Non-porous polymer matrices, e.g. MiniBeads, are available
for extremely high resolution micropreparative or analytical separations.
12
Charged groups
The presence of charged groups is a fundamental property of an ion exchanger.
The type of group determines the type and strength of the ion exchanger; their
total number and availability determines the capacity. There is a variety of groups
which have been chosen for use in ion exchangers (3); some of these are shown in
Table 1.
Table 1. Functional groups used on ion exchangers.
Anion exchangers
Functional group
Diethylaminoethyl (DEAE)
-O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2
-O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
Cation exchangers
Functional group
Carboxymethyl (CM)
-O-CH2-COO-
Sulphopropyl (SP)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-
Sulphonic and quaternary amino groups are used to form strong ion exchangers;
the other groups form weak ion exchangers. The terms strong and weak refer to
the extent of variation of ionization with pH and not the strength of binding.
Strong ion exchangers are completely ionized over a wide pH range (see titration
curves on page 49) whereas with weak ion exchangers, the degree of dissociation
and thus exchange capacity varies much more markedly with pH.
Some properties of strong ion exchangers are:
Sample loading capacity does not decrease at high or low pH values due to loss
of charge from the ion exchanger.
A very simple mechanism of interaction exists between the ion exchanger and
the solute.
Ion exchange experiments are more controllable since the charge characteristics
of the media do not change with changes in pH. This makes strong exchangers
ideal for working with data derived from electrophoretic titration curves. (see
Chapter 9)
13
The resolution is defined as the distance between peak maxima compared with the
average base width of the two peaks. Elution volumes and peak widths should be
measured with the same units to give a dimensionless value to the resolution.
Rs is a measure of the relative separation between two peaks and can be used to
determine if further optimization of the chromatographic procedure is necessary.
If Rs = 1.0 (Fig. 4) then 98% purity has been achieved at 98% of peak recovery,
provided the peaks are Gaussian and approximately equal in size. Baseline resolution requires that Rs 1.5. At this value purity of the peak is 100%.
Note: A completely resolved peak is not equivalent to a pure substance. This peak
may represent a series of components which are not resolvable using the selected
separation parameter.
The resolution achievable in a system is proportional to the product of the selectivity, the efficiency and the capacity of the system, the three most important parameters to control in column chromatography. The analytical expression for Rs is:
Rs = 1/4
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Capacity factor
The capacity or retention factor k is a measure of the retention of a component
and should not be confused with loading capacity (mg sample/ml) or ionic capacity (mmol/ml).
The capacity factor is calculated for each individual peak. For example k for peak
1 in Figure 5 is derived from the equation:
VR1 - Vt
capacity factor k =
Vt
In the equation for Rs, k is the average of k1 and k2.
Adsorption techniques such as ion exchange chromatography can have high
capacity factors since experimental conditions can be chosen which lead to peak
retention volumes greatly in excess of Vt (Vt is also often denoted Vm). This can
15
be seen in contrast with the technique of gel filtration where capacity is limited
since all peaks must elute within the volume (Vt - V0).
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Fig. 5. Hypothetical chromatogram. V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1,
VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, wb1 = peak width for peak 1, wb2 =
peak width for peak 2.
Efficiency
The column efficiency is related to the zone broadening which occurs on the
column and can be calculated from the expression:
N = 5.54
VR1 2
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( )
and is expressed as the number of theoretical plates (N) for the column under specified experimental conditions. Efficiency is frequently stated as the number of
theoretical plates per metre chromatographic bed, or expressed as H (height equivalent to a theoretical plate, HETP), which is the bed length (L) divided by the
plate number.
H = L/N
Since the observed value for N depends on experimental factors such as flow rate
and sample loading, it is important that comparisons are done under identical conditions. In the case of ion exchange chromatography, efficiency is measured under
isocratic conditions, using a substance which does not interact with the matrix,
e.g. acetone.
16
One of the main causes of zone broadening in a chromatography bed is longitudinal diffusion of the solute molecules. The effect is minimized if the distances available for diffusion, in both the mobile phase and stationary phase, are minimized.
In practice this is achieved by using small uniform bead sizes and important developments in ion exchange chromatography have been the introduction of 10 m
and 15 m diameter particles such as MonoBeads and SOURCE, to give high efficiency preparative media. The highest efficiency is achieved with the non-porous,
3 m diameter MiniBeads, designed for analytical and micropreparative
applications.
After bead size, the second major contributory factor to efficiency is good experimental technique. Badly, unevenly packed chromatography beds and air bubbles
will lead to channelling, zone broadening and loss of resolution. Good separations
require well packed columns and the importance of column packing increases in
direct proportion to the performance required.
Selectivity
The selectivity (a) defines the ability of the system to separate peaks i.e. the distance between two peaks. The selectivity factor can be calculated from the chromatogram (Fig. 5) using the expression
a=
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17
Selectivity in ion exchange chromatography depends not only on the nature and
number of the ionic groups on the matrix but also on the experimental conditions,
such as pH and ionic strength. It is the ease and predictability with which these
experimental conditions, and thus the selectivity, can be manipulated which gives
ion exchange chromatography the potential of extremely high resolution.
Capacity
The capacity of an ion exchanger is a quantitative measure of its ability to take up
exchangeable counter-ions and is therefore of major importance. The capacity
may be expressed as total ionic capacity, available capacity or dynamic capacity.
The total ionic capacity is the number of charged substituent groups per gram dry
ion exchanger or per ml swollen gel. Total capacity can be measured by titration
with a strong acid or base.
The actual amount of protein which can be bound to an ion exchanger, under defined experimental conditions, is referred to as the available capacity for the gel. If
the defined conditions include the flow rate at which the gel was operated, the
amount bound is referred to as the dynamic capacity for the ion exchanger. Available and dynamic capacities depend upon:
The properties of the protein.
The properties of the ion exchanger.
The chosen experimental conditions.
The properties of the protein which determine the available or dynamic capacity
on a particular ion exchange matrix are its molecular size and its charge/pH relationship. The capacity of an ion exchanger is thus different for different proteins.
On a porous matrix used for ion exchange chromatography, molecules which are
small enough to enter the pores will exhibit a higher available capacity than those
molecules which are restricted to the charged substituents on the surface of the gel.
Similarly, since the interaction is ionic, the proteins charge/pH relationship must
be such that the protein carries the correct net charge, at a sufficiently high surface
charge density, to be bound to a particular ion exchanger under the chosen buffer
conditions.
The properties of the ion exchange matrix which determine its available capacity
for a particular protein are the exclusion limit of the matrix, and the type and
number of the charged substituents. High available capacity is obtained by having
a matrix which is macroporous and highly substituted with ionic groups which
maintain their charge over a wide range of experimental conditions. Non-porous
18
matrices have considerably lower capacity than porous matrices, but higher efficiency due to shorter diffusion distances.
The experimental conditions which affect the observed capacity are pH, the ionic
strength of the buffer, the nature of the counter-ion, the flow rate and the temperature. The flow rate is of particular importance with respect to dynamic capacity,
which decreases as the flow rate is increased. These conditions should always be
taken into consideration when comparing available capacities for different ion
exchangers.
Methodologies for determining the available and dynamic capacities for an ion
exchanger are given in Chapter 10.
19
3. Product Guide
Amersham Biosciences manufactures a wide range of ion exchange media suitable for
analytical, micropreparative, small scale preparative, and process scale applications. The product range is summarized below.
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SOURCE 15Q, SOURCE 15S, SOURCE 30Q and SOURCE 30S are strong ion
exchangers based on the same type of rigid polymer matrix as MonoBeads, polystyrene/divinyl benzene beads. SOURCE 15Q and SOURCE 15S are based on
15 m monodisperse particles while SOURCE 30Q and SOURCE 30S are based
on 30 m mondisperse particles. SOURCE ion exchange media are designed for
high performance applications at both research and industrial scales. They provide
high capacity at high flow rates and at a minimum of back-pressure, thus allowing
short cycle times, high productivity and scaleability.
SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high resolution (efficiency) is required. SOURCE 30 matrices gives, in comparison with SOURCE 15
matrices, slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressure. This makes SOURCE 30 ideal for purification with more complex samples and
larger volumes. Using SOURCE 30, a higher degree of purification can be obtained with high productivity. Typically working flow rate ranges for ion exchangers
based on SOURCE 15 and SOURCE 30 are 30-600 cm/h and 300-1000 cm/h
respectively.
20
BioProcess
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Q and SP Sepharose Big Beads are strong ion exchangers designed for industrial
applications. They are based on 100-300 m highly cross-linked 6% agarose
beads. The large particle size combined with high physical stability of the base
matrix ensures rapid processing, even for viscous samples. Sepharose Big Beads is
therefore the choice at the beginning of a purification scheme, where viscosity and
back-pressure may limit the throughput attainable with ion exchangers based on
smaller bead sizes, such as Sepharose Fast Flow ion exchangers. The medium
should be chosen when large volumes are handled and fast adsorption is required
and when resolution is of less importance.
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Bulk quantities
All Amersham Biosciences ion exchangers are available in larger pack sizes or larger
pre-packed columns. Contact your local Amersham Biosciences supplier for further
information.
Equipment
Amersham Biosciences also supply a full range of equipment for operating all of the
ion exchangers covered in this handbook. Information regarding specific equipment is available upon request from Amersham Biosciences.
22
Fig. 7. Characterization of venom from the White Faced Hornet by cation exchange chromatography (6).
Conditions: Venom (7 mg) dissolved in 50 mM BICINE, pH 8.4 (buffer A); Column,
Mono S HR 5/5; Buffer B, 0.35 M NaCl in Buffer A; Gradient, 0-100% B in 40 ml; flow
rate, 1 ml/min; detection, 280 nm at 0.05 AUFS.
MonoBeads ion exchangers are based on a 10 m beaded hydrophilic polystyrene/divinyl benzene resin which has been substituted with quaternary amine groups
to yield the strong anion exchanger, Mono Q, or with methyl sulphonate groups
to yield the strong cation exchanger, Mono S.
Note: Substitution with the same ionic groups as Polybuffer Exchanger PBE 94
gives Mono P - the matrix used for high resolution chromatofocusing. For further
information on the technique and media for chromatofocusing the reader should
contact Amersham Biosciences.
23
The name MonoBeads is derived from the unique monodisperse nature of the
matrix. This monodispersity (Fig. 8) was accomplished through a process developed by Professor John Ugelstad of SINTEF, Trondheim, Norway.
Properties
Chemical stability
The gels are stable for continuous use in the pH range 2-12, although pH values as
high as 14 can be used during cleaning and sanitizing procedures. MonoBeads can
be used with solutions of most buffers used in biochemical separations of biomolecules and in water-alcohol (C1 - C4) and acetonitrile-water solutions.
The resistance of the MonoBeads matrix to organic solvents allows complete cleaning and the use of conditions necessary for the solubilization of very hydrophobic
samples. An example of the use of MonoBeads with organic solvents is given in
Figure 9, which shows the analysis of the peptide bacitracin on Mono S using
lithium chlorate as the eluting salt and 90% methanol as the liquid phase (7).
24
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Dimethylsulphoxide (DMSO) and similar solvents can be used, but will change the
separation properties of the gels. Aqueous solutions of urea, ethylene glycol and
similar compounds can be used but will increase the back-pressures due to their
higher viscosities. Non-ionic detergents, zwitterionic detergents or detergents with
the same charge as the ion exchange groups may be used. Oxidizing agents should
be avoided.
Physical stability
MonoBeads are based on highly rigid beads which means that they can be used at
high flow rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix these
high flow rates do not result in high back-pressures. For example, an HR 5/5
column (5 mm inner diameter and 50 mm bed height) packed with a MonoBeads
matrix normally generates a back-pressure of 1.0-1.5 MPa (10-15 bar) when operated at a flow rate of 1 ml/min (300 cm/h).
Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratory
peristaltic pumps.
25
Mono Q
Mono S
Type of gel
Charged group
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH -CHOH-CH SO -
270-370
140-180
25
N.D.
65
N.D.
80
N.D.
N.D.
75
N.D.
75
90-100
90-100
>80
>80
10 0.5
10 0.5
MW range (proteins)
up to 107
up to 107
working pH range*
3-11
3-11
pH stability**
long term
2-12
2-12
short term
2-14
2-14
26
Flow rate
The rigid monodisperse nature of the media enables high flow rates to be used on
MonoBeads columns. Normal recommended flow rates for high resolution separations are in the range 150 to 600 cm/h for HR 5/5 columns. Higher flow rates
can be used during column washing and regeneration.
In addition, the absence of buffering capacity means that buffer exchange and
re-equilibration can be executed quickly and with small amounts of buffer. Details
of the recommended flow rates to be used on the different columns are given in
Table 3.
Capacity
The high substitution levels coupled with the large pore size of the matrix, the
exclusion limit for globular proteins is 107, give MonoBeads exchangers high
capacities for large proteins as well as for smaller polypeptides and peptides.
Typical saturation capacities are in the range of 60 mg protein per ml of gel and
typical sample loading capacities are in the region of 25 mg of protein per ml of
gel. Data on the saturation capacities for some specific proteins are given in
Table 2.
Table 3. Chromatographic properties of pre-packed columns of MonoBeads.
Properties
PC 1.6/5
HR 5/5
HR 10/10
HR 16/10
BioPilot Column
35/100
60/100
0.1
20
100
300
Column dimensions
i.d. x bed height (mm)
1.6x50
5x50
10x100
16x100
35x100
60x100
0.01-0.40
0.5-2.0
up to 6
up to 10
up to 32
up to 94
Number of theoretical
plates per meter (N/m)
25 000
25 000
25 000
25 000
25 000
25 000
Normal separation
times (min)
5-20
5-20
40
40
60-90
60-90
Recommended working
flow rate range (ml/min)
Max operating
pressure (MPa)
27
The titration curves for Mono Q and Mono S (Fig. 10) show no buffering capacity which means that the loading capacity does not vary with pH over the working
range of the gel.
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Fig. 10. Titration curves for Mono Q and Mono S. (Work by Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden.)
Recovery
Non-specific interactions to the MonoBeads matrix are very low and consequently recoveries are high. Recoveries of protein mass are typically 90-100% and of
protein activity greater than 80%. Examples of protein activity recoveries are
shown in Table 4.
Table 4. Protein activity recoveries (%) from MonoBeads columns.
Protein
Mono Q
Mono S
b-Glucuronidase
b-Glucosidase
Phosphodiesterase
Creatine Kinase
Enolase
Lactate Dehydrogenase
Aldolase
106
N.D.
80
90
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
93
N.D.
N.D.
95
102
94
28
Reproducibility
The stability of the MonoBeads matrix together with controlled synthesis and
column packing procedures ensure very reproducible separations both over time
and from column to column. Figure 11 shows the reproducibility of a separation
performed on three different Mono S columns.
