Scribd Logo
Upload

Welcome to Scribd!

  • 3 views

    NMISO7218

    Uploaded by

    raboufatima
    MICROBIOLOGIE

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content

    You might also like

    NMISO7218

    Uploaded by

    raboufatima
    3 views48 pages
    MICROBIOLOGIE

    Copyright

    © © All Rights Reserved

    Available Formats

    PDF or read online from Scribd

    Did you find this document useful?

    Is this content inappropriate?

    Report this Document
    MICROBIOLOGIE

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    Download as pdf
    3 views48 pages

    NMISO7218

    Uploaded by

    raboufatima
    MICROBIOLOGIE

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    Download as pdf
    of 48
    ZA ° NM ISO 7218 Norme Marocaine amg Indice de classement NM 08.0 D101 Micrologie des aliments Régles générales pour les examens microbiologiques Norme Marocaine homologuée P; r€té conjoint du Ministre de!'Industrie, du Commerce, de) Ener gie et des Mines et du Ministre de I'Agriculture, du Développement Rural et des Eaux et Foréts Correspondance La présente norme reprend intégralement la norme ISO 7218-1996, Modifications etadopive pa Tecomité technique de sation des méthodes Wanalyses et d’échantillonnage des denrées alim: et dilfusée par le Service de Normalisat Bai SNIMA 2008, NM ISO 7218 SOMMAIRE Page 1 Domaine a'application.... 1 2 Référence normative... a 1 3 Locaus. =e 1 4 Matériels et équipement 4 5 Personnel... 15 - 6 Préparation du matér a 16 7 Préparation et stérilisation des milieux de culture et des réactifs. 19 8 Echantillons pour laboratoire...... 3 9 ‘Techniques d'examen et expression des ré 25 = annexeA uD Annexe B. 44 Annexe Conon 46 ANMCKE Deseo NORME INTERNATIONALE © 1SO 10 721 896(F) Microbiologie des aliments — Régles générales pour les examens microbiologiques 4 Domaine d'application La présente Norme internationale donne des ragles générales pour la réalisation d'exemens microbiclogiques effectués selon des normes spécifiques. Le but de la présente Norme internationale est d'aider & garantir la validité des examens, & sassurer que les techniques générales utlisées pour effectuer ces examens sont les mémes dans tous les laboratoires, & particiver ainsi a homogénéiser les résultats obtenus dans différents laboratcires et & contribuer & la protection de la santé du personnel de laboratoire, en évitant les risques diinfection. La présente Norme internationale peut étre utilisée dans son ensemble ou partiellement pour les accréditations de laboratoire par les organismes nationaux. 2. Référence normative La norme suivante contient des dispositions qui, par sulte de la référence qui en esi falte, constituent des dispositions valables pour la présente Norme intemationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute norme est sujette @ révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme intemationaie sont invitées & rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes indiquées ci-apres. Les membres de la CEI et de I'lSO possédentle registre des Normes internationales en vigueur & un moment donne. ISO 6887:1983 Microbiologie - Directives générales pour le préparation des dilutions en vue de Texamen microbiologique. 3 Locaux 3.1 Locaux d'essais .¢ manipulations inhérentes un L'ensemble des locaux permettant de réaliser les divers laboratoire de microbiologie sont: - la réception, le stockage, la préparation et le traitement des échantilions; - la préparation et la stérllisation des milieux de culture et du matériel; - la réalisation des analyses: pesées, dilutions, ensemencements, repiquage, incubation, © conservation des souches, etc.; ISO 7218:1996(F) e1so - la décontamination et le nettoyage des matérieis d'anelyse, ainsi que le traitement des déchets d'analyse. 2.2 Locaux annexes Sont coneidérés dane cette catégorie, par exemple, les locaux suivante: - les acces, couloirs, escaliers, monte-charges ou ascenseurs; - les locaux administratits (Secrétariat, bureaux, salles de documentation, etc); - les vestiaires et les sanitaires; - les salles clarchives: - les magasins. 3.3 Implantation des locaux Llenvironnement dans lequel les analyses microbiologiques sont effectuées ne doit pas affecter leur fiabilité. Les locaux doivent étre implantés de fagon a éviter les risques de contamination croisée. Uappiication du principe de la «marche en avant» peut aider 4 obtention d'un tel résultat. Une protection contre les conditions extrémes telles que l'excds de température, de poussiare, dhumidité, de vapeur, de bruit, de vibration, dexposition aux rayonnements solaires, etc. doit éire assurée. La surface doit étre suffisante pour maintenir les zones de travail propres et en ordre. I! est recommandé de compter environ 20 m? par analyste pour l'ensemble des locaux dessais. Au cours des essais, faccés aux locaux d'essais doit étre limité aux seules personnes nécessaires a la réalisation de ces derniers. Des salies indépendantes etiou des zones séparées et/ou des enceintes spécifiques doivent &tre prévues pour: - la reception et le stockage des échantilions; - la préparation des échantilions, en particulier dans le cas des matires premiéres (par exempie les produits en poudre contenant un nombre élevé de microorganismes); - la manipulation des germes pathogénes (par exemple Salmonella, Listeria monocytogenes); - la préparation et la stérilis: n des milieux de culture et du matériel; - le nettoyage de la verretie et des autres matériels ainsi que la décontamination du matériel et des milieux de culture contaminés; 2 SSE e1so ISO 7218:1996(F) - le contréle de la stérilité des produits alimentaires. li convient d'envisager également la séparation des locaux suivants: - les locaux de préparation des milieux de culture et le local de stérilisation des milieux de culture et du matériel; et - la zone de décontamination et la zone de lavage. Les étuves, réfrigérateurs et conaélateurs peuvent étre placés dans des locaux spécifiques et spécialement adaptés. 3.4 Aménagement des locaux 3.4.1 Les locaux d'essais doivent étre aménagés de fagon & réduire les risques de contamination par l2 poussiére et donc par les microorganismes: o< ~les murs, plafonds et sols devraient étre lisses, faciles & nettoyer, résistants aux produits détergents et aux désinfectents utilisés au laboratoire; - A moins détre hermétiquement enfermées, les conduites de fluides ne devraient pas traverser les locaux en hauteur; - des systémes de protection contre les rayonnements solaires doivent étré Vextérieur des fenétres sauf cas exceptionnel; installés & - les fenétres et les portes doivent pouvoir tre fermées de fagon hermétique lors des essais afin de minimiser tout courant d'air; dautre part, leur conception doit permettre d’éviter les nids a poussiére et de faciliter ainsi leur nettoyage. 3.4.2 La température ambiante et la qualité de 'air (teneur en microorgenismes, hyorométtie, iaux lempoussiérement, etc.) doivent &tre compatibles avec la réalisation des essais. Dans ce but, il est ecommandé dinstaller un systeme de ventilation filtre pour l'air aspiré. ios essais doivent étre réalisés on atmosphere trds peu contaminée, Ie local doit étre spécielement équipé d'une hotte & flux ¢'air laminaire, horizontal ou vertical ev/ou d'une hotte de sécuri Get équipement doit respecter la réglementation en vigueur. 3.4.3 Les paillasses et les mobiliers de laboratoire doivent étre constitués de matériaux lisses, imperméables, faciles & netioyer et & désiniecter. Aiin d’éviter l'accurulation de poussiére, les Possible, atteindre le plafond, rs de laboratoire doivent étre congus pour faciliter ie nettoyage des sols (par exemple meubles mobiles). Des meubles fermés doivent étre mis & disposition pour le rangement des documents utilisés lors des manipulations des échantilions, des milieux de culture, des réactis, etc. 180 7218:1996(F) e1so NOTE - Il est souhaitable que les documents ou livres qui ne sont pas frequemment utlisés soient placés a l'extérieur des locaux dessais, 3.4.4 Les locaux doivent étre bien éclairés en évitant la création de reflets génants. II convient déviter eu maximum exposition directe au soleil des espaces de travail et du matériel sensible (étuves en particulier) 3.5 Entretien et contréle Les sols, murs, plaionds, paillasses ot mobiliers de laboratoire doivent étre réguliérement entretenus afin d'éviter apparition de défauts de continuité qui créent des zones dencrassement privilégiées et sont donc sources de contamination. Un netioyage et une désinfection doivent étre effectués régulierement afin de maintenir les locaux s cans un état compatible avec la réalisation des essais. ‘ Les syst8mes de ventilation et leurs filtres doivent étre