Spektroskopija u UV-Vis

oblasti
teorijske osnove tehnike i primena

UVEK TREBA IMATI NA UMU DA:

Elektromegnetno zraenje (EM) i

materija
Transmisija - EM prolazi kroz meteriju bez ikakve
interakcije
Apsorpcija - EM biva adsorbovan od strane atoma, jona
ili molekula podiui ih na via energetska stanja
Emisija - oslobadjanje energije od strane atoma, jona ili
molekula dovodei ih na nia energetska stanja

Vizuelna kolorimetrija je jedna od najstarijih analitikih

metoda; i mada postoje indikacije da je koriena jo u
vreme starih Grka, nauna primena zaeta je kada je 1729
Pierre Bouguer izneo tezu da:
ako data debljina obojenog stakla apsorbuje polovinu
svetlosti koja dolazi sa izvora svetlosti, onda e dvostruko
deblje staklo redukovati tu svetlost na etvrtinu poetne
vrednosti.

30 godina kasnije, Jean-Henri Lambert (17281777) je

postavio prvu matematiku vezu koja kae da je:
logaritam opadanja intenziteta svetlosti jednak proizvodu
neprozirnosti (opacity) te sredine i njene debljine.

Konano, 1850, nemaki fiziar Auguste Beer je postavio

relaciju izmedju koncentracije i optike gustine (sada
nazvane apsorbancija), koja je dovela do dananjeg oblika
LambertBeerBouguer zakona.

Apsorpcija svetlosti iz oblasti od 80 do 1100 nm (bliska UV do bliske IR

oblasti), od strane materije je izuzetno opseno izuavana pojava.
Apsorpcija svetlosti iz ovog dela spektra donosi malo podataka o
strukturi materije, ali je vrlo korisna u smislu kvantitativnih merenja
koncentracija supstance u rastvoru moe biti odredjena primenom
LambertBeerBouguer zakona metoda je poznata pod imenom
kolorimetrija.
Kolorimetrija je primenljiva ne samo na supstance koje pokazuju
spektar apsorpcije u ovoj oblasti; ve na sve one supstance koje posle
modifikacije odredjenim reagensima, pokazuju takav spektar.
Merenja se vre primenom itave pelete razliitih instrumenata, od
bazinih kolorimetara do automatizovanih spektrofotometara za multikomponentne analize.
Potreba za razvijanjem UV-Vis detektora za potrebe tene
hromatografije i kapilarne elektroforeze podstakla je usavravanje ove
vrste instrumenata; dajui na taj nain mogunost da se istovremeno
dobiju hromatogrami i dobiju informacije u vezi sa prirodom i
(kvantitativno) sastavom jedinjenja.

UV-Vis spektralni region i poreklo

apsorpcije
Ovaj deo spektra elektromagnetnog zraenja podeljen je na 3 podoblasti: bliski UV (185-400 nm), vidljivi (400-700 nm) i bliski IR (7001100 nm).
Veina komercijalnih spektrofotometara pokriva oblast 185 900 nm.
Donja granica instrumenta zavisi od prirode optikih komponenti koje
se koriste u opremi; i znaajno, od toga da li je na putu svetlosti (na
optikom putu) prisutan vazduh ili ne; znajui da kiseonik i voda
apsorbuju intenzivno u oblasti ispod 190 nm.
Neki instrumenti, koji su konstruisani tako da se u njima (u odeljku u
koji se smeta uzorak) moe izvriti evakuacija, rade sa gasnim
uzorcima do granice od 150 nm. Ovo je domen daleke ili vakuumske UV
oblasti.

to se tie gornje granice detekcije, ona je odredjena osobinama

detektora
spektrofotometra.
Postoje
komercijalni
UV-Vis
spektrofotometri kod kojih je granica detekcije u bliskoj infracrvenoj
oblasti pomerena do 3300 n.