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29
Availability
Mono Q and Mono S are available pre-packed in columns HR 5/5, HR 10/10
and HR 16/10, containing 1, 8 and 20 ml of gel respectively. The media are also
available in BioPilot Columns 35/100 and 60/100 containing respectively 100 and
300 ml bed volumes, for chromatography at BioPilot scale. MonoBeads ion
exchangers are also available as Mono Q PC 1.6/5 and Mono S PC 1.6/5, prepacked columns specially designed for micropurification on SMART System.
These columns can also be used in other high performance chromatography systems by using a column holder for Precision Columns. For further information
about the column holder, please contact your Amersham Biosciences representative.
For ordering information, see Chapter 14.
MiniBeads
MiniBeads is the base matrix for 3 m high resolution ion exchange media. This
non-porous matrix, consisting of monodisperse hydrophilic polymer beads is substituted with Q and S functional groups to give Mini Q and Mini S. Both media
are packed in Precision Columns 3.2/3 (3.2 mm inner diameter and 30 mm bed
height) for micropreparative chromatography on SMART System. With a specially designed column holder, these columns can also be used in FPLC and HPLC systems.
MiniBeads are highly efficient pH-stable adsorbents designed for high performance micropurification of proteins, peptides and polynucleotides. The monodispersity permits the use of high flow rates at relatively low back-pressures. The main
properties are listed in Table 5.
Due to the smaller particle size, Mini Q and Mini S give faster separations with
higher resolution of peaks than ion exchangers based on MonoBeads, see
Figure 12. This resolution is crucial for success when separating complex samples
in the pg to g micropreparative scale.
30
Sample:
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Fig. 12. Comparison of (A) Mini S PC 3.2/3 and (B) Mono S PC 1.6/5. Mini S PC 3.2/3
gives a faster separation and a better resolution of the peaks. Similar results have been
found with Mini Q PC 3.2/3 and Mono Q PC 1.6/5. (Work by Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden.)
Properties
Chemical stability
MiniBeads may be used in aqueous solutions and nearly all organic solutions commonly used in chromatography of proteins, oligonucleotides and peptides. As
examples, the matrix is stable to 100% acetonitrile, 75% acetic acid, 2 M NaOH
and 1 M HCl. Dimethylsulphoxide (DMSO), dimethylformamide, and formic acid
and similar solvents will change the separation properties of the gels. Aqueous
solutions of urea, ethylene glycol and similar compounds can be used but will
increase the back-pressure due to their higher viscosities. Non-ionic detergents,
zwitterionic detergents or detergents with the same charge as the ion exchange
groups may be used. Oxidizing agents should be avoided.
31
Physical stability
The combination, non-porous and monodisperse beads gives MiniBeads very high
physical stability. It has better flow kinetics and can withstand higher back-pressure
(up to 10 MPa) than MonoBeads.
Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratory
peristaltic pumps.
Table. 5. Main properties of Mini Q PC 3.2/3 and Mini S PC 3.2/3.
Properties
Mini Q PC 3.2/3
Mini S PC 3.2/3
Type of gel
Charged group
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-
60-90
16-30
3.2 x 30
0.24
0.24
3 m
3 m
1.4
N.D.
1.4
N.D.
N.D.
1.3
N.D.
1.3
1-1.5
1-1.5
200
200
70-90
70-90
working pH range*
3-11
3-11
pH stability**
long term
3-11
3-11
short term
1-14
1-14
1.0
1.0
10
10
5-20
5-20
32
Reproducibility
Figure 13 shows a long life test and reproducibility test on Mini S PC 3.2/3. Long
life and reproducibility are a result of the stabile nature of MiniBeads together
with controlled synthesis and column packing procedures.
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Column:
Sample:
Mini S PC 3.2/3
Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A,
Lysozyme 6 mg in proportions 1:3:1
20 mM acetic acid, pH 5.0
20 mM acetic acid, pH 5.0 with 0.4 M NaCl
400 ml/min
0100% B in 12 min
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Fig. 13. Long life test on Mini S PC 3.2/3. The chromatograms show the 1st, 5th and 201st
separation of a series run on the same column. The same consistently good stability and
reproducibility have been confirmed on Mini Q PC 3.2/3 (data not shown here). (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
Availability
Mini Q and Mini S are available pre-packed in Precision Columns 3.2/3. For
ordering information, see Chapter 14.
33
5. SOURCE
SOURCE ion exchangers are high performance media for fast and high resolution
separations of biomolecules such as proteins, peptides and oligonucleotides.
Examples are given in Figure 14, 18 and Figure 19.
SOURCE media are available in two
particle sizes, 15 and 30 m, and as
Column: RESOURCE S 1 ml
6.4 mm diam x 30 mm bed height
anion and cation exchangers. The
Sample: Snake venom 4 mg/ml, 0.1 ml
Flow rate: 5 ml/min (180 cm/h
strong anion exchangers SOURCE
Buffer A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8
Buffer B: Buffer A + 0.4 M NaCl
15Q and 30Q are produced by substiGradient: 0 - 100% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)
System: FPLC System
tution of the base matrices with
quaternary amino groups. For the
strong cation exchangers, SOURCE
15S and 30S, the matrices have been
substituted with methyl sulphonate
groups. Table 6 summarizes the
general properties of SOURCE ion
exchangers.
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34
Table 6. Characteristics of SOURCE 15Q and 15S, and SOURCE 30Q and 30S.
Properties
SOURCE 15Q
SOURCE 30Q
SOURCE 15S
Type of gel
Charged group
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH -CHOH-CH SO -
Matrix
Polystyrene/divinyl benzene
Bead form
15
SOURCE 30S
30
15
30
N.D.
80
80
Dynamic binding
capacity* (mg/ml gel)
Lysozyme (MW 14 500) N.D.
45
45
N.D.
N.D.
MW range (proteins)
up to 107
up to 107
up to 107
up to 107
working pH range**
2-12
2-12
2-12
2-12
pH stability***
long term
2-12
2-12
2-12
2-12
short term
1-14
1-14
1-14
1-14
1800
2000
1800
20002
Recommended working
flow rate range (cm/h)
30-600
300-1000
30-600
300-1000
4-40
4-40
4-40
A uniquely wide pore size distribution and a large specific surface area offer excellent resolution and capacity for a wide range of molecules; from small peptides
and oligonucleotides up to large proteins. The performance is well maintained at
high flow rates and high sample loads. This is illustrated in Figure 16 and 17,
which show separations of model protein mixtures on SOURCE 30Q.
35
Column:
Sample:
Sample load:
Eluent A:
Eluent B:
Flow rate:
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Fig. 16. The influence of increasing flow rate on resolution. (Work by Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden.)
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Fig. 17. The influence of increasing sample load on resolution. (Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)
SOURCE 15 and SOURCE 30 ion exchangers are designed for research and
industrial applications, with emphasis on high performance, high capacity, high
reproducibility, and easy scaleability.
In comparison with media based on SOURCE 15 matrix, SOURCE 30 gives
slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressure. This
makes SOURCE 30 ideal for purifications with more complex samples and larger
volumes. Using SOURCE 30, a high degree of purification can be obtained with
36
high productivity. SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high
resolution (efficiency) is required.
SOURCE 15 media are available in pre-packed RESOURCE columns. These
columns are convenient for lab research applications and method development.
Properties
Chemical stability
The hydrophilized polymeric matrix has high chemical stability and can be used
over a wide pH range allowing flexibility in the choice of conditions for separation.
The wide pH stability range, 1-14, allows cleaning and sanitization with harsh
agents like 1 M NaOH. Additionally, in applications such as the purification of
synthetic oligonucleotides, the wide pH stability also allows use of a high pH buffer to prevent aggregation, see Figure 18.
Column:
Sample:
Sequence:
Eluent A:
Eluent B:
Flow rate:
Gradient:
System:
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Flow rate
SOURCE media are based on highly rigid beads which allows use at high flow
rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix, these high flow
rates do not result in high back-pressures. The back-pressure from SOURCE
media is much lower than for other media of the same particle size range. The low
back-pressure offers the advantage of being able to run at very high flow rates on
medium pressure equipment, as well as with acceptable flow rates on low pressure
equipment. As an example, when a RESOURCE 1 ml column is used at the maximum flow rate of FPLC or HPLC systems (about 10 ml/min, 1800 cm/h) separations are completed in less then 3 minutes, see Figure 19. At flow rates of 1
ml/min (180 cm/h) the extremely low back-pressures (typically around 0.1 MPa,
1 bar, 15 psi) allow high resolution separations in about 20 minutes with systems
based only on a peristaltic pump, see Figure 20.
Column:
RESOURCE Q 1ml
6.40 mm diam x 30 mm bed height
Pancreatin 5 mg/ml, 0.2 ml
9.6 ml/min (1800 cm/h)
20 mM BIS TRIS PROPANE, pH 7.5
Buffer A + 0.5 ml NaCl
0 - 80% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)
FPLC
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20 mM sodium phosphate, pH 6.8
Buffer A + 0.4 ml NaCl
0 - 100% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)
GradiFrac with Peristaltic Pump P-1
Fig. 20. Separation of snake venom (Sigma) on RESOURCE S 1 ml at 1.0 ml/min (180
cm/h). System: GradiFrac equipped with Peristaltic Pump P-1. Although high performance
separations with RESOURCE Q and S do not put special demands on the pump, resolution
obtained on the column can be lost through mixing in dead spaces. Low dead volumes,
accurate gradient generation, and a good detector and fraction collector are also essential
for good results. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
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Fig. 21. Pressure versus flow rate curves that can be expected with SOURCE media. Curve
in a) shows that RESOURCE 1 ml columns can be used with high pressure equipment or
peristaltic pumps. The curves in b) are from a large scale column packed with SOURCE 15
media to 4 different bed heights. Curve c) shows the flow characteristics of the monosized
SOURCE 30 matrix compared with polysized media with mean diameters of 35 and 50 m
respectively. The pressure flow data were determined in a 100 mm i.d. column with a bed
height of 10 cm. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
POROS is a registred trademark of Perseptive Biosystems.
S HyperD F is a registred trademark of BioSepra.
39
Recommended flow rates for high resolution separations are in the range 30 to
600 cm/h for SOURCE 15Q and 15S and 300 to 1000 cm/h for SOURCE 30Q
and 30S.
Figure 21 shows pressure versus flow rate characteristics of SOURCE 15 and
SOURCE 30.
Capacity
SOURCE ion exchangers have high capacities for large proteins as well as for
smaller polypeptides, peptides and oligonucleotides. This is a result of an optimized pore size distribution, a high substitution level and a large binding surface
area. Figure 22 shows breakthrough curves at different flow rates on RESOURCE
Q and RESOURCE S.
SOURCE Q and S retain their charge and can therefore be used over a wide pH
range, 2-12, without variation in loading capacity.
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Recovery
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Chapter 12, purification of exotoxin A, the recovery in the SOURCE 30Q step
was 91%.
40
Reproducibility
Emphasis during development has been on quality, reproducibility and scaleability, features which are particularly important for industrial applications under
strict regulatory control. Through the combination of high quality assurance standards and a patented manufacturing process, the particle structure is consistent
both bead-to-bead and batch-to-batch. Modal particle diameter varies between
batches within 1 m for SOURCE 15 and 2 m for SOURCE 30. The reproducibility of a separation of a standard protein mixture performed on four different
production batches of SOURCE 30S, see Figure 23, is an example that reflects the
reproducible qualities of SOURCE media.
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Fig. 23. Quality control evaluation of 4 production batches of SOURCE 30S. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
Availability
SOURCE 15Q and 15S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml, 200 ml, 500 ml
and 1 litre. SOURCE 30Q and 30S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml,
200 ml, 1 litre, and 5 litres.
RESOURCE Q and S are pre-packed columns with SOURCE 15Q and 15S respectively. They are available in 1 and 6 ml sizes, packed to a bed height of 3 cm. For
ordering information please refer to Chapter 14.
41
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Chemical stability
Sepharose ion exchangers tolerate extreme working conditions of temperature,
pH and chemical agents. They are stable in water, salt solutions, and organic solvents. Details on the pH stability range for each gel is given in the appropriate section below.
The ion exchangers can be used in solutions of non-ionic detergents such as
Triton X-100 and with strongly dissociating solvents such as 8 M urea and 6 M
guanidine hydrochloride (9). The Sepharose based ion exchangers also tolerate
1 M acetic acid, 30% isopropanol, 30% acetonitrile, 70% ethanol and 1 M
NaOH. Under oxidizing conditions, limited hydrolysis of the polysaccharide
chains may occur.
The gel-forming fibres of agarose are stiff bundles of polysaccharide chains rather
than flexible single chains (10). For this reason the water in the gel can be replaced
by other solvents with relatively little effect on pore size. Sepharose ion exchangers
Triton is a registred trademark of Rohm and Haas Co.
42
can be used in polar organic solvents and in aqueous/organic mixtures. The gel
matrix is stable in a wide variety of solvents including ethanol, dimethylformamide, tetrahydrofuran, acetone, dimethylsulphoxide, chloroform, dichloromethane,
dichloroethane and dichloroethane/pyridine (50:50).
Sepharose is very resistant to microbial attack due to the presence of the unusual
sugar, 3,6-anhydro-L-galactose. However, most buffers can support bacterial
growth and so a antimicrobial agent should be used in storage (see page 103).
Physical stability
The highly cross-linked structure of the modern Sepharose based ion exchangers,
e.g. Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance, not only gives them
increased chemical stability but also results in improved physical stability. This
improves flow properties enormously compared to Sepharose CL-6B gels. Crosslinking prevents fluctuations in bed volume under conditions of increasing ionic
strength. Thus Sepharose ion exchangers can be regenerated and re-equilibrated
repeatedly in the column. Repacking between experiments is thus eliminated,
improving reproducibility.
Sepharose ion exchangers can be used at temperatures up to 70 C and can be sterilized repeatedly in the salt form by autoclaving at 121 C, pH 7, for 30 minutes.
43
Properties
Physical stability
The high degree of cross-linking of Sepharose High Performance renders the
media extremely stable physically. The high rigidity of the cross-linked agarose
matrix eliminates volume variations due to changes in pH or ionic strength.
Capacity
As is the case with all ion exchangers, the capacity depends upon the accessibility
of the charged groups and their number. Sepharose High Performance gels have
an exclusion limit of approximately 4 x 106 and are highly substituted with strong
ion exchange groups. Thus they remain charged and maintain consistently high
capacities for proteins over a broad working pH range (Table 7). This allows the
selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
Titration curves for Q and SP Sepharose High Performance are similar to those
for Q and SP Sepharose Fast Flow, which are shown in Figure 26.
Capacity varies from case to case depending on protein properties and flow rate.
