POLIMORFNI DNA MARKERI U

EKOTOKSIKOLOGIJI I BIOMONITORINGU

 DNA marker: polimorfni DNA lokus koji se koristi u mapiranju

gena, dijagnostici, taksonomiji, ekotoksikologiji i dr.
Polimorfni lokus: dva ili vie alela na istom DNA lokusu;
frekvencija drugog alela u populaciji mora biti najmanje 5%
Razlika u sekvenci lokusa homolognih kromosoma iste jedinke ili
razliitih jedinki je u prosjeku 1 na svakih 1000 pb. Ako
usporedimo 3x109 pb u DNA dva haploidna humana genoma
(primjerice u spermijima ili jajnim stanicama) dobit emo 3
milijuna razliitih alela
Ukupan broj polimorfnih humanih lokusa mogao bi biti 100
milijuna i vie to je ogromno spremite potencijalnih DNA
markera

 Toksine tvari iz okolia interferiraju s genetikom strukturom

populacija bilo direktno (mutacijski dogaaji) ili indirektno preko
populacijskih (evolucijskih) dogaaja (selekcija, efekt uskog grla)
GENETIKA TOKSIKOLOGIJA
oteenja na individualnoj razini

detekcija

genotoksinog

GENETIKA EKOTOKSIKOLOGIJA analiza genetikih uinaka

na razini ekosistema preko analize genetike strukture
populacije (eko-genotoksikologija, evolucijska toksikologija)

 GENETIKA PROMJENA KAO GENOTOKSINI SINDROM

promjena frekvencije genotipova i smanjenje genetike
varijabilnosti populacije - rezultat izloenosti razliitim tvarima
koje zagauju okoli (ne moraju biti samo genotoksine tvari)
Genetiki efekti nakon izlaganja oneienju:
- genetika adaptacija;
- genetika promjena na razini alozima (enzima proteina)
- genetika promjena na razini molekularnih markera

DNA
genotoksino djelovanje

Citogenetika stabilnost je integralni

dio homeostaze svake jedinke

popravak

DNA

oteena

DNA adukti
lomovi DNA

Cjelovitost
strukture
DNA
ostvaruje
se
dinamikom ravnoteom
izmeu oteivanja DNA i
popravka tih oteenja

apoptoza
I/ili eliminacija od
strane
imunokompetentnih
stanica

nepotpun popravak
replikacija
Genske mutacije
disfunkcija proteina
sindrom genotoksinih bolesti
(Kurelec 1993)

mutacije
aktivacija onkogena

kromosomske mutacije

 Adaptacija promjena frekvencije gena i genotipova u populaciji

te je na taj nain populacija bolje prilagoena tetnim uincima
okolia
Tolerancija rezistentnost ili aklimatizacija: nije isto to i
adaptacija (nema promjene frekvencije gena i genotipova) do
nje dolazi modifikacijom ekspresije gena ili promjenom strukture
gena

Alozimi (izoenzimi) s razliitom elektroforetskom mobilnou kodirani

s razliitim alelima (nukleotidne varijacije) istoga gena (1965-1980tih:
analiza genetike raznolikosti prirodnih populacija)
-kodominantni marker
Ogranienja:
- nedovoljno pogodnih tkiva za analizu
- mala genetika varijabilnost
- promjene na razini DNA koje ne rezultiraju promjenama na razini
proteina se ne detektiraju
- vrpce koje se smatraju produktom istog alela mogu biti produkt
multiplih alela
- rezultati mogu podcijeniti stvarnu DNA-varijabilnost

DNA markeri:
1. Jezgrin genom: jedinstvene sekvence i ponavljajue sekvence
Jedinstvene sekvence strukturni geni
Ponavljajue ili repetitivne sekvence: kodirajui segmenti (rRNA
geni) i nekodirajue ponavljajue sekvence najvarijabilniji
markeri u genomu eukariota (VNTR: mini i mikrosateliti)
2. Genom organela
Citoplazmatsko (najee majinsko) nasljeivanje
Najveu varijabilnost pokazuje mitohondrijska DNA (stopa
supstitucije nukleotida u mtDNA je via od one u jezgrinoj DNA)

