1.

METODE IZOLACIJE DNK

Mnogo razliitih metoda je razvijeno za izolaciju genomske DNK. Metode i protokoli za
izolaciju DNK prilagoeni su biolokom materijalu, tj. polaznoj osnovi iz koje se ekstrahuje
DNK. U svim metodama za izolaciju DNK postoje tri osnovne faze:
- pucanje i liziranje elija u polaznom materijalu,
- otklanjanje proteina i ostalih kontaminanata iz lizata,
- sedimentacija i rastvaranje DNK.
Prvom fazom postie se razbijanje elijskog zida u cilju oslobaanja elijskih
konstituenata. Zatim se elijske organele moraju razoriti kako bi se DNK oslobodila u
ekstrakcioni pufer. Ovaj deo procedure postie se korienjem deterdenata, poput natrijum
dodecil-sulfata (SDS) ili cetiltrimetil-amonijum-bromida (CTAB). Etilendiamin-tetrasiretna
kiselina (EDTA) je helirajui agens koji vezuje dvovalentne Mg 2+ jone koji slue kao kofaktor za
veinu nukleaza ime dolazi do njihove inhibicije. Konano potrebno je ekstrahovati DNK iz
ekstrakcionog pufera, tkz. lizata, to se moe uraditi razliitim metodama: metod isoljavanja,
metod organske ekstrakcije, metod centrifugiranja sa gradijentom gustine cezijum hlorida, metod
izmene anjona, metod selektivne adsorpcije DNK putem silicijumske gel membrane . Ekstrakcija
visoko molekulske DNK je deo procedure, jer inicijalni DNK ekstrakt sadri velike koliine
RNK, proteina, polisaharida, tanina i pigmenata, koje je u nekim sluajevima teko odvojiti od
DNK. Najvei deo proteina se moe ukloniti denaturacijom i precipitacijom iz ekstrakata
koristei fenol i / ili hloroform .
U prolom veku dve osnovne metode su koriene za ekstrakciju biljne DNK i to: CTAB
metod (Hombergen and Bachmann, 1995) i metod po Dellaporta et al. (1983). Ove metode
pokazale su se uspenim za irog opseg vrsta dajui poeljnu koliinu DNK odgovarajue
molekulske mase i zadovoljavajue istoe. Danas se esto koriste standardizovani protokoli sa
gotovim

puferima

(kit-ovi)

koji

se

zasnivaju

na

napred

(http://www.qiagen.com/about/whoweare/default.aspx?WT.svl=m).

citiranim

metodama

Postoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNK:

Elektroforeza na agaroznom gelu,

UV spektrofotometrija,

Real-time PCR,

Picogreen reagens

Quantiblot itd.

Od ovih nabrojanih metoda najee se koriste elektroforeza na agaroznom gelu i UV

spektrofotometrija.

1.1. ELEKTROFOREZA
Elektroforeza oznaava kretanje estica u elektrinom polju, dok elektroforeza DNK
predstavlja tehniku koja se primjenjuje za separaciju biolokih molekula, baziranu na fizikim
osobinama molekula, kao to su veliina, oblik ili izoelektrina taka molekula. Najee se
primenjuje u analitike svrhe, za separaciju i analizu DNK fragmenata razliite veliine. Snaga
elektrinog polja podstie migraciju fragmenata DNK kroz gel.
Molekuli koje se elektroforetski razdvajaju najee u svojoj strukturi sadre anjonske ili
katjonske grupe. Fragmenti DNK difunduju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog
naboja koji nosi DNK molekul. Fragmenti vee molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u
odnosu na fragmente manje molekulske mase ija je migracija bra. Veliina fragmenata
razdvojenih na gelu se odreuje uporeivanjem uzorka sa DNK ladder-om, koji sadri fragmente
DNK poznate veliine i slui kao referentni sistem.

