articulos PRODUCCION RECUPERACION Y PURIFICACION PARCIAL DE ANTIBIOTICOS PRODUCIDOS POR Pleurotus ostreatus. ESCALAMIENTO A 10 LITROS Isbelia J. onesies: Universidad de los Andes. Facultad de Farmacia. Departamento de Ciencia de los Alimentos. Mérida- Venezuela isbelia@yahoo.com PALABRAS CLAVES. Hongo, antibistico, Pleuratns, fermentacisn. RESUMEN, En Venezuela no se produce ningin antibiotico. La facilidad de importacion y los intereses de los grandes monopolios Farmacéuticos son Tas causas fundamentales| de nuestra dependencia, Ademds de este problema existe la necesidad de descubrir y —probar otros ‘microorganismos productores de antibiéticos en vista de la resistencia cada ver mayor de las bacterias a los fagentes antibacterianos conveneionales, El hongo comestible Pleurotos ostreatus es capaz de crecer en) cualquier substrato y tiene la capacidad de producir antibidticas. Se realizé wn estudio a nivel de matraces en medio nutritive (M-200) y luego se escal6 a 10 litros. Cada preinéculo se enriquecié con sulfato de amonio al 10:1 % y fosfato de amonio al 0.2%, ajustando el pHa 5.5 con aireacion y agitacién. Se esteriliz6 a 121 ° C durante 20 min, Se tomaron muestras cada 2 horas para determinar el crecimiento celular por peso seco. y produccién de antibiético mediante el método de difusin en agar, utilizando mieroorganismos de prueba Gram-positivos y Gram-negativos. Se encontraron halos de inhibicién para C. glutamicum, E. colty S. aureus s partir del tercer dia de crecimiento, teniéndose una mayor produccién entre el sexto y séptimo dia. Estos resultados demostraron que Pleurotos ostreatus es \in productor de antibiéticos de amplio espectro, por ello justtica purificar y caracterizar el antibiético producide. KEY WORDS. fermentation, Mushroom, antibiotic, Plewrotus, ABSTRACT There is no commercial antibiotic production in ‘Venezuela, Importation facilities and pharmaceutics monopoly are fundamental causes of our dependence on. exportations. It is necessary to discover, through research and development, new antibiotic producing ‘microorganisms due to the increasing resistance generated towards conventional trade antibacterial agents, In this work, we optimized a culture medium for Pleurotos ostreatus and produced a new antibiotic increasing the fermentation volume to 10 litters. We also studied the scale validity. ‘The edible mushroom Pleurotos ostreatus is able to grow in any substrate and is an antibiotic producer. We started a 1 L M-200 calture medium study and scaled to 10 L. Starters were cultured in aineated and shaking enriched media itoclaved 121°C x 90 min, 0.1 % ammonium sulphate the pH to 5.5 in a continuous aeration and shaking process. We took and 02 % ammonium phosphate, adjust samples out every 24h to measure dry weight cell growth and antibiotic production, testing and searehing, the degree of sensibility for Gram-positive and Gram negative microorganisms. We found inhibition halos for C. glutamicum, E. coll and 8. aureus since the third day, with an increase in its size during the sixth and seventh day of culture. These results demonstrated that Pleurotus ostreatus produces an antibiotic of wide spectrum; therefore, we suggest its further purification and characterization,INTRODUCCION La histor de la quimioterapia est mareada por tres claros perfodos, en el primero, que es muy antiguo, las dinieas sustancias eapaces de eurar una infeecién por accién sistémica eran Ios productos de plantas naturales: Ja segunda fue la era de la sintesis, y en la tercera volvemos a los productos naturales, aunque de fuentes de un orden muy inferior: los hongos y las bacterias| capaces de formar antibiéticns (Garrod y col, 1985). El descubrimiento de la Penicilina por Fleming, maroé la cra de los antibiéticos, cuyo progreso imaginado esta todavia en marcha. En