Hưӟng dүn thҭm duyӋt phương pháp thӱ vi sinh

vұt

1. Giӟi thiӋu:
- Hưӟng dүn này áp dөng cho các phương pháp thӱ vi
sinh tiӃn hành trên các mүu thӵc phҭm và nưӟc.
- Quy trình thӵc hiӋn trong hưӟng dүn này dӵa trên cơ
sӣ đánh giá sӕ lưӧng vi sinh vұt đã tăng sinh tҥo nên
khuҭn lҥc hoһc gây đөc.
Hưӟng dүn thҭm duyӋt phương pháp thӱ vi sinh vұt

- Ví dө: pp đӃm tәng sӕ vi sinh vұt hiӃu khí, phương pháp

MPN hay pp đӃm sӕ khuҭn lҥc cӫa mӝt dҥng vi sinh vұt
nhҩt đӏnh trên môi trưӡng chӑn lӑc đһc hiӋu.
- Hưӟng dүn này không áp dөng cho các pp thӱ nhanh vì
các phҧn ӭng ӣ đây lӋ thuӝc rҩt nhiӅu vào loҥi sҧn phҭm
cҫn phân tích.
Hưӟng dүn thҭm duyӋt phương pháp thӱ vi sinh vұt

- Các phòng kiӇm nghiӋm nên áp dөng các pp tiêu chuҭn/

tham chiӃu trong hoҥt đӝng kiӇm nghiӋm cӫa mình.
- Mӝt khi đã áp dөng phương pháp tiêu chuҭn thì ptn chӍ
cҫn thҭm tra lҥi pp đӇ chӭng tӓ pp đó đáp ӭng đưӧc mөc
đích và yêu cҫu thӱ nghiӋm đã đӅ ra.
 Hưӟng dүn thҭm duyӋt phương pháp thӱ vi sinh vұt
- NӃu trưӡng hӧp phҧi áp dөng các pp thӱ nӝi bӝ, pp cӫa khách
hàng, pp tiêu chuҭn cҧi biên hay áp dөng các pp tiêu chuҭn và
nhӳng phҥm vi và lĩnh vӵc không đúng như tiêu chuҭn đӅ ra,
phòng kiӇm nghiӋm phҧi tiӃn hành viӋc thҭm duyӋt.
- Chӫng chӭng dùng đӇ tiӃn hành viӋc thҭm duyӋt phҧi đưӧc kiӇm
tra đӝ thuҫn khiӃt bҵng cách cҩy và kiӇm tra trên mt chӑn lӑc, mt
không chӑn lӑc, nhuӝm gram.
Hưӟng dүn thҭm duyӋt phương pháp thӱ vi sinh vұt

