SELEKSI CENDAWAN POTENSIAL PENGHASIL

ENZIM ENDOGLUKANASE (KARBOKSIMETIL SELULASE)

DAN ISOLASI GEN PENYANDINYA

NEO ENDRA LELANA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
 SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Seleksi Cendawan
Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi
Gen Penyandinya adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Februari 2009

Neo Endra Lelana

NRP P052060101
 ABSTRACT

NEO ENDRA LELANA. Selection of Potential Fungal for Endoglucanase

(Carboxymethyl Cellulase) Producer and Isolation of Its Gene. Supervised by
UTUT WIDYASTUTI and NAMPIAH SUKARNO

Cellulose is the most renewable resources in the earth. Enzymatic

hydrolysis of cellulose can be achieved by synergistic action of three types of
cellulase enzyme, namely endoglucanases, exoglucanases/cellobiohydrolases and
glucanases. Filamentous fungi, particularly Aspergillus and Trichoderma, are well
known as efficient producers of cellulolytic enzymes.
The aims of the research were to screen endoglucanases or carboxymethyl
cellulase (CMCase) from Aspergillus niger and Trichoderma isolates and to
isolate and characterize gene encoding endoglucanase from selected isolate.
Fungal isolates were screened by plate screening method in agar medium
containing 1% carboxymethyl cellulose with congo red staining and the fungal
cellulase activity was measured by dinitrosalicilic acid (DNS) methods from
seven days filtrate culture. Trichoderma reesei was used as a standard isolate for
cellulase enzyme activity test. Gene encoding endoglucanase of A. niger IPB1,
designated eglA, was isolated from RNA to obtain coding sequence (CDS) with
RT-PCR using specific primer EAF and EAR. The resulting fragment coding
eglA was cloned into pGEM-T Easy plasmid, introduced into E. coli DH5α and
sequenced by ABI Prism 310 automated DNA sequencer. Characterization of
eglA gene was carried out by using several software programs from webserver
that available online.
Quantitative assay of cellulolytic activity showed that A. niger IPB1 had
highest value of specific activity, 5.74 U/mg, compared to other isolates and
standard isolate tested and had been chosen as an isolate for isolation gene
encoding endoglucanase. The full length of CDS region of eglA gene from A.
niger IPB1 had been successfully isolated and cloned into pGEM-T Easy plasmid.
The gene was 720 bp in length and encoding 239 amino acids. The result of
BLAST analysis of this gene showed high similarity, 97 (E-value 1.1e-148) - 99%
(E-value 3.7e-152 ) , with other A. niger endoglucanases obtained from database.
Based on deduced amino acids sequenced, eglA of A. niger IPB1 was a secreted
protein belonging to glycoside hydrolase (GH) family 12. This enzyme lacked of
carbohydrate binding moduls (CBM). From sequence comparisons with GH12
homolog with known sequence in which the catalytic residue had been identified,
the identities of the catalytic nucleophile and the acid-base of eglA A. niger IPB1
were Glu116 and Glu 204, respectively. Glucosyl binding site were Trp (22, 49,
51, 85, 120, 144), Tyr (61, 98, 115) and Phe (163, 179). Phylogeny analysis
showed that the eglA of A. niger IPB1 had close relationship with another
Aspergillus group.

Keywords : endoglucanase, eglA, gene isolation, Aspergillus niger, Trichoderma

 RINGKASAN

NEO ENDRA LELANA. Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim

Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya. Dibimbing
oleh UTUT WIDYASTUTI dan NAMPIAH SUKARNO