 Veina molekularno-genetikih metoda bazira se na tehnici

umnaanja kratkih sekvenci nukleotida (PCR metoda) te njihovoj
analizi
Danas se koriste razliite tehnike koje analiziraju DNA markere
(DNA fingerprinting tehnike):
RAPD (random amplified polymorphic DNA) i AFLP (amplified
fragment lenght polymorhism) koriste razliite poetnice
(primer) koje umnaaju (amplificiraju) nasumino odabrane
regije u genomu
RAPD i AFLP su dominantni markeri
Varijacije u broju pruga ili prisutnost/odsutnost pruga
rezultat su tokastih mutacija, inverzija, delecija, adicija ili
veih kromosomskih rearanmana koji utjeu na mjesto
vezanja poetnice
Amplificirani fragmenti se vizualiziraju gel elektroforezom

RAPD*

od 1995-2005 objavljeno vie od 9000 znanstvenih radova

koristi se u genetikom mapiranju, taksonomiji, filogeniji,
istraivanjima genotoksinosti i karcinogeneze
kratki (10 pb) oligonukleotidni primeri nasumino odabrane sekvence
alelna varijabilnost oituje se u prisustvu/odsustvu odreenog
amplificiranog produkta razdvojenog gel elektroforezom i vizualiziranog
sa EtBr
rezultat: nekoliko polimorfnih genetikih segmenata po primeru
stupanj varijabilnosti za mnoge primere ukazuje na mogunost
primjene metode u razliitim analizama (dokazivanje oinstva,
identifikacija jedinki, identifikacija sojeva/linija, filogenetika analiza,
ekotoksikologija)

*Williams et al 1990 Nucleic Acid Research 18: 6531-6535.

Welsh & McClelland 1991 Nucleic Acid Research 18: 7213-7218.

Lanana reakcija polimerazom Kary Mullis

(1983): Nobelova nagrada za kemiju 1993.

Detekcija polimorfnih lokusa RAPD tehnikom. Lokus B je polimorfan.

RAPD amplifikacijski produkti

1 normalni fenotip
2 - abnormalni fenotip

ANALIZA RAPD PROFILA:

Fenetika najea u ekotoksikologiji; slinost/raznolikost
Raznolikost/slinost
se
procjenjuje
na
temelju
odsutnosti/prisutnosti RAPD vrpci u izloenih i ne-izloenih
jedinki (analiza slinosti) ili na temelju broja vrpci i njihove
koliine u izloenih i ne-izloenih jedinki (analiza raznolikosti)
Postoji niz metoda za izraunavanje indeksa slinosti i
raznolikosti
Genetika bazirana na analizi genotipova
RAPD su dominantni markeri (genotip AA ili Aa prisutna vrpca; aa
nema vrpce lokus koji nije fenotipski eksprimiran)

Prednosti RAPD:
Veliki broj lokusa se moe analizirati, a nije potrebna prethodna
informacija o DNA sekvenci to se ujedno smatra i nedostatkom
Relativno jednostavna i brza metoda za preliminarni pregled
(screen) populacije izloene genotoksinim zagaivaima
Primjenjiva na razliite organizme
Ima potencijal za detekciju irokog raspona DNA oteenja i
mutacija (tokaste mutacije, inverzije, delecije, adicije ili
kromosomski rearanmani)
Nedostaci:
Ne daje nikakvu informaciju o sekvenci DNA
Reproducibilnost? ovisi o uvjetima PCR metode
Dominantni marker pa se heterozigoti ne razlikuju od dominantnih
homozigota
Ne otkriva vrstu oteenja; kvalitativna, semi-kvantitativna
metoda
Idealno bi bilo koristiti markere povezane s fitnesom organizma jer
su to dobri kandidati za ekotoksikoloka istraivanje ali to je dosta
zahtjevan posao