Poreklo apsorpcije svetlosti u ovom spektralnom domenu je interakcija

fotona svetlosti iz izvora sa jonima (molekulima) uzorka. Kada molekul
apsorbuje foton iz UV-Vis oblasti, odgovarajua koliina energije biva
zarobljena od strane jednog ili vie spoljanjih elektrona te ispitivane
materije.
Kao posledica tog dogadjaja, deava se promena energetskog stanja tog
elektrona (Eelec), i takodje promena komponenti ukupne (mehanike, to
jest, kinetike) energije molekula: energije rotacije i energije
vibracije: Erot i Evib.
Promena Eelec dovee do promena i u Erot and Evib, to e ukupno
dati veliki broj mogunosti za posebne pojedinane razliite prelaze
(skokove) elektrona; a kako e time jo biti i izmenjena polarnost
(kovalentne) veze izmedju molekula; spektri koji e na ovaj nain nastati
nazivaju se: charge transfer spectra.

Etot =Erot +Evib +Eelec

gde je Eelec >Evib>Erot.

Energetska kvantifikacija molekula.

Dijagram pokazuje elektronska,
rotaciona i vibraciona energetska
stanja molekula.
Svaka horizontalna linija odgovara
razliitom energetskom stanju.
Hijerarhijska struktura je sledea:
izmedju svaka dva elektronska
stanja, obeleena sa S, postoji vie
vibracionih (V) nivoa, koji su svaki
dalje podeljeni na rotacione (R)
podnivoe (skala ovog dijagrama nije
realna vibracioni i rotacioni nivoi
su daleko blii jedan drugom nego
to je pokazano), a realan odnos
izmedju Eelec:Evib:Erot je
1000:50:1.
U kondenzovanim stanjima, kako su
molekuli vrlo blizu jedan drugom, ni
jedan instrument, bez obzira na
njegovu rezoluciju, ne moe da
registruje pojedine elektronske
prelaze.

VEOMA VANO: RAZLIKUJEMO:

-Atomsku i molekulsku spektroskopiju (po mestu gde se

deava kvantni prelaz);
-Apsorpcionu i emisionu spektroskopiju (po tome da li
detektujemo energiju koja je apsorbovana ili emitovana;
ovo zavisi SAMO od toga kako konstruiemo instrument);
-Refleksionu i transmisionu spektroskopiju (instrumenti se
konstruiu da bi radili na jedan od ova dva naina, zavisno
od toga da li treba da slue za analizu transparentnih ili
netransparentnih uzoraka).
-Takodje, metode
nedestruktivne!

mogu

da

budu

destruktivne

ATOMSKA APSORPCIONA
SPEKTROSKOPIJA - AAS

-Tehnika je zasnovana na tome da atomi apsorbuju svetlost specifinih

talasnih duina kvantiranost energije! ~ 1800 zakon Kirchoff-a, Bunsen-a,
Angstrom-a, Rowland-a, Michelson-a i Balmer-a: Materija apsorbuje
svetlost na istim talasnim duina na kojima je i emituje princip na
kome funkcionie metoda AAS.

AAS koristi pojavu apsorpcije svetlosti u svrhu merenja koncentracije

atoma koji se nalaze u gasnoj fazi. Kako su uzorci najee u tenom ili
vrstom stanju, uzorci najpre moraju biti prevedeni u gasno stanje.
Atomi apsorbuju UV ili Vis fotone, zbog toga njihovi elektroni prelaze na vie
energetske nivoe. Koliina apsorbovane energije je specifina za odredjeni
elektronski prelaz u konkretnom, pojedinanom atomu (elementu).
Koncentracija analita moe biti odredjena iz koliine apsorbovane svetlosti,
primenom Lambert-Beer-ovog zakona (odredjivanjem standardne prave).

Uzorak je preveden u atomsko

stanje najee primenom plamena.
Apsorbovana svetlsot dolazi iz
zivora (lampe).

AAS je spektroskopska tehnika koja omoguava kvalitativna i kvantitativna

odredjivanja hemijskih elemenata; zahvaljujui apsorpciji radijacije
(elektromagnetnog zraenja) od strane slobodnih atoma u gasnom stanju. U
analitikoj hemiji ova tehnika se koristi da bi bila odredjena koncentracija
analiziranog uzorka. Mogue je analizirati preko 70 elemenata iz PSE.

