Thudmg qui ky thuat Haemophilus Influenzae HAEMOPHILUS INFLUENZAE TS. Phan Lé Thanh Hwong Muc luc 1. Vai tra gay bonh 2. Cu tric va tinh chat khang nguyén 3. Hinh thé, dic diém nudi cdy 3.1 Hinh thé 3.2 Dac diém nudi céy 4. Kj thudt phan lap H. influenzae 4.1 Céch lay bénh phim 4.2 Quy trink phan lip Cac tiéu chudn xéc dinh H. influenzae Tai ligu tham khéo H.influenzae 1a vi khuan thuge t6¢ Haemophilus, duge phat hign Lin dau trong bgnh phim dom cia mt bénh nhan viém phdi 6 vy dich cam ndm 1892 béi Robert Pfeifer. Tén vi khuan la sy két hop cia dic cin cae yéu t6 c6 & mau (haemophilus: wa mau) va od méi lién quan lich sir véi com (influenzae) ciia vi khudn, 1. Vai trd gay bgnh _ Cae thanh vién cita toc Haemophilus 18 loai vi khudn ky sinh bat bude, tao nén mot Khudin binh thurdng 6 ngudi va nhiéu lodi dOng vat (chiém khoang 10% hé vi khudn ving hiu hong). Ty 1g mang vi khudn H.influencae & dudng ho hap trén thay d6i theo Ira tudi: Nguidi lon khoé manh: tir 20-40 % ‘Tré em khoé manh: 75- 80% H.influenzaechi gay bénh cho ngudi, khéng gay bénh cho déng vat Yéu 16 6 tinh manh déc chi yéu 18 v6 polysaccharide cia vi khuan (sinh ra typ huyét thanh). 90% cde truémg hgp nhiém tring nghiém trong (nhiém khutin xi hi dof. influenzae c v6 typ b (Hib), ngoai ra Hib cdn 1a tae nhan gay viém phéi cép, viém nap thanh quan cap, viém mé té bao. Ty Ig ngudi inh mang Hib dao dong tir 1-5%, han hizu c6 noi 10% nhung 6 nhiing nha gitt tré c6 tré bj viém mang nao do Hib, ty 1g ngudi lanh mang vi khuan ny lén ti 70%, Ngugc ai, cde chiing H. influenzae khéng c6 v6 boc thudng chi gay cdc bénh nhiém tring khu tra nhu viem tai gita, vviém phé quan man tinh, viém xoang cap hay man (> 90%), rat han hau la nguyén nhan ciia cdc nhiém tring x4m dn, va thudng xay ra ¢ tré méi sinh, ngudi gia va tré em & cdc mrde dang phat trién. Co ché gay bénh ciia Hib c6 thé duge hiéu nhw v6 boc c6 kha nang khang Iai sy thye bao, va c6 thé 06 y nghia quyét dinh nhat trong tinh manh de ciia vi khuan. /1. influenzaekhéng san xuat ngoaiGc t6 nhung sinh men protease phan huy IgA tao diéu kién thudn Igi cho viéc x4m lan cua vi khuan, ruc tiép tir ngu’i sang ngudi thong qua vige hit phai céc gigt dich duémg h6 2. Cau tric va tinh chat khang nguyén Thanh té bao H. influenzae cing c6 cdu trac tuong ty nhu thanh cua cdc vi khudn Gram 4m khéc, cé ban chat la lipopolysaccharide-protein. Cac protein dic higu loai (species - specific proteins) va dic higu ching (strain - specific proteins) nam trén mang ngoai cua vi khuan, nhung cdc khdng nguyén cia thinh té bio vi khudn H. influenzae c6 vd hay khong v6 déu khong lién quan dén dOe tinh eiia vi Khudn, H. influenzae gm loai khong vo va c6 v6 polysaccharide boc ngoai. V6 polysaccharide ¢6 tinh quyét dinh kha nang gay bénh cia vi khudn. Tuy theo cu trac khéng nguyén cua v6, H. influenzae 06 vo duge phan thanh 6 typ huyét thanh, dénh dau theo thir te a,b,c,d,e,f trong s6 nay typ b la typ giy bénh nguy hiém nhat, li mét dang tring hop cia ribose, ribitol va phosphate (goi 1a polyribosyl- ribitol-phosphate [PRP] ). G typ a, glucose thay thé cho ribose. Cée khang nguyén v6 6 thé duge phat hign bing cde ky thudt huyét thanh hoc nhu phan img ngung két gitta vi khuan véi khdng huyét thanh dac higu, phan ing ngung két gitta khdng nguyén véi hat latex duge phu khang thé dic higu, mién dich gan men, mién dich phéng xa, mién