METODE MOLEKULSKE

SPEKTROHEMIJE U FORENZICI
-odreivanje jedinjenja (molekula) prisutnih u uzorku-

Dr Nada Bonjakovi-Pavlovi
nadab@ffh.bg.ac.rs

Energetskinivoiumolekulimasumnogo
sloenijiodonihuatomima
istielektronski
energetskinivoi

Svakielektronskinivoimamnogo
vibracionih,asvakivibracionimnogo
rotacionihnivoa

Vibracioni
nivoi
Elektronski
nivoi
Rotacioni
nivoi

Energetski nivoi molekula

Vibracioni nivoi

Rotacioni
nivoi

Elektronski
nivoi
Vibracioni
nivoi

Line Emission Spectra for Atoms

Linijskiemisionispektaratoma

A
B
S
O
R
B
A
N
C
E

Wavelength
Figure2.Thegroundstateconsistsofoneelectronicenergylevel,oneormore
Osnovno stanje se sastoji
od jednog elektronskog energetskog nivoa, jednog ili vie vibracionih i
vibrationalenergylevels,andaverylargenumberofrotationalenergystates.
Theexcitedstatehasthesamefeatures.Theresultoftransitionsbetweenall
velikog broja
rotacionih stanja. Slino je sa pobuenim stanjima. Pri prelazu
theselevelsisabroadspectrum,ratherthanaseriesofnarrowlines.
izmeu svih ovih nivoa nastaje irok spektar a ne niz otrih linija

Broad Absorption Spectrum for Molecules

irokapsorpcionispektarmolekula

- energetski nivoi molekula imaju slozeniju strukturu u odnosu na

atomske.
- pored potencijalne energije elektrona, to imamo i kod atoma,
molekuli imaju i vrbracionu i rotacionu energiju, koja je takoe
kvantovana.

Sve energije, sem KE su kvantirane

Euk = Erot+ Evib+ Eele

Energetski nivoi molekula

Pobudjeno
Elektronsko
Stanje

Rotacioni
Energetski nivoi

Vibracioni
Energetski
nivoi

Osnovno
Elektronsko
Stanje

Molekulski spektri nastaju kao posledica

prelaza izmeu energetskih nivoa

Pobudjeno
Elektronsko
Stanje

Vibracioni
Energetski
Nivoi

Rotacioni
Energetski
Nivoi

Osnovno
Elektronsko
Stanje

Rotacioni
prelaz

Vibracionip
relaz

Elektronski
prelaz

Energija prelaza
Pobudeno
Elekt
Stanje

Vibracioni
EelEnergetski
Nivoi

Rotacioni
Energetski
Nivoi

Osnovno
Elektronsko
Stanje

Evib

Erot
Rotacioni
prelazi

Vibracioni
prelazi

Elektronski
prelazi

1-20 cm-1

2000-4000 cm-1

10000-50000 cm-1

Mikrotalasi

IC

UV-Vis

Rastojanja izmedju susednih nivoa zavise od

vrednosti odgovarajucih energija. Rotaciona
energija molekula je najmanja a elektronska
najveca, pa rotacioni nivoi su najblizi jedni
drugim a elektronski najdalje.

Rotacioni
prelazi
1-20 cm-1

<<

Vibracioni
Prelazi
2000-4000 cm-1

<<

Elektronski
Prelazi
10000-50000 cm-1

Kvanti potencijalne energije elektrona su puno vei od kvanata vibracione

energije a ovi od kvanata rotacione energije

- umesto jedne spektralne linije, koje imamo kod jednog elektronskog

prelaza, kod molekula pri promeni elektronskog stanja imamo itav
sistem traka pri emu jedna traka odgovara prelazu izmeu dva
vibraciona stanja a ine je pojedinane linije koje potiu od
rotacionih pralaza

- molekulski spektri mogu nastati.