U postupku emisione spektroskopske analize, ispitivana

materija se dovede do usijanja, a potom se emitovana
svetlost detektorskim sistemom razlani na emisioni
spektar, koji se dalje analizira. Kako svaka pojedina
vrsta atoma emituje svoj karakteristini spektar,
emisioni spektar neke smese (na primer, legure)
odgovarae adiciji (zbiru) spektara prisutnih sastojaka.

Za dokazivanje prisustva pojedinih elemenata, dovoljno

je pronai na fotografskoj ploi njihove spektralne
linije u UV ili Vis podruju. Za ovu vrstu analize posebno
su pogodni (osetljivi) alkalni metali, koji se ovakvom,
emisionom spektroskopskom analizom, mogu otkriti jo
od koncentracija od 0.0001%.

Izvori svetlosti su: katodne lampe, lampe sa pranjenjem,

deuterijumske lampe, kontinualni izvori zraenja.
Ima vie vrsta atomizera, ali se najee koriste plamen i/ili elektrotermalni
atomizeri.
U plamenu se deavaju sledei procesi:
-Suenje (evaporacija rastvaraa), uzorak ostaje u obliku nano estica;
-Isparavanje u gasnu fazu;
-Atomizacija molekuli disosuju do slobodnih pojedinanih atoma;
-Jonizacija zavisno od njihovog jonizacionog potencijala, neki atomi analita mogu
da budu prevedeni u jonsko stanje.
Najpoznatiji i najee korieni plamen je onaj
nastao od meavine vazduha i acetilena (2100 C) i
onaj nastao od N2O i acetilena (2700 C).

MOLEKULSKA
SPEKTROSKOPIJA

NASTANAK SPEKTRA
Apsorpcioni spektar u UV-Vis oblasti nastaje tako to se svetlost sa
izvora upuuje na uzorak koji zbog prethodno objanjenih fenomena
vri apsorpciju u odredjenim porcijama, tako da detekcioni sistem
registruje smanjenje u intenzitetu svetlosti koja izlazi iz uzorka.
Bilo koji snimljeni spektar dobijen je od uzorka koji sadri ogroman
broj molekula koji nisu svi na istom energetskom stanju.
Zbog toga, iako je elektronski skok kvantiran i odredjen, dobijeni
grafiki prikaz spektra je u obliku trake a ne linije, pa ta traka
pokriva linije nastale od elektronskih, vibracinih ili rotacionih prelaza
individualnih molekula.
Energija koja je apsorbovana (zarobljena) tokom apsorpcije fotona
moe naknadno biti oslobodjena u vie razliitih procesa koji se
deavaju
medjusobno
konkurentno:
emisija,
fosforescencija,
fluorescencija; i one predstavljaju osnove drugih metoda.

Instrumenti koji se koriste u UV-Vis regionu

Spektrofotometri imaju obavezno tri osnovna dela (modula):
- izvor
- disperzivni sitem
- detekcioni sistem.
Uzorak se umee na optiki put, bilo ispred ili iza disperzionog
sistema.

Bitna osobina instrumenata je rezolucija. Neki instrumenti, koji se koriste za

rutinske analize, ne moraju obavezno da imaju visoku rezoluciju. Medjutim, za
sve spektrofotometre je vano da daju mogunost kvantitativnog
odredjivanja.

UV/Vis spektar daje skup podataka o apsorbovanoj koliini zraenja u

funkciji od talasne duine i predstavlja se kao transparencija (ili
apsorbancija) vs. talasna duina (preporueno izraena u nm, mada
moe da bude izraena i u cm-1).
U spekroskopiji, transparencija T, predstavlja meru propustljivosti
sredine (uzorka) za monohromatski zrak, to jest pretstavlja kolinik
intenziteta svetlosti koja je prola kroz uzorak (I) sa intenzitetom
svetlosti koja je na uzorak upuena (I0).

cm 1

cm

~
E h hc
Dobijeni spektar je sastavljen od traka, i moe biti relativno
jednostavan (jedna ili nekoliko irokih traka, najee dobijen
rastvaranjem vrstog materijala) ili moe da pokazuje finu
strukturu (vie dobro definisanih, uzanih traka, kao u sluaju spektara
gasova).