As an example, the dynamic capacity for human serum albumin on
Q Sepharose High Performance is approximately 70 mg per ml gel at 150 cm/h
(start buffer 20 mM Tris, pH 8.2). The dynamic capacity for ribonuclease on
SP Sepharose High Performance has been estimated to 55 mg/ml gel at 150 cm/h
(start buffer 0.1 M sodium acetate, pH 6.0). The characteristics of the media are
shown in Table 7. Characteristics specific for HiLoad, HiTrap and BioPilot
columns pre-packed with Q and SP Sepharose High Performance are shown in
Table 8.
44
Q Sepharose
High Performance
SP Sepharose
High Performance
Type of gel
strong anion
strong cation
140-200
140-200
70
N.D.
55
Recommended working
flow rate range (cm/h)
up to 150
up to 150
34
34
24-44
24-44
working pH range**
2-12
4-13
pH stability***
short term
1-14
3-14
long term
2-12
4-13
Table 8. Characteristics of HiLoad, HiTrap and BioPilot columns pre-packed with Q and
SP Sepharose High Performance.
Product
HiLoad
16/10
26/10
HiTrap
1 ml 5 ml
BioPilot Column
35/100
60/100
7x25
16x25 35x100
60x100
53-58
100
300
13
20
25 70
Recommended working
flow rate range (ml/min)
up to 5
up to 13
0.3
0.3
0.3
Number of theoretical
plates per meter** (N/m)
20-22
N.D.
N.D.
0.31.1
1.1
>10 000
>10 000
45
Flow rate
The rigidity of Sepharose High Performance based ion exchangers together with
the small particle size distribution of the 34 m beads confers excellent flow properties. Flow rates achievable with Sepharose High Performance media and prepacked columns are given in Table 7 and 8.
Availability
Q and SP Sepharose High Performance are available in packs of 75 ml, 1 and
5 litres.
To ensure optimal performance and reproducibility Sepharose High Performance
media are also available in pre-packed HiLoad columns with dimensions 16 and
26 mm in internal diameter and 10 cm in bed height.
Q and SP Sepharose High Performance are also available in pre-packed, ready-touse 1 ml and 5 ml columns, HiTrap Q and HiTrap SP respectively. They are designed for method scouting, group separations, sample clean-up or sample concentration.
For pilot scale separations, Q Sepharose High Performance is available in prepacked BioPilot columns of 100 ml (35/100) and 300 ml (60/100).
SP Sepharose High Performance pre-packed in BioPilot columns 35/100 and
60/100 are available on request. For ordering information, please refer to
Chapter 14.
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Fig. 25. Partial structure of Sepharose Fast Flow ion exchange media.
46
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stability allows the gels to be used at the higher flow rates required for modern
laboratory separations as well as meeting the throughput and cleaning-in-place
requirements of process scale chromatography.
To give a complete range of ion exchange media Sepharose Fast Flow is available
with the weak exchanger groups, DEAE and CM and the strong exchanger groups
Q and SP. Figure 25 shows the partial structures of these media. Characteristics of
the different ion exchangers based on Sepharose Fast Flow is listed in Table 9.
Table 9. Characteristics of Q, SP, DEAE and CM Sepharose Fast Flow.
Product
Q Sepharose SP Sepharose
Fast Flow
Fast Flow
DEAE Sepharose
Fast Flow
CM Sepharose
Fast Flow
Type of gel
strong anion
strong cation
weak anion
weak cation
180-250
180-250
110-160
90-130
Recommended
working flow rate
range (cm/h)
100-300
100-300
100-300
100-300
Approx. mean
particle size (m)
90
90
90
90
45-165
45-165
45-165
45-165
working pH range*
2-12
4-13
2-9
6-10
pH stability**
short term
1-14
3-14
1-14
2-14
2-12
4-13
2-13
4-13
long term
* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.
Properties
Physical stability
Sepharose Fast Flow ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for packing or in pre-packed columns. The highly cross-linked nature of the matrix means
that the bead size and bed volumes do not change with changes in ionic strength
or pH.
Capacity
As is the case with all ion exchangers the capacity is dependent upon the accessibility of the charged groups and their number. Sepharose Fast Flow ion exchangers
are highly substituted and have an exclusion limit of approximately 4 x 106 giving
47
high capacity for proteins. Capacity data for Fast Flow ion exchange media are
given in Table 10. Characteristics specific for pre-packed columns with Q and SP
Sepharose Fast Flow, HiLoad columns, are shown in Table 11.
Table 10. Capacity data for Sepharose Fast Flow ion exchangers.
Ion Exchanger
180-250
180-250
110-160
90-130
N.D.
3.1
N.D.
120
N.D.
110
N.D.
110
N.D.
100
N.D.
N.D.
50
N.D.
15
N.D.
50
N.D.
30
N.D.
70
N.D.
50
HiLoad 16/10
HiLoad 26/10
20-22
53-58
10
26
Recommended working
flow rate range (ml/min)
up to 7
up to 18
0.3
0.3
Number of theoretical
plates per meter** (N/m)
>3000
>3000
Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow are highly substituted with
strong ion exchange groups. These groups remain charged and maintain consistently high capacities over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respectively. This allows the selection of a pH value and buffer that best suit the properties
of the sample. Titration curves for both gels are shown in Figure 26. The working
pH ranges for DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow are 2-9
and 6-10 respectively.
48
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Flow rate
The optimal cross-linking of Sepharose Fast Flow confers excellent flow properties on the matrix. This is illustrated in Figure 27 which shows the relationship between flow rate and operating pressure for DEAE Sepharose Fast Flow.
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Fig. 27. Flow rate as a function of pressure drop of DEAE Sepharose Fast Flow.
Column: Amersham Biosciences XK 50/30 fitted with 1/4 inch tubing. Gel bed height 15 cm.
Gel volume 294 ml. Eluent 0.1 M NaCl. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
49
Flow rates achievable with Fast Flow media are above 300 cm/h at 0.1 MPa
(1 bar) in an XK 50/30 column packed with a 15 cm high bed of gel. In laboratory
separations where the best possible separation is frequently a major consideration
this flow rate is frequently traded off against improved resolution. In industrial
processing, the high throughput properties of Sepharose Fast Flow ion exchangers
give significantly reduced cycle times and improved productivity.
Availability
DEAE and CM Sepharose Fast Flow are available in packs of 500 ml, 10 and 60
litres. Q and SP Sepharose Fast Flow are available in packs of 25 ml, 300 ml, 5
and 60 litres and are also available pre-packed in HiLoad 16/10 and 26/10
columns. Q, DEAE and CM Sepharose Fast Flow are supplied in 20% ethanol and
SP Sepharose Fast Flow in 20% ethanol with 0.2 M sodium acetate. For ordering
information, please refer to Chapter 14.
Type of gel
strong anion
strong cation
180-250
180-250
Recommended working
flow rate range (cm/h)
1200-1800
1200-1800
200
200
100-300
100-300
working pH range*
2-12
4-13
pH stability**
short term
2-14
3-14
2-12
4-13
long term
* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.
50
Properties
Physical stability
Sepharose Big Beads ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for packing. The average bead diameter is 200 m with a bead size distribution of 100300 m. The highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and
bed volumes do not change with changes in ionic strength or pH.
Capacity
Q and SP Sepharose Big Beads are highly substituted with strong ion exchange
groups. These groups remain charged and maintain consistently high capacities
over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respectively. This allows the
selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
Figure 28 shows typical binding capacities of SP Sepharose Big Beads.
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Flow rate
Because of its flow characteristics, Q and SP Sepharose Big Beads is the choice for
initial purification when high viscosity precludes the use of ion exchangers with
smaller bead size, e.g. Sepharose Fast Flow ion exchangers. Even with viscosities
as high as 2.5 times water a high flow rate (500 cm/h) is maintained in industrial
column operation.
Availability
Q and SP Sepharose Big Beads are available in packs of 1 and 10 litres. For
ordering information, please refer to Chapter 14.
51
STREAMLINE SP and
STREAMLINE DEAE
STREAMLINE adsorbents are specifically developed for expanded bed adsorption, see page 98 for details, and are based on a modified Sepharose matrix, crosslinked 6% agarose.
STREAMLINE adsorbents have been designed with a well-defined density distribution, which is required in expanded bed adsorption. This is achieved through
inclusion of inert crystalline quartz material in the base matrix. Mean particle
density is approximately 1.2 g/ml drained gel. The porosity is comparable to
Sepharose Fast Flow ion exchangers, with an exclusion limit of 4 x 106 for
globular proteins.
Table 13. Characteristics of STREAMLINE ion exchange adsorbents.
Product
STREAMLINE SP
STREAMLINE DEAE
Type of gel
strong cation
weak anion
170-240
130-210
70
N.D.
N.D.
55
200-400
200-400
- elution
50-150
50-150
200
200
100-300
100-300
working pH range**
4-13
2-9
pH stability***
short term
3-14
1-14
long term
4-13
2-13
52
Properties
Physical stability
STREAMLINE adsorbents are supplied pre-swollen and ready for use. The average bead diameter is 200 m with a bead size distribution of 100-300 m. The
highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and bed volumes
do not change with changes in ionic strength or pH.
Capacity
As is the case with all ion exchangers the binding capacity of STREAMLINE
adsorbents are dependent on each different molecules size and pI, the flow rate
etc. In general, the adsorption characteristics of STREAMLINE adsorbents are
similar to those of a packed bed in chromatography, a direct result of the stability
of the expanded bed during feed application. This is illustrated in Figure 29 which
compares the breakthrough curves for a model protein with STREAMLINE
DEAE in packed mode and expanded mode at two scales of operation.
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53
Availability
STREAMLINE SP and DEAE are available in packs of 300 ml and 7.7 litres.
For ordering information, please refer to Chapter 14.
Properties
Physical stability
DEAE and CM Sepharose CL-6B are supplied pre-swollen and ready for packing.
As stated earlier, the cross-linked nature of the matrix means that the bed volume
changes very little with changes in ionic strength or pH (approximately 2% change when the pH is reduced from 10 to 4).
54
Capacity
Since DEAE and CM Sepharose CL-6B are weak ion exchangers, the number of
ligand groups which are charged and hence the capacity for macromolecules is
dependent upon pH. This dependency is illustrated by the titration curves for
DEAE and CM Sepharose CL-6B (Fig. 31).
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Fig. 31. Titration curves; Approximately 5 ml DEAE and CM Sepharose CL-6B both in
50 ml 1 M KCl. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
The working pH ranges for the media are 2-9 for DEAE Sepharose CL-6B and
6-10 for CM Sepharose CL-6B.
DEAE and CM Sepharose CL-6B have exclusion limits of approximately
4 x 106. Capacity data for Sepharose CL-6B ion exchangers are summarized in
Table 14.
55
CM Sepharose CL-6B
130-170
100-140
2.0
N.D.
N.D.
9.5
N.D.
75
170
N.D.
150
N.D.
N.D.
120
up to 60
90
90
45-165
45-165
working pH range**
2-9
6-10
pH stability***
short term
2-14
2-14
long term
3-12
4-13
Flow rate
The cross-linked structure of Sepharose CL-6B ion exchangers allows flow rates of
up to 100 cm/h to be used. Figure 32 illustrates the variation of flow rate with
pressure drop for DEAE and CM Sepharose CL-6B.
56
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Fig. 32. Flow rate as a function of pressure drop in columns (5x10 cm bed volume) of
DEAE and CM Sepharose CL-6B. pH 7.0; Ionic strength 0.02. (Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)
As in all types of chromatography, resolution is dependent on flow rate (5). Therefore in applications where resolution is critically important high flow rates should
be avoided or an exchanger based on Sepharose High Performance used.
For applications where high flow rates and large throughput of material are required, ion exchangers based on Sepharose Fast Flow or Sepharose Big Beads should
be used since these forms have been specially developed with these criteria in
mind.
Availability
DEAE and CM-Sepharose CL-6B are available in packs of 500 ml and 10 litres.
The gels are supplied in 20% ethanol. For ordering information, please refer to
Chapter 14.
57
7. DEAE Sephacel
DEAE Sephacel is a bead-formed cellulose ion exchanger produced from high
purity microcrystalline cellulose. Cellulose is a naturally occurring polymer consisting of b(1-4) linked glucose units. In the native state, adjacent polysaccharide
chains are extensively hydrogen bonded, forming microcrystalline regions. These
regions are interspersed with amorphous regions with less hydrogen bonding.
Limited acid hydrolysis results in preferential loss of the amorphous regions and
gives so-called microcrystalline cellulose.
During the production of DEAE Sephacel the microcrystalline structure is broken
down and the cellulose is regenerated to give a bead-formed (40-160 m) gel. The
gel is strengthened by cross-linking with epichlorohydrin, although the main structure-forming bonds are still hydrogen bonds. Functional groups are attached
during the synthesis by ether linkages to glucose units of the polysaccharide chains
to give the structure shown in Figure 33.
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Properties
Chemical stability
DEAE Sephacel is stable in aqueous suspension within the range pH 2-12. Hydrolysis may occur in strongly acidic solutions and the macromolecular structure is
broken down in strongly alkaline solutions. The free base form of the DEAE
group is inherently unstable at high pH values. Strong oxidizing agents should be
avoided.
DEAE Sephacel is susceptible to microbial attack, especially in the presence of
phosphates, and should therefore be stored in the presence of antimicrobial agents
when not in use (see page 103). Samples containing enzymes capable of hydrolysing b-glucosidic linkages should be purified on MonoBeads, MiniBeads,
SOURCE, Sepharose or Sephadex based ion exchangers.
58
Physical stability
The cross-linked bead form of DEAE Sephacel gives it increased physical stability
compared to ordinary microgranular celluloses. It has a stable bed volume over a
wide range of ionic strengths (approx. 5% change between I = 0.05 and I = 0.5)
and pH values and can therefore be re-equilibrated in the column.
DEAE Sephacel can be sterilized by autoclaving at pH 7 for 30 minutes at 121 C.
During autoclaving, minute quantities of carbohydrate are released; these can be
washed away with sterile buffer solution.
Capacity
DEAE Sephacel is macroporous and has an exclusion limit for proteins with molecular weights of approximately 1 x 106. The binding of substances with molecular
weights substantially greater than 1 x 106 will be restricted to charged groups on
the surface of the beads. Capacity data for DEAE Sephacel is summarized in
Table 15.
Table 15. Capacity data for DEAE Sephacel.
Total ionic capacity
DEAE Sephacel
(mol/mg gel)
(mol/ml gel)
130-150
100-140
160
10
*Capacity was determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. The
starting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3 Limit buffer was start buffer containing 2.0 M NaCl.
The adsorption kinetics for bead-formed cellulose ion exchangers are substantially
the same as for conventional cellulose ion exchangers (11). As with other weak ion
exchangers the capacity varies with pH. The titration curve for DEAE Sephacel is
shown in Figure 34.
