1 Poglavlje - Temp

Poglavlje 1
1. Pregledno o stanicama i istraivanju stanica

Porijeklo i evolucija stanica 4
Stanice kao eksperimentalni modeli 15
Orua stanine biologije 20
KLJUNI EKSPERIMENT: Kultura animalnih stanica 32
MOLEKULARNA MEDICINA: Virusi i rak 35
Molekularna biologija stanice aktivno je podruje istraivanja koje predstavlja osnovu za
sve bioloke znanosti. Ova injenica istinita je ne samo sa stajalita bazine znanosti,
nego takoer, s obzirom na rastui broj primjena, u medicini, poljoprivredi, i
biotehnologiji. Naroito nakon zavretka sekvenciranja ljudskog genoma, napredak u
staninoj i molekularnoj biologiji otvara nove horizonte u medicinskoj praksi. Meu
udarne primjere spada razvoj novih lijekova koji specifinim ciljanjem spreavaju rast
tumorskih stanica te potencijalna uporaba matinih stanica (engl. stem cells) u zamjeni
oteenih tkiva i lijeenju pacijenata oboljelih od stanja kao to su dijabetes,
Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, ozljede lene modine i srana bolest.
Budui da se polje istraivanja stanine i molekularne biologije naglo iri, vano
je razumjeti njegove eksperimentalne osnove kao i sadanje spoznaje. Prema tome, ovo
poglavlje e se usredotoiti na naine istraivanja stanica te na pregledni prikaz nekih
njihovih osnovnih svojstava. Za razumijevanje stanine biologije posebice je vano
shvatiti slinosti i razlike meu stanicama. Prvi dio ovog poglavlja raspravlja stoga i o
jedinstvenosti i o razliitosti dananjih stanica uzimajui u obzir njihovu evoluciju iz
zajednikog pretka. S jedne strane, sve stanice dijele zajednike temeljne osobine koje
su ostale sauvane tijekom evolucije. Primjerice, sve stanice upotrebljavaju DNA kao
svoj genetiki materijal, okruene su plazma membranama, i koriste iste temeljne
mehanizme za metabolizam potreban pri proizvodnji energije. S druge strane, dananje
stanice su razvile razliite oblike ivota. Mnogi organizmi, poput bakterija, ameba, i
kvasaca sastoje se od jedne jedine stanice koja je sposobna za samostalno umnaanje.
Sloeniji organizmi izgraeni su od zbirki stanica ije je djelovanje usklaeno, a razliite
stanice specijalizirane su za izvravanje odreenih zadataka. Primjerice, ljudsko tijelo
izgraeno je od preko 200 razliitih vrsta stanica od kojih je svaka specijalizirana za
neku od posebnih funkcija kao to je pamenje, vid, kretanje ili probava. Raznolikost
koju iskazuju razliite vrsta stanica vrlo je dojmljiva; primjerice, razmotrimo razlike
izmeu bakterija i stanica ljudskog mozga.
Temeljne slinosti izmeu razliitih vrsta stanica predstavljaju zajedniku temu
stanine biologije koja omoguava da se temeljni principi steeni iz eksperimenata s
jednom vrstom stanica ekstrapoliraju na druge tipove stanica i uope. Nekoliko vrsti
stanica i organizama na veliko se koristi u prouavanju razliitih aspekata stanine i
molekularne biologije; u slijedeem odjeljku ovog poglavlja raspravlja se o nekim
svojstvima tih stanica koja ih ine osobito vrijednim eksperimentalnim modelima.
Konano, vano je shvatiti da napredak stanine biologije posebno ovisi o raspoloivosti
eksperimentalnih orua koja znanstvenicima omoguuju postizanje novih opaanja ili
provoenje novih tipova eksperimenata. Prema tome, uvodno poglavlje zavrava
raspravom o nekim eksperimentalnim pristupima koji se koriste za istraivanje stanica,
www.perpetuum-lab.com
te takoer pregledom nekih najznaajnijih povijesnih napredaka koji su doveli do

sadanjeg razumijevanja stanine strukture i funkcije.
Porijeklo i evolucija stanica

Stanice su podijeljene u dvije velike grupe koje su poetno definirane time da li sadre ili
ne sadre jezgru. Prokariotske stanice (bakterije) nemaju jezgrinu ovojnicu, a
eukariotske stanice imaju jezgru u kojoj je genetiki materijal odvojen od citoplazme.
Prokariotske stanice openito su manje i jednostavnije od eukariotskih; osim toga to im
nedostaje jezgra, njihovi genomi su jednostavniji i ne sadre citoplazmatske organele ili
citoskelet (Tabela 1.1). Usprkos ovim razlikama, isti osnovni molekularni mehanizmi
upravljaju ivotom kako prokariota tako i eukariota, pokazujui da sve dananje stanice
potjeu od zajednikog prvobitnog pretka. Kako se razvila ta prva stanica? A kako se
razvila sloenost i raznolikost koju posjeduju dananje stanice?
Prva stanica
ini se da je prvi ivot nastao pred najmanje 3.8 milijardi godina, po prilici 750 milijuna
godina nakon to se Zemlja formirala. (Slika 1.1). Kako se ivot pojavio i kako je nastala
prva stanica predmeti su iste spekulacije, budui da se ti dogaaji ne mogu
reproducirati u laboratoriju. Usprkos tome, nekoliko razliitih vrsti pokusa dalo je vane
podatke u svezi nekih stupnjeva tog procesa.
1920-tih po prvi put je predloeno da se jednostavne organske molekule mogu
spontano polimerizirati u makromolekule u uvjetima za koje se pretpostavlja da su
postojale u primitivnoj Zemljinoj atmosferi. Smatra se da je, u vrijeme kada se ivot
pojavio, Zemljina atmosfera sadravala malo ili nije sadravala nita slobodnog kisika
nego je umjesto toga sadravala uglavnom CO 2 i N2 i uz to manje koliine plinova kao
to su H2, H2S i CO. Takva atmosfera osigurava reducirajue uvjete u kojima se mogu
spontano formirati organske molekule, uz izvore energije kao to je suneva svjetlost ili
elektrino pranjenje. Spontano formiranje organskih molekula prvi puta je
eksperimentalno dokazano 1950-tih, kada je Stanley Miller (tada jo student) pokazao
da izbijanje elektrine iskre u mjeavini H2, CH4 i NH3, u prisustvu vode, omoguuje
formiranje razliitih organskih molekula, ukljuujui i nekoliko aminokiselina (Slika 1.2).
Iako Millerovi eksperimenti nisu tono ponovili uvjete na primitivnoj Zemlji, ipak su jasno
pokazali vjerojatnost spontanih sinteza organskih molekula kao osnovnih materijala iz
kojih su nastali prvi ivi organizmi.
Idui korak u evoluciji bio je formiranje makromolekula. Dokazano je da se
monomeri kao osnovne graevne jedinice makromolekula mogu spontano polimerizirati
u vjerojatnim prebiotskim uvjetima. Zagrijavanje suhe mjeavine aminokiselina,
primjerice, rezultira njihovom polimerizacijom i formiranjem polipeptida. Ali, kritina
osobina makromolekule iz koje se razvio ivot morala je biti njezina sposobnost da se
replicira. Jedino makromolekula sposobna da upravlja sintezom vlastitih novih kopija
trebala bi biti sposobna za reprodukciju i daljnju evoluciju.
Od dviju glavnih vrsti informacijskih makromolekula u dananjim stanicama
(nukleinske kiseline i proteini), jedino su nukleinske kiseline sposobne upravljati
vlastitom replikacijom. Nukleinske kiseline slue kao kalupi za vlastitu sintezu, to se
temelji na specifinom sparivanju baza izmeu komplementarnih nukleotida (Slika 1.3).
Znaajan korak u razumijevanju molekularne evolucije bio je postignut u ranim 1980-tim
godinama, kada je u laboratoriju Sida Altmana i Toma Cecha otkriveno da je RNA

sposobna katalizirati odreeni broj kemijskih reakcija, ukljuujui i polimerizaciju
nukleotida. Daljnje studije proirile su opseg poznatih katalitikih aktivnosti RNA,
ukljuujui opis RNA molekula koje upravljaju sintezom novog RNA lanaca prema RNA
kalupu. Prema tome, RNA posjeduje jedinstvenu sposobnost da slui kao kalup i da
katalizira vlastitu replikaciju. Stoga se openito vjeruje da je RNA bila inicijalni genetiki
sustav, a smatra se da su se rani stupnjevi kemijske evolucije temeljili na
samoreplicirajuim RNA molekulama period evolucije poznat kao RNA svijet. Zatim su
pravilne interakcije izmeu RNA i aminokiselina evoluirale u dananji genetiki kod, a
DNA je konano zamijenila RNA kao genetiki materijal.
Pretpostavlja se da se prva stanica razvila tako da se samoreplicirajua RNA
okruila membranom izgraenom od fosfolipida (Slika 1.4). Kako se detaljno raspravlja
u slijedeem poglavlju, fosfolipidi su osnovne komponente svih dananjih biolokih
membrana, ukljuujui plazma membrane kako prokariotskih tako i eukariotskih stanica.
Kljunu osobinu fosfolipida koji formiraju membrane predstavlja injenica da su oni
amfipatske molekule, to znai da je jedan dio molekule topiv u vodi, a drugi nije.
Fosfolipidi imaju duge, ugljikovodine lance netopive u vodi (hidrofobne), vezane za
vodo-topive (hidrofilne) glave koje sadre fosfat. Kada ih stavimo u vodu, fosfolipidi se
spontano agregiraju u dvosloj tako da su fosfatne glave izvana u vodenoj sredini, a
ugljikovodini repovi u unutranjosti, meusobno se dodirujui. Takav lipidni dvosloj
oblikuje stabilnu barijeru izmeu dva vodena odjeljka pa tako, primjerice, odvaja
unutranjost stanice od vanjskog okolia.
Zatvaranje samoreplicirajue RNA i pridruenih joj molekula unutar fosfolipidne
membrane moglo ih je tako odrati kao jedinicu, sposobnu za samoreprodukciju i daljnju
evoluciju. U to vrijeme mogla se ve razviti i sinteza proteina ovisna o RNA, pa se u tom
sluaju prva stanica morala sastojati od samoumnoavajue RNA i proteina koje je ona
kodirala.
Evolucija metabolizma
Budui da su se stanice razvile u moru organskih molekula, bile su sposobne dobivati
hranu i energiju direkno iz svog okolia. Ali takva situacija je sama po sebi
ograniavajua, pa su stanice trebale razviti svoje vlastite mehanizme za proizvodnju
energije i sintezu molekula potrebnih za svoju replikaciju. Proizvodnja i kontrolirana
upotreba metabolike energije kljuna je za sve stanine aktivnosti, pa su osnovni
metaboliki putevi i dobivanje energije (detaljno opisano u poglavlju 2) uvelike
evolucijski sauvani u dananjim stanicama. Sve stanice koriste adenozin 5'-trifosfat
(ATP) kao svoj izvor metabolike energije za provoenje sinteze staninih dijelova i
izvravanje drugih aktivnosti za koje je potrebna energija, poput kretanja (npr. miina
kontrakcija). Smatra se, da su se mehanizmi koje stanice koriste za proizvodnju ATP-a
razvili preko tri stupnja, to odgovara evoluciji glikolize, fotosinteze i oksidativnog
metabolizma (Slika 1.5). Razvoj ovih metabolikih puteva promijenio je atmosferu
Zemlje, ime se promijenio i tijek daljnje evolucije.
Pretpostavlja se da su prve reakcije stvaranja energije, u Zemljinoj atmosferi koja
je u poetku bila anaerobna, ukljuivale razlaganje organskih molekula u odsustvu
kisika. Te reakcije su vjerojatno bile oblik dananje glikolize anaerobna razgradnja

glukoze u mlijenu kiselinu, sa istim dobitkom energije od dvije molekule ATP-a. Uz
koritenje ATP-a kao svojeg izvora stanine kemijske energije, sve dananje stanice
vre glikolizu, to je u skladu s idejom da su se te reakcije pojavile vrlo rano tijekom
evolucije.
Glikoliza je omoguila mehanizam kojim se energija sadrana u ve oblikovanim
organskim molekulama (npr. glukoza) moe pretvoriti u ATP, koji se tada moe upotrebiti
kao izvor energije za pokretanje drugih metabolikih reakcija. Openito je miljenje da je
razvoj fotosinteze bio idui veliki evolucijski korak koji je dopustio da stanica iskoristi
energiju suneve svjetlosti ime se postigla neovisnost od koritenja ve oblikovanih
organskih molekula. Prva fotosintetska bakterija, koja se razvila prije vie od 3 milijardi
godina, vjerojatno je koristila H2S da pretvori CO2 u organske molekule put fotosinteze
koji neke bakterije jo uvijek koriste. Koritenje H 2O kao donora elektrona i vodika za
pretvorbu CO2 u organske spojeve razvilo se kasnije, a vana posljedica je bila
mijenjanje Zemljine atmosfere. Koritenje H 2O u fotosintetskim reakcijama proizvodi kao
nusprodukt slobodni O2; misli se da je ovaj mehanizam bio odgovoran za stvaranje
obilnih koliina O2 u Zemljinoj atmosferi.
Oslobaanje O2 kao posljedice fotosinteze promijenilo je okoli u kojem su se
stanice razvijale pa se openito smatra da je to dovelo do razvoja oksidativnog
metabolizma. S druge strane, mogue je da se oksidativni metabolizam razvio prije
fotosinteze, porastom atmosferskog O 2 koji je tada pruio jaku selektivnu prednost za
organizme sposobne za koritenje O 2 u reakcijama koje proizvode energiju. U svakom
sluaju, O2 je visoko reaktivna molekula, pa je oksidativni metabolizam, koristei tu
reaktivnost, omoguio mehanizam za stvaranje energije iz organskih molekula koji je
puno efikasniji od anaerobne glikolize. Primjerice, potpuna oksidativna razgradnja
glukoze na CO2 i H2O stvara energetski ekvivalent od 36 do 38 molekula ATP-a, za
razliku od 2 molekule ATP-a koje nastaju anaerobnom glikolizom. Uz nekoliko iznimaka,
dananje stanice koriste oksidativne reakcije kao svoj glavni izvor energije.
Dananji prokarioti
Dananji prokarioti, u koje ubrajamo sve razliite tipove bakterija, podijeljeni su u dvije
skupine arhebakterije i eubakterije koje su se rano razdvojile tijekom evolucije. Neke
arhebakterije ive u ekstremnom okoliu koji danas nije uobiajen, ali je vjerojatno
prevladavao na primitivnoj Zemlji. Primjerice, termoacidofili ive u vruim sumpornim
vrelima u temperaturama do 800 C sa niskom pH vrijednosti do 2. Eubakterije, meu
koje spadaju uobiajeni oblici dananjih bakterija, velika su grupa organizama koja ivi u
razliitim vrstama okolia kao to su zemlja, voda, i drugi organizmi (npr. ljudski
patogeni).
Bakterijske stanice su veinom okrugle, tapiaste ili spiralne, sa promjerom od 1
10 m. Sadraj DNA varira od 0.6 milijuna do 5milijuna parova baza, to je dovoljna
koliina da kodira oko 5000 razliitih proteina. Najvei i najsloeniji prokarioti su
cijanobakterije, bakterije u kojima se razvila fotosinteza.
Struktura tipine prokariotske stanice objanjena je na primjeru Escherichiae
coli (E. coli), normalnog stanovnika ljudskog probavnog trakta (Slika 1.6). Stanica je
tapiasta, promjera oko 1m i duljine oko 2m. Kao i mnogi drugi prokarioti, E. coli je
obavijena krutom staninom stijenkom izgraenom od polisaharida i peptida. Ispod