 4000nm
1 ~
1
10 nm
1
2500cm

4000nm cm
7

Elektronski prelazi organskih molekula

UV-Vis spektroskopijom se najvie ispituju organska
jedinjenja.

Primeeni elektronski prelazi ukljuuju elektrone iz ili

orbitala, ili takodje, nevezujue elektrone iz orbitala lakih
atoma kao to su: H, C, N, O.
Gde god je mogue, vri se identifikacija apsorpcionih
traka, i trai veza za molekulskom orbitalom (MO) iz koje
elektron potie; i takodje, vri se odredjivanje molarnog
apsorpcionog koeficijenta (L mol-1 cm-1), na odgovarajuoj
talasnoj duini koja odgovara maksimumu apsorpcije.

Apsorpcija energetski nivoi

Rotacioni nivo
E

Vibracioni nivo

E
R

Elektronski nivo

G
Y

Apsorpcija energetski nivoi

E = talasni foton

E = IR foton

E
N

E = UV/Vis foton

G
Y

Postoje sledei elektronski prelazi:

n *

n*

dd

prelaz deava se u dalekoj UV oblasti, jer pretstavlja skok iz vezujue MO u

antivezujuu MO, i zahteva visoku energiju. Ovo je objanjenje zato su
zasieni ugljovodonici, koji poseduju samo ovu vrstu veza, transparentni u
oblasti bliskog UV:

hexane (gas state): max =135nm

zasieni ugljovodonici mogu biti rastvarai za supstance koje apsorbuju u
bliskoj UV oblasti.

n *

Skok jednog n elektrona sa atoma O, N, S, Cl u * nivo daje prelaz srednjeg

intenziteta na oko 180nm u sluaju alkohola, oko 190nm u sluaju etara ili
halogenih derivata I oko 220 nm za amine.
Methanol: max = 183nm; ether: max = 190nm;
ethylamine: max =210nm; 1-chlorobutane: max =179nm.

n*

Ovaj prelaz niskog intenziteta nastaje zbog prelaza n elektrona (iz

nevezujue MO u antivezujuu * orbitalu). Ovaj prelaz se sree kod
molekula koji poseduju hetero atome sa sparenim parom (nevezujuih)
elektrona.
Najpoznatiji primer je karbonilna veza, ija optika apsorpcijaje nadjena oko
270 do 295 nm.
Primer: etanal: max =293nm, sa etanolom kao rastvaraem).

Jedinjenja koja poseduju izolovanu etilensku dvostruku vezu, pokazuju jaku

apsorpciju na oko 170 nm.
Primer: ethylene: max =165nm

dd

Brojne neorganske soli poseduju elektrone u d orbitalama; oni su odgovorini

za prelaze sa slabom apsorpcijom koja se ispoljava u Vis oblasti. Ovi prelazi
su u optem sluaju odgovorni za boju ovih soli.

Funkcionalne grupe organskih jedinjenja koje su odgovorne

za apsorpciju u UV-Vis oblasti, nazivaju se hromofore.
Vrste koje nastaju tako to se na ugljenini niz koji je
transparentan u bliskom UV-u, nakai jedna ili vie
hromofora, naziva se hromogen.
Izolovane hromofore: za seriju molekula koji imaju istu
hromoforu, pozicija i intenzitet apsorpcione trake ostaju
konstantni. Kada molekul poseduje nekoliko izolovanih
hromofora (koje medjusobno ne interaguju zato to su
razdvojene sa najmanje 2 jednostruke veze C skeleta),
tada se primeuje preklapanje traka koje potiu od
izolovanih hromofora.

Sistem
konjugovanih
hromofora:
kada
hromofore
interaguju jedna sa drugom, apsorpcioni spektar je
pomeren ka veim talasnim duinama (batohromni efekat),
to je praeno poveanjem intenziteta (hiperhromni
efekat).