PRIMJENA U GENETIKOJ EKOTOKSIKOLOGIJI

za detekciju genetikih efekata koji se odnose na promjene
strukture i funkcije DNA (DNA adukti, DNA lom i mutacije)
promjene u genetikoj strukturi populacije (genetika
raznolikost, frekvencija gena)

Primjer 1
Istraivanja u kojima su koriteni markeri vezani za lokuse koji
su vani za selekcijsku prednost kod riba (Gambusia affinis) na
stanitima optereenima radioaktivitetom (Theodorakis i
Shugart 1997)
Pronaeno je da se neki RAPD markeri javljaju s veom
frekvencijom na kontaminiranim stanitima to su tzv. CIBs
(contaminant-indicative bands): pruge povezane s fitnesom i
radiorezistencijom
Usporedbom rezultata RAPD s testovima genotoksinosti
(komet) - naena pozitivna korelacija ribe na kontaminiranim
stanitima s poveanom frekvencijom CIBs pruga imale su manje
oteenja mjereno komet-testom
Zakljuak: radioaktivno zagaenje utjecalo je na genetiku
strukturu populacije riba preko prirodne selekcije inducirane
zagaenjem

Theodorakis & Shugart 1997. Environ Toxicol Chem 17(10): 1992-1998.

Primjer 2
Detekcija DNA oteenja RAPD metodom na klijancima jema
tretiranih tekim metalom Cd te usporedba promjena RAPD profila
sa stopom rasta korjenia i koliinom ukupnih topivih proteina
(Liu et al. 2009)
Rezultati RAPD pokazali varijabilnost u intenzitetu pruga, gubitak
pruga (linearno ovisan o koncentraciji Cd) i pojavu novih pruga u
odnosu na kontrolne uzorke
Modifikacije RAPD profila nastaju zbog: genomskih rearanmana
koji utjeu na mjesta vezanja poetnica; strukturnih promjena
zbog razliitih tipova DNA oteenja; interakcije DNA polimeraze
sa oteenom DNA to utjee na polimerizaciju DNA u PCR reakciji
RAPD kao biomarker jednako osjetljiv kao test toksinosti (rast
korijena)
RAPD osjetljiviji od klasinih genotoksinih testova jer moe
detektirati privremena DNA oteenja koja nee zavriti
mutacijom

VNTR variable number tandem repeats:

ANALIZA MIKROSATELITNE DNA: ISSR (intersimple sequence
repeat) polymorphisms
Mikrosatelitna DNA - kratke sekvence (1-5 baza) koje se
ponavljaju serijski
Kodominantni marker
Nekodirajue DNA sekvence
Specifini i visoko polimorfni
Visoka frekvencija spontanih mutacija: 100 puta su ee nego u
kodirajuim genima
Zbog hipervarijabilnosti, gustoe i iroke rasprostranjenosti u
genomu dobri su genetiki markeri
Zbog velike varijabilnosti i brze evolucije pogodni su za analizu
razlika izmeu srodnih populacija i nedavnih brzih promjena
genetike strukture populacije, naroito onih uzrokovanih
okolinim mutagenima
Metoda ISSR objedinjuje PCR amplifikaciju genomske DNA
koritenjem jedne poetnice po ponavljajuoj jedinici
Produkti se vizualiziraju gel elektroforezom

Genetika

razlika

razliitih izolata gljivice

Phytophthora capsici (metoda ISSR koritena
jedna poetnica GTC)