emisijom, apsorpcijom i rasejanjem svetlosti
- za pobuivanje emisionih spektara potrebna velika energija to
najee dovodi do disocijacije molekula. Emisioni molekuli se
mogu dobiti samo za mali broj uglavnom dvoatomskih molekula.
- od interesa su molekulski apsorpcioni spektri, tada nema
disocijacije molekula

Saglasno trima vrstama energija (energetskih nivoa) razlikujemo

vie vrsta molekulskih spektara
- ekscitacija elektrona (molekulska UV-VIS spektrofotometrija:
elektronska spektrofotometrija)
- vibracioni prelazi (infracrvena spektrometrija, Ramanska
spektrometrija vibraciona spektroskopija)
- rotacioni prelazi (mikrotalasna oblast, delom daleka infracrvena,
malo se koristi u analitici)
- prelazi u vezi spina (radiotalasna oblast - nuklearna i mikrotalasna
oblast - elektronska magnetna rezonancija NMR i EPR)

UV-VIS spektrofotometrija
- za razliku od atomskih spektara, molekulski elektronski
spektri nisu dovoljno karakteristini, trake su iroke i
nespecifine.
- primena UV-VIS spektrofotometrije za kvantitativnu
hemijsku analizu jedinjenja vrlo iroko zastupljena.
- uobiajena osetljivost je reda 10 -4 do
10-5M ili ak nie za 1-2 reda veliine.

UV: 180 380nm

Vid: 380 780nm
nanometri nm
1nm = 1 x 10-9m

HROMOFORE -

KVALITATIVNA ANLIZA

Poloaj i oblik apsorpcionih traka razliitih supstancija u VIS i UV delu spektra

u vezi je sa strukturom tih supstancija
Atomi ili atomske grupe ija ekscitacija elektrona dovodi do apsorpcije fotona
nazivaju se hromoforama i njihovo prisustvo u molekulu odgovorno je za boju
supstancije
Najee hromofore u organskim molekulima su atomske grupe sa dvostrukim i
trostrukim vezama u kojima su elektroni labavije vezani
Joni prelaznih metala kao i usamljeni parovi elektrona u radikalima
predstavljaju hromofore

Hromofrne grupe su: C=C, N=N, C=O,

-N=O-

Zraenje intenziteta Io koje pada na medijum debljine b,bie delom reflektovano,

apsorbovano i delom proputeno.

Grotus-Draperov zakon:
I0 = IA + IT + IR

I A IT I R
1

AT R
I0 I0 I0
apsorpcija

refleksija

transparencija

Apsorpcioni Spektar

Io

U
z
o
r
a
k

It

b- Duina
elije

T, je transparencija. Ona je
deo upadne svetlosti
proputen kroz uzorak
T = I/Io
A, apsorbancija je
definisana kao
A = log10(Io/I)
= -log10(T)

max
talasna duina na
kojoj je A maksimalno

KMnO4

Kvalitativna analiza:
Mnoge organske funkcionalne grupe imaju
dobro definisane apsorpcione
karakteristike: max & ili a (obino u
UV)

kofein
kofein

- napraviti rastvor poznate koncentracije(c)

- snimiti spektar izmeu 180 i 350nm
-identifikovati max, izraunati ili a
aspirin

Ne-obojeni analiti mogu

reagovati dajui obojena
jedinjenja npr. PO43-

max

aceton

Za kvantitativna odreivanja optikim apsorpcionim

tehnikama slui Lambert Beer-ov zakon
Intenzitet elektromagnetskog zracenja I0
smanjuje se prolazom kroz rastvor (ispitivanu
supstancu) koja moe apsorbovati zracenje.
Smanjenje intenziteta zavisi od koncentracije
supstance (c) koja apsorbuje elektromagnetno
zraenje, debljine sloja, b, (svetlosnom putu
kroz
uzorak),
molarnom
apsorpcionom
koeficijentu, a, specificnom za svaku
supstancu (menja se sa talasnom duinom).
Smanjenje intenziteta upadnog zraenja pre i posle prolaza kroz uzorak
definisali su Lambert i Beer zakonom apsorpcije.