Uticaj rastvaraa
Kako svaki rastvara ima svoju karakteristinu
polarnost, i kako se zna da elektronski prelazi menjaju
raspored naelektrisanja jedinjenja u rastvoru, oigledno
je da e pozicija i intenzitet apsorpcionih traka varirati
u izvesnoj meri zavisno od prirode rastvaraa koji je
primenjen.
Uticaj na poloaj maksimuma apsorpcije koji se ostvaruje
kada se promeni rastvara je vrlo vana indikacija za tip
elektronskog prelaza koji postoji u uzorku. Postoje dva
razliita sluaja:

Hipsohromni efekat (plavi pomeraj):

Ako je hromofora koja je odgovorna za primeeni prelaz

polarnija u svom osnovnom stanju nego kada je
ekscitirana, tada e polarni rastvara solvatacijom
(rastvaranjem) stabilisati molekul, pre nego to se desi
apsorpcija fotona.
Molekuli rastvaraa e tada okruiti molekul rastvorka,
zbog elektrostatikih efekata. Zbog toga e biti
potrebno vie energije da se izvri elektronski prelaz o
kome se radi (max kraim talasnim duinama), u odnosu
na ono to bi se dogodilo u nepolarnom rastvarau.

Batohromni efekat (crveni pomeraj):

Za manje polarna jedinjenja, uticaj rastvaraa je mali.
Medjutim, ako dipolni momenat hromoforne grupe raste
kao rezultat elektronskog prelaza, konano dobijeno
stanje e biti solvatisano u veoj meri. Tako polarni
rastvara moe da stabilie ekscitovanu formu i
primeuje se pomeraj max veim talasnim duinama u
odnosu na ono to se uoava u nepolarnom rastvarau. Ovo
je batohromni (crveni) pomeraj.

Uticaj pH rastvaraa:
- moe biti veliki; i omoguava promenu boje zahvaljui
upotrebi hemijskih indikatora, na primer, tokom,
acidimetrijskih merenja.

SPEKTROFOTOMETRI MOGU DA
BUDU:
-Emisioni i apsorpcioni;
-Jednozrani i dvozrani;

-Skenirajui i neskenirajui;
-Transmisioni i refleksioni.
-Najvanija osobina je: REZOLUCIJA

Izvori zraenja
za vidljivi deo spektra, lampa sa volframovim filamentom u kvarcu;

za UV region: deuterijumska luna lampa pod pritiskom, da bi

emitovala kontinualno na <350nm;
alternativno, za celi region od 200 do 1100 nm, ksenon luna lampa.

UV/Vis spektrofotometri se po dizajnu klasifikuju u tri

glavna tipa:
-Jendozrani fiksni spektrofotometar;
-Skanirajui dvozrani spektrometar
odredjivanje apsorbancije;

za

automatsko

-Neskenirajui spektrofotometar sa
simulatno merenje vie talasnih duina.

detektorom

za

Jendozrani fiksni spektrofotometar

Skanirajui dvozrani spektrometar za automatsko odredjivanje

apsorbancije

VANO!

Dvozrani
spektrofotometar
omoguava
difirencijalna merenja
izmedju uzorka i slepe
probe***.
irina trake koja se
moe odrediti ovim
instrumentima moe biti
ak 0.01 nm.

-Neskenirajui kolorimetar sa detektorom za simulatno merenje

vie talasnih duina.

Shema
refleksionog
spektrofotometra

VANO!
Da bi se obezbedila tana merenja, mora se izvriti
kalibracija talasnih duina u UV/Vis oblasti, i to, i po y osi
(T, %) i po x osi ().
Koristi se rastvor holmijum oksida (Ho2O3) u razblaenoj
perhlornoj kiselini.

KVANTITATIVNA
ODREDJIVANJA
Apsorpcija u UV-Vis oblasti je iskorienja za
postavljanje metode za kvantitativno odredjivanje
koncentracije.
Metoda se bazira na LambertBeer zakonu, koji, pod
odredjenim uslovima, povezuje apsorpciju svetlosti sa
koncentracijom rastvora.