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59
Flow rate
As with other ion exchangers, resolution decreases with increasing flow rate. Flow
rates of 10 cm/h are usually suitable for the resolution of protein mixtures on
DEAE Sephacel. Figure 35 illustrates the variation of flow rate as a function of
pressure drop for DEAE Sephacel. For applications requiring higher flow rates
SOURCE or Sepharose based ion exchangers should be used.
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Fig. 35. Flow rate as a function of the pressure drop across beds of DEAE Sephacel.
0.1 M Tris-HCl buffer solution pH 7.6. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
Availability
DEAE Sephacel is supplied in packs of 500 ml as a suspension in 20% ethanol.
For ordering information, please refer to Chapter 14.
60
Description
Functional groups
Counter ion
DEAE
Sephadex
A-25
A-50
Weakly basic
anion exchanger
Diethylaminoethyl
Chloride
QAE
Sephadex
A-25
A-50
Strongly basic
anion exchanger
Diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl
Chloride
CM
Sephadex
C-25
C-50
Weakly acidic
cation exchanger
Carboxymethyl
Sodium
SP
Sephadex
C-25
C-50
Strongly acidic
cation exchanger
Sulphopropyl
Sodium
Properties
Chemical stability
Sephadex ion exchangers are insoluble in all solvents. They are stable in water, salt
solutions, organic solvents, alkaline and weakly acidic solutions. In strongly acidic
solutions, hydrolysis of the glycosidic linkages may occur and thus pH values
below 2 should be avoided, particularly at elevated temperatures. Sephadex ion
exchangers can also be used in the presence of denaturing solvents which can be
important when substances are to be separated on the basis of their electrostatic
properties alone (12, 13, 14).
Exposure to strong oxidizing agents or dextranases should be avoided. During
regeneration, the ion exchanger can be exposed to 0.2 M NaOH for a short time
61
Physical stability
Swollen Sephadex ion exchangers can be sterilized by autoclaving for up to 30 min
at 121 C, at neutral pH in the salt form. During autoclaving, minute quantities of
carbohydrate are released; these can be washed away with sterile buffer.
Swelling
The swelling properties of Sephadex ion exchangers are related to those of the
parent Sephadex G-types, those based on 50-types swelling more than those based
on 25-types. Due to the presence of charged groups in the matrix, the swelling
varies with ionic strength and pH.
pH dependence
The degree of dissociation and hence the extent to which an ion exchanger is charged is dependent on pH. Repulsion between charged groups is greatest at pH values where the ion exchanger is fully dissociated, and decreases at pH values close to
the pK of the charged groups.
Note: QAE Sephadex and SP Sephadex have swelling properties quite independent
of pH since they are charged over a very wide pH range.
Capacity
Due to differences in swelling characteristics, ion exchangers based on Sephadex
G-25 have a much higher ionic capacity per ml gel than those based on Sephadex
G-50. (Table 17).
62
Table 17. Total ionic capacity data for Sephadex based ion exchangers.
Ion exchanger
DEAE
A-25
Sephadex
A-50
QAE
A-25
Sephadex
A-50
CM
C-25
Sephadex
C-50
SP
C-25
Sephadex
C-50
3.5 0.5
500
175
3.0 0.4
500
100
4.5 0.5
550
170
2.3 0.3
300
90
Thus for smaller biomolecules (MW < 30 000) the A-25 and C-25 types have a
higher available capacity. In the molecular weight range 30 000 to 100 000 however, the A-50 and C-50 exchangers have higher available capacities due to their
larger pore size.
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Fig. 36. Titration of 0.1 gram of Sephadex ion exchangers in 50 ml 1 M KCl. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
63
If working with larger molecules (MW > 100 000), a higher available capacity is
frequently observed with the A-25 and C-25 types since at these molecular weights
binding is only occurring on the bead surface and the higher ionic capacity can be
used to advantage.
As capacity also depends upon the number of substituent groups which are charged under given buffer conditions, it will also vary with pH. The variation of the
charge on Sephadex ion exchangers with pH is illustrated by their titration curves
(Fig. 36).
Dynamic capacity data for Sephadex ion exchangers are given in Table 18.
Table 18. Dynamic capacity (mg/ml wet gel) data for Sephadex ion exchangers
Protein
(MW)
Thyroglobulin
(669 000)
HSA
(68 000)
a-lactalbumin
(14 300)
IgG
(160 000)
Bovine COHb
(69 000)
Ion exchanger
A-25
1.0
30.0
140.0
N.D.
N.D.
Sephadex A-50
DEAE
2.0
110.0
50.0
N.D.
N.D.
A-25
1.5
10.0
110.0
N.D.
N.D.
Sephadex A-50
QAE
1.2
80.0
30.0
N.D.
N.D.
C-25
N.D.
N.D.
N.D.
1.6
70.0
Sephadex C-50
CM
N.D.
N.D.
N.D.
7.0
140.0
SP
C-25
N.D.
N.D.
N.D.
1.1
70.
Sephadex C-50
N.D.
N.D.
N.D.
8.0
110.0
Availability
Sephadex ion exchangers are supplied as dry powders in packs of 100 g and 500 g.
Bulk quantities of 5 kg or more are available on request. For ordering information, please refer to Chapter 14.
64
9. Experimental design
Choice of ion exchanger
No single ion exchanger is best for every separation. The choice of matrix and
ionic substituent depends on:
1. The specific requirements of the application
2. The molecular size of the sample components
3. The isoelectric points of the sample components
65
Scaleability
Frequently ion exchange separations are carried out initially on a small scale to
optimize conditions before committing the sample to full scale separations. It is
thus important to choose an ion exchanger which will allow simple and convenient scale up so that methods established on a small column can be applied more or
less directly to the larger column. Detailed information on scaling up ion exchange
separations is given in Chapter 11.
66
Reproducibility
Reproducibility is obtained when the characteristics of the chromatography bed
remain unchanged during the course of the separation and during regeneration of
the column. The more rigid varieties of Amersham Biosciences ion exchangers, such as
MiniBeads, MonoBeads, SOURCE, Sepharose High Performance, Sepharose Fast
Flow and Sepharose Big Beads, show no changes in bed size with changes in pH
and ionic strength and can thus be washed and regenerated in the columns providing additional reproducibility.
The use of media which are supplied pre-packed and tested, such as MiniBeads,
MonoBeads, RESOURCE, HiTrap columns pre-packed with Sepharose High Performance and HiLoad columns pre-packed with Sepharose High Performance or
Sepharose Fast Flow assures reproducibility since variability in column packing is
eliminated.
Economy
Column or batch procedures in which the ion exchanger is used once and thrown
away, as well as applications requiring large amounts of gel, may make economy a
major consideration. Sephadex A-50 and C-50 ion exchangers are the least expensive in terms of bed volume, followed by Sephadex A-25 and C-25 ion exchangers.
Using expanded bed adsorption, STREAMLINE product line, reduces the number
of operations in a process by fusing the function clarification, concentration and
adsorption into one operation. It offers process developers the selectivity afforded
by chromatography, the throughput of ultra-filtration and the convenience of
small scale centrifugation.
67
The exclusion limits for the different media and subsequent effects on available
capacity are given in the relevant sections covering each gel type.
When working with samples of unknown molecular weight the use of
MonoBeads, SOURCE and Sepharose based ion exchangers is recommended since
they are particularly easy to handle and have good capacities over a large molecular weight range.
The pH of the buffer thus determines the charge on amphoteric molecules during
the experiment. In principle therefore, one could use either an anion or a cation
exchanger to bind amphoteric samples by selecting the appropriate pH. In practice
however, the choice is based on which exchanger type and pH give the best separation of the molecules of interest, within the constraints of their pH stability.
68
Methods for determining the optimum pH and corresponding ion exchanger type
are discussed later in this chapter.
Many biological macromolecules become denatured or lose activity outside a certain pH range and thus the choice of ion exchanger may be limited by the stability
of the sample. This is illustrated in Figure 37. Below its isoelectric point a protein
has a net positive charge and can therefore adsorb to cation exchangers. Above its
pI the protein has a net negative charge and can be adsorbed to anion exchangers.
However, it is only stable in the range pH 5-8 and so an anion exchanger has to be
used.
In summary:
1. If the sample components are most stable below their pIs, a cation exchanger
should be used.
2. If they are most stable above their pIs, an anion exchanger should be used.
3. If stability is high over a wide pH range on both sides of pI, either type of ion
exchanger can be used.
69
4. Equilibrate the gel in each tube at a lower ionic strength (0.05 M for Sephadex
or 0.01 M for Sepharose and Sephacel ion exchangers) by washing 5 times with
10 ml of buffer of the same pH but lower ionic strength.
5. Add a known constant amount of sample to each tube.
6. Mix the contents of the tubes for 5-10 minutes.
7. Allow the gel to settle.
8. Assay the supernatant for the substance of interest. The results may appear as
shown in Figure 38 (a).
The pH to be used in the experiment should allow the substance to be bound, but
should be as close to the point of release as possible. If too low (or high) a pH is
chosen, elution may become more difficult and high salt concentrations may have
to be used. In Figure 38 the buffer chosen should be pH 7.0.
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If maximum separation is observed at a pH where the sample molecules are positively charged, i.e. below their isoelectric points, maximum resolution will be obtained using a cation exchanger such as Mono S, SOURCE S or SP Sepharose Fast
Flow.
If the largest difference in electrophoretic mobility is found at a pH where the
components of interest are negatively charged, i.e. above their isoelectric points,
an anion exchanger such as Mono Q, SOURCE Q or Q Sepharose Fast Flow
should be chosen.
If maximum separation of the curves occurs at the position of sample application
i.e. at the isoelectric points of the molecules, then maximum resolution may be
achieved using the technique of chromatofocusing. Further information on techniques and media for chromatofocusing is available on request.
Measurement of pH can be done using a surface electrode or by running pI calibration proteins as a narrow band at the top or bottom of the slab gel during the
first dimension electrophoresis as the pH gradient is established in the gel. This
section of the gel is removed and stained before the sample is applied for the
second dimension electrophoresis and then afterwards replaced to estimate pH
values.
Staining the titration curve with a general protein stain such as Coomassie Blue
does not give any information about the charge/pH relationship for specific proteins unless they can be clearly identified by their isoelectric points. To gain positive identification it is necessary to use a specific detection technique such as zymographic analysis or immunofixation as illustrated in Figure 42.
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73
Since the lines on the ETC reflect the degree of charge of the components at different pHs, the curves may be used to predict the order in which the components
will be eluted from the column. The molecular species with the lowest electrophoretic mobility at a certain pH has logically the lowest charge at that particular pH
and should be the first substance eluted from the column in the gradient. Similarly
the species showing highest electrophoretic mobility will be the most strongly
retained on a column of opposite charge and should be eluted last. The order in
which solutes are eluted cannot be predicted with 100% certainty from the titration curve since electrophoretic mobility depends on the total net charge on a
molecule and ion exchange chromatography depends on the net charge on the
solutes surface.
74
A 280nm
A 280nm
a)
Mono S
pH 3.0
A280nm
b)
Mono S
pH 5.0
f)
Mono Q
pH 11.0
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11
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Mono Q
75
Choice of buffer
As with the choice of ion exchanger, there are a number of variables which have to
be considered. These include:
1. The choice of buffer pH and ionic strength.
2. The choice of buffering substance.
3. The price of the buffer if it is to be used in production process.
76
In the case of pre-packed ion exchangers and columns which can be run conveniently quickly, trial experiments using salt gradients will allow the determination of
an optimal starting ionic strength.
In the case of Sephadex based exchangers for batch applications or where column
running times are prohibitively long, a simple test-tube technique is recommended
as a test for a suitable ionic strength.
77
Substance
Conc.
(mM)dT
2.00
2.88
3.13
3.81
*3.75
*4.21
*4.76
*5.68
*7.20
1.5-2.5
2.38-3.38
2.63-3.63
3.6-4.3
3.8-4.3
4.3-4.8
4.8-5.2
5.0-6.0
6.7-7.6
Maleic acid
Malonic acid
Citric acid
Lactic acid
Formic acid
Butanedioic acid
Acetic acid
Malonic acid
Phosphate
20
20
20
50
50
50
50
50
50
*7.55
*8.35
7.6-8.2
8.2-8.7
HEPES
BICINE
50
50
dpKa/
(C)
Counter-ion
Comments
Dicarboxylic acid
Dicarboxylic acid
Dicarboxylic acid
-0.0028
Na+
Na+/Li+
Na+
Na+
Na+/Li+
Na+
Na+/Li+
Na+/Li+
Na+
-0.0140
-0.0180
Na+/Li+
Na+
Dicarboxylic acid
Often needs
purification
before use
Zwitterionic
Zwitterionic
Comments
-0.0024
+0.0002
-0.0018
+0.0002
Substance
Conc.
(mM)dT
dpKa/
(C)
Counter-ion
*4.75
4.5-5.0
20
-0.015
Cl-
*5.68
*5.96
*6.46
*6.80
*7.76
5.0-6.0
5.5-6.0
5.8-6.4
6.4-7.3
7.3-7.7
N-methyl
piperazine
Piperazine
L-histidine
bis-Tris
bis-Tris propane
Triethanolamine
20
20
20
20
20
-0.015
*8.06
7.6-8.0
Tris
20
-0.028
Cl-/HCOOClClClCl-/
CH3COOCl-
*8.52
8.0-8.5
N-methyldiethanolamine
50
-0.028
SO2-/Cl-/
CH3COO-
*8.88
8.4-8.8
Diethanolamine
-0.025
Cl-
*8.64
8.5-9.0
20 at pH 8.4
50 at pH 8.8
20
-0.031
Cl-
20
20
20
-0.029
-0.026
-0.026
ClClCl-
20
20
-0.031
-0.026
ClCl-
*9.50
*9.73
*10.47
11.12
12.33
1,3-diaminopropane
9.0-9.5
Ethanolamine
9.5-9.8
Piperazine
9.8-10.3 1,3-diaminopropane
10.6-11.6 Piperadine
11.8-12.0 Phosphate
-0.017
-0.020
78
Often needs
purification
before use and
especially
sensitive to
temperature
change.
Substance
Counter-ion
2.0
Formic acid
H+
2.3-3.5
Pyridine/formic acid
3.0-5.0
Trimethylamine/formic acid
HCOOHCOO-
3.0-6.0
Pyridine/acetic acid
CH3OO-
4.0-6.0
Trimethylamine/acetic acid
6.8-8.8
Trimethylamine/HCl
CH3COOCl-
7.0-8.5
Ammonia/formic acid
HCOO-
8.5-10.0
Ammonia/acid
7.0-12.0
Trimethylamine/CO2
CH3COOCO -
7.0-12.0
Triethylamine/CO2
CO3-
7.9
Ammonium bicarbonate
8.0-9.5
Ammonium carbonate/ammonia
HCO3CO -
8.5-10.5
Ethanolamine/HCl
Cl-
8.9
Ammonium carbonate
CO3-
79
Column chromatography
Choice of column
Good results in column chromatography are not solely dependent on the correct
choice of gel media. The design of the column and good packing technique are also
important in realising the full separation potential of any gel. These factors are
built into the pre-packed columns supplied by Amersham Biosciences and should be
considered before packing a chromatography column in the laboratory.
