c


 
  c

Vietsciences- 
ng Văn Hͣp, Nguyʂn Lân ng 27/02/2007

½


 


 
(Polymerase Chain Reaction)

Viʄc nhân ADN cho phép làm tăng s͑ lưͣng gɢp hàng triʄu hoɴc nhiɾu
hơn nͯa đ͑i v͛i đoɞn ADN hay ARN nghiên cͩu. Có nhiɾu phương pháp khác
nhau đʀ phân tích ngu͓n ADN khuyɼch đɞi theo cách này. Phương pháp đơn
giɠn nhɢt là sͭ dͥng điʄn di đʀ xác đʈnh kích thư͛c sɠn phɦm cͧa phɠn ͩng
PCR. Có thʀ xác đʈnh đ͙ nhɞy và tính đɴc hiʄu cao hơn nɼu sɠn phɦm PCR
đưͣc lai v͛i mɨu dò đɴc hiʄu đã đưͣc đánh dɢu. Phương pháp đưa lɞi thông
tin nhiɾu nhɢt là xác đʈnh đưͣc trình tͱ ADN và ARN cͧa sɠn phɦm PCR. Viʄc
xác đʈnh đưͣc sai khác cͧa chu͗i ADN sɺ cho phép xác đʈnh và đʈnh typ
chính xác nhɢt các đ͑i tưͣng vi sinh vɪt nghiên cͩu. Kɼt quɠ xác đʈnh trình
tͱ ADN còn cho phép xác đʈnh m͑i liên hʄ tiɼn hoá và dʈch tʂ h͍c cͧa các
chͧng vi sinh vɪt.

2







 

Phɠn ͩng chu͗i PCR nhɮm khuyɼch đɞi ADN lɤn đɤu tiên đưͣc Saki
(1985) gi͛i thiʄu và đây đưͣc coi là m͙t trong nhͯng tiɼn b͙ khoa h͍c quan
tr͍ng nhɢt vɾ sinh h͍c trong thɪp kͷ 80. Phɠn ͩng PCR sͭ dͥng enzym chʈu
nhiʄt tɞo ra nhiɾu phiên bɠn theo hàm s͑ mũ. Có thʀ ví dͥ, chʆ cɤn 1 sͣi
ADN sau vài gi͝ có thʀ nhân lên 1011 phiên bɠn ADN tương đương v͛i 100 ng
ADN. Sau khi thͱc hiʄn phɠn ͩng PCR thì cɤn tiɼn hành m͙t s͑ k͹ thuɪt đʀ
xác đʈnh sɠn phɦm, đơn giɠn nhɢt là điʄn di và xác đʈnh kích thư͛c cͧa sɠn
phɦm PCR. Trong các nghiên cͩu chɦn đoán thì kɼt quɠ này rɢt có ý nghĩa,
nó chͩng t͏ sͱ có mɴt cͧa ADN đích trong mɨu nghiên cͩu. Có thʀ nhɪn
đưͣc tính đɴc hiʄu và đ͙ nhɞy cao hơn khi sͭ dͥng k͹ thuɪt RFLP v͛i sɠn
phɦm PCR hoɴc lai v͛i mɨu dò đɴc hiʄu. Tuy nhiên, thông tin đɤy đͧ nhɢt
vɨn là kɼt quɠ xác đʈnh trình tͱ ADN cͧa sɠn phɦm PCR.