Veza je data kao:

A je apsorbancija, optiki parameter bez dimenzija koji se

cobija merenjem spektrofotometrom; l je debljina (u cm)
sloja rastvora koji se analizira, C je molarna koncentraicja i
je molarni apsorpcioni koeficijent (L mol-1 cm-1), na
talasnoj duini na kojoj se merenje vri.
Ovaj parametar, takodje nazvan i apsorptivnost, je
karakteristika jedinjenja i zavisi, izmedju ostalog, od
temperature i prirode rastvaraa. Generalno, njegova
vrednost se daje za odredjenju talasnu duinu maksimuma
apsorpcije (zauzima vrednosti od 0 do 200000).

Prema Lambert-ovoj hipotezi, intenzitet monohromatske radijacije I

opada za dl (negativna vrednost) posle prolaska svetlosti kroz sloj
ispitivanog materijala debljine dx, a iji je apsorpcioni koeficijent k
za datu :

Ako je I0 intenzitet upadne svetlosti, tada je:

Beer: k C

I I 0e
I
T
I0

k lC
'

Zamenom k sa kC, dobijena je nova jednaina:

A abC
Zakon vai pod sledeim uslovima:
1. Upotrebljena svetlost mora biti monohromatska
2. Koncentracije moraju biti niske

3. Rastvor ne sme biti fluorescentan ili heterogen

4. Sa rastvorkom se ne sme deavati fotohemijska
transformacija
5. Rastvorak ne sme da ulazi u hemijsku asocijaciju ili
reakciju sa rastvaraem.

Frakcija (udeo) zraenja

koja je proputena kroz
rastvor, ili transparencija
(T) definisana je sa:

A = - logT = k l C = abC

It
T
I0

Aditivnost apsorbancija

Metode kvantitativne analize

Ako jedinjenje ne apsorbuje svetlost iz odredjenog
spektroskopskog podruja, ono ne moe biti izkorieno za
kvantitativno odredjivanje; osim ako ne bude hemijski
transformisano na taj nain da dobije hromoforu.

Dakle, da bi kvantitativno odredjivanje postalo mogue u

sluajevima kada hemijska vrsta ne apsorbuje, ima slabu
apsorpciju ili se nalazi u smei sa supstancama koje
takodje apsorbuju, neophodno je najpre izvriti njegovu
hemijsku transformaciju, koja mora biti:
specifina, potpuna, brza i reproduktivna tako da dovede
do stabilne hemijske vrste koja na dalje moe da slui za
apsorpciju zraenja iz UV-Vis oblasti.

Javljaju se dva glavna tipa kolorimetrijskih*** analiza:

1. Supstanca koju treba analizirati je prisutna u matrici za ostalim
konstituentima koji takodje apsorbuju u istoj spektralnoj oblasti.
Da bi ovaj problem bio prevazidjen, jedinjenje od interesa se
hemijski prevodi u vrstu ija apsorpciona kriva je izvan oblasti
apsorpcije ostalih konstituenata:

2. Jedinjenje koje se analizira ne apsorbuje (nema hromoforu koja

se moe iskoristiti). Tada je neophodno izvriti hemijsku
transformaciju tako da se hromofora pojavi.

A = b c (gde je c u mol/L or M)
A = a b c (gde je c = g/l)

ili:

U praksi, prvo se odredjuje kalibracioni dijagram.

Ponekad se koristi samo jedan standardni rastvor:

Izraunavanje koncentracije analita moe da bude pogreno, ako

uzorak sadi neistoe koje utiu na apsorpciju, odnosno koje takodje
apsorbuju u istoj oblasti.
Tada se vri provera bazirana na tome da je za isto jedinjenje, odnos
apsorpcionih koeficijenata odredjenih na dve talasne duine
karakteristika datog jedinjenja.

Dekonvolucija

Nefelometrija & turbidimetrija

Metode su zasnovane na pojavi rasipanja svetlosti od strane
suspendovanih vrstih estica u rastvoru. Koliina vrste materije u
nekoj suspenziji moe se odrediti merenjem proputene
(turbidimetrija) ili rasute (nefelometrija) svetlosti od strane vrstih
estica.
Da bi se ove metode primenile potrebno je:
1. Utvrditi da li je neka hemijska reakcija moe da da suspenziju
pogodnih osobina;
2. Definisati optimalni postupak za pripremanje suspenzije;
3. Pripremiti radnu krivu.

