Fluorescencija i

spektrofluorimetrij
a

Emisija energije pri povratku

elektrona iz pobuenog u osnovno
stanje zove se luminiscencija

Emisija pri povratku elektrona iz

pobuenog singlet stanja u osnovno stanje
je fluorescencija.
Emisija pri povratku elektrona iz triplet
stanja u osnovno stanje je fosforescencija.
Ovisno o vrsti energije koja je dovela do
pobuivanja postoje:

Fotoluminiscencija
Hemiluminiscencija
Tribuluminiscencija
Elektroluminiscencija
Bioluminiscencija

Duina trajanja
fluorescencije i
Elektron fosforescencije
iz osnovnog u pobueno stanje

prelazi za oko 10-15 sekundi. Zbog ovako

kratkog vremena ne dolazi do promjena u
geometriji nukleusa (Franck-Condon-ov
princip).
Pri fluorescenciji, elektron u pobuenom
stanju boravi oko 10 ns.
Fosforescencija moe trajati nekoliko
milisekundi do nekoliko sekundi, pa i vie.

 Fenomen fluorescencije
je prvi uoio Sir John
Friedrich William
Herchel promatrajui
vodenu otopinu kinina.

Osnovne teorije u
spektrofluorimetriji je
dao Alexander
Jablonski.

Jablonski dijagram

 Maksimum emisije je u pravilu na viim

valnim duinama od maksimuma
apsorpcije (Stockesov pomak).
Emisioni spektar je, teoretski, obino
lik apsorpcionog spektra u ogledalu.
Razlike energije u vibracionim nivoima
se jasno vide na emisionom spektru
perilena i antracena.
Bez obzira koja je valna duina
ekscitacije, emisioni spektar ima isti
izgled.

Izuzeci od pravila
U ekscitacionom spektru kinina prvi
maksimum potjee od prelaska elektrona na
drugo pobueno stanje. Elektron se obino
vraa sa drugog na prvo pobueno stanje za
10-12 sekundi.
Prilikom prelaska u pobueno stanje moe
doi do promjene u strukturi molekule, kao to
je sluaj sa 1-hidroksipiren-3,6,8trisulfonatom. U pobuenom stanju molekula
je kiselija, pKa fenolske skupine je manji i
dolazi do njene disocijacije.
Vrlo rijetko, elektron moe prei sa drugog
pobuenog stanja u osnovno stanje.

Ekscitacioni i emisioni
spektar kinina

 Poliaromatski spojevi u pobuenom stanju prenose

naelektrisanje na aromatske amine, ukoliko su prisutni,
pri emu nastaju tzv. ekscipleksi, tj. kompleksi u
pobuenom stanju.

 Neki spojevi u pobuenom stanju mogu dati

dimere koji se zovu ekscimeri. Prisustvo
ekscimera raste s porastom koncentracije.

Utjecaj strukture molekule na

sposobnost fluorescencije nije
posve razjanjen.
Slino kromofornim
grupama koje su
odgovorne za apsorpciju svjetla, postoje i
fluoroforne grupe odgovorne za
fluorescenciju.
Primjena fluorescencije se ograniava na
spojeve sa elektronima.
Auksofluori su obino elektron-donorske
skupine sa o-i p-direkscionim utjecajem
(amino, metil, metoksi, alkilamino,
hidroksi..)

 Planarna, rigidna struktura molekule doprinosi

pojavi fluorescencije.
Kao diminofluori djeluju grupe sa m-direkcionim
utjecajem koje imaju tendenciju lokalizacije
elektrona (karboksi, nitro, cijano, aldehidna
grupa..).
Poveana brzina unutranje konverzije dovodi do
smanjenja fluorescencije.
Kompleksi sa lantanidima imaju fluorescenciju koja
moe trajati nekoliko sekundi.
Teki atomi, poput joda dovode do perturbacije
molekulskih orbitala i favoriziraju prelazak u triplet
stanje.
Metali se mogu prevesti u fluorescentne komplekse
sa raznim ligandima, np. 8-hidroksikinolinom.

Utjecaj joda na intenzitet

fluorescencije

Gaenje fluorescencije
(quenching)
Koliziono (dinamiko) gaenje nastaje
sudarom molekule u pobuenom stanju sa
drugim esticama.
Kolizioni gasioci mogu biti razliiti:

Kisik
Halogenidi
Amini
Molekule siromane elektronima (np.
akrilamid)

Poveanjem temperature za 1 oC intenzitet

fluorescencije se smanjuje za 1%

Pojednostavljen Jablonski
dijagram kolizionog gaenja

Rezonantni prenos
energije

Deava se kad se emisioni spektar

fluorofora (donor) prekriva sa
apsorpcionim spektrom neke druge
supstance (akceptor).

 Statiko gaenje fluorescencije

nastaje formiranjem kompleksa
izmeu gasioca i potencijalno
fluorescentne molekule u osnovnom
stanju.

Utjecaj rastvaraa
Mogunost stvaranja hidrogenovih
veza, dipol-dipol interakcije,
prisustvo neistoa.
Poveanjem viskoznosti poveava se
intenzitet fluorescencije.
Rayleigh-evo rasipanje
Ramanovo rasipanje

Rayleigh-evo rasipanje
Rayleigh-evo rasipanje je pojava reemisije svjetlosti koju izaziva otapalo.
Deava se na istoj valnoj duini na
kojoj se deava i ekscitacija.
Ukoliko se prati emisija na valnoj
duini bliskoj duini ekscitacije,
mogu je znaajan utjecaj Rayelighevog rasipanja.

Ramanovo rasipanje
Fiziko porijeklo Ramanovog rasipanja lei
u ne-elastinom sudaru fotona i molekule.
U ovom sudaru dolazi do izmjene energije
izmeu molekule i fotona. Obzirom na zakon
o ouvanju energije, istu koliinu energije
koju izgubi foton primi molekula i obratno.
Energija koju molekula primi ne ovisi o
energiji fotona, nego o energetskim
razlikama izmeu vibracionih nivoa. To
znai da je energija Ramanovog rasipanja
karakteristina za svaku supstancu i ne
ovisi o energiji zraenja.

Signali u emisionom
spektru

Poloaji Ramanove trake, raunati za

valne duine ivine lampe i neke od
najvanijih otapala

Odnos izmeu intenziteta

fluorescencije i
U svakoj taki
otopine intenzitet
koncentracije

fluorescencije je razliit, zbog toga to se

dio zraenja ekscitacije apsorbira prije nego
dostigne molekulu, a dio zraenja emisije se
isto apsorbira prije nego napusti otopinu.
Ovo je fenomen postojanja prefiltera i
unutranjeg filtera.
Openito ukupna fluorescencija koja dospije
do detektora je zbir pojedinanih
fluroescencija malih zapremina otopine
uzorka.

Kvantni prinos
fluorescencije

je odnos izmeu broja emitiranih

fotona i broja apsorbiranih fotona.

 Prema Lambert-Beerovom zakonu

A=log I0/I pa je:

Za jako razblaene otopine

vrijedi:

Za apsorbancu manju od 0,01 vrijedi

F = 2,303kI0lC
Ako se svi utjecaju ovisni od
eksperimentalnih uvjeta i vrste
supstance predstave kao konstanta,
onda vrijedi:F = KI0C
U sluaju visokih koncentracija,
intenzitet fluorescencije ne ovisi vie o
koncentraciji i jednaina poprima oblik F
= kI0

Konstrukcija
instrumenta