dich dign di déi uu, Cac khang thé khang PRP da duge ding dé diéu tri cdc nhiém khuan nang do H. influenzae typ b khi chwa c6 khang sinh. 3. Hinh thé, dic diém nudi cay 3.1. Hinh thé Thue logi da hinh thé: hinh edu, hinh tryc khudn ngén (short rod), hinh true khudn dai (long rod), hinh edu trye khuan (coccobacilli). Hinh thé vi khuan con thay déi theo méi trudng séng (vi du trong dich nfo tuy, vi khuan ¢6 thé kéo dai gp 4, 5 lan kich thuéc binh thudng va néi véi nhau tao hinh soi). Nhin chung vi khudn 6 kich thude minh nhé: 1-1,5 x 0,3pm, bit mau Gram 4m (mau héng nhat hon cdc vi khudn Gram 4m khéc do bin chit méng manh ciia vi khudn). Trén méi trréng thach, khudn lac ca ching ¢6 v6 uét bong, dng anh khi chiéu sing, sau 24 dén 48 gid trang thai mat vo xuat hign, tinh éng anh bién mit, vi khuin ty ly gidi va c6 thé tinh chit bat mau Gram thay d6i. Hign tuong thay ddi nay lign quan dén sy thay d6i hoat tinh eiia cdc enzym ndi sinh. Trong méi trudmg long, tinh trang mat vé xay ra sém hon. Vi vay néu muén xic dinh vé can chon mét thoi diém nudi cdy thich hop (18 gid). Khuan lac cla cde ching H. influenzae khong c6 vd khdng phét quang, ¢6 sy thay. d6i tir khuan lac dang $ sang dang R (thung gp cae chiing vi khuin phan Igp tir duémg hé hap trén). Tinh trang nay ciing 6 the xay ra khi m6i trang nudi edy khéng dit yéu 16 phat trién cin thiét cho vi khuan H. influenzae c6 v6. Vi khudn khéng nhugm mau axit, khong di ddng va kh6ng hinh thinh bao tir. 3.2. Die diém nudi cay Muén phan lap duge H. influenzae, moi truéng nudi cay gidu chat dinh duéng théng thug can phai c6 thém céc yéu t6 sau: * Yéu td X (Heamin): yéu té nay c6 trong mau (trong huyét tuong) va ca trong héng cau.* Yéut6 V (NAD = Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide): yéu t6 nay thudng chi ¢6 trong héng cau (cing c6 thé o6 trong huyét tuomg m6t s6 dng vat nhumg Khéng t6n tai lau do bj ee enzyme ly giai). Mudn co V phai ly giai héng ca ting nhiét do (80°C). Ngoai ra mét sé vi sinh vat nhu ty vang cing cé kha nang san sinh 'V va giai phong ra méi trvéng trong qué trinh phat trién. Nhigt d6 phat trién thich hop: 38 37°C Khi trudng thich hop: $-10% CO . Néu khéng c6 ti 4m CO} can phai sir dung binh kin dét nén (sau khi nén tit, khi truéng trong binh cé thé c6 3% CO). HL influenzae cé tinh dé khing influenzae, trong méi trudng nudi cdy c6 thé i Bacitracin, do vay véi myc dich chi phan lip H. xung Bacitracin 300yg/ml dé loai bé vi khudn khide. Sau 16 -18 gid nudi cay, H. influenzae phat trién thinh é dudmg kinh tir 1-2mm va khéng gay tan huyét. Cac ching c6 v6 c6 thé tao nhay wot va cé dung kinh Ién hon. Vi khuan thuan nat c6 mii tanh dic bigt (mai chudt chi). Phan biét H. influenzae dua theo nhu cau phat trién (bang 1). Lodi Tan huyét Cinyéut5X Cinyéut5 V Cinco, H. influenzae - \ \ t H parainfluenzae = - \ - H.hemolyticus i \ : Hparahemolyticus 4 - \ L H, aphrophilus : - ' 4. Kj thuit phan lip H. influenzae 4.1. Cach l4y bénh pham Tuy theo thé loai bénh ma chon céch lay bénh phém. Vige phat hién, xde dinh chinh xéc vi khudn gay bénh phy thude vio ky thudt léy bénh phim cing nhu qué trinh bio quan va van chuyén bénh phim phong thi nghiém. Sau day 1a mt s6 phuong phdp lay bénh phdm dé phat hign H. influenzae 4.1.1. Chit dich ducing ho hap: trong nhimg truéng hgp viém phéi, viém phé quiin, viém phé ngudi In, dm duge ldy vao budi sing