réguliérement entretenus et les filtres changés autant que nécessaire. La qualité microbiologique des suriaces et de l'air doit étre réguliérement vériliée et maitrisée. La contamination des surfaces peut étre estimée par application directe dun milieu de culture gélosé contenant des agents neutralisants appropriés. La qualité de lair peut étre examinée par exposition pendant 15 min d'une bolts de Petri ouverte contenant un miliou de culture gélosé non sélectif [par exemple “plate count agar" (PCA). NOTE - D'autres méthodes peuvent également étre utilisées pour estimer la contamination des surfaces et de l'air. 4 Matériels et equipement De fagon générale, tous les matériels et équipement doivent étre maintenus propres et en bon état de fonctionnement. Il convient dassurer un suivi des opérations de maintenance. Les instruments de mesure doivent étre vérifiés réguiiérement 4.1 Hotes microbiologiques 4.1.4 Description Une hotte est un poste de travail dépoussiéré & écoulement c'alr laminalre horizontal ou vertical. En microbiologie, une hotte de sécurité est utilisée pour retenir les microorganismes sur ces filtres. Conventionneliement, fe nombre maximal tolérable de particules de dimension supérieure & 0,5 um par métre cube représente le classe d'empoussiérement d'une hotte de sécurité. Pour les hoites utilisées en microbiologie alimentaire, le nombre de particules ne doit pas dépasser 4.000 par métres cubes. 6 e180 ISO 7218:1996(F) Les hottes sont de deux types: 2) hottes @ flux laminaire, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures et de minimiser les contaminations dues & lopérateur, b) hottes de sécurité, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures et également de protéger lopérateur et l'environnement li convient dlutiiser les hottes de sécurité pour tout travail présentant un risque pathogéne. 4.1.2 Entretien et contrdle Leefficacité dune hotte de sécurité doit étre contrblée lors de sa récention et intervalles réguliers par une personne habilitée (une fréquence annuelie est recommandée). Dans le cas des hottes avec préfiltres, ceux-ci doivent étre changés réguliérement. lly a lieu de nettoyer et de désiniecter les hoties aprés utilisation. Il convient de réaliser des Vérificatione périodiques des contarinations microbiennes par des contréles de la suriace dela zone de travail et des parois. Une vétification périodique du taux de microorganismes présents doit étre effestuée en utilisant Téquipement habituel. Par exemple en exposent plusieurs bottes de Petri ouvertes contenant un milieu gélosé non sélectif (gar exemple PCA) pendant 30 min sous chaque hotte. Diautres méthodes peuvent également étre utilisées. — — 4.2 Balance 4.2.1 Utilisation Un laboratoire de microbiologie alimentaire doit &tre équipé de balances adaptées en portée et en précision aux différents produits & poser. Doux sonsibilités sont en général nécessaires: + 0,01 g et #0,0001 g. Ces balances sont principalement utilisées pour la pes¢e de la prise d'essai de !échantilion & analyser et celle des composants des milieux de culture et des réacilfs. Elles servent éventueliement & effectuer des mesurages pondéraux de volume de diluant. 4.2.2 Entretien et contréie La balance doit étre posée sur un support horizontal stable, a l'abri des vibrations. Elle doit étre vérifiée réguliérement avec des masses étalons de travail (de préférence chaque jour d'utilisation). Elle doit étre vérifiée sur l'ensemble de sa portée par une personne habilitée au moins une fois par an. Le plateau de la balance doit étre nettoyé, si nécessaire, aprés chaque utilisation et eu moins une fois par jour. Un nettoyage et un contrdle du mécanisme doivent étre effectués par une personne habilitée au moins une fois par an. ISO 7218:1896(F) e1so 4.3 Appareil pour I'homogénéisation 4.3.4 Description Cet appareil est utilisé pour préparer la suspension mére a partir de I'échantillon pour essai des produits autres que les produits liquides. Lun ou lautre des appareils suivants peut étre utilisé - homogénéisateur de type péristaltique avec dos sees etériles en plastique et comportant évertuellement un variateur de vitesse et un minuteur; - homogénéisateur de type rotaiif, dont ia vitesse de rotation est comprise entre 6 000 tiimin et 45 000 tr/min, avec des bols en verre ou en métal stériisables et munis de couverdes. Dans certains cas particuliers, !homogénéisetion peut étre réalisée avec des billes de verre stérilisables de diamétre approprié (environ 6 mm; voir normes spécifiques). 4.3.2 Utilisation La durée habituelie de fonctionnement d'un homogénéisateur péristaltique est de 1 min & 2 min. Ce type d'appareil ne doit pas éire utilisé pour certains produits alimentaires, tels que: - les produits risquant d'entrainer des perforations du sac (présence de pariicules pointues, dures ou séches); ou ey - les produits cifficiles & homogénéiser de part ieur texture (par exemple saucisson seo). Lhomogénéisateur rotatif doit fonctionner pendant une durée telle que le nombre total de tours soit compris entre 15 000 et 20 000. Méme avec I'homogénéisateur le plus lent, cette durée ne doit pas excéder 2,5 min. Les billes de verre peuvent étre utilisées pour fa préparation, par agitation, des suspensions méres de certains produits visqueux ou épais, notamment certains produits laitiers (voir normes spécifiques). 4.3.3 Entretien et controle Ces différents appareils doivent tre contrdlés at entretenus selon les instructions du fabricant. e1so ISO 7218:1996(F) 44 pH-métre 4.4.1 Description Le pH-matre est utilisé pour mesurer le différence de potentiel, & une température déterminée, entre une électrode de mesure et une électrode de référence, toutes deux étant introduites dans le produit. I doit étre capable de réaliser des mesures & 0,1 unité pH prés, et son seuil minimal ce mesure doit étre de 0,01 unité pH. Le pH-métre doit étre équipé dun systéme de compensation de lempérature soit manuel soit automatique. NOTE ~ L'électrode de mesure et I'électrode de référence sont généralement réunies en un systeme d'électrodes combinées. 4.4.2 Utilisation ; Le pH-matre sert & mesurer le pH de chaque fabrication de milieu de culture et de réactit (7.2) pour vérifier si un ajustement du pH est nécessaire. II peut également servir A mesurer et/ou & ajuster le pH de l'échantillon pour essai ou de la suspension mére. Lutlication d'un pH-méire est mentionnée dane la norme spécifique du produit & analyser qui précisera les conditions de la détermination du pH, de ajustement du pH ainsi que le méthode de nettoyage et de décontamination des électrodes. 4.4.3 Entretien et contréle Le pH-métre doit étre étalonné, selon les instructions dU febricant, avec au moins deux solutions tampons étalons, au moins chaque jour avant l'utilisation. Les solutions étalons ont des valeurs de pH connues, & la seconde décimale pres, & la température du mesurage (en général, pH 4,00 et pH 7,00 & 20 °C). Elles doivent encadrer les valeurs de pH mesurés. Les électrodes doivent étre vérifiées et entretenues selon les instructions du fabricant. li est nécessaire, en particulier, de surveiller réguligrement. - le vieillissement et !encrassement des électrodes; ~ le temps de réponse et la stabilité Avant chaque utlisation, vérifier que le bulbe de mesure des électrodes trempe entlérement dans eau distiliée ou tout autre liquide, selon les instructions du fabricant; sinon, le faire temper 24 n avant d'effectuer tout mesurage. Netioyer les éiectrodes aprés chaque utilisation. Pour tenir compie de l'encrassement et du vieillissement des électrodes, procéder é un netioyage périodique plus soigneux, selon les instructions du fabricant. Conserver les électrodes selon les instructions du fabricant. ISO 7218:1996(F) e1sO 45 Autoclave 4.5.1 Description Un autodave est appareil permettant d'obtenir une vapour saturés & une température minimale de 121 °C, en vue de détruire les microorganismes. 45.2 Utilisation Lors du méme cycle de stérilisation, autoclave ne doit pas étre utilisé pour stériliser un matériel propre (et/ou un milieu de culture) et pour décontaminer un matériel deja utilisé (et/ou un milieu de culture d3jé utilisé). Il est préférable dutiiser des autoclaves séparés pour réaliser ces deux opérations. L'autoclave doit étre muni -d'au moins une soupape de sécurité; - d'un manometre; - d'un robinet de purge; - d'un dispositif de régulation permettant le maintien de la température &¢ 1 °C de la valeur prévus; tun thermométre ou d'un thermomiétre enregistreur. Ii est également préférable de munir lautoclave d'un indicateur de durée ou dun programmeur-minuteur. La stérilisation a la vapeur comporte lobligation d'exoulser tout l'air avant la montée en pression. Si l'autoclave n’est pas muni dun dispositif d'évacuation automatique, il est nécessaire de le purger de son eir jusqu’a émission d'un jet continu de vapeur. 