stanine stijenke je plazma membrana, graena od dvosloja fosfolipida i pridruenih
proteina. Dok je stanina stijenka porozna i lako proputa razliite molekule, plazma
membrana osigurava funkcionalno odvajanje izmeu unutranjosti stanice i vanjskog
okolia. DNA E. coli je jedna kruna molekula u nukleoidu, koji za razliku od jezgre
eukariota, nije obavijen membranom koji ga odvaja od citoplazme. Citoplazma sadri po
prilici 30,000 ribosoma (mjesta sinteze proteina), koji su odgovorni za njezin zrnati
izgled.
Eukariotske stanice
Poput prokariotskih stanica, sve eukariotske stanice su okruene plazma membranama i
sadre ribosome. Meutim, eukariotske stanice mnogo su sloenije grae i sadre
jezgru, razliite citoplazmatske organele i citoskelet (Slika 1.7). Najvea i najbolje vidljiva
organela eukariotskih stanica je jezgra, s promjerom od oko 5m. Jezgra sadri
genetsku informaciju stanice, koja je u eukariota sadrana u linearnim, a ne cirkularnim
DNA molekulama. Jezgra je mjesto gdje se replicira DNA i sintetizira RNA; translacija
RNA u proteine odvija se na ribosomima u citoplazmi.
Uz jezgru, eukariotska stanica sadri u svojoj citoplazmi razliite organele
okruene membranama. Ove organele odreuju odjeljke u kojima su lokalizirane
razliite metabolike aktivnosti. Eukariotske stanice su openito mnogo vee od
prokariotskih stanica, esto sa staninim volumenom najmanje tisuu puta veim.
Stvaranje odjeljaka pomou citoplazmatskih organela osigurava eukariotskoj stanici
efikasnije funkcioniranje. Dvije od ovih organela, mitohondriji i kloroplasti, imaju
kljune uloge u stvaranju metabolike energije. Mitohondriji, koji se nalaze u gotovo
svim eukariotskim stanicama, mjesta su odvijanja oksidativnog metabolizma i prema
tome odgovorni za proizvodnju veine ATP-a dobivenog razgradnjom organskih
molekula. Kloroplasti su mjesta gdje se odvija fotosinteza i naeni su samo u biljnim
stanicama i zelenim algama. Lizosomi i peroksisomi takoer odreuju specijalizirane
metabolike odjeljke za probavu makromolekula kao i za razliite oksidativne reakcije.
Uz to, mnoge biljne stanice sadre velike vakuole koje obavljaju razliite funkcije,
ukljuujui probavu makromolekula i spremanje kako otpadnih produkata tako i hranjivih
tvari.
Zbog veliine i sloene grae eukariotskih stanica, transport proteina na njihovo
tono odredite unutar stanice je golem zadatak. Dvije citoplazmatske organele,
endoplazmatski retikulum i Golgijev aparat, su specifino odreene za
rasporeivanje i transport proteina namijenjenih za sekreciju, ugradnju u plazma
membranu i unoenje u lizosome. Endoplazmatski retikulum je opsena mrea
unutarstaninih membrana, koja se prostire od jezgrine ovojnice kroz itavu citoplazmu.
Njegova funkcija nije samo u obradi i transportu proteina nego takoer u sintezi lipida.
Od endoplazmatskog retikuluma proteini se transportiraju u unutar malih membranskih
vezikula do Golgijevog aparata, gdje se dalje obrauju i razvrstavaju za transport do
konanih odredita. Uz ulogu u transportu proteina, Golgijev aparat predstavlja mjesto
gdje se sintetiziraju lipidi i (u biljnim stanicama) mjesto gdje se sintetiziraju neki
polisharidi koji izgrauju staninu stijenku.
Eukariotske stanice imaju jo jednu razinu unutranje organizacije: citoskelet,

mreu proteinskih filamenata koja se prostire kroz citoplazmu. Citoskelet predstavlja
strukturnu osnovu stanice, odreujui stanini oblik i openitu organizaciju citoplazme.
Uz to, citoskelet je odgovoran za pokretanje cijelih stanica (npr. kontrakcija miinih
stanica) i za unutarstanini transport i poloaj organela i drugih struktura, ukljuujui i
kretanje kromosoma tijekom stanine diobe.
Eukarioti su se razvili pred barem 2.7 milijardi godina, to je uslijedilo nakon 1 do
1.5 milijardi godina tijekom kojih su se razvili prokarioti. Istraivanja njihovih DNA
sekvencija pokazuju da su arhebakterije i eubakterije meusobno razliite kao to je i
svaka od njih razliita od dananjih eukariota. Prema tome, izgleda da je vrlo rani
dogaaj u evoluciji bio grananje u tri linije potomstva od zajednikog pretka, dajui
dananje arhebakterije, eubakterije, i eukariote. Zanimljivo je, da su mnogi geni
arhebakterija mnogo sliniji genima eukariota nego genima eubakterija, to pokazuje da
arhebakterije i eukarioti dijele zajedniko evolucijsko porijeklo i put i da su meusobno
srodniji nego ijedno od njih s eubakterijama (Slika 1.8).
Vaan korak u evoluciji eukariotskih stanica bio je stjecanje staninih organela
okruenih membranom, to je omoguilo razvoj sloenih karakteristika ovih stanica.
Smatra se da su organele bile steene kao rezultat povezivanja prokariotskih stanica s
pretkom eukariota.
Hipoteza da su eukariotske stanice evoluirale simbiotikim povezivanjem s
prokariotima endosimbioza osobito je dobro potkrijepljena istraivanjima
mitohondrija i kloroplasta za koje se smatra da su se razvili iz bakterija koje su ivjele u
veim stanicama. Oboje, mitohondriji i kloroplasti, slini su bakterijama po veliini, a kao
i bakterije, reproduciraju se diobom. Kao najvanije treba istaknuti da i mitohondriji i
kloroplasti sadre vlastitu DNA, koja kodira neke njihove dijelove. DNA mitohondrija i
kloroplasta replicira se svaki put kad se organela dijeli, a geni koje kodira prepisuju se
unutar organele i informacija se prevodi na ribosomima organele. Tako mitohondriji i
kloroplasti sadre vlastite genetike sustave, koji se razlikuju od genoma stanine
jezgre. Nadalje, ribosomi i ribosomske RNA ovih organela srodniji su bakterijskima nego
onima koji su kodirani genomom jezgre eukariota.
Endosimbiotsko porijeklo ovih organela je sada ope prihvaeno, s time da se
smatra da su se mitohondriji razvili iz aerobnih bakterija, a kloroplasti iz fotosintetskih
bakterija, kao to su cijanobakterije. Dobitak aerobne bakterije osigurao bi anaerobnoj
stanici provoenje oksidativnog metabolizma. Dobitak fotosintetske bakterije osigurao
bi prehrambenu neovisnost pomou sposobnosti obavljanja fotosinteze. Ovakva
endosimbiontska udruivanja davala su neobino veliku prednost partnerima to je bilo
vano za njihov evolucijski odabir. Tijekom vremena, veina originalnih gena iz ovih
bakterija oito se ugradila u genom stanine jezgre, tako da genomi organela kodiraju
jo samo nekoliko sastavnih dijelova mitohondrija i kloroplasta.
Razvoj viestaninih organizama

Mnogi eukarioti su jednostanini organizmi, koji su poput bakterija, izgraeni samo od
jedne stanice sposobne za samoumnoavanje. Najjednostavniji eukarioti su kvasci.
Kvasci su mnogo sloeniji od bakterija, ali mnogo manji i jednostavniji nego stanice
ivotinja ili biljaka. Primjerice, najee istraivani kvasac Saccharomyces cerevisae
promjera je oko 6 m i sadri 12 milijuna parova baza u DNA (Slika 1.9). Ostali
jednostanini eukarioti, meutim, mnogo su sloenije stanice, a neke sadre toliko DNA
koliko imaju i ljudske stanice (Tabela 1.2). Meu njima su organizmi specijalizirani za
izvravanje najrazliitijih zadataka, ukljuujui fotosintezu, pokretanje, te hvatanje i
gutanje drugih organizama kao hrane. Amoeba proteus, primjerice, velika je stanica,
sloene grae. Njen volumen vie je od 100,000 puta vei od E. coli, a duina
premauje 1mm kada je stanica potpuno ispruena (Slika 1.10). Ameba je vrlo pokretan
organizam koji upotrebljava citoplazmatska produenja (izdanke), nazvane
pseudopodiji, za kretanje i prodiranje hrane koju ine drugi organizmi poput bakterija i
kvasaca. Drugi jednostanini eukarioti (zelene alge) sadre kloroplaste i sposobni su
vriti fotosintezu.
Viestanini organizmi razvili su se iz jednostaninih eukariota pred najmanje 1.7
milijardi godina. Neki jednostanini eukarioti oblikuju viestanine agregate, pa se
smatra da predstavljaju evolucijski prijelaz od jedne stanice prema viestaninim
organizmima. Na primjer, stanice mnogih algi (npr. zelena alga Volvox) udruuju se
meusobno i formiraju viestanine kolonije (Slika 1.11), za koje se smatra da su
evolucijske pretee dananjih biljaka. Poveanje stanine specijalizacije tada je dovelo
do prijelaza kolonijalnih agregata u prave viestanine organizme. Nastavljanje stanine
specijalizacije i podjela rada meu stanicama jednog organizma dovele su do sloenosti
i razliitosti koje se mogu opaziti kod mnogih tipova stanica koji grade dananje biljke i
ivotinje te ljudska bia.
Biljke su izgraene od manjeg broja staninih tipova nego ivotinje, ali svaka od
razliitih vrsta biljnih stanica je specijalizirana za provoenje specifinih zadataka
potrebnih cijelom organizmu (Slika 1.12). Stanice biljaka su organizirane u tri glavna
sustava tkiva: osnovno tkivo, kono tkivo, i provodno tkivo. Osnovno tkivo sadri
parenhimske stanice, koje izvode veinu metabolikih reakcija biljke, ukljuujui i
fotosintezu. Osnovno tkivo takoer sadri dvije specijalizirane vrste stanica
(kolenhimske stanice i sklerenhimske stanice) koje imaju karakteristinu debelu staninu
stijenku, i omoguuju strukturnu potporu biljke. Kono tkivo pokriva povrinu biljke i
izgraeno je od epidermalnih stanica, koje oblikuju zatitni sloj i omoguuju apsorpciju
hranjivih tvari. Konano, nekoliko razliitih tipova izduenih stanica gradi provodni
sustav (ksilem i floem), koji je odgovoran za transport vode i hranjivih tvari kroz biljku.
U ivotinja se nalazi puno vie razliitih stanica nego u biljaka. Primjerice, ljudsko
tijelo izgraeno je od vie od 200 razliitih vrsta stanica, za koje se openito smatra da
su sastavni dijelovi petorih glavnih tkiva: epitelnog tkiva, vezivnog tkiva, krvi, ivanog
tkiva i miinog (Slika 1.13). Epitelne stanice tvore slojeve koji pokrivaju povrinu tijela i
unutarnjih organa. Ima mnogo razliitih vrsta epitelnih stanica, a svaka je specijalizirana
za odreenu funkciju kao to je zatita (koa), apsorpcija (npr. stanice tankog crijeva), i
sekrecija (npr. stanice lijezda slinovnica). U vezivno tkivo ubrajamo kost, hrskavcu i
masno tkivo, a svako od njih tvore razliite vrste stanica (osteoblasti, hondrociti,
adipociti). Rahlo vezivno tkivo koje lei ispod epitelnog sloja i popunjava prostore
izmeu organa i tkiva u tijelu je sainjeno od druge vrste stanica, fibroblasta. Krv sadri
nekoliko razliitih vrsta stanica, koje imaju funkciju u transportu kisika (crvene krvne
stanice ili eritrociti), upalnim reakcijama (granulociti, monociti i makrofagi) i imunoodgovoru (limfociti). ivano tkivo je graeno od ivanih stanica ili neurona, koje su
visoko specijalizirane za prijenos signala kroz tijelo. Razliite vrste osjetilnih stanica, kao
to su stanice u oku ili uhu jo su k tome specijalizirane za primanje signala iz okolia.
Konano, nekoliko razliitih tipova miinih stanica odgovorno je za snagu i kretanje.
Jasno je da je evolucija ivotinja ukljuivala razvoj odgovarajue raznolikosti i

specijalizacije na staninoj razini. Razumijevanje mehanizama koji kontroliraju rast i
diferencijaciju tako sloenog niza specijaliziranih stanica, polazei od jedne oploene
jajne stanice, jedan je od glavnih izazova s kojim se suoava suvremena stanina i
molekularna biologija.
Stanice kao eksperimentalni modeli