sém, ho va khac sau, dom duge gid 6 hop vo khuan rdi chuyén vé phong thi nghiém trong vong 2 -6 gid (nhiét dé phong thi nghiém). Dich ty hau (mii hong): néu bénh nhan khéng khac duge hoc 1a tré nhé ding tim béng can manh mém lay chat dich ¢ nga ba mii - hong theo duémg mii (dich ty hau): da tim béng vio saw niza khoang céch tinh tir canh mai dén dai tai ciing phia, vé nhe ri rat ra. Chi ¥, néu chua 6 lai 6 mai bén kia. Tam béng phai dim bio khéng dé bj tut dau béng vao khi quan va can lam bang kim loai manh, mém khéng gi khéng dé gay ki hg hign thao tie. nhe: cach nay thay thé cho cach ngody ty hau & dura su qua 16 mii mét khodng cach bang 1/2 khoang céch tir n Ong tai ngoai cia bénh nhan dé hit dich. trén, Ding. ong. thong plastic nhé mé dinh mii Ngoay hong: dé Iudi, ding tim béng v6 khudn di duge lam am bang nuée mudi sinh ly (vokhuan) cha sat nhe 2 héc amidan, thanh sau hong (sau ludi ga) inh _khéng duge cham vao ludi, rang, mat trong ma va ludi ga. Sau dé phai cdm tim béng vio méi trang van chuy. 4.1.2. Dich nao tuy: trong truéng hop nghi viém mang nao, ding kim choc tiy s6ng v6 khudn lay khoang 2-3ml nuée nao ty. 4.1.3. Mau: trong trudng hgp bénh nhin e6 sét cao, nghi viém mang nio, viém phéi edp, ding bom kim tiém v6 khuan ldy it nhét 3ml méu tinh mach cho ngay vio binh canh thang ndo-tim (Brain Heart Infusion) hoe Thioglycolate hoje glucose 2% theo ty Ig | phn méu 10 phan eanh thang, hoe sit dung chai cdy mau do cde hang thuong mai pha ché sin, Chit y: dng téc va qua trinh lay mau, cdy mau phai dim bao that v6 khudn trong m6t quy trinh kin. T6t nhat, kim lay mau duge néi trye tiép vao binh mi trudng qua mot dng cao su hay plastic v6 khuan, Sat tring vj tri iy mau bing con idt. H. influenzae 1a mét vi khudn rat nhay cam va dé chét nbat 14 khi bénh pham bj khé hodc bj lanh gid, vi vay cdc bénh phim nén duge chuyén vé phéng thi nghigm trong vong 2 gid, hoe khOng qué 6 gid & mhigt d6 phdng thi nghiém (24-28°C). Néu 1a tim bong phai gitt trong méi trudng van chuyén (bao quan). Cé thé gitt 6 nhiét 46 4-8° C t6i da 24 h trong méi trudng van chuyén, 4.1.4. Céc bénh pham khéc: ma amidan, mi tai gitta, dich choc phdi 4.2. Quy trinh phan 1 4.2.1. True nhugm Gram hoe Papanicolaou quan sat hinh thé va danh gid sé long cac té bao viém (bach edu da nhan trung tinh, dai thyc bao) va vi khuan 6 trong va ngoai té bao theo +, +4, +++. Dém té bao: trén 25 bach cau da nhan va duéi 25 té bao biéu m6 (trén ting sé 100 té bao 6 vi trudng) c6 nhiéu kha ning do nhiém vi khudn, 4.2.2. Nudi cdy va phan lap: tay theo timg loai bénh phim dé cé cdc cach xir ly va nuéi cdy phi hop. Bénh phim duéng ho hdp: néu dae can lam léng dim hode dich duéng hé hép bing N-Acetyl-L- Cystine hoe sputolysin, Nén pha lodng bénh phém it nhat 10 lin trong nuée mudi sinh Iy trade Khi ely. Dich néo tiy: cdy song song vita lén méi trudng thgch s6c6la (thach mau chin) vira vio canh thang ting sinh choH. influenzae (Trypticasein soya with 5% Fildes Enrichment) dé néu vi khudn khé moe trén méi trudng thach sé cdy chuyén tiép tir canh thang ting sinh sang thach s6c6la vio cdc ngay 2, 3 va 7. Sau 7 ngiy, néu vi khudn khéng moc méi duge huy bd mau nudi cdy. Mu : duge cdy trong canh thang ké trén, theo doi hang ngay néu duong tinh sé duge cdy chuyén ra mii trudmg thach sdcéla va thach mau dé phan lap tiép Dé cé thé phan lap duge ca cée cin nguyén vi khudn