Emisione tehnike
Neka jedinjenja emituju svetlost kada su pobudjena
fotonima iz UV ili Vis oblasti.
Ova pojava naziva se fotoluminiscencija, i na njoj su
bazirane selektivne i vrlo osetljive metode.
Kako postoji veza sa koncentracijom, ove metode imaju
veliku primenljivost.
-flourimetrija: brzo vraanje u normalno stanje;
-fosforescencija: postepeno vraanje u osnovno stanje;
-Hemiluminisenicja:
reakcija

emisija

tokom

nekih

hemijskih

U bihemiji, fluorescencija ima brojne primene uglavnom

za kvantitativna odredjivanja proteina ili nukleinskih
kiselina.

Primena UV-Vis spektroskopskih metoda u

istraivanjima i industriji hrane

UV-Vis spektroskopske tehnike koriste se:

-u istraivake svrhe;
-u kontroli kvaliteta i bezbednosti hrane;
- u menadmentu i kontroli procesa.
Ove primene ostvaruju se kroz:
-Kvantitativna odredjivanja;
-Proveru istoe (stabilnosti) uzorka.
Posebnu klasu primena ine merenja za klasifikacije
(sortiranja), provere, ispitivanja na osnovu boje
uzoraka.

Boja je generalni naziv

za senzacije koje
potiu od aktivnosti
retine.

Boja je, zajedno sa aromom i teksturom, vana osobina

hrane, bilo da je ona preradjena ili nepreradjena; i igra
vanu ulogu u prihvatanju hrane.
Takodje, boja hrane, ili promena boje hrane, moe da bude
znaajna indikacija hemijskih promena (tamnjenje,
karamelizacija, ).
Boja hrane potie od:
- Transmisije (apsorpcije) svetlosti, u sluaju pia i ulja;
- Refleksije svetlosti, u sluaju mutne (netransparentne)
hrane.
Boja, kao ni tekstura i aroma hrane, ne moe biti uoena
niti ispitivana be ljudskog senzornog sistema.

Boja uoena kada oko vidi osvetljeni objekat u vezi je sa tri

faktora:
- spektralnim sastavom svetlosti koja osvetljava objekat;
- hemijskim i fizikim karakteristikama objekta; i
- spektralnom osetljivou oka.

Na sreu, sposobnost ljudskog ula vida (razliitih

jedinki) je prilino ujednaena, pa nije suvie teko da se
za potrebe istraivanja ili industrijske primene ljudsko
oko zameni instrumentom senzorom, ili fotoelijom.
SPEKTROFOTOMETRI

Ima vie naina za klasifikaciju boja; najpoznatiji i

najznaajniji je CIE sistem - (Commission International de
1'Eclairage).
Kada razliito obojeni objekti reflektuju
razliitih boja, spektrofotometriranjem se
razliite krive:

svetlost
dobijaju

Standardni posmatra

Osim boje, od znaaja je i SJAJ uzorka sposobnost refleksije

svetlosti. Refleksija moe biti difuzna ili ne.
Boja uzorka (hrane) potie od prisutnih pigmenata.
Medjutim, refleksija svetlosti sa mutnih uzoraka zavisie od odnosa
apsorbovane i rasejane svetlosti, kao funkcija vrste i koliine
pigmenata, indeksa refrakcije i rasejavanja svetlosti sa materijala.

Postoji Kubelka-Munk metod (i istoimene jedinice u kojima se

izraava koliina transmitovane, reflektovane ili apsorbovane
svetlosti); on omoguava razdvajanje apsorbovanog i rasejanog dela
zraenja.