Izbor sistema pufera je bitan, jer o njemu zavisi koliina elektrine energije koja se moe
primeniti na sistemu. Ako je dovod struje previsok, dolazi do preteranog zagrevanja, to moe
uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod struje prenizak, ne dolazi do znaajnijeg
zagrevanja, ali elektroforeza traje dugo pa razdvojene zone nisu otre zbog difuzije.
Kao standardna metoda za razdvajanje, identifikaciju i preiavanje DNK fragmenata
koristi se elektroforeza na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. Agarozni gelovi su manje
toksini, jednostavniji i laki za upotrebu od poliakrilamidnih gelova, pa se iz tog razloga ee
koriste za elektroforezu DNK.
Za pripremu gela potrebne su sledee komponente:
1. 1xTBE pufer,
2. agaroza i
3. etidijum bromid (10 mg/mL).
Sastav 1xTBE (Tris-borat-EDTA) pufera:
- 0,089M Tris,
- 0,089M borna kiselina,
- 0,002M EDTA.
Priprema gela:
- 1 % : odmeriti 1,5 g agaroze i preneti u staklenu au, agarozu preliti sa 150 mL 1xTBE pufera.
au prekriti sahatnim staklom i staviti u mikrotalasnu pe oko 4 minuta (do vrenja), kako bi se
rastvorila agaroza. Nakon rastvaranja agaroze, rastvor hladiti do ~ 60 oC pod mlazom hladne
vode. Kada se uspostavi eljena temperatura dodati 10 L etidijum bromida (10 mg/mL).
Rastvor paljivo izliti u kadicu za elektroforezu i ostaviti 45 minuta da se polimerizuje.
- 2 % : odmeriti 3 g agaroze i preneti u staklenu au, agarozu preliti sa 150 mL 1xTBE pufera.
au prekriti sahatnim staklom i staviti u mikrotalasnu pe oko 4 minuta (do vrenja), kako bi se
rastvorila agaroza. Nakon rastvaranja agaroze, rastvor hladiti do ~ 60 oC pod mlazom hladne

vode. Kada se uspostavi eljena temperatura dodati 10 L etidijum bromida (10 mg/mL).
Rastvor paljivo izliti u kadicu za elektroforezu i ostaviti 45 minuta da se polimerizuje.
Gel postaviti u kadicu za elektroforezu u kojoj se nalazi 1xTBE pufer i podesiti da tee
pri konstantnom naponu od 120 V u trajanju od 1h.
1.2. UV SPEKTROFOTOMETRIJA
Spektrofotometrija je jedan od naina kvantifikacije biomolekula. Ona predstavlja fotoelektrino
merenje zraenja koje neka supstanca apsorbuje na odreenoj talasnoj duini. Prema podrujima
talasnih duina izvora svetla, razlikuju se ultraljubiasta (200 - 400 nm), vidljiva (400 - 760 nm)
i infracrvena (iznad 760 nm) spektrofotometrija.
Ova metoda slui za kvantitativno odreivanje malih koliina rastvorenih supstanci. Koliina
apsorbovanog

svetla odreene talasne duine odgovara koncentraciji ispitivane supstance.

Maksimalna apsorpcija DNK i RNK je na talasnoj duini od 260 nm, a minimalna na 230 nm.
Izmeu apsorpcije svetla i koncentracije nukleinskih kiselina postoji linearan odnos.
Lamber-Beerov zakon definie zavisnost energije apsorbovane na odreenoj talasnoj duini kao
funkciju koncentracije apsorbovanog molekula:
I= I0-dc
Gde je: I-intenzitet proputenog svetla, I0- intenzitet upadnog svetla, - molarni ekstincijski
koeficijent, d- duina puta zraka svetlosti kroz uzorak, c-koncentracija apsorbovanog molekula.
Prilikom

odreivanja

koncentracije

nukleinskih

kiselina,

spektrofotometrom

se

meri

apsorbancija na:
230 nm - apsopcijski minimum nukleinskih kiselina, a apsorpcijski maksimum peptidnih veza u
proteinima, apsorpcija fenola, ugljenih hidrata, EDTA;
260 nm - apsopcijski maksimum nukleinskih kiselina;
280 nm - apsorpcija aromatinih aminokiselina, proteina i peptida, kao i jedinjenja sa
aromatinim prstenom;
320 nm proteini i nukleinske kiseline ovde ne apsorbuju.

Raunanjem odnosa ovih apsorbancija moe da se utvrdi istoa DNK uzorka.

Odnos A260/A280 je najei nain za odreivanje proteinske kontaminacije. Ukoliko je vrednost
1,8 smatra se da rastvor sadri istu DNK. Vrednosti manje od 1,8 ukazuju na kontaminaciju
proteinima, a vrednosti vee od 1,8 na kontaminaciju sa RNK.
Odnos A230/A260 je jo bolji indikator proteinske, polifenolne ili ugljenohidratne kontaminacije.
Vrednosti manje od 0,5 ukazuju na ist uzorak.
Za odreivanje koncentracije DNK dobijene izolacijom, uzorak DNK jedinine apsorbancije na
260 nm ima koncentraciju 50 g/mL DNK, jer je proseni ekstincijski koeficijent dvolanane
DNK je 50 (g/mL)-1cm-1.
Da bi se kvantifikovala DNK spektrofotometrijskom analizom potrebno je uzorak DNK
razblaiti, izmeriti apsorbanciju na 230, 260, 280 i 320 nm, i koncentraciju raunati prema
formuli:
cDNK (g/mL) = A260 x R x 50 g/mL, gde je R faktor razblaenja