Evolucija dananjih stanica iz zajednikog pretka vrlo je znaajna za staninu i
molekularnu biologiju kao eksperimentalnu znanost. Budui da su osnovna svojstva svih
stanica ouvana tijekom evolucije, temeljni principi spoznati iz eksperimenata sa jednom
vrstom stanica, openito su primjenjivi na druge vrste stanica. S druge strane, zbog
velike raznolikosti dananjih stanica, mnoge vrste eksperimenata mogu se mnogo lake
izvesti s jednom vrstom stanica nego s nekom drugom. Nekoliko razliitih vrsta stanica i
organizama openito se koristi kao eksperimentalne modele u istraivanju razliitih
podruja stanine i molekularne biologije. Prema raspravi u odlomcima koji slijede
osobine odreenih stanica ine ih posebno pogodnim pokusnim modelima.
E.coli
Zbog njihove relativne jednostavnosti, prokariotske stanice (bakterije) su idealni modeli
za istraivanje temeljnih procesa u biokemiji i molekularnoj biologiji. Najtemeljitije
istraivana vrsta bakterija je E. coli, koja je dugo bila najomiljeniji organizam za
istraivanje bazinih mehanizama molekularne genetike. Veina naih dananjih
spoznaja iz molekularne biologije ukljuujui nae razumijevanje replikacije DNA,
genetskog koda, ekspresije gena i sinteze proteina proizale su iz istraivanja ove
skromne bakterije.
E. coli je izuzetno korisna molekularnim biolozima zbog svoje relativne
jednostavnosti i lakoe kojom se moe razmnoavati i istraivati u laboratoriju. Genom
E. coli, primjerice, sastoji se od otprilike 4.6 milijuna parova baza i sadri oko 4000
gena. Ljudski genom je gotovo tisuu puta vei (priblino 3 milijardi parova baza) i
smatra se da sadri 30-40,000 gena (Tabela 1.2). Mali genom E. coli (koji je potpuno
sekvenciran 1997. godine) predstavlja oiglednu prednost za genetike analize.
Molekularno genetike eksperimente nadalje olakava brzi rast E. coli pod dobro
definiranim laboratorijskim uvjetima. U optimalnim uvjetima kulture, E. coli dijeli se
svakih 20 minuta. tovie, klonalna populacija E. coli , u kojoj su sve stanice dobivene
diobama iz jedne ishodne stanice, mogu lako biti izolirane kao kolonije koje rastu u
polutekuem agaru s medijem (Slika 1.14). Budui da se bakterijske kolonije koje sadre
akd 108 stanica mogu razviti preko noi, izoliranje genetske varijante soja E. coli na
primjer, mutante rezistentne na antibiotik kao to je penicilin lako je i brzo. Lakoa
kojom takve mutante mogu biti izolirane i analizirane bila je odluna za uspjeh
eksperimenata koji su definirali temeljna naela molekularne genetike, o emu se
raspravljalo u Poglavlju 3.
Hranjivi medij u kojem se E. coli najbre dijeli sastoji se od glukoze, soli, i
razliitih organskih spojeva, poput aminokiselina, vitamina i pretea nukleinskih kiselina.
Meutim, E. coli moe takoer rasti na mnogo jednostavnijim medijima koji sadre samo
soli, izvor duika (kao to je amonijak) i izvor ugljika i energije (kao to je glukoza). U
takvom mediju, bakterije rastu neto sporije (vrijeme diobe je oko 40 minuta) jer moraju
same sintetizirati sve aminokiseline, nukleotide i druge organske spojeve. Sposobnost
E. coli da izvri ove biosintetske reakcije u jednostavnim definiranim medijima uinila ih
je izuzetno pogodnim za razjanjavanje biokemijskih puteva. Dakle, brzi rast i
jednostavni hranidbeni zahtjevi E. coli uvelike su olakali osnovne eksperimente u
molekularnoj biologiji i biokemiji.
Kvasci
Iako su bakterije bile neobino vrijedan model za istraivanje mnogih evolucijski
ouvanih svojstava stanice, one oigledno nisu mogle biti upotrebljene za istraivanje
stanine strukture i funkcije jedinstvene za eukariote. Kvasci, najjednostavniji eukarioti,
posjeduju brojne eksperimentalne prednosti sline onima u E. coli. Posljedica toga je
bila da su kvasci postali kljuni model za studij mnogih temeljnih procesa u staninoj
biologiji eukariota.
Genom najistraenijeg kvasca, Saccharomyces cerevisiae, sastoji se od oko 12
milijuna parova baza DNA i sadri oko 6 000 gena. Premda je genom kvasaca po prilici
tri puta vei nego genom E. coli, s njime se moe puno lake izai na kraj prilikom
istraivanja nego sa genomima sloenije graenih eukariota, kao to su ljudi. I u svojoj
jednostavnosti, stanica kvasca pokazuje sve tipine osobine eukariotske stanice (Slika
1.15). Ona sadri jezgru obavijenu jezgrinom ovojnicom, njena genomska DNA je
organizirana u 16 linearnih kromosoma, a citoplazma sadri citoskelet i stanine
organele.
Kvasci se mogu lako uzgajati u laboratoriju i mogu se istraivati mnogim od
molekularnih pristupa koji su bili toliko uspjeni u E. coli. Premda se kvasci ne mogu
replicirati tako brzo kao bakterije, oni se ipak esto dijele, svaka 2 sata, a mogu lako
stvarati kolonije iz jedne stanice. Prema tome, kvasci se mogu koristiti za razliite
genetike manipulacije sline onima koje se mogu izvoditi u bakterijama.
Ove osobine uinile su od stanice kvasca najpristupaniju eukariotsku stanicu sa
stajalita molekularne biologije. Mutante kvasca postale su vane za razumijevanje
mnogih temeljnih procesa u eukariota, ukljuujui DNA replikaciju, transkripciju, RNA
obradu, razvrstavanje proteina i regulaciju stanine diobe, o emu e se raspravljati u
slijedeim poglavljima. Jedinstvo molekularne biologije stanica postalo je prilino jasno s
injenicom da su temeljna naela stanine strukture i funkcije otkrivena u prouavanjima
kvasaca primjenjiva na sve eukariotske stanice.
Dictyostelium discoideum
Dictyostelium discoideum je sluzavac, koji je poput kvasca relativno jednostavan
jednostanini eukariot. Genom Dictyostelium-a je po prilici deset puta vei od genoma
E. coli mnogo sloeniji nego genom kvasca, ali znatno jednostavniji nego genomi viih
eukariota. tovie, Dictyostelium moe dobro rasti u laboratoriju i pogodan je za razliite
genetske manipulacije.
U obilnim prehrambenim uvjetima, Dictyostelium ivi kao jednostanina ameba,
hranei se bakterijama i kvascima. Vrlo je pokretna stanica, a to svojstvo ini
Dictyostelium vanim modelom za studiranje molekularnih mehanizama odgovornih za

pokretanje animalnih stanica (Slika 1.16). Primjerice, uvoenjem odgovarajuih mutacija
u Dictyostelium bila je otkrivena uloga nekolicine gena odgovornih za stanino
pokretanje.
Slijedea zanimljiva osobina Dictyostelium-a je sposobnost jedne stanice da
agregira u viestanine strukture. Kada je opskrba hranom nedovoljna, stanice se
udruuju u crvolike strukture nazvane puevima (engl. slug), od kojih svaka sadri i
do 100,000 stanica koje funkcioniraju kao jedinka. Prema tome, ini se da je
Dictyostelium na granici izmeu jednostaninih i mnogostaninih organizama i
predstavlja vaan model za prouavanje stanine signalizacije i interakcije izmeu
stanica.
Caenorhabditis elegans
Jednostanini eukarioti Saccharomyces i Dictyostelium su vani modeli za istraivanje
eukariotskih stanica, ali za razumijevanje razvoja mnogostaninih organizama potrebne
su eksperimentalne analize biljaka i ivotinja, koji su mnogo sloeniji organizami.
Nematoda Caenorhabditis elegans (Slika 1.17) posjeduje nekoliko znaajnih osobina
koje je ine jednim od najvie upotrebljavanih modela za prouavanje razvoja ivotinja i
stanine diferencijacije.
Premda je genom C. elegans (oko 100 milijuna parova baza) vei nego genomi
jednostaninih eukariota, ipak je jednostavniji i mnogo pogodniji za rukovanje od
genoma veine ivotinja. Kompletna sekvenca njegova genoma odreena je, pa se
otkrilo da genom C. elegans sadri oko 19,000 gena po prilici trostruki broj gena od
kvasca, i pola od broja gena u ljudi. Bioloki, C. elegans je relativno jednostavan
mnogostanini organizam: odrasle jedinke sadre samo 959 somatskih stanica, plus
1000 do 2000 zametnih stanica. Uz to, C. elegans se moe lako uzgajati i podvrgavati
genetikim manipulacijama u laboratoriju.
Jednostavnost grae C. elegans omoguila je detaljno prouavanje tijeka
njegovog razvitka pomou mikroskopa. Ovakve analize uspjeno su ule u trag
embrionalnom porijeklu i lozi svih stanica odrasle jedinke. Genetika istraivanja takoer
su otkrila mnoge mutacije odgovorne za razvojne abnormalnosti, to je dovelo do
izolacije i karakterizacije kljunih gena koji kontroliraju razvitak i diferencijaciju
nematoda. Vano je da slini geni takoer djeluju u sloenim ivotinjama (ukljujui
ovjeka), to C. elegans ini vanim modelom za prouavanje razvitka ivotinja.
Drosophila melanogaster
Poput C. Elegans, vinska muica Drosophila melanogaster (Slika 1.18) predstavljala je
kljuni model ivotinjskog organizma u razvojnoj biologiji. Genom Drosophila-e je
veliinom slian onom C. elegans, iako Genom Drosophila-e sadri samo oko 14,000
gena. Nadalje, Drosophila se moe biti lako odravati i uzgajati u laboratoriju, a njen
kratak reprodukcijski ciklus (oko dva tjedna) ini je vrlo pogodnim organizmom za
genetike eksperimente. Mnogi temeljni pojmovi genetike kao to je odnos izmeu
gena i kromosoma proizali su iz istraivanja Drosophila-e poetkom dvadesetog
stoljea (vidi Poglavlje 3).
10
Iscrpna genetika analiza Drosophila-e otkrila je mnoge gene koji kontroliraju

razvoj i diferencijaciju, a sadanje metode molekularne biologije omoguile su detaljnu
analizu funkcije tih gena. Kao rezultat toga, istraivanja Drosophila-e dovela su do
znaajnog napretka u razumijevanju molekularnih mehanizama koji upravljaju
ivotinjskim razvojem, osobito s obzirom na uspostavljanje plana grae tijela sloenih
viestaninih organizama. Kao kod C. elegans, slini geni i mehanizmi postoje kod
kraljenjaka, pa je koritenje Drosophila-e kao glavnog eksperimentalnog modela u
suvremenoj razvojnoj biologiji nesporno.
Arabidopsis thaliana
Istraivanje biljne molekularne biologije i razvoja predstavlja aktivno i sve opsenije
podruje znaajne ekonomske vanosti kao i intelektualnog interesa. Budui da genomi
biljaka imaju razinu sloenosti usporedivu sa ivotinjskim genomima (vidi Tabelu 1.2),
optimalni model za istraivanje biljnog razvoja bio bi relativno jednostavan organizam s
nekima pogodnim svojstvima C. elegans i Drosophila-e. Malena biljka cvjetnjaa
Arabidopsis thaliana (Slika 1.19) ispunjava te kriterije i zbog toga se naveliko koristi
kao model za istraivanje biljne molekularne biologije.
Arabidopsis je znaajan zbog svog genoma od oko samo 120 milijuna parova
baza, koji sadri otprilike 15,000 razliitih gena sloenost slina onoj C. elegans i
Drosophila-e. Osim toga, Arabidopsis se relativno lako uzgaja u laboratoriju, pa su
razvijene metode molekularnih genetikih manipulacija s ovom biljkom. Istraivanja su
dovela do identifikacije gena ukljuenih u razliite aspekte biljnog razvoja, kao to je
razvoj cvijea. Analiza ovih gena ukazuje na mnoge slinosti, ali i izrazite razlike, izmeu
mehanizmima koji kontroliraju razvoj biljaka i ivotinja.
Kraljenjaci
Najsloenije ivotinje su kraljenjaci, ukljuujui ljude i druge sisavce. Ljudski genom
ima otprilike 3 milijardi parova baza oko 30 puta je vei od genoma C. elegans,
Drosophilae ili Arabidopsisa i sadri 30 - 40 tisua gena. Osim toga, ljudsko tijelo se
sastoji od vie od 200 razliitih vrsta specijaliziranih tipova stanica. Ova sloenost ini
istraivanje kraljenjaka tekim za prouavanje sa stajalita stanine i molekularne
biologije, ali veina zanimanja za bioloke znanosti ipak izvire iz elje da se razumije
ljudski organizam. tovie, razumijevanje mnogih pitanja od neposredne praktine
vanosti (npr. u medicini) mora se bazirati direktno na istraivanjima ljudskih (ili blisko
srodnih) tipova stanica.
Vaan pristup istraivanju ljudskih stanica i stanica ostalih sisavaca je uzgoj
izoliranih stanica u kulturi, gdje se njima moe manipulirati pod kontroliranim
laboratorijskim uvjetima. Upotreba kultiviranih stanica omoguila je istraivanje mnogih
aspekata stanine biologije sisavaca, ukljuujui eksperimente koji su razjasnili
mehanizme replikacije DNA, ekspresije gena, sinteze i obrade proteina, i stanine diobe.
tovie, sposobnost stanica da se kultiviraju u kemijski definiranim medijima, omoguilo
je istraivanja signalnih mehanizama koji normalno kontroliraju stanini rast i
diferencijaciju unutar organizma.
Specijalizirane osobine nekih visoko diferenciranih tipova stanica uinile su ih
vanim modelima za istraivanja odreenih aspekata stanine biologije. Primjerice,
11
miine stanice su visoko specijalizirane za kontrakciju, proizvodei snagu i pokret.

Zbog te specijalizacije, miine stanice su kljuni model za istraivanje staninog
kretanja na molekularnoj razini. Drugi primjer pruaju ivane stanice (neuroni), koje su
specijalizirane za provoenje elektrokemijskih signala na velike udaljenosti. U ljudi,
aksoni ivanih stanica mogu biti dui od jednog metra, a neki beskraljenjaci, poput
lignje, imaju ogromne neurone s velikim aksonima koji imaju i do 1 mm u promjeru. Zbog
njihove visoko specijalizirane strukture i funkcije, ovi ogromni neuroni su vani modeli za
istraivanja transporta iona kroz plazma membranu, i ulogu citoskeleta u transportu
organela iz citoplazme.
aba Xenopus laevis vaan je model za istraivanje ranog razvoja kraljenjaka.
Jaja Xenopus-a su neobino velike stanice, s promjerom od otprilike 1 mm (Slika 1.20).
Budui da se ta jaja razvijaju izvan majke, svi stupnjevi razvoja od jaja do punoglavca
mogu se lako prouavati u laboratoriju. Uz to, lako se moe pribaviti velik broj jaja
Xenopusa to olakava biokemijsku analizu. Zbog ovih tehnikih prednosti, Xenopus se
mnogo koristio u istraivanjima razvojne biologije i pruio je vane uvide u molekularne
mehanizme koji kontroliraju razvoj, diferencijaciju, i diobu stanica zametka.
Zebrasta riba (Slika 1.21) posjeduje brojne prednosti za istraivanja genetike
razvoja kraljenjaka. Ove malene ribe lako je odravati u laboratoriju i brzo se mnoe.
Uz to, zameci se razvijaju izvan majke i prozirni su, tako da se rane faze razvoja mogu
lako promatrati. Mone metode razvijene su da olakaju izolaciju mutacija koje
zajedniki utjeu na razvoj zebraste ribe, a nekoliko tisua takvih mutacija je ve
identificirano. Budui da je zebrasta riba kraljenjak koji se lako prouava, obeava
premotavanje jaza izmeu ljudskih i jednostavnijih beskraljenjakih sustava, poput C.
elegans i Drosophilae.
Meu sisavcima, mi je najprikladniji za genetike analize, koje e biti olakane
nedavnim dovravanjem sekvenciranja mijeg genoma. Iako su tehnike potekoe u
istraivanju genetike mia velike (u usporedbi, primjerice, sa genetikom kvasaca ili
Drosophilae), identificirane su mnoge mutacije koje utjeu na razvoj mia. Najvanije je,
da su nedavna postignua u molekularnoj biologiji omoguila stvaranje transgeninih
mieva, u kojem su specifini mutirani geni uvedeni u zametne stanice mijeg zametka,
tako da se uinak unesenih gena na razvoj ili druge stanine funkcije moe istraiti
direktno u cijeloj ivotinji. Prikladnost mia kao modela za prouavanje ljudskog razvoja
indicirana je ne samo slinou mijeg i ljudskog genoma nego i injenicom da mutacije
homolognih gena rezultiraju slinim razvojnim nepravilnostima kod obje vrste; poseban
oblik poemeaja pigmentacije predstavlja izvanredan primjer (Slika 1.22).
12
ALATI & METODE STANINE BIOLOGIJE