4.5.3 Entretien et contréte Lautociave dott ire maintenu en pariait état de fonctionnement et dot étre régullérement controls par les services compétents selon les instructions du fabricant. Tous les instruments de contréle doivent étre maintenus en parfait état et doivent étre réguligrement vérifiés. Les opérations de détertrage, si besoin est, et de vidange doivent étre régulizrement effectudes, iso ISO 7218:1996(F) 4.6 Etuve 4.6.1 Description Une étuve est une enceinte permettant de maintenir une température stable et uniforme & + 1 °C prés, sauf specification coniraire, 4.6.2 Utilisation Les étuves doivent étre équipées dun systeme de régulation permettant de mainienir une température uniforme et stable dans l'ensemble de leur volume utile Sila température ambiante est proche ou supérieure & la température de I'étuve, i! est nécessaire de munir 'enceinte ¢'un systéme de refroidissement. Nl convient de protéger les parois de l'étuve de la lumiére solaire directe = Ii est recommandé de ne pas remplir compiétement "étuve en une seule opération car le temps d'équilibrage de le température dans le milieu de culture géiosé sera trés iong, quel que soit le type d'étuve utilisé (convection dair foros ou autre), Lors du chargement des étuves, il y a fieu de veiller a faciliter fa circulation d’air; en aucun cas les boites de Petri ou les tubes ne doivent étre placés & moine de 25 mm des parois intornes de létuve. Les piles, d’au maximum 6 boites, doivent étre espacées d'au moins 25 mm les unes des autres. 4.6.3 Entretien et contréle Lnomogénéité de la température & l'intérieur du volume utile doit étre contrOiée & l'eide de plusieurs thermométres ou sondes. W convient que la précision de mesure soit quatre ‘ois meilleure que la précision demandée (par exemple pour une précision demandée de + 2 °C, la précision devrait étre de = 0,5 °C). La stabilité de la tompéraiure doit étre contrélée, par exemple avec un ou plusieurs thermométres & minima-mexime. La température de l'étuve doit étre contrdlée au moins tous les jours d'utilisation. Dans ce but, chaque étuve doit contenir au moins un thermométre dont le réservoir est immergé dans du glycérol placé dans un flacon fermé. D'autres systmes de vérification d'efficacité équivalente peuvent également étre utilisés. Les parois intemes et externes doivent étre nettoyées et désinfectées réguliérement et, s'ily lieu, ie systeme de ventilation doit étre dépoussiéré. ISO 7218:1998(F) e1so 47 Rétrigérateur, chambre froide 4.7.4 Description Un réirigératour ot une chambre froide sont des enceintes permettant de garantir une conservation en froid positif. La température, sauf spécification contraire, doit re de +3°C 42°C sauf pour la conservation des échantillons pour analyse, ou la température doit étre de+2°C+2°C. 4.7.2 Utilisation ll est nécessaire de disposer d'enceintes différentes pour la conservation: - des milieux de culture non ensemencés et des réactifs; - des échantilions pour analyse; - des souches de microorganismes et des milieux incubés. Les rétrigérateurs et chamibres froides doivent étre chargés en veillant & maintenir une circulation dair appropriée, 4.7.3 Entretien et contréle La tampérature de chacune des enceintes doit étre vérifiée chaque jour de travail & l'aide d'un thermométre ou d'une sonde placée & demeure. (Voir 4.6.3 pour la précision de l'appareil) Les opérations centretien suivantes doivent étre régulibrement effectuées: poussiérage des alleties ou des plagues d'échange thermique exiemes; ivrage; ~nettoyage et désinfection de lintérieur des enceintes. 48 Congéiateur 4.8.1 Description Un congélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation en froid négatif. La température, sauf spécification contraire, doit étre inférieure & — 18 °C, de préférance égale & 24°C 22°C, 4.8.2 Utilisation I est nécessaire de disposer denceintes différentes pour la conservation: -de cartains milieux die culture non ensemencés et des réactifs; 10 e1so ISO 7218:1996(F) - des échantillons pour analyse; - des souches de microorganismes. Le congélateur doit étre chargé en veillant & maintenir une température suffisamment basse et ce, particuligrement lorsque sont introduits des produits non congelés. 4.8.3 Entretien et controle La température de chacune des enceintes doit étre vérifiée chaque jour de travail @ l'aide d'un thermométre ou c'une sonde placée 2 demeure.(Voir 4.6.3 pour la précision de fappareil.) Les opérations d'entretien suivantes doivent étre régullé rement effectuées: - dépoussiérage des ailettes ou des plaques d'échange thermique externes; ~~ - dégivrage; - nettoyage et désinfection de lintérieur des enceintes, 4.9 Bain thermostaté 4.3.1 Description Un bain thermostaté est un bain permettant de mainteni de fagon stable une température spécifiée. La précision, sauf spécification contraire, doit tre de + 0,5 °C. Les températures Cutilisetion sont précisées dans chaque méthode d'application. 4.9.2 Utilisation Les principales utilisations sont: - le maintien en surfusion des milieux gélosés & 47 °C +2 °C; - Nincubation de milieux de culture ensemensés & une température constante; - la préparation de suspensions meres & une température maintenue constante (par exemple la préparation des suspensions meres de caséinates nécessite leur maintien pendant 15 min dans un bain d'eau @ 37 °C); le traitement thermique de suspensions meres A une température maintenue constante (par exemple le dénombrement des spores peut nécessiter la destruction des callules végétatives) Pour un régiage précis de la température, le bain thermostaté doit 8tre équipé d'une pompe & circulation ¢'eau et d'un systéme de réglage automatique du cheufiage. L'agitation du liquide ne doit pas provoquer la projection de gouttes. ISO 7218:1998(F) e1so 439.3 Entretien et contrdle Cheque bain dott étre muni Gun thermométre ou d'une sonde indépendant du systéme de ragulation (voir 4.6.3 pour la précision de l'appareil) La temperature du bain dolt etre contrélée lors de chaque utilistion et, de préférence, une fols par jour. Le niveau du liquide du bain (eau, ethylene glycol, etc.) dot etre regullérement controls. Pour éviter toute prolifération microbienne, le liquide doit étre changé fréquemment. 4.40 Four a stériliser 4.10.1 Description Unfour & stétiliser est une enceinte permnettant d'atteindre une température de 170°C & 180 °C, en we de déiruire les microorganismes par chaleur seche. 4.10.2 Utilisation Seuls les matériels métalliques ou en verre sont stérlisés au four & stériliser. La durée de sterilisation est d'au moins 1 h lorsque la température correcte est atteinte. AVERTISSEMENT — Aucune verterie graduée ne doit étfe stérilisée dane un four # stériliser- La répartition de la température dans l'enceinte doit étre homogéne. - Le four doit &tre muni: - d'un dispositif de réguiation (thermostat); - dun thermometre ou d'un thermométre enregistreur. ilest égelement préterable que le four soit muni d'un indicateur de durée ou d'un programmeur- minuteur. 4.40.3 Entretien et contréle Lthomogénéité de la température a Fintérieur du volume utle doit étre contrélée. Le four doit étre maintenu en partait état de fonctionnement et les instruments de contrdle dovent etre verifiés réguliérement. Un nettoyage régulier est recommands. e1so ISO 7218:1996(F) 4.11 Four & micro-ondes 4.14.1 Description Un four & micro-ondes est un appareil permettant de chauffer un produit par l'utilisation de micro- ondes. 4.11.2 Utilisation En I’état actuel de nos connaissances, seule [utilisation pour la fusion des milieux de culture aélosés est possible. L'appareil utilisé fonctionne sous pression atmosphérique. Il doit pouvoir chaufier les milieux de culture de fagon contréiée par un cycle d'émiesions micro-ondes. La répartition des micro-ondes doit tre homogéne & lintérieur du produit afin ¢'éviter les points de surchautfe. Pour une meilieure distribution de la chaleur, il convient de munir'eppareil d'un plateau tournant. ATTENTION - Manipuler avec soin ! Le chauffage des milieux de culture gélosés dans un four & micro-ondes peut entrainer un retard d'ébullition. NOTE - En labsence de démonstration suffisante de fefficacité des micro-ondes pour la stérilisation des milieux de culture, cette utilisation ne peut actuellement pas étre prévue dans le cadre de la présente Norme internationale. 