2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Lanana reakcija polimeraze (Polymerase Chain Reaction - PCR) je biohemijska i
molekularno bioloka tehnika tokom koje se eljeni fragment ili sekvenca DNK eksponencijalno
umnoava putem jednostavne enzimske replikacije. PCR je in vitro tehnika koja se moe
sprovoditi bez ogranienja u pogledu porekla elija iz kojih se izoluje DNK i moe se
ekstenzivno modifikovati, to omoguuje njenu veoma iroku primenu. Osnov koji ini PCR
tehniku iroko primenjivom je to to genetski materijal svih ivih bia, biljaka ili ivotinja,
bakterija ili virusa, poseduje nukleotidne sekvence (DNK ili ponekad RNK), jedinstvene i
specifino prisutne samo u njihovim sopstvenim vrstama. Takoe, sloeni organizmi kao to su
ljudska bia, poseduju DNK sekvence koje su jedinstveno i specifino prisutne samo kod
odreene individue. Te jedinstvene varijacije ine moguim svrstavanje genetskog materijala
prema njegovom poreklu, identifikujui sa velikom preciznou kojoj vrsti pripada dati
organizam i esto o kojem pojedinanom lanu te vrste se radi.
Prvobitno PCR eksperimenti su izvoeni sa DNK polimerazom iz bakterije Escherichia
coli i nakon svakog koraka denaturacije morala se dodavati nova koliina enzima, jer se ova
polimeraza inaktivira na visokim temperaturama denaturacije. Iz tog razloga otkrie
termostabilnih DNK polimeraza omoguilo je efikasnu in vitro amplifikaciju, bez potrebe
naknadnog dodavanja novih koliina enizima. Taq polimeraza je prvi predstavnik termostabilnih
DNK polimeraza . Otporna je na relativno brza i velika temperaturna kolebanja. Izolovana je iz
bakterije Thermus aquaticus koja ivi u toplim izvorima Jeloustonskog nacionalnog parka u
SAD u kojima temperatura dostie i preko +70 oC.

Osim Taq polimeraze postoji jo niz

termostabilnih DNK polimeraza izolovanih iz drugih bakterija koje ive u toplim izvorima, kao
to su: Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus i dr..
Osnovni princip na kome je zasnovana PCR metoda je amplifikacija specifinih regiona
DNK koja u nekim fazama odgovara procesu replikacije DNK, koji se normalno odvija u svim
ivim organizmima. Ti delovi DNK mogu biti pojedinani geni, delovi gena ili nekodirajue
sekvence. Kod veine varijanti klasine PCR metode, obino se amplifikuju fragmenti DNK ne
vei od nekoliko stotina baznih parova.

Replikacija DNK je proces u kome se od jednog molekula DNK dobijaju dva nova,
identina molekula DNK (Slika 1.). Poto svaki od lanaca dvolanane DNK sadri redosled
(sekvencu) nukleotida koji je apsolutno komplementaran naspramnom lancu DNK, pri udvajanju
(replikaciji) molekula DNK, svaki lanac slui kao matrica za sintezu novog, komplementarnog
lanca. Zahvaljujui tome genetika informacija u DNK se precizno kopira u novi
komplementarni lanac tokom replikacije. Pomou PCR metode mogue je analizirati, opisati i
sintetisati bilo koji deo specifine DNK ili RNK. Nju je mogue izolovati

iz biolokog

materijala ije poreklo moe biti krv, kosa ili tkivni uzorci, mikrobi, ivotinje ili biljke. Pri tome
uzorci iz kojih se izoluje DNK mogu biti svei, ali je PCR proceduru mogue izvesti i sa
uzorcima DNK meu kojima neki mogu biti stari i po nekoliko hiljada ili ak miliona godina.

