Nucleic Acid Technique:

Metode dalam
Diagnostik Molekuler
Marissa Arifin, M.Kes
Farmasi 2015

Diagnostik Molekuler
Deteksi dan/atau analisis molekul asam
nukleat (DNA atau RNA) untuk
memberikan informasi klinis.
(John Brunstein, Medical Laboratory Observer, 2012)

MDx
Deteksi
Patogen

Pemeriksaan
Genetik

Asam Nukleat

6 m = 6000 nm

2,5 nm

Apa yang bisa ditawarkan oleh

pemeriksaan DNA/RNA?
Bagaimana kita bisa mendeteksi
DNA/RNA?
Metode apa saja yang bisa digunakan?

Sensitivitas, Spesifisitas
Amplifikasi / Perbanyakan

Metode dalam MDx

Reverse
Transcription PCR

PCR Melting /
HRM

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Real Time PCR

PCR - Sequencing

Nucleic Acid Sequence Based

Amplification (NASBA)

PCR - RFLP

Multiplex PCR

Nested PCR

Metode dalam MDx

Branched DNA (bDNA)

Hybrid Capture

Metode dalam MDx - Prodia

PCR

Reverse
Transcription PCR

Real Time PCR

Mutiplex PCR

PCR - RFLP

PCR Sequencing

Nested PCR

Hybrid Capture

What is PCR?
Polymerase Chain Reaction
Menggunakan enzim Taq
Polymerase

Reaksi Berantai
(Chain)

Menggunakan perubahan suhu berulang-ulang

Melakukan perbanyakan kopi DNA dalam ukuran pendek
(100 10.000 bp).

Kary Mullis, the inventor of PCR, was

awarded the 1993 Nobel Prize in
Chemistry

Taq Polymerase
Buffer
MgCl2

Step 1: Denaturation
94/95 oC

Template
DNA

Step 1: Annealling
50 - 60 oC

Primer
Forward
and
Reverse

Step 1: Extension
72 oC

dNTPs
MgCl2

Primer Annealing

5 AGACTGATGACAGATAGAGGACCCTACGATACTGTTACAGATACGACCAGATC 3
3

TATGCTGC
TCTGACTACTGTCTATCTCCTGGGATGCTATGACAATGTCTATGCTGGTCTAG
5`
3`
3`
5` 5
GATGACA

PCR

Video PCR

PCR

Deteksi Hasil PCR

Run di elektrophoresis
menggunakan gel
agarose 2 %
10^6 copies

Baca di bawah sinar UV

+ ethidium bromide

Nested PCR

2 round of PCR

In 2nd round: the PCR product of
the 1st round PCR become the
DNA template

Increase sensitivity and specificity

Higher risk of contamination

Reverse Transcription PCR

PCR yang dilakukan jika target yang ingin
dideteksi berupa RNA.
Virus RNA (HCV, HIV, dll)
RNA manusia (mis. mRNA bcr-abl, dll)
RNA
Reverse Transcription
(Reverse Transcriptase)
DNA
PCR

Real Time PCR

+ intercalating dye (SYBR Green I, dll)

or
+probes (taqman probe, hybridization
probe, molecular beacon, dll)

Intercalating Dye

Amplification Curve  Ct value

Melting Curve  Tm

Amplification Curve
Siklus 1  2 kopi

Siklus 2  4 kopi

Siklus 25  10^6 kopi

Siklus 35  10^9 kopi

Ct/Cp value
Critical Threshold/Crossing Point

Real Time PCR  quantitative PCR (qPCR)

10^5
10^4
10^3
10^2 10^1

NTC

No.
1
2
3
4
5
6

Name
NTC
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5

Ct
35.11
31.72
27.75
24.51
21.20

Melting Curve
5 AGACTGATGACAGATAGAGGACCCTACGATACTGTTACAGATACGACCAGATC

TCTGACTACTGTCTATCTCCTGGGATGCTATGACAATGTCTATGCTGGTCTAG

5
TCTGACTACTGTCTATCTCCTGGGATGCTATGACAATGTCTATGCTGGTCTAG

Suhu 50 oC Suhu 60 oC

Suhu
82 oC
5

Suhu 90 oC

High Resolution Melting (HRM)

Profil Melting yang lebih detil

Bahkan perubahan satu basa, dapat dideteksi.

Menggunakan Dye tertentu (Evagreen, LC Green, Syto 9)

Memerlukan instrumen dengan software khusus (HRM
Software)

Difference Graph

Real Time PCR - Probes

5 AGACTGATGACAGATAGAGGACCCTACGATACTGTTACAGATACGACCAGATC 3
TCTGACTACTGTCTATCTCCTGGGATGCTATGACAATGTCTATGCTGGTCTAG

TaqMan
Probes

Hidrolysis Probes
Label: FAM, VIC, HEX, TET, dll
Quencher: BHQ, Tamra, dll

Taqman Probe

Sinyal dibaca di tahap Extension

Hybridization Probes
Donor: LC640, LC705, Cy5.5, dll

Akseptor: Fluorescein, dll

Hybridization Probes

Sinyal dibaca di tahap annealling

Mutiplex PCR
Dimungkinkan pada
end-point PCR jika
panjang amplicon PCR
berbeda, mis. 300 bp
dengan 100 bp

Dimungkinkan juga
pada Real Time PCR
dengan penggunaan
Probe

PCR - RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Menggunakan endonuclease yang dapat
memotong urutan DNA tertentu (spesifik), mis.
EcoRI  dapat memotong DNA dengan urutan 5' GAATTC 3
SmaI  dapat memotong DNA dengan urutan 5' GGGCCC 3

Digunakan untuk mendeteksi

polimorfisme/perubahan urutan basa
Perubahan 1 basa : GGGCCC  GGACCC

(wildtype)
(mutant)

PCR RFLP
Wild Type
5
3

GGGCCC
CCCGGG

wt

hm

ht

350 bp

5
Sma I

120 bp

230 bp

500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp

Mutant Homozygot
5
3

GGACCC
CCTGGG

350 bp
Sma I

120 bp

230 bp
30

Hybrid
Capture
HPV DNA

PCR - Sequencing
Sanger Sequencing  1st gen Sequencing
Fred Sanger, A two-nobel prize winner
Nobel kedua diperoleh atas sumbangsihnya
dalam penemuan metode untuk menentukan sequence DNA

Sequencing  menentukan urutan basa dalam sekuens target tertentu.

Sanger Sequencing

Jika ditambahkan
ddNTP  extention
berhenti

Questions?

 http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/
ab/applications-technologies/pharmabiotherapeutics/DNA_sequencing.swf

Methods in MDx
Pcr 

Reverse Transcription PCR

end point PCR
Real time PCR
Multiplex PCR
PCR RFLP
PCR hybridization

Sequencing
Hybrid capture
NASBA
Branched DNA

Reaksi Real Time PCR:

Primer forward, dan primer reverse
Taq polymerase (tahan panas)
dNTP (basa A, G, T, C
Buffer (Tris HCL, KCL)
MgCL2
Template DNA
Dye (SYBR Green I), atau
Probes

39