Sva znanstvena eksperimentalna istraivanja, a to podrazumijeva i istraivanja u
staninoj biologiji, ovise o laboratorijskim metodama koje se koriste u ispitivanju
strukture i funkcije stanice. Brojni znaajni pomaci u naem razumijevanju stanica
direktna su posljedica razvoja novih metoda, koje su omoguile potpuno nove
pristupe istraivanjima. Soga je poznavanje i pravilno razumijevanje
eksperimentalnih alata i metoda koji stoje na raspolaganju staninom biologu,
presudno ne samo za razumijevanje sadanjeg statusa, ve i za razumijevanje
smjerova razvoja kojima stremi ovo vrlo propulzivno podruje znanosti. U pasusima
koji slijede opisane su neke od vanih metoda stanine biologije. Preostali
eksperimentalni pristupi, ukljuujui biokemijske metode i metode molekularne
biologije, biti e opisani u narednim poglavljima.
SVJETLOSNA MIKROSKOPIJA
Zbog injenice da je veina stanica premalena da bi se vidjele golim okom,
ispitivanje stanica uvelike je ovisilo o upotrebi mikroskopa. U stvari, otkrie stnice
potaknuto je razvojem mikroskopa: Robert Hook prvi je uveo naziv stanica
promatrajui komadi pluta jednostavnim svjetlosnim mikroskopom 1665. godine
(Slika 1.23). Koristei mikroskop koji je poveavao objekte oko 300 puta, Antony van
Leeuwenhoek je 1670. godine mogao promatrati razliite tipove stanica (spermije,
crvene krvne stanice, i bakterije). Stanina teorija koju su predloili Matthias
Schleiden i Theodor Schwann 1838. godine, moe se pak smatrati roenjem
suvremene stanine biologije. Mikroskopska ispitivanja biljnih tkiva koja je vrio
Schleiden, te isptivanja animalnih tkiva koja je provodio Schwann dovela su do istog
zakljuka: svi se organizmi sastoje i graeni su od stanica. Nedugo nakon tog otkria,
shvaeno je da stanice ne nastaju de novo, nego diobom ve postojeih stanica.
Time prepoznavanje stanice kao fundamentalne jedinice svih ivih organizama
zahvaljujemo opaanjima vrenim svjetlosnim mikroskopom.
Uz tehnika poboljanja koja dozvoljavaju vizualizaciju sve veeg broja detalja
stanine strukture, svjetlosni mikroskop i dalje ostaje osnovnim alatom stanine
biologije. Dananji svjetlosni mikroskopi mogu poveati objekte do priblino 1000
puta njihove stvarne veliine. Kako je promjer veine stanica izmeu 1 i 100 m,
cijele se stanice kao i neki od veih staninih organela (jezgre, kloroplasti, i
mitohondriji) mogu promatrati svjetlosnim mikroskopom. Meutim, razluivanje
svjetlosnog mikroskopa nije dovoljno snano za uoavanje finih detalja stanine
strukture. Razluivanje, a to je sposobnost mikroskopa da susjedne bliske objekte
razlikuje kao odvojene strukture, vanije je od same sposobnosti poveavanja. Slike
mogu biti poveane po elji (na primjer, projekcijom na veliki pano), ali na taj nain
dobivena poveanja ne doprinose ujedno i razaznavanju veeg broja detalja.
Maksimalno razluivanje svjetlosnog mikroskopa iznosi priblino 0.2m. Stoga se
dva objekta koji se nalaze na manjoj udaljenosti od 0.2m uoavaju kao jedan objekt
ili slika, i ne mogu se meusobno razlikovati jedan od drugoga. Teoretska granica
razluivanja svjetlosnog mikroskopa odreena je s valnom duljinom ( vidljive
13
svjetlosti i sabirnom moi lea mikroskopa (numerika apertura, NA), a izraunava se

prema jednadbi:
Razluivanje = 0.61/NA
Valna duljina vidljive svjetlosti iznosi 0.4 do 0.7 m, pa se uzima da je vrijednost
svjetlosnog mikroskopa priblino 0.5 m. Numerika apertura moe se definirati
kao stoasti snop svjetla koji nakon prolaza kroz bioloki uzorak, ulazi u lee
mikroskopa (Slika 1.24). Numerika se apertura izraunava prema jednadbi:
NA = sin
gdje je indeks refrakcije ili loma svjetlosti medija kroz koji prolazi svjetlost na putu
izmeu uzorka i lee. Vrijednost za zrak je 1.0, no moe se poveati do priblino 1.4,
koristei lee (imerzione lee, imerzione objektive) prilagoene gledanju uzorka kroz
kap imerzionog ulja. Kut odgovara polovini irine stoastog snopa svijetla koji je
proao kroz leu. Maksimalna vrijednost za je 90, kod koje je sin = 1, pa je
najvea mogua vrijednost numerike aperture 1.4.
Teortsko maksimalno razluivanje svjetlosnog mikroskopa moe se prema tome
izraunati na slijedei nain:
Razluivanje = 0.61 x 0.6/1.4 = 0.22 m
Mikroskopi koji su sposobni dosei tu vrijednost razluivanja izraeni su ve krajem
devetnaestog stoljea, pa se u tom smislu daljnja poboljanja svjetlosnog mikroskopa
ne oekuju.
Nekoliko se tipova svjetlosnih mikroskopa koriste rutinski u ispitivanju razliitih
aspekata stanine strukture. Najjednostavniji je svjetlosni mikroskop na principu
prolaznog svjetla, odnosno mikroskopija svjetlog polja, (engl.: bright-field
microscopy), kod kojega svjetlost prolazi direktno kroz stanicu, a sposobnost
razlikovanja pojedinih staninih dijelova ovisi o kontrastu koji je rezultat absorpcije
vidljive svjetlosti od strane staninih komponenata. Da bi se poveao kontrast izmeu
razliitih dijelova stanice, u mnogim se sluajevima stanice boje bojama koje
reagiraju s proteinima ili nukleinskim kiselinama Prije samog bojanja, uzorci se
obino podvrgavaju fiksaciji (alkoholom, octenom kiselinom, ili formaldehidom) ija
je svrha stabilizacija i ouvanje staninih struktura. Analiza fiksiranih i obojanih
uzoraka tkiva svjetlosnim mikroskopom, standardan je pristup ispitivanjima uzoraka
tkiva u histolokim laboratorijima (Slika 1.25). Tehnike bojanja dovode do ugibanja
stanica, i stoga takav nain pripremanja stanica za analizu nije prikladan za
mnogobrojne eksperimente kojima se eli ispitati ive stanice,
Bez bojanja, direktan prolaz svjetlosti pak ne stvara kontrast dovoljan za
razlikovanje mnogih unutarstaninih dijelova, to ograniava upotrebu mikroskopa
sa svjetlim poljem. Meutim, kontrast izmeu valova svjetlosti koji prolaze kroz
regije stanice razliitih gustoa moe se poveati modificiranjem optike svjetlosnog
mikroskopa. Dva najea naina vizualizacije ivih stanica njihova je analiza faznokontrastnim i diferencijalno interferentno-kontrastnim mikroskopom
14
(slika 1.26). Oba tipa mikroskopa koriste optike sisteme za pretvaranje razlika u
gustoi ili debljini razliitih staninih dijelova, u razlike u kontrastu na konanoj slici.
Kod mikroskopa sa svjetlim poljem transparentne strukture (kao to je jezgra) slabo
su kontrastne jer slabo absorbiraju svjetlo. Meutim, brzina svjetla se smanjuje
prolazom kroz te strukture, pa je faza svjetlosti promijenjena (zaostaje) u usporedbi
sa fazom svjetla koje je prolo kroz okolnu citoplazmu. Fazno-kontrastna i
interferentno-kontrastna mikroskopija pretvaraju razlike u fazi svjetlosti u razlike u
kontrastu, to rezultira poboljanom kvalitetom slika ivih, neobojanih stanica.
Snaga svjetlosnog mikroskopa moe se pojaati upotrebom video kamera i
kompjutera za analizu i obradu slika. Takovi elektronski sistemi za obradu slika mogu
srazmjerno poveati kontrast slike dobiven svjetlosnim mikroskopom, dozvoljavajui
vizualizaciju malih objekata koji se inae ne bi mogli uoiti. Na primjer, videom
pojaana interferentno-kontrastna mikroskopija dozvoljava vizualizaciju pomicanja
organela, proteinskih filamenata citoskeleta du mikrotubula promjera 0.025 m
(Slika 1.27). Meutim, to pojaanje ne prelazi teoretsku granicu razluivanja
svjetlosnog mikroskopa od priblino 0.2 m. Iako videom pojaano razluivanje
omoguava vizualizaciju mikrotubula, oni su na konanoj slici nerazgovjetni i mutni,
promjera od najmanje 0.2 m. Pri tom se pojedini mikrotubuli ne mogu razlikovati
od susjednih struktura.
Svjetlosna mikroskopija dosegla je razinu molekularnih analiza, metodama
oznaavanja (engl. labeling) specifinim molekulama koje se unutar stanica mogu
vizualizirati. Specifini geni i RNA transkripti mogu se detektirati hibridizacijom
DNA/RNA probama s komplementarnom sekvencom, a proteini upotrebom
odgovarajuih anatitijela (vidi Poglavlje 3). I DNA/RNA probe i antitijela mogu se
oznaiti razliitim molekulama (engl. tag) koji omoguuju njihovu vizualizaciju u
svjetlosnom mikroskopu, inei moguim odreivanje poloaja specifinih molekula
unutar pojedinane stanice.
Fluorescentna mikroskopija u irokoj je primjeni kao izuzetno senzitivna
metoda ispitivanja distribucije staninih molekula (Slika 1.28). Fluorescentna boja
(fluorokrom, fluorofor) koristi se za oznaavanje molekule od interesa unutar
fiksiranih ili ivih stanica. Fluorescentna boja je molekula koja absorbira svjetlost
jedne valne duljine, a emitira svjetlost druge valne duljine. Fluorescencija se postie
osvjetljivanjem uzorka svjetlou valne duljine koja ekscitira fluorescentnu boju, a
upotrebom odgovarajuih filtera odreuje se specifina valna duljina svjetlosti koju
potom emitira fluorescentna boja. Fluorescentni se mikroskop danas koristi u
ispitivanjima brojnih razliitih molekula unutar stanica. esta primjena sastoji se u
oznaavanju protein-specifinih antitijela fluorescentnim bojama, za odreivanje
distribucije proteina unutar pojedinih stanica.
Upotreba zelenog fluorescentnog proteina (GFP, engl.: green fluorescent
protein) meduza za vizualizaciju proteina unutar ivih stanica, predstavlja vano
nedavno unapreenje fluorescentne mikroskopije. Standardnim metodama
rekombinantne DNA, GFP se moe vezati za bilo koji protein od interesa. Spoj GFP i
proteina moe se uvesti u stanicu i vizualizirati fluorescentnim mikroskopom, bez
potrebe za fiksacijom i bojenjem stanica (to bi bilo potrebno u sluaju detekcije
proteina antitijelima). Zbog svoje svestranosti, primjena GFPa u staninoj biologiji
izuzetno je popularna, a koristi se u praenju poloaja i kretanja velikog broja
razliitih proteina u ivim stanicama (Slika 1.29).
15
Konfokalna mikroskopija sjedinjuje znaajke fluorescentnog i mikroskopa s

elektronskom analizom i obradom slike, ime se postie dobivanje slika s vie detalja
i jaeg kontrasta. Malen snop svjetla, u prvilu dobiven laserom, fokusira se na
odreenu dubinu uzorka. Emitirano fluorescentno svjetlo se potom sakuplja pomou
detektora (video kamere). Prije nego li emitirano svjetlo dosegne detektor, ono mora
proi kroz siunu konfokalnu aperturu. Konfokalna apertura precizno je smjetena
na mjestu gdje se svjetlo emitirano s odabrane dubine uzorka nalazi u fokusu (Slika
1.30). Stoga je samo svijetlo koje je emitirano s ravnine u fokusu, sposobno dosegnuti
detektor. Skeniranje uzorka proizvodi dvodimenzionalnu sliku ravnine u fokusu, koja
je mnogo otrija od slike koja se moe postii standardnim fluorescentnim
mikroskopom (Slika 1.31). tovie, serija slika dobivenih s razliitih dubina moe
posluiti za rekonstrukciju trodimenzionalne strukture uzorka koji se ispituje.
Multi-foton ekscitacijska mikroskopija je alternativa konfokalnom
mikroskopu u primjeni analize ivih stanica. Uzorak se osvjetljava s valnom duljinom
svjetla na nain da ekscitacija fluorescentne boje zahtijeva istovremenu absorpciju
dva ili vie fotona (Slika 1.32). Vjerojatnost da dva fotona istovremeno ekscitiraju
fluorescentnu boju znaajna je samo u onoj toci uzorka gdje se ulazni laserki snop
svjetla (engl. beam) nalazi u fokusu. Na taj se nain postie emisija fluorescencije
samo s ravnine fokusa ulaznog svjetla. Ta vrlo precizno lokalizirana ekscitacija
automatski proizvodi trodimenzionalo razluivanje stvarajui trodimenzionalni
slikovni prikaz ivih stanica, bez potrebe da emitirano svjetlo prolazi kroz aperturu
(kao u sluaju konfokalnog mikroskopa). Stovie precizna lokalizacija ekscitacije
smanjuje na minimum oteivanje biolokog uzorka tijekom mikroskopiranja.
Elektronska mikroskopija
Zbog ogranienog razluivanja svjetlosnog mikroskopa, analiza detalja stanine
strukture zahtijevala je snaniju mikroskopsku tehnikuelektronsku mikroskopiju
(EM), koja je razvijena 1930tih godina. Albert Claude, Keith Porter, i George Palade,
1940tih i 1950tih godina prvi su primjenili elektronsku mikroskopiju u analizi
biolokih uzoraka. Elektronski mikroskop moe dosei znatno vee razluivanje od
svjetlosnog mikroskopa jer je valna duljina elektrona kraa od valne duljine svjetlosti.
Valna duljina elektrona u elektronskom mikroskopu moe biti i do 0.004 nm, to je
stostruko manja vrijednost od valne duljine vidljive svjetlosti. Teoretski tom bi se
valnom duinom moglo postii razluivanje od 0.002 nm. Meutim, to se
razluivanje u praksi ne moe postii, budui je razluivanje odreeno ne samo
valnom duljinom, ve i numerikom aperturom lea mikroskopa. Numerika
apertura je ograniavajui faktor u elektronskoj mikroskopiji jer znaajke
elektromagnetskih lea odreuju veliinu kuta njihove aperture na priblino 0.5 o, to
odgovara numerikim aperturama od oko 0.2 nm. Nadalje, razluivanje koje se moe
postii s biolokim uzorcima, ogranieno je i nedostatkom njihovog svojstvenog
kontrasta. To je razlog da maksimalno razluivanje elektronskog mikroskopa iznosi 1
do 2 nm za bioloke uzorke. Premda je to razluivanje EM znatno manje od
razluivanja predvienog izraunavanjem valne duljine elektrona, ono predstavlja
vie od stostrukog poveanja snage razluivanja svjetlosnog mikroskopa.
Dva osnovna tipa ekeltronskih mikroskopa, transmisijski (TEM) i scanning
(SEM), primjenjuju se u brojnim staninim ispitivanjima, a zajedniko im je to da u
stvaranju slike koriste snop elektrona. Princip transmisijske elektronske
16
mikroskopije slian je mikroskopiji u svjetlom polju. Uzorci se fiksiraju i boje