4.12. Microscope optique isation Un microscope optique présente des objectifs & différents grossissements. A fort grossissement et & limmersion, il permet d'observer la morphologie des microorganismes en suspension agueuse ou apres coloration. Il est préférable que le microscope soit équipé d'un dispositif & contraste de phase pour améliorer les observations & l'état frais. NOTE - Des appareils (microscopes 2 lame) 2 feible grossissement et idéalement stéréoscopiques sont disponibles pour l'examen des coloniss de bactéries sur ou dans les milioux de culture gSlosés. 4.12.2. Entretien et controle Aorés utilisation & immersion, 'objectif doit tre nettoyé de maniére ne pas altérer la qualité de optique et afin d'éliminer le produit utilisé pour immersion. ‘Au moins une fois par an, Ie microscope doit subir un nettoyage général, un contrdle du mécanisme et de l'optique par une personne habilitée. 4.13 Brileur & gaz, incinérateur & fil Un brOleur & gaz est utilisé pour créer et maintenir une zone de protection autour d'un point chaud. Ilsert a stériliser les fils et les anses en métal, en les portant a incandescence. ISO 7218:1996(F) e180 Il est préférable dutiliser lincinérateur a fil pour la stérilisation des fils et des anses en métal aprés la manipulation des bactéries pathogénes. 4.14 Répartiteur de milieux de culture et de réactits 4.144 Description C’est un instrument ou appareil permettant de répartir les milieux de culture et réactis dans les tubes, flacons ou boites de Petri (par exemple éprouvette graduée, seringue manuelle, seringue automatique, pompe péristaltique ou distributeur automatique de milieux) 4.44.2 Utilisation Dans le cas de répartition aseptique de milieux de culture et de réactits stériles, toutes les parties de 'nsirument ou de l'appareil en contact avec le produit @ répartir doivent étre stériles (voir 6.2). La précision de linstrument ou de lappareil doit étre adaptée & la précision du volume & répartir. En particulier, la précision demandée sur les volumes de diluants utilisés pour effectuer les dilutions décimales est de + 2%. 4.143. Entretien et contréle Ces instruments et appareils doivent étre maintenus en pariait état, selon les instructions du fabricant. Les volumes délivrés doivent étre réguliérement contrdlés. 4.15 Agitateur mécanique Un agitateur mécanique permet de mélanger de fagon homog2ne divers milieux liquides (par exemple les dilutions décimales et les échantillons pour essai liquides) ou mettre an suspension des cellules bactériennes dans un liquide. ‘Son principe est fondé sur un mouvement de rotation excentrée du contenu des tubes & essai (vortex). 4.16 Dispositif de comptage des colonies li est préférable que l'appareil soit muni d'un systéme d'éclairage avec fond noir, d'une loupe de grossissement minimal x 1,5 et d'un compteur numérique mécanique ou électronique. Tout autre systeme de comptage automatisé defficacité équivalente peut étre ullisé (par exemple compleur laser). 14 81SO ISO 7218:1996(F) 4.17 Matériel pour culture en atmosphere modifiée 4.17.1 Description Cest une jarre & fermeture étanche ou tout autre appareillage approprié permettant dobtenir et de maintenir des conditions d'atmosphére modifiée (par exemple anaérobiose) pendant toute ia durée de incubation du milieu de culture. D'autres systémes de performance équivalente, par exemple chambres anaérobies, peuvent étre utllisés. Les instructions du fabricant doivent étre suivies pour linstallation et la maintenance. 4.17.2. Utilisation La composition de latmosphere obtenue par un mélange gazeux (par exempie d'une bouteille de g2z) ou par tout autre moyen approprié (par exemple des systémes gazeux disponibles dans le commerce) sera précisée dans la Norme internationale spécifique. 4173. Entretien et contréle Un indicateur de contréle de la nature de tatmosphére doit étre placé dans chaque enceinte pendant chaque utilisation. Quand un systeme catalytique est empioyé, il doit étre régénéré selon les instructions du fabricant. Un nettoyage et une désinfection de ce matériel doivent étre effectués réguliérement. - 418 Autres matériels Diautres matériels et équipement sont dlutilisation courante, dont les suivants: appareils de filtration, récipients (tubes @ essais, flacons, bouteilles, elc.) en verre ou en matiére plastique, boites de Petri en verre ou en matiére plastique (les plus courants ayant entre 90 mm & 100 mm. de diamétre), pipettes en verre ou en matiere plastique (de 10 mi, 2 ml, 1 mi, etc.), instruments pour prélevement déchantilon, fils et anses (en nickeVchrome, en piatine iridié ou en matiere plastique & usage unique, etc.). 5 Personnel 5.1 Compétence Tour personnel intervenant dans un laboratoire de microblologie doit avoir regu la formation indispensable & la bonne réalisation des opérations qui lui sont confiées. Le personnel chargé de la réalisation des essais doit avoir une bonne connaissance et une pratique suffisante des techniques microbiologiques et des mictoorganismes recherchés. II doit également pouvoir interpréter les notions de précision et de fidélité requises pour obtenir des résultats acceptables. Pour cela, ii pourre, par exemple, participer & des essais circulaires, utiliser das matériaux de référence, ou effectuer des essais ¢'auto-évaluation pour le dénombrement des microorganismes (se référer en particulier aux travaux de la FIL). 15 Iso 7218:1996(F) e1so L'ensemble du personnel doit recevoir une information continue ot adaptée en matisre e'hygiéne ot de sécurité, 5.2 Hygiéne Dans le domaine de thygiéne personnelie, les précautions suivantes doivent étre prises pour éviter le contamination des échantillons et des mieux de culture, mais également pour Sviter des risques d'infection du personnel: - porter des vétements de laboratoire de couleur claire, propres et en bon étet, réalisés dans un tissu limitant les risques d'infammabilitg; ces vétements ne doivent pas étre portés hore des locaux d'essais et, éventuellement, des vestiaires; - porter des protections pour les cheveux et la barb, si nécesseire; - garder des ongies parlaitement propres et soignés et, de prétérence, courts; ~ se laver scigneusement les mains & leau tiéde, délivrée de préférence par un robinet & commande non manuelie, et au savon liquide ou en poudre, éventuellement désinfectant, délivré de préférence par un distriouteur maintanu en bon état de propreté, avant et apres les examens microbiologiques et imméciatement apras chaque passage aux tollottes; pour se sécher les mains, utiliser des serviettes en papier ou en tissu A usage unique; - pendant les ensemencoments, éviter de parler, de tousser, etc.; =e pas fumer, boi ‘ou manger dans les locaux d'essais; ~ prendre des précautions pantioulléres pour les personnes préseniant des infections (panaris) ou des maladies dont les germes, susceptibles de contaminer les échantillons, risquent de fausser les résultats; = ne pas placer aliments destinés 2 le consommation personnelie dans les réfrigératours diessais, 6 Préparation du matériel 6.1 Préparation Le matériel utilisé en microbiologie doit étre préparé de facon & garantir sa propreté etfou sa stérilité jusqu'au moment de lutlisation, Le matériel utilisé doit étre lavé avant utilisation méme s'il c'agit de matériel neuf. Les tubes et flacons doivent atrs bouchés avant stérilisation par un moyen approprié (coton cardé, bouchons méialliques ou bouchons plastiques, etc.}. Les pipettes doivent étre bouchées avec du coton cardé ou tout autre matériau adéquat. 1s eIso 1SO 7218:1996(F) Si nécessaire, le matériel & stérliser peut étre placé dans des récipients spéciaux, ou emballé dans un matériau adapté (papier spécial, aluminium, etc.). convient que le matétiel & passer & autoclave vide ('est-a-dire sans milieu ou autre solution aqueuse) permette fe libre acsés de la vapeur, sinon la stérilisation ne serait pas réalisée. 6.2 Stérilisation 6.2.1 Stérilisation par chaleur sécho Chautier dans un four & st¢riiser (four Pasteur) (4.10) pendant au moins 1 h & une température comprise entre 170 °C et 180 °C. 6.2.2 Stérilisation par chaleur humide Chautfer pendant au moins 15 min & 121°C dans un autoclave (4.5) muni, de prétérence, d'un dispositif de séchage sous vide. Des indicateurs de température peuvent étre ulilieés, afin de S'assurer que la température a bien été atteinte (par exemple papiers spéciaux) 6.3 Matériel A usage unique Le matériel & usage unique est accepté au méme titre que la verrerie réutilisable (bottes de Petr, Pipettes, flacons, tubes, etc.) si les spécifications sont similaires. I est alors conseillé de s'assurer auprés du fournisseur que les matériels proposés conviennent Pour l'utilisation en microbiologie (en particulier en matiére de stérilité) et que le matériel ne Contient pas de substance susceptible diinhiber la croissance des microorganismes. Le matériel & usage unique doit étre décontaming avant son éiimination. Outre les méthodes citées on 6.6, lincinération peut étre utilisée. Sil'incinérateur fait partie de 'établissement, I Permet de réaliser en une méme opération le déconiamination et 'élimination, 6.4 Gestion du matériel propre Le matériel propre doit étre stocké a l'abri de la poussiére dans des conditions assurantle maintien de sa propreté, 6.5 Gestion du matériel stérile Avant utilisation, le matériel doit éte stocké dans des conditions assurant le maintien de sa stériité, Les matériels & usage unique doivent etre stockés selon les spécifications du fabricant, sans détérioration des emballages; les metériels préparés au laboratoire doivent éire stockés dans des conteneurs propres, Iso 7218:1996(F) e1so Lors de la stériisation des matériels destinés & la microbioiogie, une date limite d'utilisation (ou une dete de febrication) doit 6tre apposée sur chaque conditionnement. Les matériels bouchés hermétiquement peuvent étre conservés jusqu'a 3 mois avant utilisation. Les matériels conditionnés non hermétiquement doivent étre conservés pendant un temps plus court (8 jours par exemple). 