Column design
The material used in the construction of the column should be chosen to prevent
destruction of labile biological substances and minimize non-specific binding to
exposed surfaces. The bed support should be designed so it is easily exchangeable
to restore column performance whenever contamination and/or blockage in the
column occurs. Bed supports made from coarse sintered glass or glass wool cannot
be recommended because they soon become clogged, are difficult to clean and
cause artifacts (22). Dead spaces must be kept to a minimum to prevent re-mixing
of separated zones.
The pressure specifications of the column have to match the back-pressure generated in the packed bed when run at optimal flow rate. This is particularly important
when using high performance media with small bead size.
Amersham Biosciences has developed a series of standard columns suitable for ion
exchange chromatography. All are easy to dismantle and reassemble to allow thorough cleaning, which is a particularly important aspect when handling biological
samples.
Further information on the full range of Amersham Biosciences chromatography
columns are available upon request.
Larger chromatography columns, specially designed for pilot and process scale
chromatography are also available. Some aspects regarding process scale columns
are described in Chapter 11.
80
Column dimensions
As for most adsorptive, high selectivity techniques, ion exchange chromatography
is normally carried out in short columns. A typical ion exchange column is packed
to a bed height of 5-15 cm. Once the separation parameters have been determined,
scale-up is easily achieved by increasing the column diameter.
81
Columns of 100 ml(35/100) and 300 ml (60/100). SP Sepharose High Performance pre-packed in BioPilot Columns are available on request. For the above mentioned pre-packed columns, the preparation consists of washing out the 20% ethanol
packing solution with 5 column volumes of start buffer.
Alternative counter-ions
If ion exchangers are to be used with counter-ions other than those supplied (i.e.
other than sodium or chloride) then the following procedure should be used.
Suspend the required amount of ion exchanger in and excess of 0.5-1.0 M solution
of a salt of the new counter-ion. After sedimentation and decantation, re-suspend
the ion exchanger in the buffer to be used in the experiment. Decant and re-suspend
the ion exchanger in this buffer several times.
Decantation of fines
Decantation of fines is not necessary with any Amersham Biosciences ion exchangers.
82
()
N = 5.54 x
wh
H = L/N
where
VR is the volume eluted from the start of sample application to the peak maximum
and wh is the peak width measured as the width of the recorded peak at half of the
peak height, see Figure 44. L is the height of the packed bed.
Measurements of VR and wh can be made in distance (mm) or volume (ml) but
both parameters must be expressed in the same unit.
83
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As a general rule of thumb, a good H value is about two to three times the mean
bead diameter of the gel being packed. For a 90 m particle packing, this means
an H value of 0.018-0.027 cm.
Another useful parameter for testing the packed bed is the symmetry factor (As)
As =
b
a
where
a = 1st half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)
b = 2nd half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)
As should be as close as possible to 1. A reasonable As value for a short column
such as an IEX column is 0.80-1.80. (For longer gel filtration columns it will probably fall within 0.70-1.30).
An extensive leading edge is usually a sign that the gel has been packed too tightly
and extensive tailing is usually a sign that the gel has been packed too loosely.
84
Sample preparation
Sample concentration
The amount of sample which can be applied to a column depends on the dynamic
capacity of the ion exchanger and the degree of resolution required. For the best
resolution it is not usually advisable to use more than 10-20% of this capacity
(23). Information on the available capacities for the different exchangers is given
in the relevant product sections. Methods for determining available and dynamic
capacities are given later in this chapter.
Sample composition
The ionic composition should be the same as that of the starting buffer. If it is not,
it can be changed by gel filtration on Sephadex G-25 using e.g. Amersham Biosciences
Disposable Column PD-10, Fast Desalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting
Columns, dialysis, diafiltration or possibly by addition of concentrated start buffer.
Sample volume
If the ion exchanger is to be developed with the starting buffer (isocratic elution),
the sample volume is important and should be limited to between 1 and 5% of the
bed volume. If however, the ion exchanger is to be developed with a gradient, starting conditions are normally chosen so that all important substances are adsorbed
at the top of the bed. In this case, the sample mass applied is of far greater importance than the sample volume. This means that large volumes of dilute solutions,
such as pooled fractions from a preceding gel filtration step or a cell culture supernatant can be applied directly to the ion exchanger without prior concentration.
Ion exchange thus serves as a useful means of concentrating a sample in addition
to fractionating it.
If contaminants are to be adsorbed, and the component of interest is allowed to
pass straight through, then the sample volume is less important than the amount
of contaminant which is present. Under these conditions there will be no concentration of the purified component, rather some degree of dilution due to diffusion.
Sample viscosity
The viscosity may limit the quantity of sample that can be applied to a column. A
high sample viscosity causes instability of the zone and an irregular flow pattern.
The critical variable is the viscosity of the sample relative to the eluent. A rule of
thumb is to use 4 cP as the maximum sample viscosity. This corresponds to a protein concentration of approximately 5%. Approximate relative viscosities can be
quickly estimated by comparing emptying times from a pipette.
85
If the sample is too viscous, due to high solute concentration, it can be diluted
with start buffer. High viscosity due to nucleic acid contaminants can be alleviated
by precipitation with a poly-cationic macromolecule such as polyethyleneimine or
protamine sulphate. Nucleic acid viscosity can also be reduced by digestion with
endonuclease. Such additives may however be less attractive in an industrial process since they will have to be proven absent from the final product.
Sample preparation
In all forms of chromatography, good resolution and long column life time depend
on the sample being free from particulate matter. It is important that dirty samples are cleaned by filtration or centrifugation before being applied to the column.
This requirement is particularly crucial when working with small particle matrices, such as MiniBeads (3m), MonoBeads (10 m), SOURCE (15 and 30 m) and
Sepharose High Performance (34m).
The grade of filter required for sample preparation depends on the particle size
of the ion exchange matrix which will be used. Samples which are to be separated
on a 90 m medium can be filtered using a 1 m filter. For 3, 10, 15, 30 and 34 m
media, samples should be filtered through a 0.45 m filter. When sterile filtration
or extra clean samples are required, a 0.22 m filter is appropriate.
Samples should be clear after filtration and free from visible contamination by
lipids. If turbid solutions are injected onto the column, the column lifetime, resolution and capacity can be reduced. Centrifugation at 10 000 g for 15 minutes can
also be used to prepare samples. This is not the ideal method of sample preparation but may be appropriate if samples are of very small volume or adsorb nonspecifically to filters.
Note: The latter may indicate that the substance in question may also adsorb
strongly to chromatography matrices. Care should therefore be taken and perhaps
a buffer additive such as glycerol or a detergent used.
Crude samples containing lipids, salts, etc. can be passed through a suitably sized
column of Sephadex G-25 e.g. Amersham Biosciences Desalting Column PD-10, Fast
Desalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting Column. Preliminary sample
clean-up can be achieved simultaneously in this way.
In expanded bed adsorption sample preparation is not as crucial as for column
chromatography. Samples can be applied directly to the expanded bed without
prior sample preparation, e.g. filtration, centrifugation etc. (Expanded bed
adsorption is described in detail on page 98.)
86
Sample application
There are a number of ways to apply the sample.
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Sample applicators SA-5, SA-50. These are reservoirs which, used in combination
with a suitable valve, e.g. SRV-4, allow the sample to be introduced via a closed
sample loop system using a pump (Fig. 45). As well as their large capacity (up to 6
ml for the SA-5 and 45 ml for the SA-50) the sample applicator offers the advantage of serving as a pulse damper and bubble trap.
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87
Superloops can be used together with the manual valves V-7 and IV-7 or the motorised valves MV-7 and IMV-7 when larger volumes of sample have to be applied
(Fig. 47). Superloops are available with capacities of 10, 50 and 150 ml. (The 150
ml Superloop is most often used in BioPilot System.)
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Syringe method (Fig. 48). The valves LV-3 and LV-4 can be used as syringe holders
to give a very simple method for the application of small samples in standard chromatography. Using this method the sample is allowed to run onto the column
under gravity.
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88
Sample reservoir (Fig. 49). In a similar way, a sample reservoir (e.g. R9, RK 16/26)
can be connected via a 3-way valve to apply larger samples.
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the tubing just above the surface and slowly pressing out the sample. Note that the
sample must be denser than the eluent or made denser by the addition of a sugar,
e.g. glucose (24). The column can then be connected for elution.
Elution
If starting conditions are chosen such that only unwanted substances in the sample
are adsorbed, then no change in elution conditions is required since the substance
of interest passes straight through the column. Similarly no changes are required if
sample components are differentially retarded and separated under starting conditions. This procedure is termed isocratic elution, and the column is said to be developed under starting conditions. Isocratic elution can be useful since no gradient
apparatus is required for the run and, if all retarded substances elute, regeneration
is not required.
Normally, however, separation and elution are achieved by selectively decreasing
the affinity of the solute molecules for the charged groups on the gel by continuously changing either buffer pH or ionic strength or possibly both. This procedure
is termed gradient elution.
Change of pH
As shown in Figure 37 on page 68, the net charge on a molecule depends on pH.
Thus altering the pH towards the isoelectric point of a substance causes it to lose
its net charge, desorb, and elute from the ion exchanger. Figure 50 shows use of a
decreasing pH gradient in separation of haemocyanin fractions (25).
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the column. The solubility of the sample components at the pH and salt concentrations to be used during separation should always be tested in advance.
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Gradient direction
Guidelines for the choice of ascending or descending gradients are given in
Table 21.
Table 21. Choosing the direction of the gradient for elution.
Ion exchanger
Direction of
pH gradient
Direction of
ionic strength gradient
Anion exchanger
decreasing
increasing
Cation exchanger
increasing
increasing
91
Stepwise ionic strength gradients are produced by the sequential use of the same
buffer at different ionic strengths. Stepwise elution is technically simple and offers
the potential of high resolution in preparative applications. Care must be exercised in the design of the steps and the interpretation of results since substances eluted by a sharp change in pH or ionic strength elute close together. Peaks tend to
have sharp fronts and pronounced tailing since they frequently contain more than
one component. Tailing may lead to the appearance of false peaks if a buffer change is introduced too early. For these reasons a first separation using a continuous
gradient is always recommended as a means of characterising the sample and an
indication of suitable steps. The differences between continuous and stepwise gradient elution are shown in Figure 52.
Continuous pH gradients are difficult to produce at constant ionic strength, since
simultaneous changes in ionic strength, although small, also occur. Linear pH gradients cannot be obtained simply by mixing buffers of different pH in linear volume ratios since the buffering capacities of the systems produced are pH dependent.
A relatively linear gradient can be produced over a narrow pH interval (Max.
2 pH units) by mixing two solutions of the same buffer salt adjusted, respectively,
to 1 pH unit above and 1 pH unit below the pKa for the buffer.
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Fig. 52. Continuous and stepwise gradient elution of b-galactosidase from Escherichia coli
on Mono Q HR 5/5 (26). (Reproduced by kind permission of the authors and publisher.)
92
Continuous ionic strength gradients are the most frequently used type of elution in
ion exchange chromatography. They are easy to prepare and very reproducible.
Two buffers of differing ionic strength, the start and limit buffers, are mixed together and if the volume ratio is changed linearly, the ionic strength changes linearly.
The limit buffer may be of the same buffer salt and pH as the start buffer, but at
higher concentration, or the start buffer containing additional salt e.g. NaCl.
Gradient elution generally leads to improved resolution since zone sharpening
occurs during elution. In all forms of isocratic elution, a limiting factor with
regards to achievable resolution is zone broadening as a result of longitudinal diffusion. In gradient elution, the leading edge of a peak is retarded if it advances
ahead of the salt concentration or pH required to elute it. In contrast the trailing
edge of the peak is exposed to continuously increasing eluting power. Thus the
trailing edge of the peak has a relatively higher speed of migration, resulting in
zone sharpening, narrower peaks and better resolution.
Gradient elution also reduces zone broadening by diminishing peak tailing due to
non-linear adsorption isotherms.
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Fig. 53. Effect of gradient slope on resolution. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden).
94
Concave gradients can be used to improve resolution in the first part of the gradient or to shorten the separation time when peaks in the latter part of the gradient
are more than adequately separated.
Complex gradients can be generated to use the maximum resolution offered by
isocratic resolution when required combined with steeper gradient portions where
resolution is adequate or unnecessary (Fig. 54). Complex gradients offer the maximum flexibility in terms of combining resolution with speed during the same separation. A knowledge of the chromatographic behaviour of the sample obtained
from previous separations using simpler gradients is essential.
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Sample displacement
When a sample of solutes, such as proteins, is applied to the top of an ion
exchange column the species with the highest charge density will bind at the top,
displacing more weakly bound species or preventing such from binding.
In effect a degree of separation occurs on the column during sample loading, with
the solutes stacked on the column in order of their relative charges and strengths
of binding.
On application of a gradient the increasing salt concentration will cause the most
weakly bound molecules to migrate and leave the column first. For this reason
reverse flow elution should never be used in the ion exchange separation of
complex mixtures. Under such conditions early desorbing substances would have
to migrate through all other bound species, possibly displacing them, and lead to
lost resolution.
95
Gradient generation
Accurate and reproducible pH and ionic strength gradients are best formed using
purpose designed equipment. The choice of gradient generating system will
depend upon the type of ion exchange media and the required complexity of the
gradient.
Gradient formation with two pumps or a single pump in combination with a switch valve
Maximum flexibility in terms of gradient production is achieved by using two
separate pumps for start and limit buffers or a single pump in combination with a
switch valve.
Using gradient programmers, e.g. GP-250 Plus or LCC-501 Plus, or using chromatography systems which are controlled via a controlling software, e.g. UNICORN
and FPLCdirector, the proportions of the start and limit buffers which constitute
the eluent being supplied to the column are programmed for specific times or volumes during the separation. The relative amounts of start and limit buffer then
increase or decrease in a linear fashion between two such breakpoints to produce the gradient. The more breakpoints which have been programmed the more
complex the gradient.
Further information on controlling software, gradient programmers and related
pump systems is available from Amersham Biosciences.
Gradient Mixer
The Amersham Biosciences Gradient Mixer
GM-1 can be used to make linear ionic
strengthen or pH gradients of up to 500 ml
in volume (Fig. 55). The mixing chamber
should contain the starting buffer and
the other chamber the limiting buffer.
Although the Gradient Mixer GM-1 will
not produce linear pH gradients it can be
used to form reproducible continuous
pH gradients from two solutions of
different pH and similar ionic strength.