solima tekih metala, koje omoguuju stvaranje kontrasta. Snop elektrona prolazi
kroz uzorak i fokusira se to dovodi do stvaranja slike na fluorescentnom zaslonu.
Elektroni koji nalijeu na ione tekih metala, prolazei kroz uzorak skreu i udaljuju
se, pa ne doprinose konanoj slici. Na konanoj su slici obojene regije uzorka tamne.
Uzorci koji se ispituju transmisijskim elektronskim mikroskopom mogu se
prirediti s pozitivnim ili negativnim bojenjem. U pozitivnom bojenju, uzorci tkiva
reu se u ultratanke prereze koji se boje solima tekih metala (osmijev tetraoksid,
uranil acetat, olovni citrat), koji reagiraju s lipidima, proteinima, i nukleinskim
kiselinama. Ioni tekih metala veu se na razne stanine strukture, to rezultira
tamnim bojenjem na finalnoj slici (Slika 1.33). Alternativne procedure pozitivnog
bojanja takoer se koriste u identifikaciji specifinih makromolekula u stanici. Na
primjer, antitijela oznaena s tekim metalima (partikulama zlata) koriste se esto u
lokalizaciji specifinih proteina. Ta je metoda slina fluorescentnoj mikroskopiji kod
koje se antitijela oznaavaju fluorescentnim bojama.
Negativno bojenje korisno je za vizualizaciju intaktnih i neoteenih staninih
struktura (bakterija, izoliranih staninih organela, i makromeolekula) (Slika 1.34).
Kod te metode, bioloki uzorak je uklopljen na nosau prekrivenim tankim filmom.
Metalna boja se ostavi osuiti oko povrine uzorka, ime se neobojeni uzorak okrui
filmom boje, stvarajui sliku u kojoj uzorak izgleda svjetao nasuprot tamno obojene
pozadine.
Sjenjanje metalom (engl. metal shadowing) je jo jedna tehnika koja se
koristi u vizualizaciji povrine izoliranih staninih struktura ili makromolekula u
transmisijskom elektronskom mikroskopu (Slika 1.35). Uzorak se prekrije tankim
slojem metalnih para (na pr. platina). Metalne pare se raspruju po uzorku pod
odreenim kutem, pa su povrine biolokog uzorka koje su direktno usmjerene
prema izvoru molekula metalnih para deblje premazane nego li ostale povrine
uzorka. Te razlike u debljini sloja metalnih para stvaraju efekt sjene, dajui uzorku
trodimenzionalni izgled na elektronskoj mikrofotografiji.
Prepariranje uzoraka metodom smrzavanja i lomljenja (engl. freeze
fracture), u kombinaciji sa tehnikom sjenjanja metalom, bila je napose vana u
istraivanju strukture membrane. Uzorci se smrznu u tekuem duiku (na -196 oC), a
zatim lome otricom noa. Taj proces esto razdvoji dvostruki lipidni sloj, to
omoguava prikazivanje unutarnjih strana stanine membrane (Slika 1.36). Uzorak
se zatim sijenja platinom, a bioloki se materijal otapa kiselinom, stvarajui metalnu
repliku povrine biolokog uzorka. Analizom replika u elektronskom mikroskopu
vide se brojna povrinska ispupenja, koja odgovaraju proteinima koji se proteu
kroz dvoslojnu lipidnu membranu. Varijacija ove tehnike nazvana smrzavanje i
urezivanje (engl. freeze etching) omoguuje ujedno vizualizaciju i vanjskih
povrina staninih membrana i unutarnjih strana membrana.
Drugi tip elektronskog mikroskopa, scanning elektronski mikroskop
koristi se za dobivanje trodimenzionalne slike stanica (Slika 1.37). Kod scanning
elektronskog mikroskopa snop elektrona ne prolazi kroz bioloki uzorak. Umjesto
toga povrina stanice je prekrivena tekim metalom, a snop elektrona se koristi za
skeniranje po uzorku. Elektroni koji se odbijaju sa povrine uzorka, sakupljaju se
stvarajui tridimenzionalnu sliku kako se snop elektrona pomie po stanici. Budui je
17
razluivanje elektronskog scanning mikroskopa samo oko 10 nm, njegova je

primjena uglavnom ograniena na ispitivanja cijelih stanica.
FRAKCIONIRANJE STANICE (engl. SUBCELLULAR FRACTIONATION)
Premda je elektronski mikroskop omoguio detaljnu vizualizaciju stanine
strukture, sama mikroskopija nije dostatna za definiranje funkcija raznih
komponenata eukariotskih stanica. Da bi se adresirala brojna pitanja vezana uz
funkciju staninih organela, pokazalo se neophodnim izolirati organele eukariostskih
stanica u obliku koji se moe koristiti u biokemiskim ispitivanjima. To se obino
postie diferencijalnim centrifugiranjem, metodom koju su uglavnom razvili Albert
Claude, Christian de Duve i njihovi suradnici, 1940tih i 1950tih godina, a kojom se
stanine komponente meusobno odvajaju na osnovu njihove veliine i gustoe.
Prvi korak u staninom frakcioniranju je razbijanje stanine membrane pod
uvjetima koji ne unitavaju ostale unutarstanine komponente. Koristi se nekoliko
metoda, ukljuujui sonikaciju (izlaganje uzorka visokim frekvencijama zvuka),
usitnjavanje u mehanikom homogenizatoru, ili tretiranje u mjealici velikih brzina.
Svi ti postupci dovode do pucanja stanine membrane i endoplazmatskog retikula u
male fragmente, dok ostale komponente stanice (jezgra, lizosomi, peroksisomi,
mitohondriji i kloroplasti) ostaju neoteene.
Suspenzija se razbijenih stanica (koja se naziva lizat ili homogenat) zatim
frakcionira u komponente serijom centrifugiranja u ultracentrifugi, koja rotira
uzorke vrlo velikom brzinom (preko 100 000 rpm), pri emu se stvaraju sile i do 50
000 puta vee od sile gravitacije. Ta sila uzrokuje da se stanine komponente pomiu
prema dnu epruvete stvarajui sediment (engl. pallet) (proces se nazviva
sedimentacija) brzinom koja ovisi o njihovoj veliini i gustoi, s time da se najvee i
najtee strukture najbre sedimentiraju (Slika 1.38). Obino se stanini homogenati
prvo centrifugiraju kod malih brzina, kod kojih se sedimentiraju netaknute stanice i
jezgre kao najvee stanine strukture. Tako se kod niih brzina centrifugiranaja
sedimentiranjem moe dobiti obogaena frakcija jezgara, dok ostale stanine
komponente ostaju resuspendirane u supernatantu (u tekuem dijelu iznad
sedimenta). Supernatant se zatim centrifugira kod veih brzina za sedimentiranje
mitohondrija, kloroplasta, lizozoma i peroksisoma. Ponovnim centrifugiranjem
supernatanta kod sve veih brzina sedimentiraju se fragmenti stanine membrane i
endoplazmatski retikul. etvrto uzastopno centrifugiranje kod jo vee brzine dovodi
do sedimentacije ribosoma, ostavljajui samo topiv dio citoplazme (citosol) u
supernatantu.
Razliite frakcije dobivene diferencijalnim centrifugiranjem predstavljaju
obogaene, ali ne i iste pripravke organela. Vei stupanj purifikacije moe se postii
centrifugiranjem u gradijentu gustoe, u kojem se organeli odvajaju
sedimentiranjem kroz gradijent guste supstance, kao to je otopina saharoze. U
centrifugiranju temeljenom na brzini sedimentacije poetni se materijal
postvalja na vrh gradijenta otopine eera (Slika 1.39). Partikule razliitih veliina
sedimentiraju se kroz gradijent razliitim brzinama, stvarajui diskretno uoljive
pruge. Nakon centrifugiranja razliite se frakcije gradijenta (pruge), odnosno frakcije
organela slinih veliina mogu odvojiti jedne od drugih. Centrifugiranje
temeljeno na ekvilibriju gradijenata gustoa, moe se uptrebiti za odvajanje
18
staninih komponenta na bazi njihove gustoe plutanja (engl. buoyant density)

gustoe, novisno od njihove veliine i oblika. U tom postupku, uzorak se centrifugira
u gradijentu koji sadri vrlo koncentriranu otopinu saharoze ili cezij klorida. Umjesto
da ih se odvoji na osnovi brzine sedimentacije, uzorak partikula se centrifugira sve
dok ne dosegnu poloaj ekvilibrija, kod kojega je njihova gustoa plutanja jednaka
gustoi okolne otopine saharoze ili otopine cezij klorida. Centrifugiranje kojim se
postie ekvilibrij, korisno je za odvajanje razliitih tipova membrana jedne od drugih,
a dostatno je osjetljivo i kao metoda odvajanja makromolekula koje su oznaene
razliitim izotopima. Klasian je primjer (opisn u 3. poglavlju) analiza DNA
replikacije odvajanjem DNA molekula s tekim i lakim izotopima duika ( 15N i 14N)
centrifugiranjem u ekvilibriju gradijenta gustoe otopine cezij klorida.
RAST ANIMALNIH STANICA U KULTURI
Analiza stanica uvelike ovisi o spremnosti stanica za rast u laboratorijskim
uvjetima, te u kojoj je mjeri rukovanje stanicama u laboratoriju zahtijevno. Iako je
proces tehniki tei od kultiviranja bakterija ili gljivica kavasca, velik broj ivotinjskih
i biljnih stanica mogu rasti u kulturi. Takovi in vitro sistemi staninih kultura
omoguili su znanstvenicima ispitivanje rasta i diferencijacije stanica, kao i genetske
manipulacije, nune za razumijevanje strukture i funkcije gena.
Kulture animalnih stanica postavljaju se usitnjavanjem tkiva na njegove
komponente koji se dodaju u posudicu za kulturu sa hranjivim medijem (tvorei
suspenziju stanica). Veina tipova animalnih stanica (kao fibroblasti i epitelne
stanice), prihvaaju se za dno plastine povrine posudice za staninu kulturu (Slika
1.40). Embriji i tumori esto se u istraivanjima koriste kao primarni materijal jer
sadre stanice koje brzo rastu. Fibroblasti embrija posebno dobro rastu u kulturi, pa
su u istraivanjima jedan od najee upotrebljavanjih tipova animalnih stanica.
Meutim, pod odgovarajuim uvjetima mnogi specijalizirani tipovi stanica mogu
rasti u kulturi, omoguavajui da se diferencijacija kao i razliite znaajke stanica
ispituju u kontroliranim eksperimentalnim uvjetima. Embrionalne matine
stanice odlian su primjer tome. Embrionalne matine stanice (stanice ranog
embrija) kultiviranjem in vitro zadravaju sposobnost diferencijacije u sve tipove
stanica koji su prisutni u odraslome organizmu. Zato su ove stanice imale vanu
ulogu u ispitivanju funkcija brojnih gena tijekom (embrionalnog) razvoja mia.
Potencijal embrionalnih matinih stanica je da kao osnova tkiva za transplantacijsku
terapiju, doprinesu uspjenom lijeenju bolesti ovjeka.
Medij (ili hranjiva podloga) za kulturu i propagiranje animalnih stanica puno je
sloenijeg sastava od minimalnog medija za potpomaganje rasta bakterija i plijesni.
Rana istraivanja staninih kultura koristila su se neprecizno definiranim medijima
(kao to su plazma, serum ili ekstrakt embrija). Prekretnica u ovom podruju
uinjena je 1955. godine, kada je Harry Eagle opisao prvi tono definiran medij koji
omoguava rast animalnih stanica. Uz soli i glukozu, medij za rast animalnih stanica
sadri razliite amino kiseline i vitamine koje stanice ne mogu same sintetizirati.
Medij za kulturu veine animalnih stanica takoer sadi i serum koji predstavlja izvor
polipeptida faktora rasta, nunih za stimulaciju staninih dioba. Identificirano je
nekoliko faktora rasta. Oni slue kao regulatori rasta i diferencijacije stanica u
viestaninih organizama, omoguavajui provoenje signala kojima razliite stanice
19
komuniciraju meusobno. Na primjer, jedna od vanih funkcija fibroblasta koe u