Ngay tͫ khi đưͣc gi͛i thiʄu thì PCR đã đưͣc xem là phương pháp đưa
lɞi kɼt quɠ khá nhɞy trong viʄc xác đʈnh và phát hiʄn vi sinh vɪt. Tính ưu
viʄt cͧa nó thʀ hiʄn ͟ ch͗ có thʀ chʆ cɤn m͙t hɞt virus hay m͙t tɼ bào vi
khuɦn nào đó cũng đͧ cho phɠn ͩng xɠy ra và khuyɼch đɞi t͛i mͩc có thʀ
phát hiʄn đưͣc trong th͝i gian ngɬn. K͹ thuɪt PCR còn đưͣc dùng đʀ nhân
ADN tͫ khuôn RNA sau khi đã đưͣc chuyʀn thành cDNA sau phɠn ͩng phiên
mã ngưͣc (RT). Phương pháp này nhanh chóng đưͣc chú ý và tr͟ lên ph͕
biɼn cho các nghiên cͩu phát hiʄn vi khuɦn hay virus ͟ n͓ng đ͙ thɢp trong
các mɨu môi trư͝ng và bʄnh phɦm. Ví dͥ viʄc phát hiʄn mɨu máu nhiʂm
HIV có nghĩa là phát hiʄn phɤn nh͏ ADN cͧa virus trong hʄ gene ngư͝i có
kích thư͛c gɢp 100 000 lɤn. Mɴt khác khi dùng k͹ thuɪt miʂn dʈch v͛i kháng
thʀ thì phɠi cɤn t͛i 8 ngày m͛i có đáp ͩng miʂn dʈch trong máu, trong khi
đó v͛i k͹ thuɪt PCR thì toàn b͙ quy trình phát hiʄn chʆ mɢt vài gi͝ (đ͑i v͛i
ngu͓n ADN hay RNA). Lͣi thɼ cͧa k͹ thuɪt PCR đưͣc tɪn dͥng cho viʄc
chuɦn bʈ ADN làm mɨu dò v͛i s͑ lưͣng l͛n cho các phép lai ADN đã trình bày
͟ trên. Các mɨu dò có thʀ đưͣc đánh dɢu bɮng phóng xɞ hay phi phóng xɞ
khi tiɼn hành phɠn ͩng khuyɼch đɞi. Mɨu dò đánh dɢu v͛i k͹ thuɪt PCR có
ưu thɼ hơn các phương pháp đánh dɢu truyɾn th͑ng bɮng k͹ thuɪt t͕ng hͣp
các mɞch đͩt gãy (nick translation) hay đánh dɢu v͛i m͓i ngɨu nhiên (rADN
random primer labeling). Các ưu thɼ này có thʀ kʀ đɼn, cͥ thʀ như là cɤn
lưͣng nh͏ sͣi ADN khuôn, có thʀ tiɼn hành đánh dɢu v͛i các mɨu dò có kích
thư͛c ngɬn, chuɦn bʈ mɨu dò không cɤn tinh sɞch ADN khuôn. Bɠng 1.7.
dư͛i đây liʄt kê m͙t s͑ ví dͥ ͩng dͥng k͹ thuɪt PCR cho phát hiʄn nhiɾu đ͑i
tưͣng vi sinh vɪt khác nhau. Rɢt nhiɾu các kɼt quɠ nghiên cͩu như vɪy đưͣc
trình bày trong các tɞp chí chuyên ngành như: ành như: ành như: ành như:
¨
  C M  
 App  E   M  


‘ 
17 M͙ s͑    ͩ

k͹ 
 PCR  
xá đʈ  s 

Vi sinh vɪt Tài liʄu

Ñ



 Vokin et al (1992)

 
 


Houard et al (1989)

 
    Marconi ADN Garon (1992)

  

 Herman an Derider (1992)






Miyakawa et al (1992)



  spp Brook et al (1992)






Hayes et al (1992)


    Gumerlock et al (1991)


  Stein an Raoult (1992)

 
  
 Laxer et al (1991)

 
Gozlan et al (1991)

  
Henchal et al (1991)



 
Samoszuk (1991)

 


Bereswill etal (1992)


  
 Jackson (1992)



spp Simonet et al (1990)



 
spp Henson (1992)

 
   Claton et al (1992)



  
Okamoto et al (1992)


    Dawood et al (1992)

 
!"#
Claas et al (1992)
!$
 

Merien et al (1992)
%

spp
Niederhauser et al (1992)
%
 
 

Robertson et al (1991)
% 

Hackel et al (1990)
& 
  

Altamirano et al (1992)
& 
   


Maiden et al(1992)
'

 


Charlotte et al (1993)
(

 

McOmish et al (1993)
(
 

Barker et al (1992)
(
 
 

Olsson et al (1993)
( 



Yang et al (1991)
(  

Seal et al (1992a)
(






 Gage et al (1992)