- Khi cҫn thiӃt phҧi tiӃn hành đӏnh danh lҥi bҵng pp cә điӇn
hay các pp thӱ nhanh đã đưӧc phê duyӋt.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chính xác
1. Đӝ chính xác (Accuracy)
- ëhӇ hiӋn sӵ phân tán cӫa kӃt quҧ phân tích xung quanh giá trӏ
thӵc cӫa chúng.
- Khi áp dөng mӝt pp đӇ phân tích mӝt loҥi vi sinh vұt đích có sҹn
tӵ nhiên hay đưӧc gây nhiӉm vào mүu như mӝt phҫn cӫa thӱ
nghiӋm thành thҥo thì pp đó phҧi đӫ khҧ năng hay lưӧng đӏnh
đưӧc rҵng mүu phân tích trên ӣ nӗng đӝ hay tҫn suҩt đúng như
thӵc đưӧc coi là ch xác.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chính xác
- Đӝ chính xác thӇ hiӋn tính әn đӏnh cӫa nhân viên phân
tích.
- Đӝ chính xác càng cao khi giá trӏ trung bình cӫa kӃt quҧ
các lҫn phân tích gҫn vӟi giá trӏ thӵc cӫa chúng.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chөm
2. Đӝ chөm (precision)
- Là mӭc đӝ phân bӕ cӫa các kӃt quҧ thӱ nghiӋm riêng lҿ cӫa
cùng mӝt mүu đӗng nhҩt, đưӧc phân tích lһp lҥi nhiӅu lҫn trên
cùng mӝt pp thӱ.
- Đӝ chөm cӫa mӝt pp thӱ thưӡng đưӧc diӉn tҧ bҵng thuұt ngӳ
µđӝ lӋch chuҭn¶ RDS (relative standard deviation) hay hӋ sӕ biӃn
thiên cӫa mӝt chuӛi các phép đo.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chөm
- Đӝ chөm có thӇ là thưӟc đo cӫa đӝ lһp lҥi hay đӝ đӅu tay cӫa
phương pháp thӱ trong điӅu kiӋn thӱ bình thưӡng.
+ đӝ lһp lҥi là đҥi lưӧng thӇ hiӋn sӵ khác biӋt giӳa các kӃt quҧ
thӱ nghiӋm đӝc lұp đưӧc thӵc hiӋn trên cùng mӝt mүu, cùng mӝt
pp, trong cùng mӝt phòng kiӇm nghiӋm và bӣi mӝt kiӇm nghiӋm
viên trên cùng thiӃt bӏ trong mӝt khoҧng thӡi gian ngҳn.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chөm
+ Đӝ đӅu tay là đҥi lưӧng thӇ hiӋn sӵ khác biӋt giӳa các kӃt quҧ thӱ
nghiӋm đӝc lұp đưӧc thӵc hiӋn trên nhӳng mүu giӕng hӋt nhau, vӟi
cùng mӝt pp nhưng tiӃn hành tҥi các phòng kiӇm nghiӋm khác nhau hay
trên các thiӃt bӏ khác nhau.
+ Đӝ đӅu tay nӝi bӝ cũng là đҥi lưӧng mang tính chҩt tương tӵ như đӝ đӅu
tay, nhưng đưӧc tiӃn hành khác ngày, bӣi nhӳng kiӇm nghiӋm viên khác
nhau hay thiӃt bӏ khác nhau nhưng đưӧc tiӃn hành trong cùng mӝt phòng
kiӇm nghiӋm.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
3. Đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
- Đӝ nhҥy:
+ ë lӋ xác đӏnh đúng trên tәng sӕ các chӫng hoһc khuҭn lҥc dương
tính giҧ đӏnh
+ Đҥi lưӧng này biӇu thӏ khҧ năng phát hiӋn sӕ lưӧng thұt cӫa vi sinh
vұt đích bҵng pp thӱ thông qua viӋc xác đӏnh t lӋ nghiӋm đúng (kӃt
quҧ dương tính) trên tәng sӕ vi sinh vұt dương tính giҧ đӏnh.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
- Đӝ đһc hiӋu:
+ ë lӋ xác đӏnh đúng trên tәng sӕ các chӫng hoһc khuҭn lҥc âm
tính giҧ đӏnh.
+ Đҥi lưӧng này biӇu thӏ khҧ năng phát hiӋn sӕ lưӧng thұt cӫa vi
sinh vұt đích bҵng pp thӱ thông qua viӋc xác đӏnh t lӋ nghiӋm
đúng (kӃt quҧ âm tính) trên tәng sӕ vsv âm tính giҧ đӏnh.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ ë lӋ dương tính giҧ: t lӋ dương tính quan sát đưӧc sai vӟi kӃt quҧ
thӵc.
‡ ë lӋ âm tính giҧ: t lӋ âm tính quan sát đưӧc sai vӟi kӃt quҧ thӵc. Đҥi
lưӧng này biӇu thӏ tӍ lӋ sӕ vsv âm tính bӏ xác đӏnh sai.
Nhӳng đһc điӇm trên đưӧc áp dөng cho các pp chӑn lӑc và đưӧc xác đӏnh
bҵng cách thҭm tra các khuҭn lҥc dương tính hoһc âm tính trên đĩa hay
thҭm tra canh khuҭn trong các ӕng nghiӋm có hoһc không có vsv phát
triӇn (MPN).
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ ërong thҭm duyӋt mӑi chӫng vsv dương tính giҧ đӏnh hay
âm tính giҧ đӏnh đӅu phҧi đưӧc thҭm tra lҥi.
‡ ërong thҭm tra chӍ nhӳng khuҭn lҥc dương tính giҧ đӏnh
mӟi cҫn đưӧc phân lұp và thҭm tra.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ Quy trình tham khҧo đӇ xác đӏnh đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu:
- Pha loãng mүu gҩp đôi hoһc gҩp mưӡi.
- NӃu mүu ít vsv đích có thӇ gây nhiӉm vsv đích vào mүu.
- ĐӇ thҭm duyӋt, phҧi gây nhiӉm ít nhҩt 3 chӫng vi sinh vұt đích vào mүu.
- ĐӇ thҭm tra, có thӇ dùng mӝt hoһc vài chӫng vsv đích gây nhiӉm vào
mүu.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
- NӃu pp cҫn thҭm duyӋt không đӅ cұp đӃn giai đoҥn phөc hӗi vsv bӏ suy
yӃu hay tәn thương thì mүu phҧi đưӧc gây nhiӉm vӟi vsv đích đã bӏ tәn
thương.
- KiӇm chӭng hiӋu quҧ cӫa viӋc làm tәn thương vsv bҵng cách kiӇm tra
viӋc giҧm sӕ lưӧng vsv phát triӇn trên mt chӑn lӑc so vӟi mt dinh dưӥng
thông thưӡng.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
- Mүu sau pha loãng đưӧc cҩy vào đĩa thҥch theo pp đӃm đĩa hoһc thӵc
hiӋn theo pp MPN.
- Ӫ trong thӡi gian và nhiӋt đӝ thích hӧp theo quy trình.
- KiӇm tra các đĩa có sӕ khuҭn lҥc trong hoһc gҫn vӟi ngưӥng theo pp
đӃm đĩa. ĐӃm sӕ tҩt cҧ khlҥc điӇn hình và không điӇn hình trên đĩa. Khi
mүu chӭa lưӧng vsv ít phҧi tiӃn hành thӭ nghiӋm lҥi (vsv dưӟi ngưӥng)
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
- Đӕi vӟi pp MPN đӃm ӕng dương tính và sӕ ӕng âm tính trong dãy
ӕng nghiӋm.
- ëhӵc hiӋn các phép thӱ sinh hoá phù hӧp cho tӯng khuҭn lҥc
trên mӛi đĩa hoһc tӯng ӕng dương tính hoһc âm tính đӇ thҭm tra
xem đó có phҧi là vsv đích hay không.
- Sau khi thҭm tra, kӃt quҧ đưӧc phân thành 4 nhóm:
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ (a) sӕ dương tính giҧ đӏnh đưӧc khҷng đӏnh là dương tính
(dương tính thӵc)
‡ (b) sӕ âm tính giҧ đӏnh đưӧc khҷng đӏnh là dương tính (âm tính
giҧ)
‡ (c) sӕ dương tính giҧ đӏnh đưӧc khҷng đӏnh là âm tính (dương
tính giҧ)
‡ (d) sӕ âm tính giҧ đӏnh đưӧc khҷng đӏnh là âm tính (âm tính thӵc)
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ Sҳp xӃp tҫn suҩt cӫa bӕn dҥng khác nhaunói trên như bҧngsau:

sӕ đӃm giҧ đӏnh

Dương tính Âm tính (không đh)
(đhình)
Kđ là dtính a b a+b
Kđ là âm tính c d c+d
a+c b+d n
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡Có thӇ tính toán các đһc tính thӇ hiӋn tӯ nhӳng dӳ liӋu trên như sau:
- Đӝ nhҥy : a/(a+b)
- Đӝ đһc hiӋu: d/(c+d)
- ë lӋ dương tính giҧ: c/(a+c)
- ë lӋ âm tính giҧ: b/(b+d)
- ëәng sӕ các phép thӱ là: a+b+c+d = n
- HiӋu suҩt thӱ E (efficiency) là thông sӕ chung duy nhҩt thӇ hiӋn t lӋ các
khuҭn lҥc hoһc các ӕng canh khuҭn đưӧc xác đӏnh đúng: E=(a+d)/n
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ Ví dө vӅ đӝ nhҥy, đӝ đһc hiӋu, t lӋ dương tính giҧ, t lӋ âm tính giҧ, hiӋu
suҩt thӱ:
KӃt quҧ tәng cӝng sau khi thӵc hiӋn phtích bҵng pp đӃm đĩa cӫa bӕn mүu
tӵ nhiên:
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
a sӕ khuҭn lҥc điӇn hình đưӧc khҷng đӏnh là dương tính (dtính thӵc) 250