6.6 Décontamination Aprés utilisation (culture de microorganismes ou contact avec les microorganismes), le matériel et son contenu doivent étre décontaminés, avant tout nettoyage ou élimination de celui-ci, que! que soit le microarganisme en cause. Per exemple, les bouchons de cotan des pipettes ne doivent étre retirés qu'aprés leur décontamination; les tubes contenant des milieux liquides doivent étre décontaminés avant d'étre lavés. La décontamination pout étre effectuée selon lune des deux techniques suivantes: - stérlisetion en chaleur humide & 'autoclave (4.5) pendant au moins 30 min & au moins 121 C. de tout le matériel qui 2 été en contact avec des cultures de microorganismes (milieux de culture incubés, solides ou liquides, réactifs contaminés, matériels, etc.); - décontamination pet trempage dans une solution désinfectante pour des matériels de petite taille et résistant & la corrosion (pipettes par exemple). Les pipettes Pasteur ne doivent étre utilisées quune seule fois. Le matériel en matiére plastique peut étre directement incinéré, si les lois du pays considéré Vautorisent. aes =o ya aa 67 Lavage Ne laver le matériel qu'aprés sa décontamination. Vider les récipients de leur contenu. Avant lavage, séparer les joints de leur bouchon, silly a lieu. Laver scignousement les bouchons et la verrerie & l'eau chaude avec une solution détergente du commerce. En labsence de produit du commerce, une solution de carbonate de sodium & 0,125 % (m/m) peut étre utiisée, puis un passage dans de l'acide diiué (par exemple acide chlorhydrique (HCI) avec p = 0,1 mol/l. Rincer tout le matériel a 'eau distillée ou de qualité équivalente. Pour faciliter les opérations de nettoyage, des matériels spécialisés peuvent étre utilisés (par exemple appareiis & déboucher les pipettes, lave-vaisselle, cuves & ultrasons, etc.) 18 ©1so ISO 7218:1996(F) 7 Préparation et stérilisation des milieux de culture et des réactifs La préparation précise des milieux de culture est une des étapes fondamentales de l'analyse microbiologique et il est nécessaire cly apporter toute la rigueur nécessaire. 7.1 Eau distillée Lieau utilisée doit étre de l'eau distiliée ou de qualité équivalente, cest-a-cire exempte de substances susceptibles d'inhiber ou diinfluencer ia croissance de microorganismes dans les conditions de ressai. Si feau distillée est préparée & partir d'eau chlorée, neuiraliser le chlore avant la distillation. Leau distillée doit Etre conservée dans des récipients en matériau inerte (par exemple verre neutre, polyéthyigne, etc.) qui doit etre exempt de toute substance inhibitrice avant utliisation. NOTE — Dans certains cas, il est nécessaire dutliser de l'eau fraichement préparée, exempte de CO2 dissous. Pour étre considérée de bonne qualité, l'eau distillée doit avoir une résistivité dau moins 300 000 Rem, NOTE ~L’eau déminéralisée, par passage sur résine échangeuse dons, est souvent tres, chargée en microcrganismes; aussi est-il conseillé de ne pas utiliser ce procédé sans verifier la pauvreté en microoroanismes de l'eau. Il convient de consulter le fabricant pour appliquer la meilleure méthode de minimisation de la contamination microbienne. La stérilisation par filtration d'une eau déionisée et contaminge par une grande quantité de microorganismes peut encore contenir des substances inhibitrices pour la croissance de certains microorganismes. 7.2 Préparation des milieux de culture Deux types de préparations existent: - soit & partir de composants de base, déshydratés ou non; ~ soit a partir de milieux complets déshydratés. Les flacons contenant les composants de base déshydratés ou les milieux compiets déshydratés doivent étre conservés & l'abri de la lumiare dans un endroit sec, & le température indiquée par le fabricant. Ne pas utiliser eprés la date limite de conservation indiquée. Les composants et milieux déshydratés étant hygroscopiques, ii est indispensabie de refermer rapidement et soigneusement les flacons apres prélevement. Un milieu déshydraté qui présente Ges signes d'agglutination ou de prise en masse, indiquant une reprise d'humidité, ne doit pas étre utilisé 19 ISO 7218:1996(F) e1so 7.2.1 Mise en solution Les recommandations de la Norme internationale concernée evou celles du fabricant doivent étre suivies. 7.2.2 Mesurage du pH i Mesurer le pH au pH-metre (4.4) et 'aluster, si nécessaire, de sorte qu’aprés stérilisation et refroidissement & 25 °C, le milieu soit au pH demandé a + 0,2 unité pH, sauf indications différentes, L'ajustement est effectué avec une solution dhydroxyde de sodium (NeOH) & environ 40 ofl (soit approximativement 1 mol/l) ou avec une solution d'acide chlorhydrique (HCl) & environ 36,5 g/l (soit approximativement 1 mol/l). 7.2.3 Répantition Répartir le milieu dans des récipients appropriés, soit manuellement, soit & l'aide d'un appareil automatique (4.14). Répartir dans un récipient de volume une, deux a trois fois le volume a répartir pour éviter que le milieu ne déborde du récipient au cours de l'autoclavage. 7.3. Stérilisation La stériisation des milieux de culture et des réactiis peut étre réalisée par différentes techniques, et notamment: - la stétilisation par ia chaleur humide; ~ la stérili sation par filtration. Gependant certains milieux et réaciifs peuvent étre utilisés sans stéilisation perticullére (se reporter & la Norme internationale spécifique etou aux inetructione du ‘abricant). Aprés stérilisation, les milieux, doivent étre contélés, notamment feur pH, leur couleur, feur siérilité et leur efficacits bactériologique. 7.3.1 Stérilisation par la chaleur humide Elle doit éire effectuée dans un autoclave (4.5) autonome ou feisant pattie d'un appareillage pour préparer et répariir les rilieux. Généralement, lautoctavage s'effectue en 15 min & 121 °C (245 kPa), Four des volumes supérieurs & 1 litre, le bareme de siérlisation doit étre adapté. Dans tous les cas, suivre les indications données dans la Norme internationale spécifique et/ou les indications du fabricant. Avant autociavage, un nombre représentatif de récipients, dans chaque parlle de autociave, doit évre muni d'un papier réactt (disponibie dans le commerce) indiquant que le température désiré2 f @ été atteinte. eo 20 e180 ISO 7218:1986(F) 7.8.2 Siérilisation par fi ‘ation Elle peut étre réalisée sous vide ou sous pression. Les membranes et cartouches filtrantes doivent avoir un diamétre de pore de 0,22 um. Elles doivent avoir été stérilisées & l'autoclave (4.5) avant utilisation. Pour l'utilisation de cartouches ou de membranes achetéss stéries, se référer aux indications du fabricant. Les différents éléments de l'appareil a filtrer, montés ou non, doivent atra stérilisés & autoclave (4.8) pendant 15 min & au moins 121 °C. Si nécessaire, un montage aseptique peut tre réalisé sous hotte a flux laminaire aprés autoclavage. Certains appareils montés peuvent étre achetés stériles. 7.4 Conservation Chaque conditionnement de flacons, de tubes et de boites de Petri doit tre étiqueté et doit comporier les indications suivantes: - identification du milieu; - date de préparation et/ou date de péremption. 7.4.1 Milieux de culture et réactits préparés en laboratoire Les rilieux de culture répartis en tubes ou flacons et les réactifs qui ne sont pas utilisés extemporanément doivent étre conservés & 'abri de la lumire et de la dessiccation (en ulilisant par exemple des capushons en caoutchouc, des capsules vissées). Sauf spécification indiquée dans la Norme internationale conoemée, ls doivent étre conservés $ mois au maximum au réfrigérateur (4.7), ou 1 mois eu maximum entre 18 °C et 26 °C dans des conditions évitant toute modification de leur composition. Ne jamais utiliser des milieux qui se sont desséchés. Avant leur utilisation, il est souhaitable que la température des milieux de culture soit mise en équilibre avec celle du laboratoire. 