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Fig. 56. Gradient from pH 10.5 to 7.5 in 400 ml produced using the Gradient Mixer GM-1.
pH , conductance - - -. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
Batch separation
There is essentially no difference in separation procedure between a column developed by stepwise elution and a batch procedure. Either the substance of interest
or contaminants may be attached to the ion exchanger.
Although batch procedures are less efficient than column techniques they may
offer advantages in particular cases. When very large sample volumes with low
protein concentration have to be processed, the sample application time on a
column can be very long and filtration of such a large sample can also be rather
difficult to perform. Binding the sample in batch mode will be much quicker and
there will be no need to remove particulate matter.
A batch procedure can also be an attractive approach if high sample viscosity
generates high back-pressure in a column procedure or if high back-pressure is
generated by contaminants such as lipids, which may cause severe fouling and
clogging of the column.
Batch separation is a very rapid technique and no technical difficulties are caused
by the swelling or shrinkage of Sephadex ion exchangers. The shrinkage may even
be an advantage in some applications.
97
When working with batch ion exchange, the starting conditions are selected in the
same way as in column chromatography, i.e. choose buffer pH an ionic strength to
bind the substance of interest but to prevent as many contaminants as possible
from binding.
To maximize recovery, the starting conditions should be selected so that the protein of interest binds much stronger than is usual in column chromatography.
Unless the proteins adsorbs to 100%, losses during subsequent washing will be
inevitable, especially if the volume of liquid is large compared to the volume of
adsorbent. To keep recovery high, the pH in a batch experiment may have to be
several units away from the isoelectric point of the protein.
Batch separation is carried out by stirring the ion exchanger previously equilibrated in the appropriate buffer with the solution to be treated until the mixture has
reached equilibrium. This usually takes about one hour. The slurry is then filtered
and washed with the buffer solution. In cases of incomplete adsorption this procedure should be repeated on the filtrate with a new batch of ion exchanger. Then
elution buffer is added (1-2 times the volume of the sedimented gel) and stirred
until desorption is complete, which can take up to 30 minutes or more. Finally,
suction is used to filter the buffer containing the desorbed product of interest from
the adsorbent. The gel can also be packed in a column after the washing step and
be eluted stepwise in the same way as during normal column chromatography.
Resolution will however be lower for such a combined batch and column procedure compared with a normal column procedure, since the sample is bound uniformly throughout the gel slurry and the subsequent chromatographic bed.
Under these conditions stepwise elution is recommended since gradient elution
will give broad bands and poor resolution.
Batch chromatography is very useful for concentrating dilute solutions and separating the substances of interest from gross contaminants during the initial stages
of a purification scheme.
Note: Fines will be generated if the ion exchangers are stirred too vigorously. This
will increase the time required for filtration.
98
It offers the selectivity afforded by chromatography, the throughput of ultra-filtration and the convenience of small scale centrifugation.
Crude feed from the fermentor containing the desired product and undesired cells,
cell debris and particulates is applied to the expanded bed. Target products are
bound by the adsorbent while particulates and contaminants pass through unhindered. The desired molecule is then eluted as in packed bed chromatography.
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Eluate
STREAMLINE adsorbents
STREAMLINE adsorbents are described in detail in Chapter 6.
STREAMLINE columns
STREAMLINE columns are designed to suit the different stages of process development. STREAMLINE 50 column is designed for method optimization. A set-up
with this column can handle 1-20 l from the fermentor at a throughput of 6 l/h. A
set-up with STREAMLINE 200 column, for pilot scale and verification of the
optimized methods, can handle 50-300 l of sample at a throughput of 100 l/h.
STREAMLINE CD column, custom designed for industrial manufacturing, can
handle production volumes of samples at a throughput of several thousands of
litres per hour.
Auxiliary equipment
To operate expanded bed adsorption in method optimization some auxiliary equipment is needed. For example, a peristaltic pump, manual valves, UV, pH and
conductivity monitors and a recorder, all standard laboratory equipment.
For production installations STREAMLINE is engineered to your specifications.
100
Regeneration
After each cycle, bound substances must be washed out from the column to restore the original function of the media. Ion exchange adsorbents can normally be
regenerated after each run by washing with a salt solution until an ionic strength
of about 2 M has been reached. This should remove any substances bound by
ionic forces. The salt should contain the counter-ion to the ion exchanger to facilitate equilibration.
To prevent a slow build up of contaminants on the column over time, more rigorous cleaning protocols may have to be applied on a regular basis, see below.
Sanitization
Sanitization is the inactivation of microbial populations. When a packed column
is washed with a sanitizing agent, the risk of contaminating the purified product
with viable micro-organisms is reduced. The most commonly used sanitization
method in chromatography today is to wash the column with NaOH. NaOH has
a very good sanitizing effect and also has the addition advantage of cleaning the
column.
Sterilization
Sterilization, which is not synonymous with sanitization, is the destruction or elimination of all forms of microbial life in the system.
101
Procedure
Sanitization
Sterilization
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A defined amount of gel is introduced into the column (Normally a quantity of gel
to give a bed volume of approximately 1 ml is sufficient). The gel is packed and
equilibrated until the eluate is of the same pH as the starting buffer. The exact
volume of gel is calculated from the known column diameter and the measured
bed height. In the case of a pre-packed column the amount of gel is already predetermined.
The protein solution (1 to 5 mg/ml in start buffer) is applied to the column by
switching the sample application valve. To ensure that the column is fully loaded,
105
sample application is not interrupted until the recorder shows 50% full scale
deflection, FSD, (0% = starting buffer; 100% = the protein solution in starting
buffer).
Sample application is stopped by re-setting the valve to allow passage of start buffer. Washing is continued until 0% full scale deflection is approached (Fig. 59).
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Fig. 59. Graph obtained with the setup in Figure 58 used in the determination of dynamic capacity.
After the wash phase, adsorbed protein is eluted with a stepwise change in ionic
strength (e.g. 2 M NaCl) or pH. Fractions are collected as long as the UV-absorption is above 2% FSD. These fractions are pooled and the UV-absorption of the
pool is measured.
Calculation
The maximum amount of protein that can be bound to the column (A) at the chosen flow rate is:
A=CxV
C = The protein concentration in the pooled fractions (mg/ml).
V = volume of pooled fractions.
C = A280/ E
A280 = absorbance of solution at 280 nm in 1 cm cell.
E = absorbance of standard solution (1 mg/ml) at 280 nm in
a 1 cm cell.
The protein capacity is calculated as:
A/gel volume
This calculation assumes that the recovery of bound protein from the column is
100%. This can be checked by comparison with the quantity of protein applied to
the column.
106
Fig. 60. Questions that must be addressed to assure a rational process design
The design must ensure that the purity requirements of the final product are met,
and also considering the special safety issues involved in production of biopharmaceuticals, such as infectious agents, pyrogens, immunogenic contaminants and
tumorigenic hazards. In general, the purity issues must be addressed in relation to
the nature of the source material and the intended use of the final product. It is
important to define the impurities and contaminants which have to be removed
from the source material during downstream processing.
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In general, optimization of any of these can only be realized at the expense of the
others. The relative priority of these parameters will vary depending on whether a
particular chromatographic step is for capture, intermediate purification or polishing. This will steer the optimization of the critical processing parameters in any
particular step, as well as the selection of the most suitable chromatography
matrix to be used in the step.
Capture
In a typical capture situation, throughput (i.e. capacity and speed) will be very
important for processing of large sample volumes, keeping the scale of equipment
109
as small as possible and giving the shortest possible cycle time. Binding capacity
for the product in the presence of the impurities will be one of the most critical
parameters to reduce the scale of work as much as possible.
High speed may be required to reduce sample application time, particularly if
proteolysis or other destructive effects occur. The characteristics of the feed and
the anticipated final scale of work will form the basis for the balance between
capacity and speed in a capture situation (Fig. 63).
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110
Intermediate purification
In intermediate purification steps, achieving resolution of similar components will
be more and more important further downstream. Capacity will still be important
to maintain productivity, i.e. amount of product produced per volume of chromatography media and time unit.
As in a capture step, selectivity during sample adsorption will be important, not
only to achieve high binding capacity, but also to contribute to the purification by
achieving a degree of separation already during sample application. However, in
contrast to a capture step, selectivity during sample desorption from the column
becomes important as we go downstream. This is usually achieved by applying a
more selective desorption principle, such as a continuos gradient or a multi-step
elution procedure.
Hence, the delicate problem in an intermediate purification step will be to decide
on the optional balance between capacity and resolution (see Fig. 64). Speed will
usually be less critical in a typical intermediate purification step due to the fact
that impurities causing proteolysis and other destructive effects should have been
removed in the capture step and also due to the fact that sample volume has been
reduced at this stage.
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Polishing
In a polishing step the prime issue will be resolution, since this is the last chance to
reach the required quality of the product by removal of trace contaminants such
as host proteins, structural variants of product, reagents, leachables, endotoxins,
nucleic acids and viruses.
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Selectivity during sample desorption from the column will be very important and
can be maximized by working on the shape and slope of a continuos gradient elution technique. The resolution required may not be achieved by working on the
selectivity alone, but high efficiency media with small bead size usually have to be
used in a typical polishing situation (see Fig. 65).
112
The number of separation media on the market is quite enormous and it will not
be possible to include all different alternatives in the initial media screening. The
number of media have to be reduced to cut down time and effort spent on the
method scouting phase of process development. Only those media supporting the
issues of scaleability and suitability for the different stages in a process, listed inside the filter in Figure 66, should be considered for testing.
Bead size
The particle size and the range of particle size distribution may also have an
impact on scaleability in the sense that particle size is closely related to the backpressure generated in the column during a chromatographic run. The optimal
bead size in any particular chromatographic step will depend on the characteristics of the feed and the degree of purification required in this step. In a final polishing step, for instance, there will be a need for smaller beads, i.e. high efficiency, to
accomplish separation of closely related compounds. In such a step, media with a
narrow particle size distribution will help to give a lower back-pressure at a given
bed height and flow rate compared to media with a wider particle size
distribution.
Regulatory support
Information on possible extractable compounds and what kind of methods to use
to quantify these compounds should be provided by the vendor. Leakage data on
the most relevant extractable compounds should be available.
113
Vendor certification
Vendor certification programmes should be initiated for all vendors of critical
chemicals or materials and should certainly include the chromatography media
supplier. Such programmes should be implemented to assure a long term, reliable
supply of chromatography media of high quality and consistency.
Delivery capacity
The delivery capacity of the vendor is an important issue during the vendor certification phase to secure timely deliveries of large quantities of media when the purification process is scaled up. The largest batch size that the vendor can provide
should be discussed and put in relation to the column size that will be used in the
final production scale. The stock situation and lead times should be discussed to
estimate the consequences for continuity in production in case of an urgent need
for a new batch of media.
Long-term contracts, based on forecasts provided by the user, should be discussed
to secure future timely deliveries. Long-term delivery guarantees should also be
discussed to assure that the same quality of chromatography media can be delivered during the entire life cycle of the product to be purified.
Binding conditions
Selectivity during adsorption to an ion exchanger is optimized by careful selection
of pH and ionic strength of the start buffer. A pH far away from the isoelectric
point of the molecule of interest will give stronger binding and increased capacity
but may also have a negative impact on selectivity due to increased binding of contaminating molecules. If retention of the molecule of interest is low at selected
start conditions, due to the pH being very close to the isoelectric point, it will start
to elute from the column during sample application (isocratic elution) when the
sample volume is increased in a preparative situation. The choice of optimal pH
114
will always be a balance between selectivity and capacity which in turn depends
on the purpose and strategic focus of any particular chromatographic step.
The buffer system should be selected to give maximum buffering power at the
least possible ionic strength to ensure high binding capacity of the molecule of
interest. To achieve this, the pKa of the buffer should ideally not be more than
0.5 pH units away from the pH being used. Generally, 10 mM of a buffer is the
minimum desirable level. Ideally, one of the buffering species should also be
uncharged, and so not contribute to the ionic strength. In large scale applications,
economic considerations often limit the choice to acetate, citrate, phosphate, or
other inexpensive components.
The pH and conductivity in the binding buffer can sometimes cause aggregation/
precipitation in the sample when it has been equilibrated to start conditions. If
aggregates are formed they may be excluded by the beads and lost in the flow
through fraction with loss of recovery as a consequence. The extent of aggregates/precipitate formation depends on the pre-column residence time, after sample
has been transferred to start conditions. This problem is often recognized as a
scale-up problem since the pre-column residence time may increase considerably
upon scale up.
Elution
Elution from ion exchangers is usually accomplished by applying a continuos or
stepwise increase of the ionic strength of the eluting buffer, thereby weakening the
electrostatic interaction between the bound molecule and the adsorbent.
Depending on the purpose and strategic focus, as previously outlined, different
desorption principles can be applied to achieve the objectives of any particular
chromatographic step in the most optimal way.
Stepwise elution
Gradient elution
Isocratic elution
Stepwise elution is often preferred in large scale applications since it is technically
more simple than elution with continuos gradients. Stepwise elution will also
decrease buffer consumption, shorten cycle times and allow the molecule of interest to be eluted in a more concentrated form.
Single-step elution and two-step elution can be characterized as being a group
separation technique. This type of elution is usually applied in initial chromatographic steps (capture) where the purpose is to remove bulk impurities and substances differing greatly from the product. In a large scale initial chromatographic
step, using a crude feed material, media with a large bead size are favoured to
avoid problems with high back-pressure and reduced media life time due to high
viscosity and severe fouling during sample application. In such an application it
will be very difficult, unless the selectivity is extremely high, to resolve closely rela-
115
ted contaminants from the molecule of interest, even when applying very shallow
gradients. The strategy will be to resolve the group of substances that the molecule of interest belongs to from group(s) containing the contaminating substances. This can most conveniently be achieved by eluting one group at a time by
applying one or several steps with increasing eluting strength.
In later purification steps however, applying feed material that has been partly
purified and using chromatography media with higher resolving power, it will be
easier to resolve closely related substances by applying multi-step or gradient elution techniques. Resolution is maximized by working on the shape or slope of a
gradient or the eluting strength of different steps in a multi-step procedure. Such
eluting techniques can be characterized as being fine separation techniques as
opposed to the group separation refered to above.
In final purification steps (polishing), where the main focus will be to reach the
predefined purity of the molecule of interest, resolution is maximized by applying
shallow gradients or even isocratic elution using high resolution media with small
bead size.
When stepwise elution is applied, one has to keep in mind the danger of getting
artefact peaks when a subsequent step is administered too early after a tailing
peak. For this reason it is recommended to use continuos gradients in the initial
experiments to characterize the sample and its chromatographic behaviour.