 Iako se mikrosateliti koriste ve dugo u populacijskoj genetici

nedavno su se poeli koristiti i u ekotoksikolokim istraivanjima
Primjer 3:
Analiza dva visoko-varijabilna mikrosatelitna lokusa populacije
lastavica na podruju ernobila (Ellegren i sur. 1997)
Populacija u Ukrajini (ernobil) bila je izloena visokim dozama
radijacije u usporedbi s populacijama s referentnih postaja u
Ukrajini i Italiji
Kod jedinki na zagaenom podruju uoen je vei broj alela na
dva istraivana mikrosatelitna lokusa ak su utvrdili da se radi
o nasljednim mutacijama jer je i u potomstvu naen vei broj
alela
opaena morfoloka promjena parcijalni albinizam (mutacija u
kodirajuoj regiji)
Poveana mutacijska stopa u istraivanim mikrosatelitima
pripisana je oteenju gena koji su zadueni za popravak DNA
oteenja uzrokovanog zraenjem
Ellegren et al 1997 Nature 389: 593-596.

Analiza kloroplastne mikrosatelitne DNA

Varijabilnost kloroplastnih mikrosatelitnih regija (cpSSR
chloroplast simple sequence repeats) koritena za filogeografska
istraivanja
Primjer 4
Mengoni i sur. 2001. po prvi puta analiziran cpSSR polimorfizam u
svrhu karakterizacije tolerantnih i netolerantnih populacija biljaka
(teki metali; vrsta Silene paradoxa L.)
Adaptacija na tlo zagaeno bakrom je povezana sa smanjenjem
genetike varijabilnosti
Smanjenje genetike varijabilnosti vjerojatno je posljedica
evolucijskih dogaaja poput efekta utemeljitelja (founder effect)
i jake selekcije tolerancije na teke metale to je dovelo do bottleneck efekta (uinak uskog grla)

Mengoni et al. 2001. Mol Ecol 10(8): 1909-1916.

Mitohondrijski genom
Haploidni genom; nema rekombinacijskih dogaaja, majinsko
nasljeivanje, vea akumulacija mutacija jer nema popravka
Sekvenciran genom mnogih vrsta (odreen slijed nukleotida)
Do 1990. veinom se koristila metoda RFLP (restriction fragment
lenght polymorhism) koritenjem 20-30 restrikcijskih enzima
koji prepoznaju sekvencu od 6 pb (restrikcijsko mjesto)
omoguena je analiza fragmenata mitohondrijskog genoma
osnova za odreivanje broja i raspodjele haplotipova (linije s
identinim RFLP profilom)
Danas se uz RFLP koristi i sekvenciranje PCR produkata
Na taj se nain moe doi do ciljanih gena
RFLP je jeftinija metoda od sekvenciranja, omoguava detekciju
varijabilnosti duina restrikcijskih fragmenata (raznolikost)
Najpogodnija je kombinacija obje metode PCR i RFLP

RFLP metoda

Literatura:

Bickham i sur. 2000. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in

natural populations: implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation
Research 463: 33-51.
Belfiore i Anderson 2001. Effects of contaminants on genetic patterns in aquatic
organisms: a review. Mutation Research 489: 97-122.
Liu i Wendel 2001. Intersimple sequence repeat (ISSR) polymorhisms as a
genetic marker system in cotton (technical note). Molecular Ecology Notes 1:
205-208.
Mengoni i sur. 2001. Genetic diversity of heavy metal-tolerant populations in
Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a chloroplast microsatellite analysis.
Molecular Ecology 10: 1909-1916.
Theodorakis 2001. Integration of Genotoxic and Population Genetic Endpoints in
Biomonitoring and Risk Assessment. Ecotoxicology 10: 245-256.
De Wolf i sur. 2004. The use of RAPD in ecotoxicology. Review. Mutation
Research 566: 249-262.
Atienzar i Jha 2006. The random amplified DNA (RAPD) assay and related
techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: A critical review.
Mutation Research 613: 76-102.
Liu i sur. 2009. Risk assessment of cadmium-contaminated soil on plant DNA
damage using RAPD and physiological indices. Journal of Hazardous Materials
161: 878-883.