intaktinh ivotinja je da proliferiraju kad je potrebno poraviti oteenje uzrokovano
ranom ili porezotinom. Njihovu diobu potiu faktori rasta koji se oslobaaju iz
trombocita za vrijeme zgruavanja krvi, stimulirajui na taj nain proliferaciju
fibroblasta oko oteenog tkiva. Identifikacija pojedinih faktora rasta omoguila je
uspostavu kultura raznih stanica u medijima bez seruma (engl. serum-free media;
mediji u kojima je serum zamijenjen specifinim faktorima rasta potrebnih za
proliferaciju stanica u pitanju).
Inicijalno uspostavljene stanine kulture zovu se primarne stanine kulture
(Slika 1.41). Stanice u primarnoj kulturi obino rastu dok ne prekriju povrinu dna
posudice u kojoj se nalaze. Nakon toga, stanice se mogu izvaditi iz posudice i u
razrijeenoj koncentraciji ponovno nasaditi, predstavljajui sekundarnu kulturu. Taj
proces nasaivanja moe se ponoviti mnogo puta, no veina normalnih stanica u
kulturi ne moe beskonano rasti. Na primjer, normalni fibroblasti ovjeka mogu se
propagirati 50 do 100 puta (doseui 50 do 100 populacijskih udvostruenja), nakon
ega prestaju rasti i ugibaju. Nasuprot tome, embrionalne matine stanice kao i
stanice tumorskog porijekla u kulturi imaju sposobnost neograniene proliferacije, i
te se kulture nazivaju permanentnim ili besmrtnim staninim linijama (engl.
immortal cell lines) . Nadalje, brojne permanentne kulture glodavaca izolirane su iz
kultura normalnih fibroblasta. Umjesto da nakon 50-100 populacijskih
udvostruenja uginu kao veina ostalih stanica fibroblasta, nekoliko stanica u tim
kulturama nastavlja s proliferacijom, tvorei permanentne kulture nalik onima
izvedenim od tumora. Te su permanentne stanine linije korisne u najrazliitijim
tipovima eksperimenata, jer predstavljaju kontinuirani i uniformni izvor stanica za
manipulaciju, kloniranje i neogranieno propagiranje stanica u laboratoriju.
ak i u optimalnim uvjetima, stanini ciklus (vrijeme jedne stanine diobe)
animalnih stanica koje najaktivnije rastu u kulturi traje 20 sati, a to je deset puta
due od vremena potrebnog da se podijeli stanica plijesni. Zato su eksperimenti s
kulturama animalnih stanica mnogo tei i traju znatno dulje od eksperimenata s
bakterijama ili kvascem. Na primjer, rast jedne stanice u vidljivu koloniju animalnih
stanica traje tjedan dana ili due, dok se kolonije E.coli ili plijesni razviju preko noi
od jedne stanice. Unato tome, genetske manipulacije animalnih stanica u kulturi od
neprocjenjive su vrijednosti za nae razumijevanje strukture i funkcije stanice.
Kultura biljnih stanica
Blijne stanice takoer se mogu kultivirati u hranjivom mediju koji sadri
odgovarajue molekule za regulaciju rasta. Nasuprot polipeptidnim regulatorima
rasta animalnih stanica, regulatori rasta biljnih stanica su male molekule koje mogu
proi kroz stijenku biljne stanice. U prisustvu odgovarajue smjese tih molekula
regulatora rasta, mnogi tipovi biljnih stanica proliferiraju u kulturi, stvarajui masu
nediferenciranih stanica koja se naziva kalus (engl. callus) (Slika 1.42).
Vrijedno je spomenuti da su mnoge biljne stanice sposobne stvarati bilo koji od
razliitih tipova tkiva koji su u konanici potrebni za regeneracije itave biljke. Stoga
se odgovarajuom manipulacijom hranjivih sastojaka i molekula regulatora rasta,
nediferencirane biljne stanice u kulturi mogu potaknuti na diferencijaciju u razliita
biljna tkiva, ukljuujui korjen, stabljiku i lie. U mnogim sluajevima, ak se i cijela
20
biljka moe regenerirati iz jedne jedine stanice u kulturi. Sposobnost stvaranja nove
biljke od jedne jedine stanice manipulacijom u kulturi, osim teoretskog interesa,
lakim ini uvoenje promjena genetskog materijala biljke, otvarajui vane
mogunosti za genetsko inenjerstvo poljoprivrednih kultura.
VIRUSI
Virusi su unutarstanini paraziti koji se ne mogu replicirati sami. Oni se
razmnoavaju infekcijom stanice domaina uzurpirajui staninu maineriju za
produkciju virusnih partikula. U svojem najjednostavnijem obliku, virusi su graeni
samo od genomske nukleinske kiseline (DNA ili RNA) obavijene proteinskim
omotaem (Slika 1.43). Virusi su vani za staninu i molekularnu biologiju jer
predstavljaju najjednostavniji sistem koji se moe iskoristiti za istraivanje staninih
funkcija. Obzirom da replikacija virusa ovisi o metabolizmu inficirane stanice,
istraivanja na virusima otkrila su brojne fundamentalne aspekte stanine biologije.
Ispitivanja bakterijskih virusa znatno su doprinjela naem razumijevanju bazinih
mehanizama molekularne genetike, a eksperimenti s biljnim virusima (virus mozaika
duhana) prvi su demonstrirali genetski potencijal RNA. Animalni su pak virusi
omoguili vrlo senzitivne naine ispitivanja raznih aktivnosti eukariotskih stanica.
Brzi rast i malena veliina genoma, bakterije ini odlinim eksperimentalnim
modelom molekularne biologije, a virusi bakterija (bakteriofagi) jo su vie
pojednostavnili ispitivanje genetike bakterija. Jedan od najvanijih bakteriofaga je
bakteriofag T4 koji inficira E.coli. Infekcija jednom partikulom T4 vodi ka stvaranju
priblino 200 potomaka virusnih partikula za 20-30 minuta. To dovodi do lize
odnosno prsnua inficirane stanice, i oslobaanja virusnih partikula u medij, u kojem
mogu inficirati nove stanice. U kulturi bakterija na agaru, replikacija T4 vodi ka
stvaranju plakova (engl. plaque), jasnih podruja liziranih stanica (Slika 1.44).
Jednako tako kako je lako kultivirati viruse, tako je lako izolirati i virusne mutante
(virusi koji rastu u jednom soju E.coli ali ne rastu u drugom soju E.coli), te je
manipulacija T4 u ispitivanjima molekularne genetike, jednostavnija, direktnija i
bra od ispitivanja na E.coli. Nadalje, genom T4 je 20 puta manji od genoma E.coli
(sadri oko 200 000 parova baza) to dodatno olakava genetsku analizu. Neki drugi
bakteriofagi imaju jo manje genome, a najjednostavniji su graeni od RNA molekula
sastavljenih od samo 3600 nukleotida. Iz tih su razloga virusi bakterija postali
krajnje jednostavan i lak eksperimentalni sistem za molekularnu genetiku.
Istraivanja vrena na bakteriofagima u mnogome su doprinjela razjanjenju brojnih
fundamentalnih principa molekularne biologije.
Zbog poveane sloenosti genoma animalnih stanica, virusi su jo vaniji u
ispitivanjima animalnih stanica nego li u ispitivanjima bakterija. Mnogi animalni
virusi repliciraju se i mogu se ispitati stvaranjem plakova u staninoj kulturi kao i
bakteriofagi. tovie, genomi animalnih virusa sline su kompleksnosti kao i genomi
bakteriofaga (veliina genoma im se kree od 3000 do 300 000 parova naza), pa je
rukovanje animalnim virusima daleko lake, nego li njihovim stanicama
domainima.
Mnogo je razliitih anaimalnih virusa, koji sadre DNA ili RNA kao genetski
materijal (Tablica 1.3). Veina virusa s RNA genomom replicira se u inficiranim
stanicama sintetizirajui nove RNA kopije njihova genoma s RNA kalupa. Meutim,
21
retrovirusi (porodica animalnih virusa) sadre RNA genom u virusnim

partikulama, ija je specifinost da u inficiranoj stanici sintetiziraju DNA kopiju
njihova genoma. Zbog toga ti virusi predstavljaju dobar primjer vanosti virusa kao
eksperimentalnih modela. Studije su retrovirusa po prvi puta demonstrirale sintezu
DNA s RNA kalupa, to predstavlja fundamentalni nain prenosa genetske
informacije, danas poznat da se zbiva u eukariotskim stanicama. Drugi primjeri u
kojima su animalni virusi predstavljali vane modele za ispitivanja njihovih stanica
domaina, ukljuuju ispitivanja DNA replikacije, transkripcije, RNA procesiranje, te
transport i sekreciju proteina.
Napose je vano istaknuti, da infekcija nekim animalnim virusima, ne ubija
stanice, ve transformira normalnu stanicu u tumorsku stanicu. Istraivanja virusa
koji uzrokuju nastanak raka, (prvi je opisao Peyton Rous jo 1911), nisu samo stvorila
bazu za nae dananje razumijevanje raka na molekularnoj i staninoj razini, ve su
vodila ka rasvjetljavanju mnogih molekularnih mehanizama koji kontroliraju rast i
diferencijaciju animalnih stanica.
SAETAK
PORIJEKLI I EVOLUCIJA STANICA
Prva stanica: Sve dananje stanice prokariota i eukariota, potiu od jedne jedine
stanice pretka. Smatra se da se prva stanica pojavila prije 3.8 milijarde godina kao
rezultat okruivanja samoreplicirajue RNA s fosfolipidnom membranom.
Evolucija metabolizma: Najranije reakcije za stvaranje metabolike energije bile
su oblik anaerobne glikolize. Nakon toga je evoluirala fotosinteza, iza koje je slijedio
oksidativni metabolizam.
Dananji prokarioti: Dananji se prokarioti dijele u grupu arhebakterija i grupu
eubakterija, koje su se razdvojile rano u evoluciji.
Eukariotske stanice: Eukariotske stanice, koje su vee i sloenije od stanica
prokariota, sadre jezgru, organele citoplazme, i citoskelet. Smatra se da su
evouluirale od simbiostskih zajednica prokariota.
Razvoj viestaninih organizama: Najjednostavniji eukarioti su jednostanini
organizmi (na pr. plijesni i amebe). Viestanini su organizmi evoluirali od asocijacija
tih jednostaninih eukariota, a podjela rada dovela je do razvoja mnogih vrsta
specijaliziranih stanica koje sainjavaju dananje biljke i ivotinje.
STANINI EKSPERIMENTALNI MODELI
E.coli: Zbog genetske jednostavnosti i lakoe ispitivanja, bakterije kao to je E.coli
napose su korisne za ispitivanja fundamentalnih aspekata biokemije i molekularne
biologije
Gljivice kvasca/plijesni: Kao najjednostavnije eukariotske stanice, kvaeve
gljivice vaan su model za ispitivanje raznih aspekata stanine biologije eukariota.
Dictyostelium discoideum: Jednostanian eukariot koji se esto koristi za
eksperimentalnu analizu pokretanja stanice.
Ceanorhabditis elegans: Nematod C. elegans jednostavan je viestanian
organizam koji slui kao vaan model u razvojnoj biologiji.
22
Drosophila melanogaster: Zbog ekstenzivne genetske analize, ispitivanja su

vinske muice dovela do glavnih napredaka u razumjevanju razvoja ivotinja.
Arabidopsis thaliana: Mala biljka cvjetnica Arabidopsis u estoj je upotrebi kao
model u ispitivanjima molekularne biologije i razvoja biljaka.
Kraljenjaci (Vertebrata): Mnoge vrste stanica kraljenjaka mogu rasti u kulturi,
gdje se mogu ispitivati u kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Specijalizirani
tipovi stanica, kao to su na primjer neuroni i miine stanice, predstavljaju korisne
modele za ispitivanje odreenih aspekata stanine niologije. aba Xenopus laevis i
riba Zebrafish vani su modeli za ispitivanje ranih stadija razvoja kraljenjaka, a mi
kao vrsta siasavca je prikladan za genetsku anlizu.
ALATI STANINE BIOLOGIJE
Svjetlosna mikroskopija: Koristei svjetlosni mikroskop kao alat, u vizualizaciji
stanica i lokalizaciji specifinih unutarstaninih molekula primjenjuju se brojne
metode.
Elektronska mikroskopija: Elektronska mikroskopija ije je razluivanje
priblino stostruko vee od razluivanja svjetlosnog mikroskopa, koristi se u analizi
detalja stanine strukture.
Frakcioniranje staninih organela: Organeli eukariotskih stanica mogu se
izolirati diferencijalnim centriugiranjem za biokemijsku analizu.
Rast animalnih stanica u kulturi: Propagiranje animalnih stanica u kulturi
omoguila su ispitivanja mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju stanica
Kultura biljnih stanica: Kultivirane stanice biljaka mogu se diferencirati u
specijalizirane stanine tipove, a u nekim sluajevima mogu regenerirati itavu
biljku.
Virusi: Virusi prestavljaju jednostavne modele za ispitivanje stanine funkcije.
KLJUNI POJMOVI
prokariotska stanica, eukariotska stanica, RNA svijet, fosfolipid,

amfipatian
(dvostranost
fosfolipidnih
membrana,
engl.
amphipatic ), hidrofoban, hidrofilan
adenozin 5-trifosfat (ATP), glikoliza, fotosinteza, oksidativni
metabolizam
Arhebakterije, eubakterije, cijanobakterije, Escherichia coli
(E.coli), stanina stijenka, plazmina/stanina membrana, ribosom
Jezgra, mitohondrij, kloroplast, lizosom, peroksisom, vakuola,
endoplazmatski retikul, Goli-jev aparat, citoskelet, endosimbioza
kvasaeve gljivice/plijesni, Saccharomyces cerevisiae, pseudopodij,
epitelne stanice, fibroblast, eritocit, granulocit, monocit, makrofag,
limfocit, neuron
Caenorhabditis elegans
Drosophila melanogaster
23
Xenopus laevis, zebrafish, transgenini mi
razluivanje, mikroskopja svjetlog polja, fazno-kontrastna
mikroskopija, videom pojaana diferencijalno iterferentnokontrastna mikroskopija, fluorescentna mikroskopija, zeleni
fluorescentni protein (GFP), konfokalna mikroskopija, multi-foton
ekscitacijska mikroskopija
transmisijski elektronski
mikroskop, sjenjanje
metalom,
smrzavanje i lomljenje, scanning elektronski mikroskop
diferencijalno centrifugiranje, ultracentrifuga, centrifugiranje u
gradijentu gustoe, centrifugiranje temeljeno na brzini,
centrifugiranje u ekvilibriju gustoe
embrionalne matine stanice, primarna kultura, stanina linija
kalus (engl. callus)
bakteriofag, retrovirus
PITANJA
1.
Koje su zajednike fundamentalne znaajke svih ivih stanica na Zemlji?
(navedi barem tri)
2.
to su pokazali eksperimenti o nastanku organskih molekula koje je vrio
Stanley Miller?
3.
Koji je tip makromolekula je sposoban upravljati svojom vlastitom
replikacijom?
4.
Zato se smatra da je evolucija fotosinteze pogodovala evoluciji
oksidativnog metabolizma?
5.
Zato je stvaranje polupropusne plazma membrane oko seta
samoreplicirajuih makromolekula tako vaan korak u nastanku ivota?
6.
Raspravi injenicu da su mitohondriji i kloroplasti porijeklom od bakterija
koje su progutali prekursori eukariotskih stanica.
7.
Koliko se razluivanje moe postii sa svjetlosnim mikroskopom ako se
uzorak promatra kroz zrak (suhi objektiv), a ne kroz ulje (uljni ili imerzioni
objektiv) ? Uzmi da je valna duljina vidljive svjetlosti 0.5 m.
8.
Koje su prednosti zelenog fluorescentnog proteina u ispitivanjima poloaja
i kretanja proteina u stanicama u usporedbi s antitijelima koji su oznaeni
fluorokromom?
9.
Identificiraj razliite karakteristike organela koji se odvajaju
centrifugiranjem brzinom u gradijentu saharoze i centrifugiranjem u evkvilibriju
u gradijentu saharaoze.
10.
Kvaeve gljivice koritene su kao model za ispitivanja mnogih aspekata
biologije eukariotskih stanica. Zato su oni pogodan model za analizu pokretanja
eukariotskih stanica?
11.
Zatoje je kutiviranje embrionalnih matinih stanica vano?
12.
Koja je razlika izmeu primarne i permanentne stanine kulture?
24
KLJUNI EKSPERIMENT
Kultura animalnih stanica___________

Nutrition Needs of Mammalian Cells in Tissue Culture
Harry Eagle
National Institutes of Health, Bethesda, MD

Science, Volume 122, 1955, pages 501-504___________
Harry Eagle
Kontekst
Najranije stanine kulture ukljuivale su rast stanica od fragmenata tkiva uklopljenih u
zgusnutu plazmu, sistem koji je bio daleko od prikladnog za eksperimentalnu analizu.
Kasnih 1940tih godina, glavni je napredak uinjen uspostavom staninih linija dobivenih
rastom izoliranih stanica privrenih za stijenku posudice za kulturu. Meutim, te su
stanice jo uvijek rasle u nedfiniranom mediju sastavljenom od razliitih kombinacija
ektrakata seruma i embrija. Na primjer, esto upoterbljavana tumorska stanina linija
(nazvana HeLa stanice) prvotno je uspostavljena 1952. godine rastom u mediju koji se
satojao od pilee plazme, ekstrakta goveeg embrija, i seruma pupkovine (placente)
ovjeka. Koritenje tako kompleksnih i neprecizno definiranih medija inili su analizu
specifinih potreba rasta animalnih stanica nemoguim. Harry Eagle je prvi prijeio taj
problem, provevi sistematsku analizu hranjivih sastojaka potrebnih za rast animalnih
stanica u kulturi.
Eksperimenti
Eagle je ispitivao rast dvije stanine linije: HeLa stanica i stanine linije fibroblasta
nazvane L stanice. Uzgajao je te stanice u mediju sastavljenom od smjese soli,
25
uhljikohidrata, aminokiselina i vitamina, uz dodatak proteina seruma. Sistematskim

variranjem komponentata tog medija, Eagle je uspio odrediti specifine hradnidbene
potrebe za stanini rast. U dodatku soli i glukoze, te hranjive tvari ukljuuju 13
aminokiselina i nekoliko vitamina. Mala koliina proteina seruma takoer je potrebna.
Bazalni medij kojeg je razvio Eagle opisan je u priloenoj tablici prevedenoj iz njegova
rada objavljenog 1955. godine.
Utjecaj
Medij kojeg je definirao Eagle jo se uvijek koristi kao bazini medij za kulturu
animalnih stanica. Njegova je upotreba omoguila znanstvenicima da kultiviraju razne
stanice u definiranim eksperimentalnim uvjetima, koji su kritini za ispitivanje rasta i
diferencijacije animalnih stanica, ukljuujui identifikaciju fakotora rasta prisutnih u
serumu (za koje se danas zna da ukljuuju polipeptide koji kontoliraju ponaanje
pojedinanih stanica u intaktnim ivotinjama).
Tablica 4. Bazalni medij za kultiviranje HeLa stanica i mijih fibroblasta (10)
L-aminokiseline*
(mM)
Arginin
Cistin
Glutamin
Histidin
Izoleucin
Leucin
Lizin
Metionin
Fenilalanin
Treonin
Triptofan
Tirozin
Valin
0.1
0.05 (0.02)
2.0 (1.0)||
0.05 (0.02)
0.2
0.2 (0.1)
0.2 (0.1)
0.05
0.1 (0.05)
0.2 (0.1)
0.02 (0.01)
0.1
0.2 (0.1)
Vitamini
(mM)
10-3
10-3
Folna kiselina
Nikotinamid
10-3
Pentotenska kis. 10-3
Piridoksal
10-3
Tiamin
10-3
Riboflavin
10-4
Soli
(mM)
Razno
Biotin
Holin
Glukoza
Penicilin
10-3
5mM
0.005%#
Streptomicin
0.005%#
Fenolno crvenilo 0.0005%#
__________________________________________
Za ispitivanje stanine hrane