b sӕ khuҭn lҥc không điӇn hình đưӧc khҷng đӏnh là dương tính (âm tính 8
giҧ)
c sӕ khlҥc điӇn hình đưӧc khҷng đӏnh là âm tính (dương tính giҧ) 20

d sӕ khlҥc không điӇn hình đưӧc khҷng đӏnh là âm tính (âm tính thӵc) 120

ëәng sӕ đӃm khlҥc tӯ các đĩa 398

 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ nhҥy và đӝ đһc hiӋu
‡ Có thӇ tính toán các đһc tính thӇ hiӋn tӯ nhӳng dӳ liӋu trên như sau:
- Đӝ nhҥy = a/(a+b) = 250/258 = 0,97
- Đӝ đ hiӋu = d/(c+d) = 120/140 = 0,86
- t lӋ dt giҧ = c/(a+c) = 20/270 = 0,07
- t lӋ âm tính giҧ=b/(b+d) = 8/128 = 0,06
- ëәng sӕ các phép thӱ = a+b+c+d = n =398
- HiӋu suҩt thӱ E= (a+d)/n = 370/398 = 0,93
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chӑn lӑc
4. Đӝ chӑn lӑc
- Đӝ chӑn lӑc thӵc (real selectivity): là logarit cӫa t lӋ các sӕ đӃm khuҭn
lҥc cӫa vsv đích thӵc sӵ (đã khҷng đӏnh là dương tính) trên tәng sӕ
khuҭn lҥc.
- Đӝ chӑn lӑc biӇu kiӃn: là logarit cӫa t lӋ các sӕ đӃm khlҥc cӫa vsv đích
giҧ đӏnh (khlҥc điӇn hình) trên tәng sӕ khlҥc.
Đӝ chӑn lӑc biӇu kiӃn F = log{(a+c)/n}
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
- đӝ chӑn lӑc
‡ Ví dө vӅ đӝ chӑn lӑc biӇu kiӃn:
sӱ dөng dӳ liӋu trong ví dө trên, ta có:
ëәng sӕ khlҥc dương tính giҧ đӏnh: a+c = 270
ëәng sӕ khuҭn lҥc đӃm đưӧc trên các đĩa
n = 398
Đӝ chӑn lӑc biӇu kiӃn:
F = log{(a+c)/n} = log(270/398) = log0,6784
= -0,16851
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
5. ë lӋ phát hiӋn (Recovery rate)
ë lӋ phát hiӋn là đӝ thӕng nhҩt giӳa sӕ lưӧng vsv phát hiӋn đưӧc bҵng pp
thӱ cҫn thҭm đӏnh so vӟi sӕ vsv phát hiӋn đưӧc bҵng pp tham chiӃu (pp
chuҭn).
- Dùng các mүu tӵ nhiên đӇ so sánh đӝ phát hiӋn cӫa các vsv đích bҵng
mӝt pp thӱ so vӟi pp tham chiӃu.
- NӃu mүu không chӭa đӫ lưӧng vsv cҫn cho viӋc thӱ nghiӋm thì cҫn phҧi
cҩy chӫng vsv đích vào mүu.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
- Khi mүu chӭa vsv bӏ tәn thương thì phҧi gây tәn thương vsv đích trưӟc
khi gây nhiӉm vào sҧn phҭm
ĐӃm lưӧng vsv đích trong mүu đã cҩy chӫng bҵng pp thӱ và pp tham
chiӃu trưӟc và sau khi gây tәn thương trên mүu.
Dùng ít nhҩt 3 lҫn lһp lҥi cho mӛi nӗng đӝ
Lһp lҥi trình tӵ trên vӟi 2 hoһc 3 chӫng vsv đích.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
- Báo cáo giá trӏ mұt đӝ trung bình bҵng pp thӱ cҫn thҭm duyӋt theo t lӋ
phҫn trăm so vӟi mұt đӝ trung bình bҵng pp chuҭn.
- ĐӇ chuҭn bӏ chӫng chӭng dùng gây nhiӉm, ptn phҧi xây dӵng thӫ tөc
hoàn chӍnh vӅ kiӇm soát nhân giӕng, kiӇm soát viӋc cҩy chuyӇn, khoҧng
thӡi gian giӳa 2 lҫn cҩy chuyӇn, thӡi gian và nhiӋt đӝ ӫ, canh cҩy, dung
tích và vұt dөng nuôi cҩy.
cҫn pha dӏch chӫng chӭng trong dd không hӛ trӧ cho sӵ phát triӇn cӫa
vsv.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
‡ ĐӇ xác đӏnh sӕ lưӧng vsv trong chӫng chӭng có thӇ dùng nhӳng
pp phù hӧp, như pp đӃm đĩa.
‡ sӕ lưӧng này phҧi nҵm trong khoҧng giӟi hҥn tin cұy trên và
dưӟi cӫa sӕ ưӟc lưӧng đúng nhҩt đã đưӧc xây dӵng trưӟc đó
bҵng các quy trình nuôi cҩy chuҭn.
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
‡ Ví dө vӅ đӝ phát hiӋn:
KӃt quҧ sӕ lưӧng cӫa 5 chӫng vsv đích đưӧc phát hiӋn bҵng pp
cҫn thҭm đӏnh và bҵng pp chuҭn trưӟc và sau khi gây tәn thương
mүu đã gây nhiӉm đưӧc biӇu thӏ trên bҧng sau:
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
Pp cҫn thҭm đӏnh Pp chuҭn
sӕ đӃm trung bình sӕ đӃm trung bình
Mүu không tәn Mүu gây tәn Mүu không tәn Mүu gây tәn thư
thương (1) thương (2) thương (3) (4)