la actualidad se conocen mas de 6.000 sustancias con actividad antibistiea, produciéndose por fermentacién industrial aproximadamente unos 100 tipos de estas sustancias. Los antibiéticos. més ampliamente comercializados son los B lncté cefalosporinas). Los cos (penicilinas antibidticos se utiliza principalmente como agentes antimierobianos en a terapia de enfermedades infecciosas humanas, aunque también tienen otras aplicaciones, por ejemplo, como agentes citotéxicos frente a ciertas tumores, en medicina veterinaria y en patologia vegetal, como conservadores alimentarios y como estimulantes del crecimiento de los ‘animales. Los antbisticos se consideran metabolites secundarios, porque son productos microhianos no relacionados con el erecimiento de los microorganisms, © sea, no son determinantes en Ia economfa del orgenismo, Los metabolitos secundarios también han sido denominados ideolitos ya que son ellos son producidos principalmente durante la ideofase (Hettina, 1953), Las bacterias son organismos que poseen un alta capacidad de adaptacion y un poder précticamente ilimitado se sobrevivencia ante circunstancias adversas (Condoit y Levin, 1991), Prueba de ello es el fendmeno de Ia resistencia bacteriana a los agentes antimicrobianos el eval ha sido considerate como una inevitable respuesta genética a la presiGn selectiva que ha ejercido 1 uso indiscriminado de los antibisticos (Acar, 1997). El hongo Pleurotus ostreatus tiene la ventaja de erecer répidamente y se sabe de su carencia de toxicidad. Es un hhongo comestible cominmente conocido como hongo stra”, Pertenece a la clase Basidiomicetes y es uno de los hongos de pudricién blanca més efectivos en la degradacién de la lignina (Martinez, 1984), — articulos MATERIALES ¥ METODOS Microorganismos utilizados sensibles a antibiotic. Corynebacterium glutamicum ATCC 19058) Staphylococcus aureus ATCC 2502s Excherichia coli MM 585, Enterococcus fecalis ATCC 062 Pseudomonas aeruginosa ATCC O59. Productor de antibiéticos Pleurotus ostreatus ATCC 82783, Medios de eultivo. Medio rico para crecimiento, conservacién y almacenamiento de hongos (M-200) Medio de Mueller-Hinton para deteotar inbibicién smicrobiana, Crecimiento micclial de Pleurotus osereatus Sobre una placa estéril que contenta medio M- 200, se sembré desde la cuna donde erecia P. ostreatus, Se colocaron tres eubreobjetos en forma inclinada insertada en el agar de las plact 80° C, durante 7 dias, y se observé al microscopio el crecimiento micelil de Petri, se incubaron a Fermentacién en medio nutritive. Un litro de medio M-200, se inoculé directamente desde un matraz de 100 ml donde erecié P. ostreatus, se ajusté el pH del medio a 5.5 y el eultivo se repartié en 10 matraces de 260 ml conteniendo 100 mi del medio cada Juno, Se incubaron a $0" C y 180 rpm de agitecién, durante 7 dias. Se retiré un matraz cada 24 horas para medir crecimiento celular, pH y actividad antibacteriana Fermentacién a escala de 10 Litros. Fermentador LKB. Bajo las mismas condiciones de crecimiento para temperature, pH y agitacién, aplicado # nivel de matraces, y con aireacin de 1.5 vym, se monté la fermentacién en el fermentador LKB con capacidad de 10 Tivos en medio de nutritive para estudiar la produceién del antibiéticn por P. ostreacus. Cada 2 horas se tomaron muestras de 250 ml para determinar Tecnologia Vol. 9 No.3 7crecimiento, pH y actividad inhibitoria sobre cepas sensibles. Determinacién de erec niento celular por peso seco. Se inocularon desde la cuna donde crecié P. ‘ostreatns 10 matraces de 260 mil de medio M-200. Cad ia se retiré tun matraz, se filtré sobre papel de filtro Whatman N* 1, previamente pesado y se secé es una estufa a 80° C por 24 horas, se enfri6 en un desecador nego se pes6 el residuo hasta llegar a peso constante. El peso se obtuvo por diferencia. (AOAC, 