Ispitivanje sposobnosti inhibicije acetilkolinesteraze

Kao izvor enzima koritena je acetilkolinesteraza, (AChE) iz elektrofora elektrine

jegulje (Tip V-S), a kao supstrat enzima koriten je acetiltiokolin jodid, (ATChI). Za
ispitivanje

sposobnosti

inhibicije

acetilkolinesteraze

koritena

je

modificirana

spektrofotometrijska metoda po Ellmanu koristei DTNB (5,5'-ditiobis-2-nitrobenzojeva

kiselina) kao tiolni reagens. Enzimskom hidrolizom supstrata nastaje tiokolin koji reagira s
DTNB-om pri emu se oslobaa uto obojeni anion 5-tio-2-nitrobenzojeve kiseline, a porast
apsorbancije aniona mjeri se pri valnoj duljini = 412 nm.

Proraun:
DTNB - proraun za traenu koncentraciju
V1 = 1100 L
c1 = 0.3 mM
V2 = 50 L
c2 = ?
c1 x V1 = c2 x V2 c2 = c1 x V1 / V2
c2 = 1100 L x 0.3 mM / 50 L
c2 = 6.6 mM
V = 5 mL = 5 x 10-3 L, pufer pH = 7 + 0,12 M NaHCO3
c = 6.6 mM = 6.6 x 10-3 M = 6.6 x 10-3 molL-1
M = 396.35 gmol-1
m=cxMxV
m = 6.6 x 10-3 molL-1 x 396.35 gmol-1 x 5 x 10-3 L
m = 0,013079 g = 13,079 mg

ATChI - proraun za traenu koncentraciju

V1 = 1100 L
c1 = 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 mM
V2 = 50 L
c2 = ?
c1 x V1 = c2 x V2 c2 = c1 x V1 / V2
c2 = 1100 L x 0.5 mM / 50 L
c2 = 11 mM
V = 5 mL = 5 x 10-3 L, pufer pH = 8
c = 11 mM = 11 x 10-3 M = 11 x 10-3 molL-1
M = 289.18 gmol-1
m=cxMxV
m =0.0159 g
m = 15.9 mg
AChE - proraun za traenu koncentraciju
1100 L x 0.03 U/ml = X x 50 L
X = 1100 L x 0.03 U/ml / 50 L
X = 0.66 U/ml
V = 5 mL, pufer pH = 8
X = 0,66 U/mL
MAT = 500 U/mL
treba uzeti 6.6 L i otopiti u 5 mL pufera pH=8
Tablica 1. Priprema kemikalija za rad
kemikalije

Volumen / L

pufer
DTNB
ATChI
AChE

950 L
50 L
50 L
50 L

Konana
koncentracija

Stock /mg

0.3 mM
0.5 mM
0.03 U/ml

13.079
15.9
6.6 L u 5 mL

Tablica 2. Shema otopina u eksperimentu

H2O

kontrola

BL1

BL2

uzorak M

uzorak BL

pufer
DTNB
uzorak

950
50
/

1000
50
/

1000
50
/

900
50
50

950
50
50

AChE
ATChI

50
50

/
50

50
/

50
50

/
50

Ili 5x manje ako se radi o Tecan-u!