Slika 1. Replikacija DNK lanca

(http://hr.wikipedia.org/wiki/Deoksiribonukleinska_kiselina)

Za proces replikacije DNK, u PCR proceduri neophodne su sledee komponente:

- jednolanana tj. denaturisana dvolanana DNK koja se kopira i ini matricu,
- prajmer,
- DNK polimeraza sa temperaturnim opsegom delovanja oko 70 0C, tj. nativna ili
rekombinantna Taq (Bacillus thermoaquaticus) polimeraza , enzim koji se dodaje radi sinteze
kopija DNK regiona koji se eli amplifikovati,
- deoksinukleotidni trifosfati (dNTPs) iz kojih DNK polimeraza sintetie novu DNK,
- puferski rastvor koji obezbeuje odgovarajuu hemijsku sredinu za optimalnu aktivnost
i stabilnost DNK polimeraze,
- dvovalentni katjoni magnezijuma Mg2+ ili mangana Mn2+, pri emu se najee koriste
magnezijumovi joni dok se joni mangana mogu upotrebiti za PCR - posredovanu DNK
mutagenezu, budui da vie koncentracije Mn2+ poveavaju stepen greke tokom DNK sinteze
(Pavlov et al., 2004),
Prajmeri ili amplimeri su kratki jednolanani oligonukleotidi iji je raspored strogo
odreen., koji se pod odgovarajuim uslovima vezuju za specifinu komplementarnu sekvencu
nukleotida na DNK. Za PCR reakciju, prajmeri moraju biti homologni

nukleotidnim

sekvencama na svakoj strani dela DNK koji elimo da amplifikujemo, to znai da mora biti
poznat taan raspored nukleotida u prajmeru. U PCR reakciji uestvuju prajmeri koji su
dizajnirani tako da se sintetie tano odreeni deo DNK ogranien prajmerima. PCR reakcija se
izvodi u mikroepruveti, zapremine 0,2 - 1,5 mL, gde dolazi do preciznih i ciklinih promena
temperature, to ima za posledicu amplifikaciju tano odreenog gena ili dela gena, milion do
milijardu puta. Reakcioni volumen PCR smee je obino od 15-100 L. Mikroepruvete se
postavljaju u termoblok, aparat koji zagreva i hladi reakcione epruvete u ciklusima.
Postoje tri osnovna koraka u PCR proceduri:
1) denaturacija DNK matrice (raskidanje vodoninih veza izmeu dva komplementarna
DNK lanca, pod uticajem temperature od 90-96 0C i traje od 20-30),
2) hibridizacija prajmera (annealing) u kojoj se uspostavljaju vodonine veze izmeu
prajmera i komplementarne sekvence, sada jednostruke DNK i traje 20-40),
3) DNK sinteza ili elongacija prajmera, katalizovana DNK polimerazom.

Startovanjem od prajmera, Taq polimeraza moe itati informaciju na lancu matrice

DNK i na osnovu toga vezuje komplemetarne nukleotide vrlo brzo. Rezultat toga je stvaranje
dvolananog segmenta DNK koji se sastoji od jednog originalnog lanca DNK-matrice i njemu
komplementarnom novosintetisanom lancu.
Da bi moglo da doe do hibridizacije prajmera sa komplementarnim sekvencama na
matrici, potrebno je matricu DNK denaturisati odnosno raskinuti vodonine veze izmeu dva
komplementarna lanca DNK molekula. Denaturacija matrice se odvija inkubiranjem DNK
molekula na 95 0C. Hibridizacija prajmera sa odgovarajuom sekvencom na matrici se odvija na
temperaturi od 42-65 0C u zavisnosti od duine nukleotidne sekvence prajmera. Elongacija
prajmera tj., ugradnja nukleotida na 3 krajeve prajmera najcesce se odigrava na 72 0C i
katalizovana je DNK polimerazom (Slika 2.).

Slika 2. Postupak PCR reakcije (A - zagrevanje do 95 oC prilikom ega dolazi do

denaturacije DNK lanaca; B 55 oC hibridizacija prajmera sa odgovarajuom sekvencom na
matrici; C 72 0C Taq polimeraza sintetie nove lance DNK)
Termostabilna Taq polimeraza omoguava nesmetan proces ponavljanja ciklusa bez
neophodnog dodavanja enzima nakon svakog ciklusa denaturacije na visokoj temperaturi. U
PCR proceduri se obino ciklusi ponavljaju 20-45 puta to rezultuje eksponencijalnom
amplifikacijom eljenog segmenta DNK. Uspenost amplifikacije se najlake proverava
elektroforezom na agaroznom gelu, a ponekad je neophodno uraditi i neke dodatne analize:

digestija restrikcionim enzimima (tzv. restrikciona analiza), DNK/DNK hibridizacija-Southern

blot, sekvencioniranje itd..