1986), Determinacién de axticares reductores (glucosa) por el método de Millar. Se pesiron 9.0 g de acido 95 DNS y se disolvieron con 75 g de tartrato de sodio y potasio en 50 tml de hidréxido de sodio & M. La mezcla se diluyé hasta 250 ml con agua destilada, Se tomé 0.1 ml de muestra/Standard/blanco y se mezelé con 1 ml del reactivo DNS. Se calent6 en Baflo de Marfa durante 10 ‘min, se enfrié a temperatura ambiente y se procedié a la Ieetura a 670 nm (Chaplin and Kennedy, 1987). Medida de la actividad del antibistico. La actividad del antibiético se determiné por 1 método de Bauer-Kirby. Se tomé un matraz cada 24 horas, se centrifiyg6 y al sobrenadante se le determin6 la actividad de Ia siguiente manera; En un tubo ‘conteniendo 3 ml de solucién salina estérl se preparé el indculo con cada cepa a ensayar, comparanda Ta tushider con el patrén N° 0.5 de Me 8 10" UFC, ideal para pruebas de sensibilidad a los 4 placa de medio Mueller Hinton, se sembraron con las cepas seleecionadas, luego se colocaron discos estériles embebidos en el land, que es equivalente antibiéticos. Laego en u sobrenadante, previo a Ia extraccién, en el extracto butandlico y en el extracto acuoso, Se incubaron a 30°C durante 24 horas y se observaron los halos de inhibicién (Bauer y col, 1966). Purificacién parcial del inhibidor bacteriano producido por P. oscreatus, ‘A los sobrenadantes de Ia centrifigacién, se les realiz6 una primera extraccién con eloruro de metileno y se obtuvo una fase acuosa con compuestos polares ¥ 8 3 tna fase eon cloruro de metileno y compuestos apolares ‘A ln fase acuosa se le realizé una segunda extraccién con mbutanol y se obtuva una fase con compuestos polares y péptidos y otra con compuestos apolares con n-butanol, En una primera fase se eterminé Ta solubilidad de Ta fase activa en diferentes solventes: n-butanol, agua y cloruro de metileno. 10 ml del sobrenadante de la centrifugacidn fue agregado al embudo de decantacién con 10 ml del solvente, se agito fuertemente durante 10 min, y se dejé reposar el misino tiempo. Se utilizé el n-butanol como solvente para realizar las extracciones segrin el método de Salas (1993). Después de cada extraccion y una ver separadas Ins fases orginieas y acuosas, se recolectaron y separaron ccuidadosamente. Se midié el pH con tiras de papel tomasol para observar la presencia de compuestos Aeidos, bésicos © neutros. La fase orgénica y acuosn se concentraron en un ratavapor hasta una concentracién 10:1, Se utilizaron os siguientes controles: a) sobrenadante del eultivo sin extraccién, b) sobrenadante del eultivo después de Ia extraceién, ©) extracto neHoso, 4) extracto butandlico y ©) n-butanol empleado en la cextraccién. Los controles y las fases acuosay orgénica fueron ensayados contra las cepas de referencia siguiendo la técnica de disco. RESULTADOS Y DISCUSION Crecimiento micelial de Preurorus oscreacus. Originalmente se eavo la dificulead para hacer cerecer el microorganismo en el medio infusion de salvado de arroz, por lo que se decidé estudiar al rmieroscopio los. tipos de micelio. involuerades para seleccionar aquel que produjera biomasa en cl menor tiempo, bajo nuestras condiciones experimentales, Pleurotus ostreatus pervenece la divisién de Ios Basidiomicetes, lo que quiere decir que posee células especiales que llevan basidiosporas en niimero de cuatro, dispuestas sobre cuatro pedsinculos. Los basidiomicetos son los hongos més evolucionados, producen Tos cuerpos fruetiferos mas grandes y desarrollados y son los Iamados hongos de sombrerito; alli se forma un gran namero de esporas (Bittara, 1989). El thicelio de Pleurotus ostreatus pasa por tres estadlos distintos de desarrollo para completar su cielo normal de vida: elrimario. monocariético, el segundo dicariético y el tereiario representado por los tejides especializados