log I /I = A = a b c
0

Ogranienja Beer-ovog zakona

Realna
Pri velikim koncentracijama deavaju se efekti
interakcije izmeu apsorbujuih vrsta

Hemijska
Analit disosuje/asosuje ili reaguje sa rastvaraem

Instrumentalna
rasejana svetlost nastala refleksijom na
monohromatoru

Kvantitativna analiza
Apsorpcioni spektar
Kalibraciona prava
A

A
A
C

350

m ax

400

350

370

390
2

450
a)

340

i) Koristi se Beer-Lambert-ova
jednaina
A =ab c
- pipremiti rastvore analita i
dodati reagense (ako su
neobojeni)

- meriti apsorbanciju na
poznatim max

410

C
b)

ii) Koristiti kalibracione krive

uobiajen metod

Metoda unutrasnjeg standarda

Unutranji standard je supstanca potpuno razliita od analita.

Odredjuje se odnos intenziteta linije ispitivanog elemanta prema

intenzitetu linije nekog drugog elementa koji sluzi za uporedjivanje
(unutrasnji standard pa se na osnovu toga konstruishe kalibracioni
dijagram

Unutranji standard je supstanca dodata uzorku i svim

standardima a koncentracija unutranjeg standarda je
konstantna i poznata je vrednost signala koji odgovara
unutranjem standardu za odreenu koncentraciju.
Ova metoda se koristi kada je osetljivost instrumentalne
metode promenjiva s vremenom, kod znatnog uticaja
matrice na signal analita, kada je mogu gubitak uzorka
za vreme odreivanja

Metoda unutrasnjeg standarda

esto se upotrebljava u hromatografskim
odreivanjima, emisijskim spektrometrijama
(spektrografiji, plamenoj spektrometriji),
rendgenskoj difrakciji.
Signal unutranjeg standarda se meri
istovremeno sa signalom analita. Priprema se
poznata smesa unutranjeg standarda i analita
za merenje relativnog signala detektora.

Hromatogram uz dodatak unutranjeg standarda;

A analit, B unutr anji standard

Metoda standardnog dodataka

Tri koraka
1. merenje signala analita iz uzorka,
2. dodavanje poznate koncentracije analita u uzorak i
merenje tog signala,
3. tako izmerimo intenzitete za nekoliko smesa sa
poznatom kolicinom dodataka.
Metoda standardnog dodatka je posebno korisna kada je
uticaj matrice na odreivanje analita znatan ili kada su
koncentracije analita u uzorku vrlo blizu granice
odreivanja. Metodom standardnog dodatka uticaj
matrice postoji ali jekonstantan za sva merenja

Metoda standardnog dodataka

Da bi se postigla maksimalna mogua

tanost i osetljivost, bitan je izbor talasne
duine merenja

Spektrofotometrija mora da ispuni sledee

uslove:

-da se merenjem postie maksimalna

osetljivost
-da male promene talasne duine ne utiu
na reproduktivnost (najee se meri na
talasnoj duini maksimuma apsorpcije)

UV/VIS spektrofotometar

instrument koji se koristi u UV/VIS spektroskopiji zove se UV/VIS

spektrofotometar. Spektrofotometar meri intenzitet svetla koje je
prolo kroz analizirani uzorak (I) te ga uporeuje s intenzitetom
upadnog svjetla (I0)
osnovni djelovi spektrofotometra su izvor svetlosti, dra uzorka,
monohromator i detektor.
spektrofotometri mogu imati jedan ili dva snopa svetlosti. Kod
instrumenata s jednim snopom I0 se meri nakon to se uzorak izvadi
iz draa. Kod instrumenta s dva snopa upadni snop se dijeli na dva
pre prolaska kroz uzorak. Jedan slui kao referentni snop (I 0), a
drugi prolazi kroz uzorak (I).
najee se mere tecni uzorci.
Uzorak je smjeten u prozirnoj posudi (kiveti) koja ja najee irine
1 cm i nainjena je od kvarca.