Elution by pH gradients is not generally applied. This is because, changing the pH
by applying a pH gradient is frustrated by the buffering power of the molecules
adsorbed on the column and, in case of weak ion exchangers, the buffering of the
adsorbent groups themselves. For stepwise applications, pH elution can be quite
successful. The pH change will be delayed compared with the new buffer front
because of these titrations, but eventually the bound molecule is desorbed, coincident with a rapid pH change.
Sample load
When the selectivity parameters have been defined to achieve the most optimal
balance between resolution, capacity, speed and recovery, in ion exchange chromatography, as for most other adsorption techniques, there are then basically two
alternative routes to follow for optimization of sample load and flow rate to achieve highest possible productivity in the system.
I. In a typical capture situation the sample will be applied to the column, nonbound substances will be washed out from the column and the compound of interest will be eluted from the column with a simple step elution procedure. The difference in eluting strength, between the different steps will usually be large, i.e. it
will be possible to elute one group of compounds while the others are still retained
on the column. In this mode, the entire bed volume can be utilized for sample bin-
116
ding and the prime consideration when optimising for highest possible productivity is to define the highest possible sample load over the shortest possible sample
application time with acceptable loss in yield.
The dynamic binding capacity for the protein of interest should be determined by
frontal analysis, i.e. by continuously applying sample on the column up to the
point where the compound of interest starts leaking off at the column outlet.
PAGE, ELISA or other appropriate techniques are used for the determination of
the break-through profile of the compound of interest.
II. In many intermediate purification steps, and always in a polishing step, the
requirements for resolution will set the limit for the amount of sample that can be
applied to the column. Sample is mainly bound in the upper part of the bed since
there will be a need for a certain bed height to achieve separation between closely
related substances moving down the column with different velocities in a shallow
gradient of elution buffer.
Maximum sample loading is defined by running a series of experiments with gradually increased sample load. Optimal conditions will be the maximum sample
load that provides a resolution still high enough to meet the pre-defined purity
requirements.
Flow rate
The maximum flow rate that can be applied in any particular ion exchange chromatography step will differ between different parts of the chromatographic cycle.
Since low molecular weight substances show high diffusion rates, i.e. are transported rapidly between the mobile phase and stationary phase, the flow rate during
equilibration, washing and regeneration procedures is limited primarily by the
rigidity of the chromatography media and by system constraints regarding pressure specification. Larger molecules, i.e. the substances to be separated during the
chromatographic run, show a lower diffusion rate which will limit the flow rate
that can be applied during sample adsorption and desorption.
In a typical capture situation, the flow rate during sample application has to be
controlled so that the residence time in the column allows for a complete binding
without leakage in the flow through fraction. Maximum flow rate is defined by
running the frontal analysis test (break-through) refered to above at a number of
different flow rates. Optimal conditions will depend on the requirements for speed
and capacity in the system. If speed, i.e. sample application time, is critical due to
proteolysis or other detrimental effects in the feed material, a higher flow rate may
have to be used on the expense of the binding capacity in terms of amount of sample that can be applied per volume of media. If speed is not a big issue, binding
capacity can be increased on the expense of flow rate which will reduce the scale
of work in the final production process. Occasionally, high back-pressure, due to
117
the viscosity and crude nature of the feed, may set the limit for maximum flow
rate during sample application.
During elution, the flow rate will affect resolution between compounds to be
separated and also the concentration of these compounds in the product pool.
When there is a need for high concentration in the product pool, a lower flow rate
may have to be applied to minimise the volume (dilution) of the eluted
product/fractions. This is particularly important in a step preceding a gel filtration
step, where the sample volume is limiting for loading capacity.
Selecting a column
When a chromatographic step is being developed to be a part of a manufacturing
process and the time has come for scaling up, the next crucial step in ensuring a
reliable product quality and maximum production economy is the decision about
which column to use. Information on large scale columns from Amersham Biosciences
is available upon request. Different demands are put on a column for production
compared with one used for the initial laboratory scale and scale-up experiments.
Flexibility, which is needed in laboratory scale and scale-up is achieved by using a
column with a movable adaptor. In production, consistency in performance and
safety of the end product are the main concerns. Here the column packing has to
be reproducible, materials of construction have to be well characterized for leakage and the design mechanically stable.
A number of criteria have to be considered. These criteria are more dependent on
the scale of operation than on the media and are thus very similar in their importance for ion exchange, hydrophobic interaction, gel filtration and affinity chromatography. Their ranking and importance change when moving through a chromatographic process is shown in Figure 67.
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Packed bed
Sanitary design
Effective cleaning and sanitizing of packed columns depends on the total column
design, including the absence of threaded fittings and the smoothness of wetted
surfaces. It is important to minimize dead volumes in the column to hinder bacterial attachment and facilitate cleaning. Columns constructed from calibrated
borosilicate glass allow the use of thin O-rings in the adaptor and end piece and
119
give minimum dead volumes. Borosilicate also has a smooth and durable surface
which facilitates cleaning. Plastic columns are usually less expensive but most
plastics do not meet pharmaceutical industry demands for chemical resistance,
hygienic design and in-line cleaning. They may however be well suited for scale-up
experiments.
Regulatory support
Regulatory support for process scale columns should be available from the
column supplier to provide information on materials necessary for registration of
the process including chemical stability, toxicological tests, physical data and
column construction.
Ergonomics
For easy handling of process columns it is important that they are constructed in a
stable way and are easy to pack and clean. Large columns should preferably have
lockable wheels.
In laboratory columns, the bed height can easily be adjusted using moveable adaptors. In large columns, adaptors may be impractical and too heavy to handle.
Therefore, columns with fixed end pieces are selected in many applications.
Valves should be easy to reach and remove when the column is taken apart.
120
calculate the exact amount of media that is required to get the appropriate bed
height.
Scale-up
When the IEX step has been optimized at laboratory scale, the method can be scaled-up. Provided that scaleability has been designed-in during the development
phase, scale-up to final production scale should be straightforward.
Design-in of scaleability has to do with how the chromatographic step has been
designed and optimized (robustness, simplicity, costs, capacity etc.) and the choice
of appropriate chromatography media (chemical stability, physical stability, bead
size, cost etc.).
Some general guidelines for scaling up are outlined in Table 23.
Table 23. Scale-up guidelines.
Maintain
Increase
Bed height
Column diameter
Distribution system
Wall effects
Sample concentration
Gradient volume/bed volume
Sample load
Increasing the bed volume by increasing the column diameter and increasing volumetric flow and sample load accordingly, will ensure the same cycle time as in the
laboratory scale method development. The column bed height, linear flow rate,
sample concentration and ratio of sample to gel, all optimized at laboratory scale,
will be kept the same. If a gradient is used for elution, the ratio of gradient volume
to bed volume will remain constant and, therefore, the time required for the gradient to develop and the effect on resolution, will remain the same on the larger
column. The same principle is applied for the volume of each step in a step elution
procedure.
Different system factors may affect performance after scale-up. If the large scale
column has a less efficient flow distribution system, or the large scale system introduces large dead volumes, peak broadening may occur. This will cause extra dilution of the product fraction or even loss of resolution if the application is sensitive
to variations in efficiency (plate number) in the system used.
121
scaling up to a larger diameter column means that most of the bed support generated by the friction against the column wall is lost. This can give increased bed
compression and poorer flow/pressure characteristics.
If all the above aspects are taken into consideration, chromatographic variability
is normally not a major issue when scaling up.
Non-chromatographic factors may have a more significant effect on performance
during scaling up. These factors include: changes in sample composition and concentration that often occur as the fermentation scale increases, precipitation in the
feed stock due to longer holding times when large volumes are handled, nonreproducibility of the buffer quality due to inadequate equipment for consistently
preparing large quantities of buffer solutions, and microbial growth in feed-stock
or buffers due to increased handling and longer holding times.
Figure 69 shows a 700-fold scale up of a model protein separation on SOURCE
30S going from a 2.2 ml column to a 1.57 liter column in one step.
122
Column:
Sample:
Sample load:
Eluent A:
Eluent B:
Flow rate:
Gradient:
System:
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123
12. Applications
Ion exchange has proven to be one of the major methods of fractionation of labile
biological substances. From the introduction of the technique in the 1960s to the
development of modern high performance media, ion exchange chromatography
has played a major role in the separation and purification of biomolecules and
contributed significantly to our understanding of biological processes. The examples given in the following section have been drawn from the published literature
as well as from work in our own laboratories.
For detailed information on specific subjects the reader is referred to the original
work.
Homogenization
70
60
50
Precipitation
40
GF
IEX
AC
30
20
10
5
6
7
Stage in purification scheme
Not only is the choice of techniques important. The order in which they are
employed will also play a role in determining the speed, the convenience and the
overall yield for the purification.
124
Sample loading, sample dilution and impurity contamination are usually maximal
at the beginning of a separation scheme. At this stage the high capacity, high selectivity and concentrating effect of ion exchange makes the technique ideal.
This suitability is reflected in Figure 70 which shows the frequency of use of different fractionation techniques in published protein purification schemes (1).
The use of multi-dimensional chromatography with ion exchange as a first step is
well illustrated by the separation of monoclonal IgG2b from cell culture medium
(Fig. 71). An initial purification and concentration of the antibody from 500 ml
cell culture medium by cation exchange chromatography on SP Sepharose High
Performance was followed by a second fractionation by gel filtration using
Superdex 200 prep grade.
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Fig. 71. Purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.
The sample composition with regards to ionic strength and pH should be taken
into consideration when designing the separation scheme. In ion exchange chro125
matography solutes bind to the gel at low ionic strength and are eluted from the
column at a higher ionic strength. The converse situation occurs in hydrophobic
interaction chromatography. Thus if these two techniques are to be used in a separation scheme it is logical to have them adjacent to each other. This principle is
illustrated in Figure 72 which shows the purification of human a2-macroglobulin
from Cohn Fraction III.
After initial purification by affinity chromatography on Blue Sepharose CL-6B to
remove albumin, the sample was applied to a Q Sepharose High Performance
column and eluted with an increasing salt concentration gradient. Relevant fractions were then pooled and a2-macroglobulin was purified to homogeneity by
hydrophobic interaction chromatography on a Phenyl Sepharose High
Performance column.
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126
Towards the end of a separation scheme the complexity and the volume of sample
to be handled is smaller, but in most cases the need for higher resolution is increased. Ion exchange chromatography, particularly with MonoBeads, SOURCE, or
Sepharose High Performance media can also be used at this stage (Fig. 73).
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Biosciences, Uppsala, Sweden.)
Application examples
Ion exchange chromatography has been used successfully to separate all classes of
charged biological molecules. The following are some representative examples.
Enzymes
In the purification of biologically active proteins such as enzymes the recovery of
biological activity is usually as important as the recovery of protein mass or degree
of homogeneity. Ion exchange chromatography has played a role in the purification of thousands of enzymes, and using modern matrices with optimized separation conditions gives extremely high recoveries. This is exemplified by the separation of enzymes from chicken breast muscle on Mono Q (Fig. 74). The recovery of
creatine kinase in this separation was 89%.
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Normally the isoforms of an enzyme have approximately the same molecular
weight. This makes their separation impossible by gel filtration. However, the
small differences in charge properties resulting from altered amino acid composition enable the separation of isoenzymes using ion exchange chromatography.
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128
Immunoglobulins
Ion exchange is frequently used for the purification of immunoglobulins. Figure
71 shows the purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant.
As illustrated in Figure 76 the technique can also be applied to the purification of
monoclonal immunoglobulin from ascites fluid.
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Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
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Fig. 79. Ion exchange separation of DNA restriction fragments form pBR322 cleaved by
HaeIII (31). (Reproduced by kind permission of the authors and publishers.)
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Fig. 82. Capillary electrophoresis of the pool and side fractions from the preparative purification of 25-mer phosphorothioate oligonucleotide shown in Fig. 81. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
Areas of application
In the preceding chapters the examples which have been used to illustrate the
principles and practice of ion exchange chromatography have mostly been based
on analytical and preparative applications from the research laboratory.
Ion exchange chromatography also has many important applications in the field
of industrial and pilot scale preparations. Many blood products such as albumin
and IgG (35) as well as the products of recombinant DNA technology, such as
growth factors and pharmaceutically important enzymes (Fig. 83), are purified
using this technique.
An example of a pilot scale purification of a recombinant protein using ion
exchange chromatography is given at the end of this chapter. For further information on the application of ion exchange chromatography at pilot and process scales the reader is advised to contact Amersham Biosciences.
Analytical applications of ion exchange chromatography are to be found in diverse areas such as quality control of purified products or process monitoring in biotechnology. Figure 84 shows the use of cation exchange in monitoring a fermentation process for the production of -galactosidase.
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Other areas of application include food research where FPLC ion exchange can be
used in the study of wheat varietals (Fig. 85) and in clinical research where ion
exchange chromatography has been used in studies such as the relationship between post-partum depression and b-endorphin secretion (Fig. 86) and the correlation of proteinuria with different renal conditions (Fig. 87).
A chromatogram of the urine from patients exhibiting tubular proteinuria, due to
acute pyelonephritis, severe burns or renal transplants, shows distinct peaks corresponding to b2-microglobulin, retinol binding protein and a1-acid glycoprotein.
The disappearance of these peaks could be correlated with the reversal of their
causal lesion (39).
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0.8
0.7
0.6
0.5
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,
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1 23
Sample.
B
10 100
Column:
90
9
Flow rate:
Buffer
A.
80
8
70
7
Buffer B.
60
6
Gradient:
50
5
40
4
Detection:
Fraction size:
30
3
0.2
20
0.1
10
10 20
30 40 50 Fraction No.
10
20 30
40 50 Fraction No.
Cation exchange FPLC of a 2-ml plasma sample collected from a pregnant woman in labour
. A. The elution pattern (
) of
UV-absorbing material and the concentration of buf
fer B (---). B. Elution ofb-endorphin immunoreactivity: the position of
elution of referenceb-endorphin in (1). 125
[ ] b-endorphin (2) andb-lipotropin are shown by the vertical lines.
135
A280nm
b2 m
ALB
RBP
+
TSF
Sample:
Column:
Flow rate:
Buffer A:
Buffer B:
Gradient:
Detection:
AGP
+
a1m
10
20
30 Vol (ml)
Purification of a recombinant
Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PE553D
This application shows a purification process for a genetically modified recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (MW 55 000) expressed in the periplasm of E. coli. The process was developed for large scale production of modified toxin, conjugation to a polysaccharide and use as a vaccine. The purification
strategy used chromatography media differentiated to tackle the problems of capture, intermediate purification and polishing (for further information please refer
to Chapter 11.)
The result was a highly purified exotoxin A from crude cell homogenate using
only four chromatography steps, and taking less than half the time of a more conventional approach.