) 

spp Taniguchi et al (1992)

)
 
Rahn et al (1992)

*

spp Murakami et al (1991)

*
  
spp Vanevan et al (1991)

+


 Grimprel et al (1991)

+ 

 Riley et al (1992)

+  




Breniere et al (1992)

+ 


$ Hill et al (1991)

"   
Nakajima et al (1992)

,


àau đây là nhͯng nét chung nhɢt cͧa k͹ thuɪt PCR:

©




 ½
 

+ Khái quát chung:

PCR là phương pháp dùng enzym khuyɼch đɞi ch͍n l͍c m͙t đoɞn ADN
theo luɪt s͑ mũ. Phɠn ͩng nhân gene đưͣc thͱc hiʄn v͛i enzym ADN chʈu
nhiʄt, hai m͓i t͕ng hͣp và 4 loɞi deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và
dTTP). M͗i m͙t chu kƒ phɠn ͩng nhân gene g͓m 3 bư͛c (xem hình vɺ minh
hoɞ): Bư͛c 1 là biɼn tính ADN, có tác dͥng tách hai sͣi đơn tͫ sͣi khuôn
xoɬn kép. Bư͛c 2 là bɬt cɴp hai m͓i vào hai sͣi đơn cͧa khuôn. Bư͛c 3 là
kéo dài chu͗i theo m͓i, chiɾu 5¶-3¶ v͛i quá trình trùng hͣp gɬn các dNTP d͍c
theo sͣi khuôn đʀ tɞo thành phiên bɠn m͛i theo nguyên tɬc b͕ sung. Tính
đɴc hiʄu cͧa phɠn ͩng đưͣc quy đʈnh b͟i m͓i và sͱ sao chép trͱc tiɼp theo
trình tͱ sͣi khuôn giͯa hai m͓i. Như vɪy, kɼt quɠ tɞo ra hàng triʄu phiên
bɠn sͣi khuôn trong vài gi͝.

M͓i cho phɠn ͩng là các đoɞn ADN có kích thư͛c 20-30 nucleotid đưͣc
thiɼt kɼ theo trình tͱ cͧa đoɞn gene cɤn khuyɼch đɞi dͱa theo dͯ liʄu có
sɲn. M͗i cɴp m͓i phɠi hoàn thành chͩc năng cͧa mình trong toàn b͙ phɠn
ͩng, tͩc là chúng phɠi bám đɴc hiʄu vào đúng vʈ trí riêng cho tͫng m͓i. S͟
dĩ như vɪy là do nɼu chúng không bám vào vʈ trí đɴc hiʄu thì không thʀ
khuyɼch đɞi đưͣc đoɞn gene đích. V͛i các gene có đ͙ bɠo thͧ cao như rADN
thì khi cɴp m͓i đưͣc thiɼt kɼ thì chúng có thʀ nhân đưͣc gene tͫ nhiɾu đ͑i
tưͣng. Ngưͣc lɞi, trong nhiɾu trư͝ng hͣp dùng m͓i không đɴc hiʄu thì có thʀ
nhân đưͣc các sɠn phɦm PCR không đɴc hiʄu. Tuy nhiên, cɠ hai kɼt quɠ trên
đɾu đưͣc dùng cho đʈnh typ vi sinh vɪt.

Thí nghiʄm phɠn ͩng PCR lɤn đɤu tiên dùng mɠnh Klenow cͧa enzym
ADN polymerase I tͫ E . Tuy nhiên, enzym này bʈ biɼn tính tɞi 94oC và
như vɪy cɤn phɠi b͕ sung enzym m͛i sau m͗i chu kƒ phɠn ͩng. Đɼn nay
quá trình này đã đưͣc cɠi thiʄn do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq =
Thermus aquaticus ) chʈu nhiʄt. Enzym này đưͣc tách ra tͫ vi khuɦn s͑ng ͟ su͑i
nư͛c nóng. T͑c đ͙ xúc tác cho phɠn ͩng cͧa enzym này rɢt nhanh, có thʀ
đɞt khoɠng 8000 bp/phút tɞi 755oC. Hoɞt tính enzym giɠm m͙t nͭa khi xͭ lý
tɞi 92.5oC trong 230 phút hoɴc 40 phút tɞi 95oC. Như vɪy khi dùng enzym
này thì không cɤn b͕ sung enzym m͛i sau m͗i chu kƒ phɠn ͩng.