7.4.2 Milieux de culture et réactifs préts & l'emploi | est nécessairo de se conformer aux indications du febricant: date de péremption, temperature et conditions de conservation, conditions d'utilisation (9H, etc.) et contréle dietficacité. 1SO 7218:1996(F) e1so 7.5 Fusion des milieux de culture gélosés Faire fondre le milieu de culture en le piagant dans un bain d'eau bouillante ou par tout autre procédé donnant des résultats identiques (par exempie en autoclave & vapeur fluente ou au four & micro-ondes). Eviter de le chautfer trop lonotemps ene retirant du bain d'eau dés au'l est fondu. Le milieu de culture doit &tre maintenu en surfusion dans un bain d'eau thermostaté & 47°C £2°C (4,9) jusqu'au moment de son utilisation. Un milieu de culture ne doit jamais étre utiioé & une température supérieure & 50°C. II est préférable de ne pas maintenir un milieu en surfusion plus de 8 h. Un milieu non utilisé ne doit jamais étre solidifié de nouveau pour une utilisation ultérieure, Dans le cas de mitieux de culture particuliérement sensibles, cette durée de surfusion doit etre réduite; elle sera précisée dans la Norme intemationale spécifique. 7.6 Désaération des milieux de culture Si nécessaire, juste avant l'utilisation, chauffer les milieux de culture dans I'sau bouiliante ou sous courant de vapeur pendant 15 min, avec bouchons Iégérement dévissés; aprés chaufiage ies bouchons doivent étre revissés et refroidis rapidement & la température d'utilisation. 7.7 Préparation et conservation des boites de Petri Couler le milieu de culture gélosé en surfusion dans les boites de Petti de facon & obtenir une €paisseur d'au moins 2 mm (par exemple pour des boites de 90 mm de diamétre, au moins 12 ml de gélose sont normalement nécessaire). Laisser refroidir et solidifier le milieu gélosé en posant les boiies de Petri sur une surface fraiche et horizontale. ee ae - a Utiliser les bottes de Petri ainsi préparées immédiatement ou les conserver dans des concitions €vitant toute modification de leur composition, a l'obscurité, au réfrigérateur (4.7) pendant 1 semeine eu maximum. Cette durée de conservation peut étre, dans certains cas, plus longue ou plus courte; elle sera précisée dans la norme spécifique. Etiqueter les boites comme décrit en 7.4, Les utiliser aprés séchage En général, pour l'ensemencsment en surface du milieu gélosé, sécher les boites, de préférence avec le couvercle enlevé et avec la surface de la gélose tournée vers le bas, dans une étuve réglée entre 25 °C et 50 °C, jusqu'a disparition des gouttelettes la surface du miliou. Ne pas les sécher davantage. Le séchage des boltes contenant ie milieu de culture gélosé peut auss! étre réalisé sous hotte 2 flux laminaire pendant 30 min avec le couvercle entrouvert ou toute une nuit avec le couvercie en place. Des boites de Petri prétes & l'emploi sont disponibies dans le commerce. Les conserver et les utiliser selon les instructions du fabricant. e1sa ISO 7218:1996(F) 8 Echantilions pour iaboratoire 81 Echantillonnage 'l est important que le laboretoire regoive un échantillon réellement représentatif du produit, non endommagé ou modifié lors du transport et de 'entreposage. U'échantillonnage ne fait pas partie des regies générales examen microbiolocique. Voir la Norme internationale spécifique du produit concerné. S'I n'y a pas de Nore internationale spécifique disponible, il est recommandé que les parties concemées se metient d'accord & ce sujet. 8.2 Transport Le transport des échantillons vers le laboratoire doit étre réalisé dans des conditions évitant toute modificetion du nombre de microorganismes présents. |i est préférable de choisir les moyens dé transport assurant ies acherninements les plus rapides. Une attention particuliére doit étre apportée au respect des températures de conservation suivantes, adaptées aux types de produits suivants: ~ produits stables: température ambiante; ~ produits frais et réfrigérés: entre 0 °C et + 4 °C; - produits congelés ou surgelés: inférieure & - 18 °O; - produits pasteurisés et simllaires: entre 0°C et + 4 ~ prodults stables altérés: entre 0°C et + 4°C. ATTENTION — Des produits alimentaires sensibles (par exemple viandes en l'état, produits de la péche) doivent étre conservés & une température comprise entre 0 °C ot + 2 °C. Les produits stebles altérés doivent étre transportés dans un emballage fermé pour les protéger d'une perte détanchéité ou d'un éclatement éventuel. 8.3 Réception et stockage Le personnel du laboratoire doit vérifier l'état des échaniilions des leur réception. Si ceux-ci sont endommagés ou s'ils soni en quentité insutfisante, le laboratoire doit refuser, clune fagon générale, les échantilions. Dans des circonstances particuliéres, le personnel peut les analyser mais le rapport d'essai doit alors comporter des réserves eur la validité des résultats. Les échanillons admis au laboratoire doivent étre référencés de maniére & en assurer le suivi jusquia la rédaction du rapport d'essai. ISO 7218:1986(F) e1so Les informations suivantes doivent étre notées: + la date de réception; - les caractéristiques du prélevement (date du prélevement, conditions de préléverna - les coordonnées du demandeur, - les caractéristiques du produit. Le stockage des échantillons en attente d'examen dol étre réalisé dans des conditions évitant toute modification du nombre de microorganismes présents. Une attention particullére doit étre apportée au respect ces températures de conservation (voir 8.2) et aux délais d’examen pour les produits suivants: ~ produits stables: le plus t6t possible et avant le dete limite de conservation; ~ produits frais et rétrigérés: dans les 24 h apras la réception (si une plus longue période de stockage ne peut étre évitée, congoier 'échantition dés que possible & température inférieure & ~ 18 °C et on faire étai dans le rapport d'essai, car, dans certains produits, la congélation modifie la composition de la flore); ~ produits pasteurisés ou similaires: le plus t6t possible et evant la date limite de conservation; ~ produits stables altérés: le plus t6t possible éf evant 48h. 84 Prises d'essai Pour éviter la contamination de l'environnement et de la prise d'essai, il esi recommandé de travailler dans des locaux particuliers ou sous des hotles de sécurité. A défaut, les prodults conus pour cortenir peu de microorgenismes (par exemple les produits pasteurisés, les plats cuisinés) doivent toujours étre exeminés en premier, puis ceux connus pour étre plus fortement contaminés. La protection de l'environnement contre la contamination est particulitrement importante lors de 'échantillonage et de la pesée de la prise d'essai des produits pulvérulenis iortement contaminés. Ces opérations doivent tte effectuées sous hotte de sécurité. Les échantillons dcivent tre manipulés de fagon & éviter tout risque de contamination. Pour cela, les précautions suivantes doivent &tre prises: ~dans Ie ces ol! 'on ne trevaille pas sous hotte de sécurité, prélever la prise d'essai & proximité une flamme; ~ pour un prodult place dans un emballage, nettoyer la partie extérieure qui sera ouverte avec oe fethano| & 70 %; fiamber si possibie; ~ tout instrument servant & ouvtir un emballage (ouvre-bottes, paire de ciseaux, ete.) doit Stre sterile; 24 91so ISO 7: ~ tout instument servant & prélever l'échantilion (spatule, pince, pipette, etc) doit re stérile; - reporter soigneusement la référence de |'échantillon de laboratoire sur les récipients, les sachets en matiere plastique, etc. (voir 8.3) renfermant !'échantillon pour essai. 