Boja hrane potie od prisustva prirodnih pigmenata ili

dodatih boja (aditivi!)
Prirodni pigmenti mogu (uz par izuzetaka) da budu podeljeni u sledee 4
grupe:
1. Tetrapirolska jedinjenja (hlorofili, hem)
2. Derivati izoprenoida (karotenoidi)

3. Derivati benzopirana (antocijani i flavonoidi)

4. Melanoidini, karamelizirajue supstance

Primer: tetrapirolni pigmenti

pirol

U sveem mesu, i u prisustvu O2, postoji dinamika ravnotea izmedju

tri pigmenta:oksimioglobina, mioglobina i metmioglobina. Reverzibilna
reakcija sa O2 je:
U oba pigmenta, gvodje je u Fe(II) fero stanju,a po prelasku
uFe(III), feri stanje, pigmen prelazi u metmioglobin. Stoga, sjajna
crvena boja (oksimioglobin) prelazi vremenom u braon boju
(metmioglobin):

Oksimioglobin je kovalentno jedinjenje Fe(II), mioglobina i kiseonika.

Mioglobin formira jonski kompleks sa vodom, u odsustvu jakog
elektron donora koji bi formirao kovalentni kompleks pokazuje
difuznu apsorpciju u zelenom delu spektra, oko 555 nm, purpurno
crvena boja.
U metmioglobinu, glavni apsorpcioni pik je pomeren ka plavom delu
spektra, na 505 nm I sa malim pikom na 627 nm uzorak izgleda
braonkasto.

Najprecizniji instrumenti koji

slue za merenje boje (I sjaja)
su SPEKTROFOTOMETRI.
U indsutriji hrane, najee se
upotrebljavaju refleksioni sp,
sa integriuom sferom ili ne
(da bi se iskljuila ili uzela u
obzir komponenta prostornog
rasejanja).

Postupci sortiranja primenljivi u industriji

hrane, bazirani na spektrofotometrijskim
merenjima
Primenljive su sledee metode:

Spektrofotometija,
Monohromatsko, bihromatsko i trihromatsko sortiranje
Fluorescentne tehnike
IR tehnike
Optiko sortiranje laserima

Berov zakon - rezime

Absorption Spectroscopy
Transmittance (T)

P
T
P0
0T1
T is independent of P0
%T = T x 100

Absorption Spectroscopy
sample with T = 50%

P0 = 1.00

P = 0.50

P = 0.25

P = 0.125

Absorption Spectroscopy

0.5

0
Concentration or Path Length

Absorption Spectroscopy
Absorbance (A)

P0
1
A log log log T
P
T
%T
T
;
A 2 log %T
100
0A

Absorption Spectroscopy

Concentration or Path Length

Beers Law

Po

P-dP

dx

Beers Law
A = dP = -Pcdx
c = concentration of analyte
probability of a photon being absorbed

dP
cdx
P
dP
c dx
P

Beers Law
ln P = -cx + C
at x = 0, ln P = ln P0
ln P0 - ln P = cx

P0
P0
ln
cx 2.303 log
P
P
P0 2.303
log

cx A
P

Beers Law

2.303

= molar absorbtivity
absorbance of solution when c=1M and
b=1cm (b=x)
DEPENDS upon

Beers Law

A = bc
Beers Law

Beers Law
max

Beers Law
MEASURING CONCENTRATION
1. Select - ideally max
2. Determine
3. Measure absorbance of unknown
measure reference blank to correct for
scattering and reflection

Beers Law - Example

A 5.0 x 10-2 M solution of benzene has a %T
of 50 at 254 in a 1 cm cell. An unknown
solution of benzene has a %T of 75 under the
same conditions. What is the concentration of
the unknown?

Beers Law - Example

A = -logT= -log0.50 = 0.30
A = bc

A
.30

6.0
bc (10
. )(.050)

log 0.75 012

.
A .12
2
c

2.0 10
b
6

Mixtures
Absorbances are additive
Asol. = qbcq + rbcr + sbcs +
To determine x compounds in a solution
you have to make measurements at x
different wavelengths and know for each
compound at each wavelength

Mixtures
max

Atotal

max

A
Aq

Ar

Mixtures - Example
q
m ax

r
m ax

0.50
0.20
0.70

0.30
0.80
0.60

0.10 M q
0.10 M r
Mixture
qmax

.5
5
.1

qmax

.2
2
.1

q
r

rmax

.3
3
.1

rmax

8
8
.1

Mixtures - Example
A = qbcq + rbcr
0.70 = 5cq + 2cr
0.60 = 3cq + 8cr
2 equations, 2 unknowns
cq = 0.13; cr = 0.025