Ž
!


"#
$


Bɢt kƒ m͙t phɠn ͩng PCR nào cũng bɬt đɤu bɮng viʄc tách ADN làm
sͣi khuôn. Nói chung, theo lý thuyɼt chʆ cɤn m͙t sͣi khuôn cũng đͧ cho
phɠn ͩng tɞo ra sɠn phɦm nhưng trong thͱc tɼ cɤn khoɠng 10-100 ng/phɠn
ͩng. Đôi khi chuɦn bʈ ADN theo phương pháp đơn giɠn không cɤn tinh sɞch
cũng phù hͣp cho phɠn ͩng PCR. Tuy nhiên, điɾu quan tr͍ng là tránh sͱ có
mɴt cͧa EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoɴc đʄm phosphat vì kɼt quɠ
sɺ làm giɠm Mg++ (do EDTA hoɴc tɞo thành mu͑i Mg3(PO4)2 khi nhiʄt đ͙
cao). Phɠn ͩng PCR có thʀ nhân đưͣc đoɞn gene dài 10 Kb nhưng trong thͱc
tɼ thư͝ng dùng đʀ nhân các đoɞn có kích thư͛c ngɬn hơn (<2 Kb). Có thʀ
tham khɠo các thông s͑ thành phɤn phɠn ͩng PCR trong bɠng dư͛i đây.

‘ 
1 T p p  ͩ
PCR


   

ADN khuôn 10-100 ng
dNTP (mӛi loҥi) 200 mM
 Mӗi xuôi 0.1 ± 1.0 mM
Mӗi ngưӧc 0.1 ± 1.0 mM
Taq polymerase 1U
KCL 50 mM
Tris HCL (pH 8.4) tҥi 25oC 10 mM
MgCl2 2.85 mM
Gelatin 100 mg/l
Nonidet-40 0.05%

S͑ chu kƒ cho phɠn ͩng tɞo sɠn phɦm đɴc hiʄu tͫ 20-30 chu kƒ. Điɾu
chú ý là các m͓i cho phɠn ͩng phɠi có nhiʄt đ͙ bɬt cɴp v͛i ADN đích gɤn
nhau, có trình tͱ không b͕ sung nhau đʀ tránh bɬt cɴp v͛i nhau. Trình tͱ
đɤu 3¶ cͧa các m͓i cũng phɠi khác v͛i trình tͱ vùng trung tâm cͧa sɠn phɦm
đʀ tránh tɞo thành hiʄn tưͣng kɶp tóc. Nói chung, ngày nay ngư͝i ta có thʀ
t͑i ưu hoá viʄc ch͍n m͓i nh͝ sͱ trͣ giúp cͧa các chương trình máy tính.

Đôi khi cũng xuɢt hiʄn hiʄn tưͣng nhân sɠn phɦm PCR không đɴc hiʄu,
điɾu này thư͝ng hay xuɢt hiʄn khi dùng các cɴp m͓i suy biɼn tͫ chu͗i acid
amin. Tuy nhiên trong hɤu hɼt các trư͝ng hͣp này thì viʄc thay đ͕i điɾu kiʄn
phɠn ͩng có thʀ hɞn chɼ đưͣc các sɠn phɦm không mong mu͑n. Các thành
phɤn như nhiʄt đ͙, n͓ng đ͙ Mg++ và enzym có ɠnh hư͟ng l͛n đɼn tính đɴc
hiʄu. Sͱ có mɴt cͧa nonidet-40 có tác dͥng tăng hiʄu suɢt cͧa phɠn ͩng.