Selulosa merupakan sumber daya terbarukan yang paling berlimpah di

alam. Secara enzimatik, selulosa dapat dihidrolisis oleh kerja sinergis tiga tipe
enzim selulase, yaitu endoglukanase, eksoglukanase/selobiohidrolase dan
glukosidase. Kelompok cendawan berfilamen, terutama Aspergillus dan
Trichoderma diketahui merupakan organisme penghasil selulase yang efisien
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan skrining terhadap enzim
endoglukanase atau karboksimetil selulase (CMCase) dari beberapa isolat
Aspergillus niger dan Trichoderma koleksi Bagian Mikologi Departemen Biologi
F.MIPA Institut Pertanian Bogor dan Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi Institut Pertanian Bogor serta mengisolasi dan mengkarakterisasi
gen penyandi endoglukanase dari isolat cendawan potensial terpilih. Seleksi
endoglukanase dilakukan dengan skrining pada media agar CMC menggunakan
pewarnaan congo red dan pengujian aktivitas enzim menggunakan metode DNS
(asam dinitrosalisilat). T. reesei digunakan sebagai isolat standar dari aktivitas
enzim endoglukanase. Isolat potensial terpilih selanjutnya digunakan untuk isolasi
gen penyandi endoglukanase. Daerah coding sequence (CDS) diisolasi
menggunakan RT-PCR dengan primer spesifik EAF (5’-CTCTAACGCCCAACA
TGAAG-‘3) dan EAR (5’-TCTAGAACCCTAGTTGACACTGG-‘3) dari RNA
total. Produk amplifikasi yang diharapkan ialah sebesar 743 bp. Gen eglA yang
diperoleh selanjutnya diklon ke dalam plasmid pGEMT-Easy dan diintroduksikan
ke dalam E. coli DH5α. Hasil klon kemudian di urutkan nukleotidanya dengan
ABI Prism 310 automated DNA sequencer dan dikarakterisasi menggunakan
beberapa software yang tersedia secara online.
Berdasarkan uji kualitatif, A. niger IPB1 menghasilkan nisbah selulolitik
lebih besar dari isolat Trichoderma dan beberapa A. niger tetapi lebih kecil dari A.
niger KB12 dan A. niger TSR52. Namun uji kuantitatif dengan metode DNS
menunjukkan isolat A. niger IPB1 mempunyai aktivitas spesifik tertinggi
dibanding isolat-isolat lainnya termasuk T. reesei, yaitu 5.74 U/mg. Isolat ini
selanjutnya dipilih untuk dilakukan isolasi terhadap gen penyandi
endoglukanasenya. Gen eglA berhasil diisolasi dan di klon ke dalam plasmid
pGEM-T Easy. Gen ini terdiri atas 720 bp dan mengkodekan 239 asam amino.
Analisis BLAST menunjukkan eglA mempunyai kemiripan yang tinggi, yaitu 97
(E-value 1.1e-148) - 99% (E-value 3.7e-152) dengan endoglukanase A. niger
lainnya dari database. Berdasarkan deduksi asam aminonya, eglA termasuk ke
dalam famili glikosida hidrolase famili 12. Enzim ini tidak mengandung
carbohydrate binding moduls (CBM). Berdasarkan perbandingan struktur
homolog dengan struktur endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu
yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger maupun pengikatan
substratnya dapat dideduksikan. Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan
Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Situs pengikatan glikosil
diprediksikan tersusun atas residu Trp (posisi 22, 49, 51, 85, 120, 144), Tyr (61,
98, 115) dan Phe (163, 179). Analisis filogenetik menunjukkan eglA A. niger
IPB1 mempunyai kedekatan dengan kelompok Aspergillus lainnya.

Kata Kunci : endoglukanase, eglA, isolasi gen, Aspergillus niger, Trichoderma

 © Hak cipta milik IPB, tahun 2009
Hak cipta dilindungi undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tesis tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan penulisan kritik
atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar Institut
Pertanian Bogor
2. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh
tulisan dalam bentuk apapun tanpa ijin Institut Pertanian Bogor.
 SELEKSI CENDAWAN POTENSIAL PENGHASIL
ENZIM ENDOGLUKANASE (KARBOKSIMETIL SELULASE)
DAN ISOLASI GEN PENYANDINYA

NEO ENDRA LELANA

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Penelitian : Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim
Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen
Penyandinya
Nama Mahasiswa : Neo Endra Lelana
NIM : P052060101

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Utut Widyastuti, MS Dr. Ir. Nampiah Sukarno

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Bioteknologi

Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS

Tanggal ujian : 20 Februari 2009 Tanggal lulus :

 PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT dimana hanya atas
karunia dan ijinNyalah karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian ini
mengambil tema Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase
(Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya dan telah dilaksanakan
sejak bulan September 2007 sampai bulan Desember 2008. Dalam kesempatan ini
penulis ingin mengucakan terima kasih yang tak terhingga kepada :
1. Dr. Utut Widyastuti dan Dr. Nampiah Sukarno selaku pembimbing yang telah
memberikan bimbingan dan arahan selama berlangsungnya penelitian dan
penulisan karya ilmiah ini.
2. Dr. Aris Tjahjoleksono selaku penguji luar komisi yang telah memberikan
arahan dan masukan dalam penulisan karya ilmiah ini.
3. Departemen Kehutanan atas beasiswa yang diberikan kepada penulis dalam
menempuh studi S2 ini.
4. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian
Bogor atas semua fasilitas laboratoriumnya.
5. Proyek Kerjasama Kemitratan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi
(KKP3T) antara Departemen Pertanian dan Pusat Penelitian Sumber Daya
Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor atas dana penelitiannya.
5. Seluruh staf pengajar di Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana
IPB atas segala ilmu yang diberikan, beserta seluruh staf administrasi dan staf
laboratorium atas segala bantuannya selama penulis menjalankan tugas belajar
di IPB.
6. Ayah-Ibu tercinta, Bapak-Ibu mertua, Istriku Ika Prasasty dan anakku Ahmad
Aulya Lathief tersayang, dan seluruh keluarga atas segala dukungan dan
kesabaran dalam mendampingi penulis.
7. Teman-teman Program Studi Bioteknologi angkatan 2006 : Pak Heri, Pak
Tontowi, Pak Roni, Slamat, Ainun, Devi, Wita, Nia, atas dukungan dan
bantuan yang diberikan.
8. Teman-teman Lab. Biorin dan Genetika Molekuler : Pak Ulung, Pak Muzuni,
Pak Hadi, Pak Mulya, Rizki, Mbak Pepi, Bu Srilis, Bu Yohana, Bu Ratna,
Yulia, Niken, Nindya dan sebagainya atas dukungan yang diberikan.
9. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah
memberikan bantuan kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian ini.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih belum sempurna. Namun
demikian penulis berharap semoga penelitian ini dapat berguna bagi pihak-pihak
yang memerlukannya.

Bogor Februari 2009

Neo Endra Lelana