Dijalizirani serum konja, 1%
Dijalizirani humani serum, 10%
Za stone kulture
NaCl
100
Konjski serum, 5%
KCl
5
Humani serum, 10%
NaH2PO4 x H2O
1
NaHCO3
20
CaCl2
1
MgCl2
0.5
* Prikladno uvati u hladnjaku kao pojedinane 20x koncentrirane stok otopine aminokiselina
Za mije fibroblaste
Prikladno uvati kao pojedinane 100 ili 1000 puta koncentrirane stok otopine; uvati stok otopine u smrznutom
stanju
Prikladno uvati u hladnjaku kao dvije stok otopine; jedna koja sadri NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, i glukozu kao
10 puta koncentrirane stok otopine, a druga koja sadri CaCl2 i MgCl2 kao 20 puta koncentrirana optopina
||
uva se kao 100mM stok otopina; uva se u smrznutom obliku kad nije u upotrebi
# uva se kao pojedinana 100 puta koncentrirana stok otopina penicilina, streptomicina i fenolnog crvenila.
26
MOLEKULARNA MEDICINA
Virusi i rak
Bolest
Rak predstavlja skupinu bolesti koju karakterizira nekontrolirani rast i proliferacija
stanica. Rast noramalnih animalnih stanica paljivo je reguliran s ciljem zadovoljenja
potreba cijelog organizma. Nasuprot tome, stanice raka rastu na nereguliran nain,
konano interferijajui s funkcijom normalnih tkiva i organa. Rak je nakon bolesti srca
drugi najei uzrok smrti u SAD. Priblino e jedan od tri Amerikanca razviti rak tijekom
svog ivota, usprkos velikog napretka u lijeenju, a gotovo jedan od etiri Amerikanca
umire od ove bolesti. Razumijevanje uzroka raka i razvijanje efikasnijih metoda lijeenja
raka, predstavljaju stoga glavne ciljeve medicinskih istraivanja.
Molekularna i stanina osnova
Danas je poznato da je rak rezultat mutacija gena koji normalno kontroliraju proliferaciju
stanica. Glavni uvid koji je vodio ka identifikaciji tih gena spoznat je kroz ispitivanja
virusa koji urokuju rak u ivotinja, a iji je prototip izolirao Peyton Rous 1911. godine.
Rous je naao da se sarkomi (rak vezivnih tkiva) pilia mogu prenjeti virusom koji je
danas poznat kao Rousov virus sarkoma (engl. Rous sarcoma virus, ili RSV). Obzirom
da je RSV retrovirus iji genom ima samo 10 000 parova baza, on se moe puno
direktnije ispitivati nego li kompleksan genom pilia ili genom neke druge animalne
stanice. Takva ispitivanja konano su dovela do identifikacije specifinih gena virusa koji
uzrokuju rak (onkogeni), i otkria analognih gena u normalnim stanicama svih vrsta
kraljenjaka, ukljuujui ovjeka. Neki tipovi raka u ovjeka uzrokovani su virusima;
drugi su pak rezultat mutacija normalnih staninih gena slinih onkogenu prvi puta
identificiranom u RSV.
Prevencija i Lijeenje
Rak ljudi koji je izazvan virusima ukljuuje rak cerviksa i druge anogenitalne karcinome
(papilloma virusi), karcinome jetre(hepatitis B i C virusi), i neke tipove limfoma (EpsteinBarr virus, i humani T-cell limphotrophic virus). Tumori inducirani tim virusima ine
ukupno oko 20% incidencije raka u svijetu. U principu, ti bi se tumori mogli prevenirati
vakcinacijom protiv odgovornih virusa. Razvojem efikasnih cjepiva protiv hepatitisa B
uinjen je srazmjeran napredak u tom je podruju.
Ostali tumori ovjeka izazvani su mutacijama normalnih gena, veina kojih se
deava tijekom ivota neke osobe, a rijee su tumori nasljedni. Istraivanja virusa koji
uzrokuju rak dovela su do identifikacije mnogih gena odgovornih za tipove raka koji nisu
27
izazvani virusima, i do razumijevanja molekularnih mehanizama odgovornih za razvoj

raka. Glavni napori usmjereni su danas za primjenu tih spoznaja u molekularnoj i
staninoj biologiji raka za razvoj novih pristupa lijeenju raka. Prvi dizajnirani efikasan
lijek u tretmanu raka u ljudi (STI-571, opisan je u 15.poglavlju) razvijen je protiv gena
vrlo slinog RSV onkogenu.
Literatura
Rous,P.1911. A sarcoma of the fowl transmissible by an agent separable from the tumor
cells. J.Exp.Med.13:379-411.
Slika : Tumor iz kojeg je RSV izoliran.
Slika 1.1 Vremenska skala evolucije
Skala prikazuje priblino vrijeme za koje se smatra da su se upravo tada zbili neki od
glavnih dogaaja u evoluciji stanica.
Sadanjost
0
1
Viestanini organizmi
2
Prolost u
milijardama
godina
Prvi eukarioti
Oksidativni metabolizam
3 Fotosinteza
Prve stanice
4
4.6
5
Formiranje Zemlje
Slika 1.2 Spontano formiranje organskih molekula

Vodena para cirkulirala je kroz atmosferu koja je sadravala CH 4, NH3, i H2 u kojoj je
dolazilo do elektrinog pranjenja. Analize produkata reakcije otkrile su nastanak
razliitih organskih molekula, ukljuujui aminokiseline alanin, asparaginsku kiselinu,
glutaminsku kiselinu i glicin.
Electrode
Electric discharge
Cooling
Water
Heat
Organic molecules
Alanine
Aspartic acid
Glutamic acid
Glycine
Elektroda
Elektrino izbijanje
Hlaenje
Voda
Zagrijavanje
Organske molekule
Alanin
Asparaginska kiselina
Glutaminska kiselina
Glicin
28
Urea
Lactic acid
Acetic acid
Formic acid
Urea
Mlijena kiselina
Octena kiselina
Mravlja kiselina
Slika 1.3 Samoumnoavanje RNA

Komplementarno sparivanje izmeu nukleotida (adenina (A) sa uracilom (U) i gvanina
(G) sa citozinom (C)) omoguuje jednom lancu RNA da poslui kao kalup za sintezu
novog lanca sa komplementarnom sekvencom.
Slika 1.4. Ograivanje samoumnoavajue RNA fosfolipidnom membranom
Smatra se da su se prve stanice razvile ograivanjem samoumnoavajue RNA i
pridruenih okolnih molekula membranom graenom od fosfolipida. Svaka fosfolipidna
molekula ima dva duga hidrofobna repa vezana za hidrofilnu grupu. Hidrofobni repovi su
ugraeni u lipidni dvosloj; hidrofilne glave su izloene vodi na obje strane membrane.
RNA
RNA
Phospholipid membrane
Fosfolipidna membrana
Water
Voda
Phospholipid molecule:
Fosfolipidna molekula:
Hydrophilic head group
Hidrofilna glava
Hidrophobic tail
Hidrofobni rep
Slika 1.5 Stvaranje metabolike energije
Glikoliza je anaerobno cijepanje glukoze do mlijene kiseline. Fotosinteza koristi
energiju suneve svjetlosti za sintezu glukoze iz CO 2 i H2O, a pri tome se oslobaa O2
kao sporedni produkt.
O2 osloboen fotosintezom koristi se u oksidativnom
metabolizmu, u kojem se glukoza cijepa do CO 2 i H2O oslobaajui mnogo vie energije
nego to se dobije glikolizom.
Glikoliza
C6H12O6
-> 2C3H6O3
Nastaje 2ATP
Glukoza
mlijena kiselina
Fotosinteza
6 CO2 + 6 H2O -> C6H12O6 + 6O2
Glukoza
Oksidativni metabolizam
C6H12O6 + 6O2 -> 6CO2 + 6H2O
Nastaje 36-38 ATP
Glukoza
Slika 1.6 Elektronskomikroskopska slika E. coli
Stanica je obavijena staninom stijenkom ispod koje se nalazi plazma membrana. DNA
je smjetena u nukleoidu. (Menge i Wurtz/Biozentrum, University of Basel/Science
Photo Library/Photo Researches, Inc.)
29
Plasma membrane
Cell wall
Nucleoid
Plazma membrana
Stanina stijenka
Nukleoid
Slika 1.7 Strukture ivotinjskih i biljnih stanica

Obje stanice, i animalna i biljna, okruene su plazma membranom i sadre jezgru,
citoskelet, i mnoge zajednike citoplazmatske organele. Biljne stanice su jo obavijene
staninom stijenkom i sadre kloroplaste i velike vakuole.
Animalna stanica
Centriole
Centriol
Mitochondrion
Mitohondrij
Nucleus
Jezgra
Nucleolus
Jezgrica
Plasma membrane
Plazma membrana
Golgi apparatus
Golgijev aparat
Ribosomes
Ribosomi
Cytoskeleton
Citoskelet
Lysosome
Lizosom
Smooth endoplasmic reticulum
Glatki endoplazmatski retikulum
Rough endoplasmic reticulum
Hrapavi endoplazmatski retikulum
Biljna stanica
Cytoskeleton
Peroxisome
Chloroplasts
Cell wall
Plasma membrane
Golgi apparatus
Nucleus
Nucleolus
Rough endoplasmic retikulum
Smooth endoplasmic retikulum
Ribosome
Vacuole
Mitochondrion
Citoskelet
Peroksisom
Kloroplast
Stanina stijenka
Plazma membrana
Golgijev aparat
Jezgra
Jezgrica
Hrapavi endoplazmatski retikulum
Glatki endoplazmatski retikulum
Ribosom
Vakuola
Mitohondrij
Slika 1.8 Evolucija stanica

Dananje stanice su se razvile iz zajednikog prokariotskog pretka u tri smjera, pa
imamo arhebakterije, eubakterije i eukariote. Porijeklo mitohondrija i kloroplasta je
endosimbiotsko udruivanje aerobnih bakterija odnosno cijanobakterija s precima
eukariota.
Cyanobacteria
Cijanobakterije
Other eubacteria
Druge eubakterije
30
Plants
Animals
Fungi (yeasts)
Protists
Archebacteria
Chloroplasts
Mitochondria
Biljke
ivotinje
Gljive (kvasci)
Protisti
Arhebakterije
Kloroplasti
Mitohondriji
Slika 1.9 Scanning elektronskomikroskopska slika Saccaharomyces cerevisiae

Fotografiji je dodana umjetna boja. (Andrew Syed/Science Photolibrary/Pfoto
Researchers, Inc.)
Slika 1.10 Svjetlosnomikroskopska snimka Amoeba proteus
(M.I.Walker/Photo Researchers, Inc.)
Slika 1.11 Kolonije zelenih algi
Pojedinane stanice Volvox-a oblikuju kolonije, koje se sastoje od upljih lopti u kojima
je u elatinozni matriks uklopljeno stotine ili tisue stanica. (Cabisco/Visuals Unlimited.)
Slika 1.12 Svjetlosnomikroskopske snimke tipinih biljnih stanica
(A) Parenhimske stanice koje su odgovorne za fotosintezu i druge metabolike reakcije.
(B) Kolenhimske stanice, specijalizirane su potporne stanice sa debelim staninim
stijenkama. (C) Epidermalne stanice na povrini lista. Siune pore (stome, pui)
okruene su specijaliziranim stanicama koje se zovu zatitne stanice. (D) Elementi ile
(provodni) i traheide su izduene stanice poredane u nizu krajem na kraj i oblikuju ile
ksilema. (A, Jack M. Bastsack/Visuals Unlimited; B, A. J. Karpoff/ Visuals Unlimited; C,
Alfred Owczarzak/Biological Photo Service; D, Biophoto Associates/Science
Source/Photo Researchers Inc.)
Slika 1.13 Svjetlosnomikroskopske snimke tipinih ivotinjskih stanica
(A) Epitelne stanice ustiju (debeli, mnogoslojni pokrov), uovod i crijevo. (B)
Fibroblasti su stanice vezivnog tkiva karakteristinog izduenog, vretenastog
oblika. (C) Eritrociti, granulociti, limfociti i monociti u ljudskoj krvi. ( (A)i i (A)ii, G.
W. Willis/Biological Photo Service; (A)iii, Biophoto Associates/Photo
Researchers, Inc.; B, Don W. Fawcett/Vissuals Unlimited; C, G. W.
Willis/Biological Photo Service.)
(A) mouth
usta
(A)ii bile duct
uni vod
(A)iii intestine
crijevo
(B)
erythrocyte
eritrocit
granulocyte
granulocit
lymphocyte
limfocit
monocyte
monocit
31
Slika 1.14 Bakterijske kolonije

Slika kolonija E. coli koje rastu na povrini agara koji sadri medij. (A.M.
Siegelman/Visuals Unlimited)
Slika 1.15 Elektronskomikroskopska snimka Saccharomyces cerevisiae
(David Scharf/Peter Arnold, Inc.)
Slika 1.16 Dictyostelium discoideum
Ova fotografija pokazuje gibanje dviju ameba tijekom etrdesetak sekundi. (Dobrotom
Davida Knechta, University of Connecticut)
Slika 1.17 Caenorhabditis elegans
(Od J. E.Sulston i H.R: Horvitz, 1997. Dev. Biol. 56:110.)
Pharynx
drijelo
Ovary
Jajnik
Intestine
Crijevo
Eggs
Jaja
Vulva
Stidnica
Rectum
Rektum
Anus
Anus
Slika 1.18 Drosophila melanogaster
(Darwin Dale/Photo Researchers, Inc.)
Slika 1.19 Arabidosis thaliana
(Jeremy Burgess/Photo Researchers, Inc.)
Slika 1.20 Jaja abe Xenopus laevis
(Dobrotom Michaela Danilchicka i Kimberly Ray.)
Slika 1.21 Zebrasta riba
(A) Zametak star 24 sata. (B) Odrasla riba. (A, dobrotom Charles Kimmel, University
of Oregon; B, dobrotom S.Kondo.)
Slika 1.22 Mi kao model za razvoj ovjeka
Dijete i mi pokazuju sline defekte pigmentacije (piebaldizam) to je rezultat mutacije
u genu odgovornom za normalnu migraciju melanocita (stanice odgovorne za
pigmentaciju koe) tijekom embrionalnog razvitka. (Dobrotom R.A. Fleischman, Markey
Cancer Center, University of Kentucky.)
Tabela 1.1 Prokariotske i eukariotske stanice
Osobine
Prokarioti
Jezgra
Nedostaje
Promjer tipine stanice
1m
Citoskelet
Nedostaje
Citoplazmatske organele
Nedostaju
Eukarioti
Prisutna
10-100m
Prisutan
Prisutne
32
Sadraj DNA (parovi baza)