Viʄc ͩng dͥng k͹ thuɪt RFLP v͛i sɠn phɦm PCR có thʀ là cách nhanh
chóng đʀ tìm sͱ khác biʄt đ͑i v͛i các gene khác nhau. V͛i cách này yêu cɤu
sɠn phɦm PCR phɠi sɞch và đ͓ng nhɢt. Theo cách này trình tͱ có thʀ đưͣc
thͱc hiʄn như sau: Sau khi điʄn di kiʀm tra đ͙ sɞch cͧa sɠn phɦm PCR, tiɼn
hành kɼt tͧa v͛i ethanol. Kɼt tͧa đưͣc hoà v͛i đʄm thích hͣp và sau đó
đưͣc xͭ lý v͛i enzym cɬt hɞn chɼ thích hͣp. Kiʀm tra kɼt quɠ thông thư͝ng
trên gel agarose, trong m͙t s͑ trư͝ng hͣp có thʀ trên gel polyacylamid đʀ
thu đưͣc đ͙ phân giɠi cao hơn. Chú ý rɮng thông thư͝ng hoɞt tính enzym
giɠm 5% sau m͗i chu kƒ nhiʄt. Như vɪy có thʀ ư͛c lưͣng 50% hiʄu quɠ
khuyɼch đɞi mɢt đi trong toàn b͙ quá trình phɠn ͩng.

+ M͙t s͑ khó khăn v͛i phɠn ͩng PCR:

PCR là k͹ thuɪt có ý nghĩa l͛n trong nghiên cͩu sinh h͍c phân tͭ
nhưng cũng nɠy sinh m͙t s͑ vɢn đɾ cɤn chú ý đɴc biʄt khi phát hiʄn m͙t
s͑ bʄnh virus hay vi khuɦn. Vɢn đɾ ͟ đây là acid nucleic cͧa cɠ tɼ bào
chɼt và tɼ bào s͑ng đɾu cho kɼt quɠ dương tính trong phɠn ͩng PCR.
Phɠn ͩng nhɞy nên m͍i sͱ nhiʂm ADN đɾu có thʀ đưa đɼn sɠn phɦm
dương tính giɠ trong kɼt quɠ. Đʀ hɞn chɼ thͱc tɼ này cɤn tiɼn hành v͛i
các mɨu đ͑i chͩng cɤn thiɼt đʀ biɼt đưͣc sͱ nhiʂm tɞp tͫ các thành phɤn
phɠn ͩng hay tͫ dͥng cͥ thí nghiʄm.

M͙t vɢn đɾ nͯa cũng cɤn đɾ cɪp là sai s͑ trong phɠn ͩng nhân
gene v͛i enzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xɠy ra v͛i
m͗i m͙t đơn vʈ sao chép khoɠng 9000 nucleotid và đ͙t biɼn dʈch khung
xɠy ra v͛i s͑ lưͣng tương ͩng khoɠng 40 000 nucleotid.

+ M͙t s͑ k͹ thuɪt PCR khác:

M͙t s͑ k͹ thuɪt phát triʀn trên cơ s͟ cͧa k͹ thuɪt PCR có ý nghĩa quan
tr͍ng cho đʈnh danh và đʈnh typ vi sinh vɪt là nested PCR (PCR l͓ng), revert
transtriptase PCR (sao chép ngưͣc) và asymmetric PCR (PCR m͙t chiɾu).
PCR l͓ng là phɠn ͩng PCR bao b͓m hai phɠn ͩng đ͓ng th͝i, phɠn ͩng đɤu ͟
vòng ngoài gene và sɠn phɦm cͧa nó lɞi làm khuôn cho phɠn ͩng sau cho
đoɞn nɮm trong gene. Như vɪy phɠn ͩng sau cɤn 1 hay 2 m͓i đʀ nhân phɤn
gene nɮm trong sɠn phɦm PCR tͫ hai m͓i phía ngoài tɞo ra. Vai trò k͹ thuɪt
này làm tăng đ͙ nhɞy và đɴc hiʄu cͧa phɠn ͩng PCR.

Phɠn ͩng PCR phiên mã ngưͣc đưͣc dùng đʀ nhân ADN tͫ ARN cͧa
virus. Viʄc kɼt hͣp phɠn ͩng này v͛i PCR l͓ng có tác dͥng phát hiʄn ARN tɞi
th͝i điʀm nhɢt đʈnh cͧa mɨu.