que ‘se originan para formar el cuerpo fructifere. El micelio primario se desarrolla generalmente a partir de la ‘germinacién de le basidiospora. Al principio puede ser ‘multinucleado, ya que el nticleo © los niicleos de la basidiospora se dividen muchas veces a medida que tubo germinative emerge de la espora y con crecer. La fase multinucleada del micelio es corta porque pronto se forman los tabiques que dividen al micelio en células uninuclesdas. E! micelio secundario se origins del ‘micelio primario. Sus eélulas son _tipicamente binucleadas. El estado binucleado comienza cuando se fusionan los protoplasmas de dos células uninucleadas, Ia ‘élula binueleada que asf se forma produce una rama a la cual migra el par celular. Los dos niicleos se dividen conjugadamente y los niicleos hermanos se distribuyen | fen Iqas dos eélulas hijas para iniciar ast el micelio binuclear. El micelio terciario est representado por los tejidos especializados que se originan para formar los esporéforos de los basidiomicetos superiores, Los esporéforos se originan seeundario forma tejidos complejos. La observacién del 1micelio erecido en cada una de las fases nos permiti6 calmente cuando el micelio realizar cultivos en medio nutritivos, Los resultados nos permiten concluir que es necesario que el hongo se tencuentre en el estadio secundario para lograr un mayor crecimiento y actividad del hongo. Si el desarrollo imicelial estéi en el estado primario o terciario no hay Fermentacién en Matraces. Medio salvado de arror, Se realizaron unos primeros ensayos utilizando medio salvado de arroz, segéin la metodologia utilizada por Di Donna y Sanchez (1994). Se montaron varias fermentaciones a nivel de matraces y Pleuroros ostreatus no crecié en este medio, una de Ia causas pudo ser Ia gelatinizacién por los restos de almidén cuando se esteriliz6 el medio, Cuando los grénulos de almidén se exponen al mismo tiempo al calor y a la humedad, hay luna gelatinizacion por encima de los 64°C, los gréinulos se hinchan, debide a una adsorcién de agua por los grupos polares hidroxilo. En ese momento la viscosidiad de Ia suspension del almidén—aumenta considerablemente, porque los grénlos hinchados se adhieren los unos los otros. Si se prolonga el tratamiento hidrotérmico, puede surgir una ruptura de los grémulos, hidrélisis parcial y disolucién més © menos completa de las moléculas constituyentes, lo que origina n descenso de la viseosidad cuando se enfita ripidamente © se dejan en reposo soluciones poco sntradas, ocurre lo que se conoce como retrogradacién. Hay un reordenan y wuelve a su condicién menos soluble (Cheftel, 1976). Otra causa pudo ser el tempo y las condiciones de almacenamiento del salvado. No obstante ereemos que la jento de las moléculas seleecin del inseulo no fue realizado con el micetio en su estado seeundario. Esto explicarfa un poco el porque el hongo no crecié en este medio, Fermentacién en matraces. Medio nutritiva, En vista de los problemas de erecimiento surgiddos con el extracto de salvado de arroz, decidimos repetir los experimentos en medio nutritivo M-200, Se observé el crecimiento de Pleurotus ostreatus cada dia. En el {grafico N° 1, podemos observar los resultados obtenidos para P, ostreatus en relacién con el incremento de biomasa, pH y produecién de antibistico, Los valores de pH se mantienen constantes durante las primeras 24 horas, luego, a partir de las 48 horas se observa vm ligero descenso del pH. Las moléeulas que se encuentran en la periferia de Ta membrana celular son protegidas contra pil extremos (écidos o bases), por Jo tanto es importante para un microorganismo tener un sistema regulatorio para detectar el pH ambiental y asegurar la sintesis apropiada de moléculas destinadas a la localizacién fuera de 1a membrana celular (Guillen y Evans, 1993). Se ‘observa un