khde ngoai H. influenzae, c6 4 logi méi trudng duge str dung: - Thach méu: tim lién cau, ty cau khuan, Moraxella, m6t sé true khuan Gram am. - Thach Mc Conkey: tim vi khuan dung ruét gay bénh duréng hé hap - Thach sécéla c6 hodc khéng c6 300g Bacitracin/Iml méi trudng (cé tac dung ite ché cdc vi khudn khdc) dé tim H. influenzae. = Thach méu thé tuoi 7%: ngoai céc loai vi khudn trén, phan lip duge ca H. influenzae. U 4m trong khi trudng 37° C c6 5% CO, tir 18 - 24 gid. Néu khéng c6 ti 4m CO, dit cée hop Iéng vao chuéng thiy tinh kin va dét 1 ngon nén, khi nén tit cting tao duge khi trrng cd CO, sau46 dat chung vao ti Am 37°C. Quan sat thay cdc khuan lac cita H. influenzae (nhé vong nhe, hoi trong, 6ng anh khi chiéu sing, khong gay tan huyét), cdy thuan lai trén mét dia thach séc6la khdc, i Am 37°C/5% COy/18 gid, ngay tigp theo lam thém cde thir nghiém sau dé khing dinh (néu chi thay thuan mét loai khuan lac thi khong cin cdy thudin ma cé thé kim luén cde bude khang dinh) 4.2.3. Thit nghigm xéc dink Lay m6t dia méi truong thach dinh dudng Trypticasein Soya, cdy vi khudn 71. influenzae lén bing cach ria day theo 3 hudng trén 1 nita dia méi trudmg, sau d6 dit céc khoanh gidy X, V va XV lén, khong cach gitta cdc khoanh gidy 1,5 - 2cm. U & 37°C qua dém, doc két qua duong tinh khi thy vi khuan chi moc quanh khoanh gidy XV hode chi mge gitia 2 khoanh X va V (cé thé hoi Igch vé pha X vi V khuéch tan nhanh hon) do vi khuan can ca 2 yéu t6 trong qué trinh phat trién. Néu vi khuan chi mgc quanh khoanh gidy X la H. aphrophilus. Néu chi mgc quanh khoanh gidy V la H. parainfluenzae. Néu chi moc quanh X va V nhung ¢6 vong tan huyét (trén méi truéng thach sécéla) 1a H. hemolyticus. Thit nghigm nay c6 thé thay thé bing thir nghiém "vé tinh” bang viéc sir dung ching ty cdu ving ey trén,méi truéng thach mau (ty cdu ving c6 kha ning sinh ra yéu t6 V trong qué trinh phat trién), khi thay vi khuan moc quanh duéng vang la dong tinh, nhung phai chi ¥ cay m6t dia thach thudng Lim chimg am, Thi nghiém porphyrin: nhim muc xe dinh chinh xac nhu cau can yéu t6 X cia vi khuan (loai bé céc truéng hop yéu t X cé thé c6 tir méi truéng nudi cay ban dau hoje cde méi truéng diing trong thir nghiém da bj nhiém yéu td X tir trade hod vi khudn c6 kha nang tong hop yéu t6 X). Lay 0,5ml @-aminolevulinic axit (2mM d-aminolevulinic axit hydrochloride-Sigma va 0,8 mM. MgSO, trong 0,1M dém PBS pH. 6,9 gitt 6 4°C) vao trong 1 éng nghiém v6 khudn, cdy mét ang day vi khuan vio, 0 37°C /4 — 24 gig, doc két qua duéi kinh hién vi huynh quang, duong tinh khi ao vi Khudn hoe huyén dich 6 mau dé. Bang céch khéc, nhé 0,5ml thude thir Kovac, ‘manh va ché dén khi huyén dich phan téch thanh cée Isp, duong tinh khi thay lop nude 6 thap chuyén mau dé hay héng (chimg t6 sy c6 mat cha porphobilinogen), Xéc dinh typ sinh hoc cita 11 influenzae: Cé thé thyc hién phan tmg nay bang cdc thuéc thi, khoanh gidy hose 9 APT 108. Vige dinh typ sinh hoc cla H. influenzaeduge dya trén co sé 3 phan img sinh hod chi yéu li ODC, URE, IND ODC: phat hign hoat tinh ciia Omithine decarboxylase: 46 (+) URE: phat hign hoat tinh ciia urease: 46 (+) IND: phat hign sy san xuat indole: do (+) * K3 thudt xéc dink bing cde thude thie ODC, Ure va Indole tw pha Idy: Sau khi da c6 cic ching vi khuan thuan khiet, ding 1 pipet Pasteur bé cong dau git vi Khun (18 gig nudi edy) hoa déu vio