K͹ thuɪt PCR m͙t chiɾu đưͣc ͩng dͥng trong phương pháp giɠi trình
tͱ ADN trͱc tiɼp tͫ sɠn phɦm PCR.phɦm PCR.

Ž
%&
'(

$

 
)
*!
+,


"


Như đã trình bày ͟ trên, dùng cɴp m͓i đɴc hiʄu có thʀ xác đʈnh đưͣc
gene đɴc trưng cho loài hay thɪm chí m͙t chͧng vi sinh vɪt nào đó. Các
chiɼn lưͣc ͩng dͥng lͣi thɼ cͧa k͹ thuɪt PCR dùng trong xác đʈnh typ vi sinh
vɪt trong nghiên cͩu dʈch tʂ h͍c đưͣc chia làm 4 nhóm sau:

- Phân tích RFLPs v͛i sɠn phɦm PCR khi dùng cɴp m͓i đɴc
hiʄu.

Trong trư͝ng hͣp này dùng kɼt hͣp k͹ thuɪt PCR và xͭ lý sɠn phɦm
PCR v͛i enzym cɬt hɞn chɼ và quan sát kɼt quɠ sau khi điʄn di sɠn phɦm
trên gel agarose hoɴc polyacrylamid M͙t dɨn chͩng cho k͹ thuɪt này là
kɼt quɠ nhân gene synthase citrat trong Rk s sau đó sɠn phɦm PCR
đưͣc xͭ lý v͛i enzym cɬt hɞn chɼ đʀ phân biʄt giͯa các chͧng v͛i nhau
(Regnery và Ctv, 1991). Các ví dͥ sau (bɠng 1.8) đã cho thɢy hiʄu quɠ
cͧa phương pháp này.

‘ 
1 M͙ s͑    k͹ 
 RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism)
p  á
 đɴ 
đưͣ   
k͹ 
 PCR

0       





spp. Kaltenboek et al (1992)

  spp. Gurtler et al. (1991)
 
   Foxall et al. (1992)


  
Okamoto et al.(1992)
& 
   

Ross &Dwyer(1993)
' 
 spp. Navarro et al.(1992)
) 

spp. Regnery et al. (1991)
*   
spp. McClellADN et al. (1992)

Ž
-.

$

 
)
/)


K͹ thuɪt PCR ribotyping là ͩng dͥng các cɴp m͓i đɴc hiʄu đʀ nhân các
vùng gene cͧa ARN (thu͙c ribosom hay ARN vɪn chuyʀn). Tuy nhiên, trong
thͱc tɼ k͹ thuɪt này yêu cɤu kinh nghiʄm, k͹ thuɪt và t͑n th͝i gian đʀ thͱc
hiʄn phép lai. Đʀ khɬc phͥc hɞn chɼ này m͙t cách tiɼp cɪn đưͣc trình bày ͟
đây là phân tích đa hình (dɢu vân tay) cͧa vùng gene này hay vùng gene
xen kɺ cͧa rARN hoɴc tARN.

Hɤu hɼt các chͧng vi khuɦn đɾu chͩa 2-22 phiên bɠn rARN trong m͗i
tɼ bào (Gottlie và Rundner, 1985) trong khi đó vùng xen kɺ giͯa 16S và 23S
chͩa m͙t s͑ các đoɞn ADN lɴp lɞi (Bacot và Reeves, 1991). Trong khi đoɞn
gene mã hoá cho tARN khá bɠo thͧ thì vùng xen kɺ cͧa tARN lɞi thay đ͕i tͫ
2-35bp đ͑i v͛i ‘
s s
s (Vod, 1985) và tͫ 2-208bp trên đ͑i tưͣng
E  (Jinks-Roberson và Nomura, 1987). Như vɪy khi sͭ dͥng cɴp m͓i
nhân toàn b͙ vùng gene tARN có thʀ tɞo ra đưͣc sͱ khác biʄt giͯa các
chͧng vi sinh vɪt. Kɼt quɠ ͩng dͥng k͹ thuɪt này trên m͙t s͑ đ͑i tưͣng
đưͣc trình bày trong bɠng 1.9.