Kromosomi
1X106 do 5X106
jedna kruna DNA molekula
Tabela 1.2 Sadraj DNA u stanicama

Organizam
Bakterije
Mycoplasma
E. coli
Jednostanini eukarioti
Saccharomyces cerevisiae (kvasac)
Euglena
Biljke
Zea mays (kukuruz)
ivotinje
Caenorhabditis elegans (nematoda)
Drosophilae melanogaster (vinska muica)
Pile
Zebrasta riba
Mi
ovjek
1.5 x 107 do 5 x 109

mnoge linearne molekule
DNA
Koliina haploidne
parova baza)
DNA
(milijuni
0.6
4.6
12
70
3000
125
5000
97
180
1200
1700
3000
3000
33
Slika 1.22 Mi kao model razvoja ovjeka

Dijete i mi pokazuju defekte u pigmentaciji (arenilo, engl. pieboldism) kao rezultat
mutacije gena potrebnog za normalnu migraciju melanocita (stanica odgovornih za
pigmentaciju koe) za vrijeme embrionalnog razvoja. (Susretljivou A.R. Fleischman,
Markey Cancer Center, University of Kentucky.)
Slika 1.23 Stanina struktura pluta
Reprodukcija originalnog crtea tankog reza pluta kojeg je izradio Robert Hook
promatranjem sa svjetlosnim mikroskopom. Stanice koje je Hook gledao zapravo su
bile samo stanine stijenke preostale od stanica koje su davno uginule.
Slika 1.24 Numerika apertura
Svjetlo se fokusira na uzorak pomou lee kondenzora kojeg potom sakuplja lea
objektiva mikroskopa. Numerika aperura je odreena kutom () stoastog snopa
svjetla koji ulazi u leu objektiva, i indeksom refrakcije medija(obino zrak ili ulje) izmeu
lee i biolokog uzorka.
Lea objektiva
Uzorak
Lea kondenzora
Svijetlo
Slika 1.25 Mikrofotografija obojenog tkiva snimljena svjetlosnim mikroskopom
(svjetlo polje).
Sekcija benignog tumora bubrega (G.W. Willis/Biological Photo Service.)
Slika 1.26 Promatranje ivih stanica mikroskopom
Mikrofotografije stanica bukalne sluznice dobivene u (A) svjetlom polju, (B) faznim
kontrastom, i (C) diferencijano interferentno-kontrastnom mikroskopijom (Susretljivou
Mort Abramowitz, Olympus America, Inc.)
Slika 1.27 Videom pojaana diferencijalno interferentno-kontrastna mikroskopija
Elektronska obrada slike omoguava vizualizaciju pojedinanih mikrotubula.
(Susretljivou E.D. salmon, University of North carolina, Chapel Hill.)
Slika 1.28 Fluorescentna mikroskopija
(A) Svjetlo prolazi kroz ekscitacijski filter koji selekcionira svjetlo odreene valne duljine
(na pr., plavo svjetlo), koje pak ekscitira fluorescentnu boju. Dihorino ogledalo tada
odbija ekscitacijsko svjetlo usmjerujui ga dolje na uzorak. Fluorescentno svjetlo koje
emitira uzorak (na pr., zeleno svjetlo) tada prolazi kroz dihorino ogledalo i drugi filter
(engl.barrier filter) koji selekcionira svjetlo valne duljine koje emitira fluorescentna boja
(boja kojom su oznaene specifine molekule u uzorku). (B) Fluorescentnim
mikroskopom dobivena mikrofotografija stanice plua tritona u kojoj je DNA obojena
34
plavo, a mikrotubuli u citoplazmi su obojeni zeleno. (Conly S. Rieder/Biological Photo

Service.)
(A)
Ekcitacijski filter
Okular
Barrier filter
Dihorino ogledalo
Fluoresentno svjetlo
Lea objektiva
Uzorak
Slika 1.29 Fluorescentna mikroskopija proteina oznaenog (engl. labelling) s GFP
Protein mitohondrija spojen s GFP ubaen je u stanice ovjeka u kulturi i vizualiziran
fluorescentnom mikroskopijom. (Susretljivou BD Biosciences Clontech.)
Slika 1.30 Konfokalna mikroskopija
Uski snop svjetla fokusira se na odreenu dubinu uzorka, a emitirano fluorescentno
svjetlo sakuplja detektor. Prije nego li stigne do detektora, fluorescentno svjelo emitirano
s uzorka mora proi kroz konfokalnu aperturu smjetenu na mjestu gdje se svjetlo
emitirano iz izabrane dubine uzorka nalazi u fokusu. Rezultat je da se detektira samo
fokusirano svjetlo emitirano s izabrane dubine uzorka.
Fokusirano svjetlo dosee detektor
Konfokalana apertura
Svjetlo izvan fokusa ne moe dosei detektor
Emitirano fluorescentno svjetlo
U fokusu
Izvan fokusa
Uzorak
Slika 1.31 Konfokalna mikrofotografija stanica ovjeka
Mikrotubuli i filamenti aktina obojeni su crvenom odnosno zelenom fluorescentnom
bojom. (K.G.Murti/Visuals Unlimited.)
Slika 1.32 Dvofotonska ekscitacijska mikroskopija
Za ekscitaciju fluorescentne boje potrebna je istovremena absorpcija dva fotona. To se
dogaa samo u toci uzorka iznad kojeg je ulazno svjetlo u fokusu., tako da se
fluorescentntno svjetlo emitira samo s odabrane dubine uzorka.
Laserski snop
Uzorak koji sadri fluorokrome
Dvofotonska ekscitacija
Fluorokrom
Ekscitirani fluorokrom
Foton
Slika 1.33 Pozitivno bojanje

Transmisijsko elektronska mikrofotografija pozitivno obojene bijele krvne stanice. (Don
W.Fawcett/Visuals Unlimited.)
Slika 1.34 Negativno bojanje
35
Transmisijsko elektronska mikrofotografija negativno obojenih filamenata aktina.

(Susretljivou Roger Craig, University of Massachusetts Medical Center.)
Slika 1.35 Sjenjanje metalom
Elektronska mikrofotografija filamenata
sjenjanjem metalom.
aktina/miozina
citoskeleta
prepariranih
Slika 1.36 Smrzavanje i lomljenje

(A) Postupak smrzavanja i lomljenja razdvaja dvoslojni lipid, ostavljajui proteine
ukljopljene u membranu pri emu proteini membrane ostaju vezani s jednom od dvije
polovice membrane. (B) Mikrofotografija staninih membrana dviju susjednih stanica
snimljena postupkom smrzavanja i lomljenja. Proteini koji se proteu kroz dvoslojnu
membranu izgledaju kao intramembranske partikule (strelica). (Don W.
Fawcett/Phozo Researchers, Inc.)
(A)
Proteini
Fosfolipidi
Slika 1.37 Scanning elektronska mikroskopija

Scanning elektronska mikrofotografija makrofaga.
Unlimited.)
(David
Phillips/Visuals
Slika 1.38 Frakcioniranje stanice

Stanice se liziraju, a stanine se komponente odvajaju serijom centrifugiranja pri sve
veim brzinama. Nakon svakog centrifugiranja, pojedini se organeli sedimentirani na
dnu epruvete mogu izdvojiti. Supernatant se zatim ponovno centrifugira na veoj
brzini da bi se sedimentirali slijedei organeli po veliini.
Centrifugiranje
800 rpm (10 minuta)
Suspenzija razbijenih stanica sadri
stanine komponente kao to su lizosomi,
peroksisomi i dijelovi membrane
Centrifugiranje supernatanta
15 000 rpm (10 minuta)
Sediment jezgara
Centrifugiranje supernatanta
100 000 rpm (60 minuta)
Sediment mitohondrija,
Lizozoma i peroksisoma
Centrifugiranja supernatanta
200 000 rpm(3 sata)
Sediment fragmenata plazma
membrane i endoplazmatskog retikula
Citosol
Sediment ribosoma
36
Slika 1.39 Brzinsko centrifugiranje u gradijentu gustoe

Uzorak se kao sloj stavi na vrh gradijenta saharoze, a partikule razliitih veliina
sedimentiraju se du gradijenta kao uoljive pruge.
Uzorak se nanosi na vrh
gradijenta saharoze
Sporo sedimentirajue partikule

Partikule razliitih veliina sedimentiraju
se kao uoljive pruge
Gradijent saharoze
Centrifugiranje
Brzo sedimentirajue partikule
Sakupljanje frakcija gradijenta
Brzo sedimentirajue partikule
Sporo sedimentirajue parikule
Slika 1.40 Animalne stanice u kulturi

Mikrofotografija humanih fibroblasta prihvaenih za povrinu posudice za kulturu,
dobivena scanning elektronskim mikroskopom. (David M. Phillips/Visual
Unlimited.)
Slika 1.41 Kultiviranje/kultura animalnih stanica
Tkivo
Komadi tkiva usitnjen na pojedinane
stanice resuspendira se u medij
Stanice se nasade
medijem
hranjivim
Suspenzija stanica
posudicu
Tekui medij
Primarna kultura
Stanice u primarnoj kulturi prihvate se
za posudicu i rastu dok ne prekriju cijelu
povrinu posudice za kulturu
Stanice se potom mogu presaditi u nioj
koncentraciji tvorei sekundarnu kulturu
Sekundarna kultura
Slika 1.42 Biljne stanice u kulturi
Nediferencirana masa biljnih stanica (engl. callus) raste na krutom homogenom
mediju. (John N.A.Lott/Biological Photo Service.)
Slika 1.43 Graa jednog animalnog virusa
(A) Parikule Papilloma virusa sadre malu cirkularnu DNA molekulu obavijenu
proteinskim omotaem (kapsida, engl. capsid). (B) Elektronska mikrofotografija
37
partikula humanog papilloma virusa. Dodana je umjetna boja. (B, Linda

Stannard/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)
(A)
DNA
Proteini kapside
Slika 1.44 Plakovi bakteriofaga

T4 plakovi vidljivi su na ploi kulture E.coli. Svaki plak nastaje replikacijom jedne
jedine virusne partikule. (E.C.S. Chen/Visuals Unlimited.)
Tablica 1.3 Primjeri animalnih virusa

Porodica virusa
Reprezentativni primjer
Veliina genoma
(x 1000 parova baza)
RNA genom
Picorna virusi
Togavirusi
Flavivirusi
Paramyxovirusi
Orhomyxovirusi
Retrovirusi
Poliovirus
V. Rubeole
V.ute groznice
V. Ospica
V. Influenze
HIV
7-8
12
10
16-20
14
9
DNA genom
Hepadnavirusi
Papovavirusi
Adenovirusi
Herpesvirusi
Poxvirusi
Hepatitis B
Humani papillomav.
Adenovirus
Herpes simplex
Vaccinia virus
3.2
5-8
36
120-200
130-180
38
39

1 Poglavlje - Temp

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

1 Poglavlje - Temp

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

1 Poglavlje - Temp

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Poglavlje 1

1. Pregledno o stanicama i istraivanju stanica

te takoer pregledom nekih najznaajnijih povijesnih napredaka koji su doveli do

Porijeklo i evolucija stanica

godinama, kada je u laboratoriju Sida Altmana i Toma Cecha otkriveno da je RNA

kisika. Te reakcije su vjerojatno bile oblik dananje glikolize anaerobna razgradnja

obavijena krutom staninom stijenkom izgraenom od polisaharida i peptida. Ispod

Eukariotske stanice imaju jo jednu razinu unutranje organizacije: citoskelet,

Razvoj viestaninih organizama

Jasno je da je evolucija ivotinja ukljuivala razvoj odgovarajue raznolikosti i

Stanice kao eksperimentalni modeli

Dictyostelium vanim modelom za studiranje molekularnih mehanizama odgovornih za

Iscrpna genetika analiza Drosophila-e otkrila je mnoge gene koji kontroliraju

miine stanice su visoko specijalizirane za kontrakciju, proizvodei snagu i pokret.

ALATI & METODE STANINE BIOLOGIJE

svjetlosti i sabirnom moi lea mikroskopa (numerika apertura, NA), a izraunava se

Konfokalna mikroskopija sjedinjuje znaajke fluorescentnog i mikroskopa s

mikroskopije slian je mikroskopiji u svjetlom polju. Uzorci se fiksiraju i boje

razluivanje elektronskog scanning mikroskopa samo oko 10 nm, njegova je

staninih komponenta na bazi njihove gustoe plutanja (engl. buoyant density)

komuniciraju meusobno. Na primjer, jedna od vanih funkcija fibroblasta koe u

retrovirusi (porodica animalnih virusa) sadre RNA genom u virusnim

Drosophila melanogaster: Zbog ekstenzivne genetske analize, ispitivanja su

prokariotska stanica, eukariotska stanica, RNA svijet, fosfolipid,

Kultura animalnih stanica___________

National Institutes of Health, Bethesda, MD

uhljikohidrata, aminokiselina i vitamina, uz dodatak proteina seruma. Sistematskim

Za ispitivanje stanine hrane

izazvani virusima, i do razumijevanja molekularnih mehanizama odgovornih za razvoj

Slika 1.2 Spontano formiranje organskih molekula

Slika 1.3 Samoumnoavanje RNA

Slika 1.7 Strukture ivotinjskih i biljnih stanica

Slika 1.8 Evolucija stanica

Slika 1.9 Scanning elektronskomikroskopska slika Saccaharomyces cerevisiae

Slika 1.14 Bakterijske kolonije

Sadraj DNA (parovi baza)

Tabela 1.2 Sadraj DNA u stanicama

1.5 x 107 do 5 x 109

Slika 1.22 Mi kao model razvoja ovjeka

plavo, a mikrotubuli u citoplazmi su obojeni zeleno. (Conly S. Rieder/Biological Photo

Slika 1.33 Pozitivno bojanje

Transmisijsko elektronska mikrofotografija negativno obojenih filamenata aktina.

Slika 1.36 Smrzavanje i lomljenje

Slika 1.37 Scanning elektronska mikroskopija

Slika 1.38 Frakcioniranje stanice

Slika 1.39 Brzinsko centrifugiranje u gradijentu gustoe

Sporo sedimentirajue partikule

Sporo sedimentirajue parikule

Slika 1.40 Animalne stanice u kulturi

partikula humanog papilloma virusa. Dodana je umjetna boja. (B, Linda

Slika 1.44 Plakovi bakteriofaga

Tablica 1.3 Primjeri animalnih virusa

You might also like