Iml canh thang BHI hay nuéc pepton, tir canh khudn nay cAy vao cée éng thir sinh hoa ODC (Omithine decarboxylase), URE (Urease) va IND (Indole), 1 37°C/5%CO, qua dém, doc két qua duong tinh khi thay chuyén mau, truée khi doc Indole nhé thuéc thir Kovac. * Kj thudt xdc dinh typ sinh hoc bang bé kit API 10S: Tao canh khudn trong Iml nude mudi sinh ly 6 46 duc khoang 1-2 46 due Me Faland, tao hop dm bang nhé vai git nuéc sach, nhé diy canh khudn vio héc ODC (phat hign vige sin xuat Omithine Decarboxylase), URE (phat hign su thuy phan Urea), IND (pI an xuit indole). Phu parafin lén bé mat ODC va URE, t qua dém 37°C/ $% CO. Doc két qua duong tinh néu thaychuyén mau dé 6 ODC va URE, nhé I giot thudc thir Kovac vao IND, néu chuyén mau dé cing 1a duong tinh Bang 2. Céc typ sinh hge ca H. influenzae : Typ sinh hge opc URE IND I + + + 0 : + + m1 : + : Vv + + : v + - + VI + - - Vil - - VuL = - - ‘Typ sinh hge eta H. influenzae thueng lién quan nhiéu dén nguén géc bénh pham. B influenzae gay bénh nhigm khuan xdm lan (viém ming nao, nhiém_ khu: influenzae typ b) thuée typ sinh hgc 1 (Mj, Bac Au) va typ sinh hoc II (Bae Vigt nam). Typ IV thuong gay nhiém rie sinh duc. Xéec dinh » vét thanh cia /7. influenzae: ngoai typ sinh hoc, H. influenzae 6 v6 con duge phan thanh 6 typ ne thanh khéc nhau tiy theo dic tinh khang nguyén cia vé polysaccarit, dénh dau tira dén f. 85- 90% loai H. influenzae c6 v6 gay nhiém khuan nghiém trong thude typ huyét thanh b. _* Vét ligu: Khing huyét thanh khdng influenzae a da gid, a, b, ¢, d, ¢, & dung dich formalin dé bat hoat vi Khuan (0,5% trong nuée mudi sinh 1); ong nghigm sach, lam kinh sach, dng hit. * Cach lam: lay 1 ng nghiém chita 0,5ml Formalin 0,5%, hoa vao 1 ang day vi Khuan tao thinh huyén dich, nhé 1 gigt huyén dich vi khudn Ién lam kinh va 1 gigt khang huyét thanh da gid, tron déu bing céch lic nhe phién kinh va quan st ngay sy ngung két bang mit thudng. Phan img duong tinh Khi thay xuat hig phan img ngung két véi cdc typ huyé é c typ huyét thanh eiia vi khuan, Néu kh6ng thay hign tugng ngung két véi khing huyét thanh da nghit vi khudn thuéc loai khéng dinh duge typ huyét thanh, do 46 kh6ng can thyc hign phan img v typ huyét thanh con lai (da gid c6é nghia la bao gém tat ca 6 typ huyét thanh don tir a dén f), 5. Cac tigu chudn xe dinh I. influenzae - Lacdu trye khudn nhé manh da dang, bit mau Gram am, khuan lac trong x4m nhe, ong anh khi chiéu sang, khong gay tan huyét, = Phat trién thudn nbdt trén moi truéng chon Igc (thach sécéla c6 Bacitracin). = Phat trién duoc can c6 dit yéu t6 X va V = Dinh typ sinh hge véi cae phan img sinh héa: ODC, URE va IND - Dinh typ huyét thanh: ede ching gay bénh hau hét thuée typ b (néu digu kign khéng c6 khéng huyét thanh dc higu, khdng di héi phai xdc dinh tiéu chudn nay)6. Tai ligu tham khao 1, Hoang Thay Long. Haemophilus influenzae. KY thudt Xét nghigm Vi sinh vat Y hoc. Nha XBVH, 1991, 60-66, 2. Keizo Matsumoto and Tsuyoshi Nagatake. Identification of Haemophilus influenzae. Clinical Microbiology of Respiratory Infections. Nagasaki University, 1994, 31-32 3. Mogens Kilian. Haemophilus. Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, 1991. 463-469 4, World Health Organization, identification of Haemophilus influenzae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by N. meningitidis, S. pneumoniae and H. influenzae. 1999. 27-30