‘ 
110 M͙ s͑   sͭ 
k͹ 
 PCR   p


   



" - 
 Klijin etal.(1991)
%
 
Czajka et al.(1993)
 & 


Van Kuppeveld et al.(1992)
(




Kostman et al.(1992)
(






 Seal et al.(1992b)
*
  
spp. Welsh &McClellADN(1992)
*   
spp. McClellADN(1992)

Khi s͑ phiên bɠn rARN tăng có nghĩa là làm tăng đ͙ nhɞy cͧa phương
pháp ͩng dͥng. Engstrand và c͙ng tác viên (1920) đã công b͑ có thʀ sͭ
dͥng mɨu dò là đoɞn nucleotid b͕ sung v͛i đoɞn 16S cͧa rARN như là m͙t
trong s͑ m͓i cho phép nhân phiên mã ngưͣc ARN và phép phân tích đưͣc
thͱc hiʄn nh͝ k͹ thuɪt PCR nhân sɠn phɦm cDNA đưͣc dùng cho phát hiʄn
÷    spp Đ͙ nhɞy cͧa phương pháp phát hiʄn này tăng 50 lɤn so v͛i
phương pháp truyɾn th͑ng.

+ K͹ thuɪt rep-PCR:

M͙t phương pháp trͱc tiɼp cho kɼt quɠ finger printing không cɤn sͭ
dͥng enzym cɬt hɞn chɼ là rep-PCR dͱa trên nguyên tɬc nhân các đoɞn
gene lɴp lɞi. Thuɪt ngͯ rep-PCR là chʆ phương pháp chung sͭ dͥng cɴp m͓i
đɴc hiʄu đʀ nhân các chu͗i lɴp lɞi ph͕ biɼn trong các vi sinh vɪt thu͙c cơ thʀ
nhân sơ. Các chu͗i lɴp lɞi có đ͙ bɠo thͧ cao trong các đ͑i tưͣng thu͙c
E     và m͙t s͑ đ͑i tưͣng khác (Versalovic và Lupsky, 1991).
Dùng các đoɞn mɨu dò bɠo thͧ có thʀ lai v͛i cɠ hai đoɞn ADN lɴp lɞi: đoɞn
có kích thư͛c 126bp (Enterobacterial repetitive intergeneic concensus-ERIC)
và đoɞn 38bp (repetitive extrageneic palindromic-REP) tͫ b͙ gene cͧa
E     vi khuɦn gram âm và m͙t s͑ chͧng có quan hʄ xa khác.
Có thʀ trͱc tiɼp thiɼt kɼ cɴp m͓i cho các đoɞn gene bɠo thͧ đʀ thu đưͣc kɼt
quɠ finger printing sau khi nhân gene dùng b͙ gene cͧa các vi sinh vɪt có
mang các đoɞn gene bɠo thͧ này. Sau khi điʄn di có thʀ phát hiʄn đưͣc trên
agarose các đoɞn gene có kích thư͛c khác nhau tͫ các ngu͓n vi sinh vɪt
khác nhau. K͹ thuɪt này đưͣc ͩng dͥng đã đem lɞi kɼt quɠ t͑t khi nghiên
cͩu m͑i quan hʄ trên các đ͑i tưͣng ‘
s s
s (Versalovic và c͙ng sͱ,
1992), C    s
s (Woods và c͙ng sͱ, 1991), R 
   
(Brujin, 1992). Thͱc tɼ phương pháp tɞo ra kɼt quɠ finger printing đa dɞng
tͫ hɤu hɼt các đɞi diʄn cͧa E     (Versalovic và c͙ng sͱ,
1991) và đưͣc ͩng dͥng trên tɢt các vi khuɦn có mang các đoɞn gene bɠo
thͧ lɴp lɞi trên.

Phương pháp tương tͱ cũng cho phép phát hiʄn sͱ khác nhau tͫ các
ngu͓n ADN trên các đ͑i tưͣng nhân thͱc thu͙c chi ©
  như mô tɠ cͧa
Belkim và Quint (1992). Phương pháp này dùng cho phát hiʄn đa hình các
đoɞn gene chung cho cɠ vi sinh vɪt nhân sơ và nhân chuɦn.