ӫng 1 128 118 127 119

ӫng 2 120 114 119 127
ӫng 3 120 119 118 125
ӫng 4 125 121 128 126
ӫng 5 132 119 131 121
Ӌ phát hiӋn 125 118 125 124
 ëhҭm duyӋt các pp thӱ đӏnh lưӧng
-t lӋ phát hiӋn
‡ ëính toán:
t lӋ phát hiӋn vsv bình thưӡng:
{ [sӕ trb (1)/sӕ trb (3)] ×100} =
(125 × 100)/125 = 100%
t lӋ phát hiӋn vsv đã bӏ suy yӃu:
sӕ trb (2)/sӕ trb (4) × 100 = (118 × 100)/124 =95%
 Mác đӏnh dãy đӃm khlҥc
6. Mác đӏnh dãy đӃm chҩp nhұn đưӧc
- sӕ lưӧng khuҭn lҥc mӑc trên đĩa có thӇ ҧnh hưӣng đӃn đӝ chính
xác cӫa viӋc đánh giá sӕ đӃm khuҭn lҥc.
- Mұt đӝ vsv cao sӁ làm giҧm đӝ chính xác
- Mұt đӝ vsv quá thҩp sӁ làm tăng sai sӕ ngүu nhiên trong đánh
giá.
 Mác đӏnh dãy đӃm khlҥc
‡ Dãy đӃm chҩp nhұn đưӧc đӕi vӟi khlҥc vi khuҭn hoһc nҩm mӕc như
sau:
- trong kiӇm nghiӋm thӵc phҭm, dưӧc phҭm: 25-250klҥc
- trong nưӟc: 30-300klҥc
- nҩm mӕc như Aspergillus niger 8-80klҥc
Dãy đӃm này có thӇ không tӕi ưu vì tính đa dҥng cӫa sҧn phҭm trên thӏ
trưӡng hiӋn nay.
 Sai sӕ thô
7. Sai sӕ thô
- Là chӍ sӕ đánh giá khҧ năng không bӏ ҧnh hưӣng bӣi nhӳng thay đәi tuy nhӓ nhưng
cũng cҫn tính đӃn trong các thông sӕ cӫa pp, đӗng thӡi cung cҩp mӝt chӍ thӏ vӅ đӝ tin
cұy cӫa pp trong quá trình áp dөng thông thưӡng.
- Ví dө tính sai sӕ thô vӅ nhiӋt đӝ và thӡi gian ӫ bҵng cách ӫ mүu ӣ hai khoҧng cӵc trӏ
khác nhau rӗi đӃm và tính ra sai sӕ giӳa hai khoҧng cӵc trӏ đó.
- Có thӇ tính sai sӕ trong viӋc bҧo quҧn mүu, viӋc chuҭn bӏ mүu,«