8.8 Conservation et destruction des échantillons pour laboratoire Sauf cas patticuliers, conserver les échantilions pour laboratoire jusqu'a ce que tous les résultats aient été obtenus ou plus longtemps ei nécessaire, en les conditionnant dans des récipients stérilos (sachots on matiére plastique par exemple) el en les remettant & la température de stockage. Pour les produits frais réfrigérés, il est recommandé de les congeler. Déconiaminer les échentillons pour leboratoire altérés ou considérés comme dangereux avant élimination, Eliminer directement les échantillons pour iaboratoire non altérés. : 8 Techniques d'examen et expression des résultats 9.1 Précautions hygiéniques pendant I'examen Des précautions doivent étre prises pour travailier le plus possible dans des conditions aseptiques, par exemple: - Sassurer que la zone de travail est propre et quil n'y a pes de courant dir (portas et fendtres fermées); Tes Le contaminer la surface de travail avec un désinfectant approprié, avant et aprés le travail; - Sassurer, avant de commencer, que I'on dispose de tout ce qui est nécessaire & la réalisation du travail; dans Ie cas de travall effectué sous hotte @ flux laminaire, ulliser des gants stériles ou se décontaminer les mains avant de commencer le travail (par exemple avec un mélange de polyalcools) et éviter le croisement des avant-bras et des mains: - dans le cas oll 'on ne travaille pas sous hotte a fiux laminaire, ouvrir les tubes & essais et les flacons & proximité d'une flamme en les tenant le plus inclinés possible; - effectuer le travail le plus rapidement possible sans faire de mouvements inutiles; sila totalité d'un sachet de pipettes jetables, de boites de Petri, etc., n'est pas utilisée au cours dune opération, s'assurer que ie récipient est bien fermé aprés avoir prélevé le nombre approprié d'unttés; ~ stériliser les anses et les fils 8 ensemencer, etc., avant et apres utilisetion, & la flamme; pour éviter les projections de mati@re et de microorganismes, utiliser de préférence un incinérateur & fil (4.13); dans tous les cas oll cela est possible, utiliser des anses et des fils stériles 2 usage unique; ISO 7218:1996(F) elso - placer les pipettes, spatules, etc., utilisées dans des récipients spécifiques contenant un désinfectant approprié (par exemple solution d'hypochlorite de sodium pour ies pipettes) avant de les décontaminer (6.0); lacer les boites de Petri, milieux de culture et tout autre matériel pouvant contenir des microorganismes dans des récipients spécifiques avant la décontamination précédant ie lavage; - placer le matériel @ usage unique dans ces récipients appropriés avant décontamination ou incineration (6.6); - enlever immédiatement tous milieux ou produits contaminés qui auraient pu se répandre, au moyen de tampons de coton ou de toute autre matiére appropriée, imprégnés d'éthanol & 70 % (V/V) ou de tout autre désinfeciant, puis nettoyer et désinfecter le surface de travail avant de continuer. La manipulation de produits susceptibles de contenir des bactéries pathoganes (Salmonella, Listeria monocytogenes, etc.) ou de produits toxiques demande des précautions particulitres décrites dans les ouvrages spécialisés. Il est recommandé d'utiliser par exemple: - une hotte & flux laminaire pour toutes les manipulations nécessaires a l'analyse; - un eppareil dlaspiration mécanique (le pipettage par aspiration & la bouche est a prosctire). Les aérosols sont une cause importante de contamination de l'environnement et dinfection. Les aérosols peuvent se créer par exemple: - pendant ouverture des bottes de Petri, tubes et flacons; - lors de lutlisation d'agitateurs, seringues, centtifugeuses, etc.: - lorsque fon vide des pipettes en soutiiant; - lors de la stérilisation danses ou de fils 4 ensemencer humides; - lors de ouverture d'ampoules contenant des cultures lyophilisées, ll est donc nécessaire d’éviter autant que possible leur formation. 9.2 Préparation de la suspension mére et des dilutions Voir iSO 6887. Dans le cas de préparation d'une suspension mére, le temps qui s’écoule entre la fin de sa préparation et Ie moment ol inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min, saut indications particuliéres mentionnées dans la Norme internationale spécifique. 26 e1so ISO 7218:1996(F) 9.3 Dénombrement par utilisation d'un milieu solide 9.3.1 Ensemencement dans la messe Préperer le milieu (en surfusion dans un bain d'eau 47 °C), les boiies de Petri, ie diluant et les dilutions & examiner (conformément & 9.2) en quantités et nombres correspondant au plan d'ensemencement spécifié dans la Norme internationale concemée. Répartir dane les boites de Petri (identifiées), les volumes détorminés des dilutions & examiner. Verser dans chaque boite le volume de milieu prescrit en 7.7. Mélanger immédiatement et soigneusement le milieu fondu et inoculum, de fagon & obtenir une répartition homogéne des microorganismes dans la masse du milieu, Laisser refroidir et se solidifier en posant les botes de Peiri sur une surface fraiche et horizontale (le temps de solicification de fa gélose ne dott pas dépasser 10 min). Dans le cas oil la présence, dans le produit & examiner, de microorganismes & coloriies envahissantes est suspectée (par exemple Proteus spp.), couler sur les boftes solidifiées une deuxisme couche de gélose non nutritive ou identique & calle du milieu de culture utilisé dans lanalyse 9.3.2 Ensemencement en surface Déposer rinooulum au centre de la boite de Petri identifiée, sur le milieu de culture gélosé (préparé seion 7.7). L’étaler de facon uniforme et le plus rapidement possibie @ la surface du milieu &'aide dun étaleur stérile en verre ou en matiére piastique jusqu’a ce qu'll ne reste plus de liquide visible @ la surface du milieu. —— L'étalement peut également éte réalisé & laide de billes de verre. Dans certains cas (indiqués dans la Norme internationale concemée), inoculum peut &tre déposé sur une membrane puis étalé sur cette membrane comme décrit précédemment. 9.3.3 Incubation ‘Sauf spécification contraire, retourner sans tarder les boites ensemencées et les placer rapidement a I'stuve réglée & la température appropriée. Si une déshydratation excessive se produit (oar exemple & 55 °C ou dans le cas d'une forte circulation ¢'air), envelooper les boites, sans serter, dans des sacs en matiére plastique avant lincubation ou utiliser tout systeme similaire d'etficacité équivalente. Pendant la durée dincubation spécifiée, des variations de température dincubation peuvent étre tolérées, par exemple lors des opérations habituelles de chargement et déchargement des étuves. NOTE Il peut étre uiile dans certains cas de prévoir des boites ensemencées en double, qui seront conservées & + 2 °C, pour les comparer, lors du dénombrement, avec ies bottes ensemencées incubées, afin de ne pas coniondre des particules du produit examine avec des colonies. Aprés incubation, les boites doivent, si possible, étre examinées immédiatement . Sinon, elles peuvent étre conservées, sauf spécification contraire, au maximum 24h au réfrigérateur (4.7). ISO 7218:1996(F) eso 9.8.4 Comptage des colonies Aprés la période d'incubation mentionnée dans la Noime internationale spécifique, procéder au comptage des colonies pour chaque boite contenant moins de 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la Norme internationale spécifique). NOTE ~ Dans certains cas, les colonies peuvent étre difficiles & compter (par exemple en présence de microorganismes envahissants). Ces cas sont traités dans les normes spécifiques. 9.3.5 Expression des résultats 9.8.5.1 Mode de calcul: Cas général Pour quun résultat soit valable, on estime en général quill est nécessaire de compter les colonies sur au moins une bolte contenant au minimum 15 colonies. Calculer le nombre N’ de microorganismes présents dans I'échantillon pour essai, en tant que moyenne pondérée & partir de deux dilutions success'ves, a taide de la formule: ye Wing + Ota) ou : : Sc estla somme des colonies comptées sur toutes les boites retenues de deux dilutions successives et dent au mcins une contient 15 colonies; V__ estle volume de l'inoculum appliqué & chaque botte, en millilitres; m4, estle nombre des boites retenues a la premiére dilution; nz est ie nombre des boites retenues & la seconde cilution; deste taux de dilution correspondent & la premigre dilution retenue, Arrondir les résultats caloulés 2 deux chiffres significatifs. Pour cela, si lo damier chitfre est inférieur & 5, le chiffre précédant n'est pas modifié; si le demier chiffre est supérieur ou égal & 5, le chiffre précédant est augmenté d'une unité. Procéder de proche en proche jusqu’a ce gue l'on alt deux chiffres significatifs, Retenir comme résuitat le nombre de microorganismes par rrlliltre (produits liquides) ou par gramme (autres produits), exprimé par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 muliplé par le puissance appropriée de 10. 28 e1so ISO 7218:1996(F) EXEMPLE Xe 684215514425 402 8 AER SS = 19 182 Vin +0,tng)d 1(2+0,1x2)x10 0,022 En arroncissant le résultat tel que prescrit ci-dessus, le résultat est 19 000 ou 1,9 x 104 microorganismes par gremme de produit. 