Exotoxin A was captured directly from unclarified E. coli homogenate by expanded bed adsorption using STREAMLINE DEAE adsorbent in a STREAMLINE
200 column (Fig. 88). The following intermediate purification step was hydrophobic interaction chromatography (HIC) on Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high
sub) packed in a BPG 200 column (Fig. 89). This step removed a substantial part
of the UV absorbing material (including nucleic acids) that could interfere with
the following steps. The second intermediate purification step on SOURCE 30Q,
packed in FineLINE 100 column, removed the majority of the remaining contaminants (Fig. 90). The polishing step was HIC on SOURCE 15PHE (Fig 91). The
process resulted in a pure protein, according to PAGE and RPC analysis (Fig 92
and 93), and the overall recovery was 51 % (Table 24).
136
Column:
Medium:
Sample:
Buffer A:
Buffer B:
Flow rate:
System:
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@?@@)Xe@V@R1?7@?B1
@?eS,e@?@?@?@@e@
@?@@0Ye@?@?@?@@e@?
?
Column:
Medium:
Sample:
Buffer A:
Buffer B:
Gradient:
Flow rate:
35 mm i.d.
SOURCE 15 HPE
from the previous step, adjusted to 1.0 M ammonium sulphate,
0.5 l/cycle was applied
1.0 M ammonium sulphate, 50 mM phosphate, pH 7.4
50 mM phosphate
0-45%B, 15 column volumes
200 cm/h
?W-X
?7R1
?@?@
J@@@
.Me@6KO)T-Kg
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3=C@L?@?e?S,
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W26X?@@??W26X
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3=C@L?@??3=C5
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3=C@T@=C(M?S,
V40R+R40Y?@0Y?
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@?S,g?@
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@?eV+Y?V+R'
W26X?W26KO26X
7<B1?7<B@@<B1
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3=C@T@=C@@=C5
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W26X
7<B1
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3=C5
V40Y
138
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?@e@@?@?@?V40Y?3T5?@?@?@@?@?J5
@@V@R1?*@@(?@?@V@R1?@@V1e@
?@e
V+Y?h?.Y
a
Lane 1 LMW markers
Lane 2 pool from
SOURCE 15 PHE
Lane 3 pool from
SOURCE 30Q
Lane 4 pool from
Phenyl Sepharose 6
Fast Flow (high sub)
Lane 5 LMW markers
Volume, litre
Exotoxin A, gram*
Step recovery*
Bacterial extract
STREAMLINE
DEAE
Phenyl Sepharose 6
Fast Flow (high sub)
180
351
10.8
13.5
140
8.54
79
11.4
41
6.60
77
SOURCE 30Q
SOURCE 15PHE
30.2
12.2
12.6
n.d.
6.04
5.5
91
91
*Activity was determined with a radial immunodiffusuin assay using Goat anti-exotoxin A antibodies
(List, USA).
139
Column:
Sample:
?W-X?
?7R1?
?@?@?
J@@@L
7<?B1*?@@@1?7R@@6T26T-X
W-KO)X?W-Kh
@?e@
S@>@T5?3T@@V@@V@R1
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W26Xe?W2@6T26X?
7<B1e?7Y?;@<B1?
@??@e?@@6X@e@?
@??@f?B@@e@?
3=C5e?/KC@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?
a)
Sample load:
A:
B:
Gradient:
Flow rate:
System:
W26XfW&?W26X?
7<B1e?W&@?7<B1?
@??@e?7Y@?@e@?
@??@e?@@@@@e@?
3=C5f?@V'=C5?
V40Y?@e?@?V40Y?
W26Xe?W26KO26X?
7<B1e?.MB@@<B1?
@??@f?J@@e@?
@??@f?'@@e@?
3=C5e?/KS@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?
W26Xe?W26KO26X?
7<B1e?.MB@@<B1?
@??@f?C@@e@?
@??@e?W20Y@e@?
3=C5e?7Y?:@=C5?
V40Y?@?@@@0R40Y?
W26XfW&?W26X?
7<B1f*@?7<B1?
@??@fN@?@e@?
@??@f?@?@e@?
3=C5f?@?3=C5?
V40Y?@e?@?V40Y?
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@??@e?@e@@e@?
@??@e?@e@@e@?
3=C5e?3=C@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?
W26X
7<B1
@??@
@??@
3=C5
V40Y
W26Xe?W26X
.MB1e?7<B1
C5e?@e@
W20Ye?@e@
7Yf?3=C5
@@@@?@?V40Y?
?
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W&@?e?7<B1
7Y@Le?@e@
@@@@e?@e@
@He?3=C5
@??@?V40Y?
?
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7Yf?7<B1
@@6Xe?@e@
@?B1e?@e@
3=C5e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
W26Xe?W26X
@?e@
@?
?@h@?e@?
7<B1e?7<B1
3L?J5
@?
J5h@?e3L
3=C5e?@e@
N1?7H
W26X@?@??@?@6T-X?W26X?e7H?@6T-Xe@?eN1
S@@Ue?@e@
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*US,e?3=C5
V40Y?@?V40Y? ?3T5?
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V40R'?V4@@?@?@?@?V4@@?e3L?@?@?@e@@@6T5
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?
?
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?@?@?
J@@@L
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W-KO)X?W-Kh
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@??@f?'@@e@?
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V40Y?@?V40MI40Y?
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@??@e?W20Y@e@?
3=C5e?7Y?:@=C5?
V40Y?@?@@@0R40Y?
W26XfW&?W26X?
7<B1f*@?7<B1?
@??@fN@?@e@?
@??@f?@?@e@?
3=C5f?@?3=C5?
V40Y?@e?@?V40Y?
W26Xe?W26KO26X?
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V40Y?@?V40MI40Y?
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7<B1e?7<B1
@??@e?@e@
@??@e?@e@
3=C5e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
W26Xe?W26X
.MB1e?7<B1
C5e?@e@
W20Ye?@e@
7Yf?3=C5
@@@@?@?V40Y?
?
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W&@?e?7<B1
7Y@Le?@e@
@@@@e?@e@
@He?3=C5
@??@?V40Y?
?
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7Yf?7<B1
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@?B1e?@e@
3=C5e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
W26Xe?W26X
7<B1e?7<B1
3=C5e?@e@
S@@Ue?@e@
*US,e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
@?e@
@?
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3L?J5
@?
J5h@?e3L
N1?7H
W26X@?@??@?@6T-X?W26X?e7H?@6T-Xe@?eN1
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N1he?B@H
?
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J@@@L
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@??@f?'@@e@?
3=C5e?/KS@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?
c)
W26Xe?W26KO26X?
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@??@f?C@@e@?
@??@e?W20Y@e@?
3=C5e?7Y?:@=C5?
V40Y?@?@@@0R40Y?
W26XfW&?W26X?
7<B1f*@?7<B1?
@??@fN@?@e@?
@??@f?@?@e@?
3=C5f?@?3=C5?
V40Y?@e?@?V40Y?
W26Xe?W26KO26X?
7<B1e?7<B@@<B1?
@??@e?@e@@e@?
@??@e?@e@@e@?
3=C5e?3=C@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?
W26Xe?W26X
7<B1e?7<B1
@??@e?@e@
@??@e?@e@
3=C5e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
W26Xe?W26X
.MB1e?7<B1
C5e?@e@
W20Ye?@e@
7Yf?3=C5
@@@@?@?V40Y?
?
?W&?e?W26X
W&@?e?7<B1
7Y@Le?@e@
@@@@e?@e@
@He?3=C5
@??@?V40Y?
?
W2@@e?W26X
7Yf?7<B1
@@6Xe?@e@
@?B1e?@e@
3=C5e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
W26Xe?W26X
7<B1e?7<B1
3=C5e?@e@
S@@Ue?@e@
*US,e?3=C5
V40Y?@?V40Y?
?
@?e@
@?
?@h@?e@?
3L?J5
@?
J5h@?e3L
N1?7H
W26X@?@??@?@6T-X?W26X?e7H?@6T-Xe@?eN1
?@?@?
?3T5?7<B@@?@??@?@V@R1?7@@)?e@??@V@R1e@?e?@
3=C@@?3=?@?@?@?@?3X?f@??@?@?@e@?e?@
?V+Y?
V40R'?V4@@?@?@?@?V4@@?e3L?@?@?@e@@@6T5
N1he?B@H
??
?@hf@?
Fig. 93. Reversed phase chromatography analysis of pools obtained after the purification
steps.
140
Strategy
The starting point for developing the purification strategy was experience from a
successful downstream process for purification of another modified Pseudomonas
aeruginosa exotoxin, LysPE38 (Fig. 94). Refinements included reducing the number of steps by the introduction of STREAMLINE DEAE for capture, and achieving high flow rates through the use of high performance SOURCE media for late
intermediate purification and polishing.
141
This approach of using media designed for different stages in a downstream process speeded up process development and shortened the production schedule.
Comparison with the earlier process for purification of a similar exotoxin demonstrates the dramatic savings in time achieved.
Interestingly, the use of ion exchange at more than one stage is a common characteristic of large-scale processes. Note that the role and mode of use of the ion
exchanger is very different in the different stages. In the example shown, the
anion exchanger, STREAMLINE DEAE, is used for expanded bed adsorption of
the product from the crude, unfiltered E. coli lysate. STREAMLINE is optimised
to handle such crude feedstocks. Particles, the bulk of the impurities and much of
the water are removed in a group separation. Sample application conditions are
optimised to achieve maximum selectivity during capture of the product and the
stepwise elution conditions achieve maximum concentration during elution.
Later in the process, anion exchange is again used, but this time to remove proteins which have very similar characteristics to the product. This time SOURCE
30Q is used with gradient elution. The uniform, small diameter particles help to
achieve good resolution with excellent flow rates and low back-pressures. The
linear salt gradient further improves resolution. Note also that a different pH has
been chosen to increases the binding strength of the product and further improve
the resolution during elution.
In other examples ion exchange can be used repeatedly in the same process under
even more divergent conditions, in one step to bind only impurities and allow the
product to pass through and later to bind the product. Furthermore, anion and
cation exchange can be combined in the same scheme or pH and salt gradient elution can be alternated to achieve removal of different impurities. All of this is an
indication of why ion exchange is such a useful technique in industrial purification.
142
Cause
No flow through
the column
Reduced or poor
flow through the
column.
Remedy
Prior to chromatography,
precipitate with 10%
Dextran Sulphate or 3%
polyvinylpyrrolidone.
Precipitation of proteins
in the column caused by
removal of stabilizing
agents during
fractionation.
Filter is clogged.
Microbial growth
has occurred in the
column.
Outlet closed.
Open outlet.
Clogged end-piece or
adaptor or tubing.
143
Problem
Cause
Remedy
Reduced or poor
flow through the
column.
Bed compressed.
Microbial growth.
Fines.
Back pressure
Turbid sample has been
increases during a applied to the column.
run or during
successive runs.
Precipitation of protein
in the column filter and/
or at the top of the gel bed.
* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.
144
Problem
Cause
Remedy
Back-pressure
Precipitation of
increases during a lipoproteins at increased
run or during
ionic strength.
successive runs.
Lipoproteins may be
precipitated prior to
chromatography by the
addition of 10% dextran sulphate and1 M calcium chloride
to final concentrations of
0.2% and 0.5 M respectively.
Protein elutes in
the wash phase.
See above.
The resolution
obtained is less
than expected.
145
Problem
Cause
Remedy
The resolution
obtained is less
than expected.
Improper filtration of
the sample before
application to the
column.
Aggregate formation of
proteins in sample and
strong binding to gel.
Overloaded column.
Leading or very
rounded peaks
observed in the
chromatogram.
* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.
146
Problem
Cause
Remedy
Leading or very
rounded peaks
observed in the
chromatogram.
Column needs
regeneration.
Previous elution
profile cannot be
reproduced.
Previous elution
profile cannot be
reproduced.
Precipitation of protein
in the column filter and/
or at the top of the gel bed.
Incorrect buffer pH
and ionic strength.
Incomplete equilibration.
Equlibrate until
conductivity is constant.
Aggregate formation of
proteins in sample and
strong binding to gel.
* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.
147
Problem
Cause
Remedy
Low recovery of
activity while
normal recovery
of protein.
Microbial growth.
148
Sample precipitates.
Hydrophobic proteins.
Problem
Cause
Remedy
More activity is
recovered than
was applied to
the column
Different assay
conditions have been
used before and after the
chromatographic step.
Removal of inhibitors
during separation.
Replace if necessary.
Adjust.
Recorder range
incorrectly set.
Adjust.
Excessive zone
broadening
* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.
149
Problem
Cause
Remedy
Distorted bands
as sample runs
into the bed.
Particles in eluent or
sample.
Strange peaks in
chromatogram.
Buffer impurities.
Peaks on blank
gradients.
Incomplete elution.
Spikes in
chromatogram.
UV baseline rises
with gradient.
Salt concentration,
micelle formation.
Impurities in buffers.
150
Quantity/Pack Size
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Code No.
17-0671-01
17-0546-01
17-0556-01
17-0506-01
17-1001-01
17-1002-01
17-0672-01
17-0547-01
17-0557-01
17-0507-01
17-1021-01
17-1022-01
MiniBeads
Mini Q, PC 1.6/5
Mini S, PC 1.6/5
Precision Column Holder
1
1
1
17-0671-01
17-0671-01
17-1455-01
SOURCE Q
RESOURCE Q 1 ml
RESOURCE Q 6 ml
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
1
1
10 ml
50 ml
200 ml
500 ml
1l
10 ml
50 ml
200 ml
500 ml
1l
17-1177-01
17-1179-01
17-0947-20
17-0947-01
17-0947-05
17-0947-02
17-0947-03
17-1275-10
17-1275-01
17-1275-02
17-1275-03
17-1275-04
SOURCE S
RESOURCE S 1 ml
RESOURCE S 6 ml
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 30S
SOURCE 30S
SOURCE 30S
SOURCE 30S
SOURCE 30S
1
1
10 ml
50 ml
200 ml
500 ml
1l
10 ml
50 ml
200 ml
500 ml
1l
17-1178-01
17-1180-01
17-0944-10
17-0944-01
17-0944-05
17-0944-02
17-0944-03
17-1273-20
17-1273-01
17-1273-02
17-1273-03
17-1273-04
151
Product
Quantity/Pack Size
Code No.
5 x 1 ml
5 x 5 ml
1
1
1
1
75 ml
1l
5l
17-1153-01
17-1154-01
17-1064-01
17-1066-01
17-1011-21
17-1012-21
17-1014-01
17-1014-03
17-1014-05
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1
1
1
1
75 ml
1l
5l
17-1151-01
17-1152-01
17-1137-01
17-1138-01
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17-1032-21
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17-1087-03
17-1087-04
1
1
25 ml
300 ml
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1
1
25 ml
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500 ml
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17-0709-01
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500 ml
10 l
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Quantity/Pack Size
Code No.
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10 l
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STREAMLINE DEAE
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STREAMLINE SP
STREAMLINE SP
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500 ml
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