Spektrofotometri se dele na jednozrane i dvozrane.

Jednozrani spektrofotometri
jedan put svetlosti
jedan
uzorak. Referentni uzorak (slepa proba) se mora analizirati posebno.
ENOARKOVNI
SPEKTROFOTOMETER
Jednozrani
spektrofotometar
3
1

1.
izvor svetlosti
1 svetlobni
izvor
uzorkom
2 izbira
valovne doline
3 zaklop
2.
selekcioni sistem -filter
3. zaklon
Izvorarnica
svetlosti

4.
4 kiveta sa
5 detektor
6 detektor
zapis signala
5.
6.
zapis signala
Filter

Detektor

Uzorak
vzorec
0 0 3 2

topilo
Slepa
proba

Dvozrani spektrofotometar

zrcalo
Ogledalo
v

detektor

izvor
r
monokromator
Monohromat
or

oper
Filter
arnica
Izvor
svetlosti

B
Detektor

Uzorak
vzorec
0 0 3 2

Slepa
topilo proba

Dvozrani spektrofotometri imaju dva puta svetlosti i istovremeno

mogu primiti dva uzorka: mereni uzorak i referentni uzorak (slepu
probu). Spektri se automatski oduzimaju jedan od drugoga, pa
naknadna obrada spektra nije potrebna.

Izvori elektromagnetnog zraenja:

VIS
Wolframove sijalice (stabilan izvor napajanja
halogene sijalice
UV
Deuterijumove sijalice

UV-VIS spektrofotometrija
eksplozivnih materija
Uzorci se rastvaraju u organskim
ratsvaraima
EKSPLOZIV
DNT
TNT

230nm
224nm

FLUORESCENCIJA
- molekulska fluorescencija, molekul
apsorbuje fotone vee energije a
zatim deo energije osobodi u obliku
toplote a zatim emituje foton nie
energije u odnosu na apsorbovani
foton.
- broj jedinjenja koja pokazuju
luminiscenciju znatno manji od broja
jedinjenja koja pokazuju UV-VIS
apsorpciju.
- osetljivost i linearnost bolji za
nekoliko redova velicine od
UV-VIS
apsorbancije.

 Fluorescencija je sekundarana emisija svetlosti

nastala pod desjtvom UV zraenja

Primena
- za otkrivanja latentnih tragova papilarnih linija
-Za izazivanje tragova sa nepodesnih povrina (kartonske
kutije, koa, metali, plastika, koje ne pokazuju
fluorescenciju pod UV zarcima) koriste se hemikalije
denzil-hlorid i 9-metil antracen.
Rasprivaima se nanesu na povrinu i oni reaguju sa
amino
kiselinama,
dajui
obojene
komplekse.
Vizuelizacija se vri uz pomo dugih UV zraka (360nm).
Fluorescencija se javlja u u VIS oblasti oko 475nm.
Za porozne povrine, papir, koristi se ninhidrin i cink hlorid.

Identifikacija novanica, papira

- primena UV lampe za kontrolu novanica
novcanice i zasticeni dokumenti imaju ugradjenie
molekulie (vidljivi ili nevidljivi) koji apsorbuju u UV oblasti
a zatim fluoresciraju u VIS oblasti
Sporni dokument se stavi ispod izvora UV zraenja

otkrivanje i za restitucija unitenog teksta. Kod obrisanih

tekstova, obezbojeni tekst fluorescira drugom bojom u odnosu na
ostalu podlogu to omoguava itanje unitenog teksta
Koriste se UV lampe kod kojih je mogue menjati talasne duine UV
zraenja

HVALA NA PANJI!