mayor crecimiento celular entre el $° y 4° dia y una mayor produccién del antibiético @ partir del 6° dia, cuando inieia la fase estacionariaFermentacién a Escala de 10 Litros. Medi M-200. De acuerdo a los resultados obtenidos en matraces, se realizaron varias fermentaciones en un fermentador LKB. con capacidad de 10 litros. En el gréfico N° 2 se observa que el pH en las primeras horas se mantiene casi constante y a partir del tercer dia disminuye lentamente, ‘4 medida que la fermentacién transcurre. Las moléculas ‘que se encuentran en Ia periferia de la membrane celular, son protegidas contra pH extremes (cides © basicos), por lo tanto es importante para un microorganismo tener un sistema regulatorio para detecter el pH ambiental y asegurar Ia sintesis apropiada de moléculas ddestinadas a Is localizacién fuera de Ia membrana celular (Brite y Demain, 1979). El comportamiento del crecimiento celular medido por peso seco y Ia produccién del antibiétice por Pleurocus ostreatus siguen una Cinética parecida a la obtenida en matraces, esto nos demuestra la validacién del esealamiento. En el grifieo N° 3, podemos observar Ia relacién cexistente entre crecimiento, consumo de azicar y produccién de antibiético por Pleurotus ostreatue en el fermentador de 10 litros. El aztcar es consumido totalmente cuando comienza la fase estacionaria. Por otra parte Ia produecién del antibiético ocurre, desde la tmitad de la fase exponencial y continua durante la fase ‘estacionaria. El peso de la biomasa disminuye alrededor del 20 % a partir de las 144 horas. Suponemos que se inicié una isis del micelio causada por factores no definides, pero en todo €aso, esa lisis no incrementa el contenido de antibiético en el medio exterior. Esto confirma que el antibi6tico es un metabolito extracelular que el hongo sintetiza y expulsa desde el citoplasma. Por 10 BioT articulos cesta razén los antibiéticos se denominan metabolitos secundarios 0 ideolitos porque son excretados al medio cen Ia ideofase (Bettina, 1989). La actividad antibacteriana cen los sobrenadantes de los cultives, medida como halos de inhibicién para diferentes cepas sensibles Gram positivas y Gram negativas, se inicia a partir de las 72 horas. 8 de esperar que la sustancia activa se sintetice a partir del 9° dia, El agente antibacteriano aleanza su ‘miéxima concentracién a las 14 horas, en la mitad de la fase estacionaria, Purifieacién parcial del antibiético producide por Pleurotus ostreatus ‘La solublided del agente antibacteriano fue festudiada con diferentes solventes. La sustancia| ‘exeretada en el sobrenadante de crecimiento es soluble ‘en agua y en n-butanol, pero insoluble en cloruro de metileno. El n-butanol se seleecioné para la extraccién del agente antibacteriano por ser el solvente universal cempleado en el aislamiento de algunos antibistieos. Se habla de una purifcacién parcial porque los sistemas desolventes varfan de acuerdo a su polaridad, haciendo diferente la separacion de cada une de los componentes, se logré separar Ia fraccién activa del butandlico y se detects activi ensayadas. con tas cepas Efecto del Antibiético producide por Pleurotus ostreatus sobre el crecimiento de bacterias sensibles. Los resultados mostraron Ia existencia de halos de inhibicién para C glucamicum, $. aureus y E. faecalis. El tamato de los halos varié de acuerdo con la copa de referencia. La cepa de € glutamioum mostr et mayor tamano del halo de inhibicién, seguida por E. faecalis y S. aureus. La explicacién del porqué el mayor grado de actividad se encuentra contra las bacterias Gram positivas y mis bajo para las Gram negatives se debe a la complejidad estructural de la pared celular de este segundo grupo de mieroorganismos, que tiene una capa externa de lipopolisacéridos, constituida por una bicapa lipidica, polisacéridos y