9.3.5.2 Mode de calcul : Cas aprés identification Dans le cas oli la méthode utilisée nécessite une identification, un nombre déterminé, A, (en général 5) de colonies sont repiquées sur chacune des boites retenues pour le compiage des colonies. Apras identification, calculer, pour chacune des boites, le nombre, 2, de micro- corganismes identifiés, & l'aide de !'Squation suivante’ b aaaxe ou b _estle nombre de colonies répondant aux criléres c'identification; C le nombre total de colonies dénombrées sur la botte. ‘Asrondir & un nombre entier de colonies selon les ragies indiquées en 9.3.5.1. Calculer le nombre Nde microorganismes identifiés présents dans 'échantillon pour essai, en tant que moyenne pondérée, a l'aide de ia formule donnée en 9.3.5.1, en remplagant YC par Ja. EXEMPLE : Un dénombrement direct d'un produit liquide a donné les résultats suivants: - &la premiére dilution retenue (10-8): 66 et 80 colonies, - &ladeuxiéme dilution retenue (10-4): 4 et 7 colonies. Oni été repiquées: ~ pour 68 colonies, 8 colonies dont 6 ont répondu aux critéres; d'ol e - pour 80 colonies, 9 colonies dont 6 ont répondu aux critares; d'oll a - pour 7 colonies, 5 colonies dont 4 ont répondu aux critéres; d'oit ~ pour 4 colonies, les 4 se sont révélées toutes étre le mictoorganisme recherche, dou a= 4. ya 453464. Da s0+53+6+4 1182 be a4 Vins +O,trg)d (2+ 0,1x2)x10 22x10 0 7218:1996(F) e1so 2 nombre de microorganismes trouvés dans l'échantillon pour essai est de 5,1 x 104 par millilitre. 3.5.3. Estimation des petits nombres 1.3.5.3.1 Si les deux bottes, au niveau de léchentillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mére (autres produits) contiennent moins de 15 colonies, faire le moyenne arithmétique y des colonies comptées sur deux boites. Exprimer le résuliat comme suit : - pour les produits liquides: nombre estimé de microorganismes par mililitre Nz - pour les autres produits : nombre estimé de microorganismes par oramme Ni oU cest le taux de dilution de la suspension mare. 9.3.5.3.2 Si les deux boites, au niveau de léchantillon pour essal (produits liquides) ou de la ‘suspension mére (autres produits), ne contiennent aucune colonie, exprimer le résultat comme suit: ~ moins de 1 microorganisme pet mililitre (produits liquides); = moins de /d microorganisme par gramme (autres procults), ov dest Ie taux de dilution de la suspension mére. 9.3.6 Limites de confiance Pour estimer la validité du résultat et éviter des interprétations trop strictes, il est nécessaire de déterminer lintervalie de confiance caractérisant la réparition statistique des microorganismes dans |'échantilion. D'autres variations dues & la technique elle-méme interviennent, en particulier celles liées aux erreurs de dilution, dont l'importance varie d'un laboratoire & un autre. 9.3.6.1 Cas général Avec une probabilité de 95 %, lintervalle de confiance 6, caractérisant la dispersion microbienne dans l'échantilion, est calculé & l'aide de l'€quation suivante: hi Bld [2S 192 B B avec B=V(n, + 0,11) 30 ISO 7218:1996(F) e180 EXEMPLE: Pour le cas donné en 9.3.2, le nombre N de microorganismes trouvés est de 5,1 x 104 par mililtre Pour 113 colonies retenues, par suite: 113 1,982, 1,96V713] [22° 22-22 85) 45-8 6= (51,36 + 0,87 + 9,47) x 10° Les limites de l'intervalle de confiance sont done - &, = 4,8 x 108 et d = 6,2 104 Dans ce cas, les limites de l'intervalle de confiance sont comprises entre - 16,7 % et + 20,1 %. ¢ 83.6.3 Estimation des petits nombres Les limites de confiance sont données dans les tableaux A.1 et A.2 de I'annexe A. 8.4 Dénombrement par utilisation d'un milieu liquide : Technique du nombre le plus probable (NPP) : — NOTE — Deux systémes d'ensemencement sont possibles. Les systémes les plus usités its «symétiques») comprennent le méme nombre de tubes pour chaque dilution, les rapports de volume entre 2 diiutions étant en général de 1 & 10. Ges systémes sont surtout utilises lorsqu'l! ne s‘agit pas uniquement de verifier qu'une certaine limite n'est pas dépassée, mais également de déterminer le nombre de microorganisms présents. Il exisie aussi des systémes (cits «dissymétriques) qui comprennent différents nombres de tubes pour différentes dilutions. Seuls les systémes «symétriques» avec dilutions décimales sont évoqués dans la présente Norme internationale, 9.4.1 Ensemencement Solon la précision souhaitée pour fes résultats, ensemencer un nombre approarié de fioles ou tubes avec la méme dilution (par exemple trois, cing ou dix fioles ou tubes). En regie générale, les techniques mises en oeuvre demandent trois fioles cu tubes par dilution. Introduire, & l'aide d'une pipette, inoculum dans les fioles ou tubes correspondants. Utiliser une nouvelle pipette stérile pour chaque dilution. 9.4.2 Incubation Disposer les jioles eV/ou les tubes ensemencés dens une étuve ou, de préférence, dans un bain 3 eau thermostaié (4.9). ISO 7218:1996(F) 180 précédentes (c'est-&-dire celles dont les concentrations en échantillon sont égales 2 10 et & 100 fois celle de la premidre dilution choisie; voir les exemples 4 et 6), sau lorsque das tubes positifs ne sont trouvés qu’au niveau de la premiere dilution préparée & parr de 'échantllon. Dans ce dernier cas, il est nécessaire de retenir les trois premiéres dilutions pour le caloul du NPP, méme si cette série renferme deux dilutions ne révélant aucun tube posit. 9.4.3.2 Calcul du nombre le plus probable (NPP) 84.3.24 ifier, selon le nombre d'échantillons examinés par lot dans le tableau B.1, siles séquences de nombre de tubes posififs correspondant aux dilutions sélectionnées selon 9.4.3.1 ‘sont acceptables du point de vue statistique. Cette acceptabilité dépend & la fois du nombre d'échantillons examinés et de la décision d’accepter ou de refuser ies résultats des catégoties 2 et 8 (voir tableau B.2). Ainsi, par exemple, lorsque seulement les résultats de la calégorie 1 sont accepts, le séquence 221 ne peut étre retenue que si 10 échantilions du lot considéré ont été examinés. Par contre, lorsque les résultats moins probables de la catégorie 2 sont également acceptés, le sequence 221 ‘sera retenue aussi dans le ces oU seulement deux, trois ou cing échantillons ont été examinés. Si la séquence 221 est le résultat d'un essai unique, elle ne sera acceptable en aucune maniére 9.4.3.2.2 Pour chaque séquence jugée acceptable selon 9.4.3.2.1, le coefficient NPP est obtenu au moyen du tableau B.1. 9.4.4 Expression des résultats A partir du coefficient NPP (voir 8.4.3.2) lu dans le tableau B.1, déterminer le nombre de jcroorganismes le plus probable dans un volume de référence donné de téchantilon & lide de équation suivante: C, est le nombre le plus probable de microorganismes dans le volume de réiérence Ve; M __ estle coefficient NPP lu dans le tableau B.1 pour la dilution de base Vo, F est linverse du taux de dilution correspondant a la dilution éventuelle de féchantillon considérée comme dilution de base utilisée dans le tableau 8.7 (généralement F= 100, ete.}; Ve est lo volume de référence choisi pour exprimer le concentration en microorgenismes; Vo esta dilution de base. e1so tSO 7218:1996(F) Dans ie cas ola dilution retenue la moins élevée correspond aux tubes préparés & partir d'un milieu double concentration (ensemencement de 10 mi), diviser préalablement le coefficient NPP par 10. Si le NPP estinférieur & 0.3 microorganisme par milllitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits) et si le mode opératoire approprié pour un faible nombre de microorganismes a été uiilisé, le résultat doit 6tre exorimé de la fagon suivante: moins de 1 microorganisme dans 1 ml (produits liquides) ou dans 1 g de produit (autres produits). EXEMPLE Dans le cas dun produit solide, le coefficient NPP est 24; le premier tube retenu correspond & lensemencement de 1 ml de la suspension mére (F = 10), Cs est, pat gramme Cy =24X 10=2,4 x 102 9.4.5 Limites de confiance Les limites de confiance sont données dans la table NPP (tableau B.1). lest bien connu que des variations imoortantas dans les résultats peuvent étre observes avec la technique du NPP. De ce fait, las résultats obienus selon la orésente méthode doivent étre utilisés aves prudence. 95 - Méthade de recherche Une métnode de recherche est une méthode qui vise & déterminer la présence ou I'absence de microorganismes définis cans une quentité donnée de produit. 9.5.1 Principe Sauf indication contraire dans fa Norme internationale concernée, une quantité p de produit & analyser est mélangée (produits liquides) ou homogénéisée (autres produits) avec (9 x p) ml oug Cun bouillon électif ou sélectif. Aprés incubation, de préférence dans un bain thermostaté (4.9), une anse ce la culture obtenue est étalée sur la surface d'un milieu gélosé sélectif de fagon & obtenir des colonies isolées. Une partie des colonies (en général cing) obienues apres incubation est ensuite identifiée. Dans certains cas, il est sounaitable de faire précéder lenrichissement dans le bouillon électif ou sélectif par un préenrichissement dans un bouillon nutritif de maniére & revivifier les micro- organismes stressés. De méme, il epparait parfois utile dlutiiiser en paralléle deux ou plusieurs bouillons électifs ou sélectifs ainsi que deux ou plusieurs milieux gélosés sélectifs. 9.5.2 Interprétation du résultat Si ls microorganisme recherché a été mis en évidence, le résultat est donné sous fa forme: «es% [se [su [> 0% o[o[o{

    You might also like