proteinas. Esta membrana es permeable a pequetias moléculas, funeién que realizan unas proteinas ubicadas a lo largo de esta estructura Namadas porinas, las cuales han sido senialadas como una de las posibles causas de la resistencia a antibidticas, al parecer cierran el paso a estos compuestos evitando que sean captados por Ia oélula bacteriana (Brown y col, 1989), Como podemos observar en la Tabla 1, PF estreatus causa inhibicién 2 un grupo importante de bacterias, sin embargo este hongo ha sido pobremente estudiado como productor de antibiético y esto demuestra la poea bibliograffa existente. Hasta ahora se hha prestado poca atencién al estudio de las cepas de P. osereatus de origen tropical, ya que mayor énfasis se ha puesto en aquetlas originarias de Europa y Estados Unidos, por haberse desarrollado y optimizado la técnica de su cultivo en tales regiones, por su capacidad de egradar la lignina (Martinez, 1984). Un trabajo de Kluge y col (1952) mostré produccién del éeido 6 amino penicilinico en cultivos inmovilizados de P. oxtratus. La sensibilidad de estos mnicroorganismos se realiz6 tanto en Ta fase acuosa como en Ta butanliea, TABLAT Actividad del Antibidtico Producido por Pleurotus oscreatus sobre Microorganismos de prueba Crtutamicum | B:coli_| & faecalis |S aurew | P.seruginoss ‘Sabrenadant= A + - = + - ‘Sobrenadant + a 2 > : ‘Sobrenadante = : : + = ‘Sabrenadante = S $ F = ‘Sobrenadante = 7 = + = ‘Sobrenadante * > + + = Fase acuose = + + + z Fase + + + + = butanélica Butanol = + = + We Sobrenadante de Ta fase acuosa, deTa fase butandlica, sobrenadantes del 3° dia al Fala y butanol BioTeeno! gia Vol.9 No. ayCONCLUSIONES EL hongo comestible P astreatus es poco lexigente en cuanto a las condiciones de crecimiento, tiene la facilidad de degradar material lignocelulésieo y carece de toxieidad, por lo que hace ficil sw ‘manipulacién, iene Ia capacidad de producir y exeretar al ‘medio antibidtico de amplio espectro, ya actiia sobre microorganisinos Gram positives y Gram negatives. BI antibistico se detecta cuando el organisme productor aleanra 1 fipal de la fase logaritmica de crecimiento, por eso es un metabolite seeundario. Las caracteristicas de su crecimiento micelia, demuestra que es necesario que el hongo se encuentre en estado secundario para su mejor crecimiento y produceién. Existe poca referencia bibliogréfica sobre el estudio de P, ostrestus como organismo productor de antibiético, lo que difieulta un estudio comparative, sin ‘embargo se encontraron resultados satisfuctorios para tmicroorganismos importantes desde el punto de vista elipico. RECOMENDACIONES Ampliar el nsimero de microorganismos sensibles para la prueba de actividad antibacteriana, haciendo mayor énfasis en mieroorganismos patégenos. ‘Completar Ia investigacién para purificar totalmente el ‘antibidtico, caracterizarlo y hacer Tos estudios de toxicidad e inocuidad en animales de laboratorio, AGRADECIMIENTOS AI Dr, José A. Séncher Crispin (+3) mi maestro y guia fundamental, siempre le estaré agradecida. Al Laboratorio de Fermentaciones de la Facultad de Giencias ya la Facultad de Farmacia de la Universidad de los Andes, 12 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ‘Acar, LF. (1977). Consequences of bacterial resistance to antibiotics in medical practice. J. Clin. Infect. Dis. ‘24 (Suppl 1) :S17-S18, A.O.A.C. (1984). Methods of Analysis, Association of Official Analytical Chemist. Fourtteenth Arlington, Virginia, dition Bauer, A. W; Kirby, Ws Sherris, J. € and Turuk, M. (1996). Antibiotic susceptibility testing by @ standardized single disle method. Am, J. Clin, Pathol 45: p. 195-497. Bettina, V. (1983). ‘The Chemistry and Biology of Antibioties, Editorial Elsevier Scientifics Publishing, ‘Company, Oxford. New York. Bittara, G. 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