El objetivo de' tU1.

curso de hlstologia es gular

at' alumna a la comprensidn de la microanatomia

d l il l l . - 'id l ~'

__ etas ceuuas, ios te~L_OS Y",' ios organos,

I~', ~,

Y C1 correlacionar La estructura con lafuncion

Los m '('tad'o(_; em "p- ileados por InE" histolo """O'~ son rnuy

_: '.' '_' e _ ":,;~ , ~', di ...... ' .. ,_" _''''-''';_01 • '~' .• ,;, '_ vr _ v:j _' :ill,c;;'III.. __ '_,:g .. ,~.- ~ ~.= ; . :.' : :_

di v erso s ~ G,· •• ·.' II an," p-arte del c 0- n teni do '. de 1 a. m I ateri at 11"" sto-

_ _ i:) _ _ _ _ _ __ ~ _., ~ _ _ _,. _ _ _ _ _,. _ _ _ . _ ~ . ~ I]l ~ _ . ill ~ _ ~

losfa 'g·"e·· P:"" iede ~n' ..... -,- QAI"f' :'l'lr' ..:i.1ir"ii 'ti'"': -"'n'- ·1 -, '0'" ·d- ~ '11,.-.tI, 1'"1f'i, ·,C: ·-r".r"";;·s·'or"'O· ipia ,~,~L-_ '~ ,U......,_ ,"'" "" _ """,U(:.I!.UJ~' ""'!I!.~, lI;,eI !J!aUl·s, ~_ """" Jli.CI. ,Ad" _ 'VL ........ __ ,H".....,.

optica, usada par los alumnos en la practica de laboratorio, La interpretacion mas detallada de la microanatomfa 8ie basa en la microscopia electronics (ME}" tanto en la de transmision de electrones (MET) CQlnO en la de

b id ("'M'E-- B') d b id "", il 1-

arru 0 .._ ,: - .',_ erne 0 a su mayor aumento uti y.a as

nume ro .",(, ~'C' teen tic QS·· auxili '(1--'- res d ~ 1- ~I b "1'0'" .logf "=i, eel ular 'liJ

IU .:" ... ·~:riJ.!Ur..:;l! IJL~ _", ,il.:-.,U> .(;1,.," A,iIL.JL . _ ,~o' ,":_ ~ ,~ .~', <:.lv.::_· .,C,;;I .. _ .. ~, .~ iL.ILJl J."

m olecu lar, para. 1 as cual e s la ME re presenta e 1 01 tim Q

• • I

paso en la adquisicion de datos, Estas tecnicas auxilia-

res incluyen:

'. Histoqufmica y citoqutmica. .. Autorradiograffa,

,. Culti vo de organos y de tejidos ..

'. S eparac ion de eel ulas y de organe 1 as par centri fugac i 6n di ferenc i al m

.. Tecnicas microscopicas y microscopies especializados.

El alumno puede sen tirse aj eno a. e stas tecnicas y a

;p; sto .. s 'p. rocedim 'I' entos d I ebi d . .('i. !'!II 'g- ue p: .; .• 0' .: ' ,.--' '~·O·' (_1;o;;'I;O:' era ] '~'1' 0·":"

'i;,;oO ... . J. UIior-''!;;.,.-' - , " I v, I, _._ ~~"J1. _ V ,ut <:_ "'"" ~'.' ~I ,l~, ,~""'" ,1 ....... 1 <'" ,l,~.

tiene experiencia direct-a con ellos en un curse normal. No ob stan te, e s i mportante C ono C e r a.l go so b re e stos procedimi entos e s_p eci ale s y so bre l os datos que apor ... 't- an E··c· ste cal n -It· ~u '0" p' vonore "i'O' '. 'i'I'Q" un Q' C V" ~,,·r ""'n gen eral de .. .' '" - 'c_. -.' r'[' .. ,t:_: .. ~j'.tf': .. ~ to: ,n, __ -_ .'_' __14t.O'.~' ..... ~ ... "~ -> _,>¢.

lO's fIretQdos Y' ojr,ece una ,exp'lt'cact6,n a:ce,rca ,de' ,cumolo,s datos obtenidos PO''p 1nedio de ellos p.ueden CtJ'niri- ...

b- -" - l' t· d"" t ad ~ '''lid: - .' •

UtI'" ' .... , '. " . .. ..' ,: -,' ,.... ' ,. , .. , .. ' .' - .' , .. ' "'., " , .- , '. '.' .' , .' .' " '. - " '.' '." ", .. ',',

I~'~C ,a qu,e e es,u r.a,u ,e " qU,I,e.ra .800$ OOflOClmle1'l ....

t - - d' h'" t·, l' "'"

_ os ." .. " e " ·lS .QO'g,lQ.~,

UnO' de los problem,as enfrentados .PQf el alumno en histologf'a. e.s compr-ende'f la naturaJeza de la in1agen bi= dimensional de ltD corte histologico 0 una fotoll1jcI'ogra ..

f'.... ill" 6"-" 6 ill . 1 - .

'. . . '" '-,', ,--'" . '.. ' . '.' - . - . , __ . . . " -. ,,--.. ., -. • -'., -, .. l ,-- --

la e ec tT_U, C a~ y c'. m}o se re 'aCt ana ·con a ies tructur.a trl =

dhnensmonaJ de la cua'l :proviene,~ P'a~ra su,perar "esta bre .. cha ·conceptua.l" p:rilnero se d.ebe pf1t~'~se:ntar una. 'breve descd.pc 1:6n de los m,etodos :nece sarlos p,a_'ra obtener c.or .. ties de. tej ido y muestras para.. mi CftH5,capi.a elec.tt6:nmc a..

PREPARA,C]ON DE LAS MUESTRAS

Tlncidn con, hematoxllina-eosina y fiJaci6n ~ al·

eon rorms ina

Las muestras examinadas con mayor frecuencia son cortes histologicos preparados con metodos

de rutina v coloreados con hematoxilina-eosina

~ .

El juego de mnestras entregado a cad-a alumno para su estudio con el microscopic optieo consiste en su mayor parte, de c-orte-s hi stologi cos fijados con formaltna incl uidos en parafina y coloreados con hematoxilina e= eosina (HE). Las micrograffas para mi croscopio optico presentadas en la seccion de laminas de este texto son cortes hrsto- 16 gicos que -pe:~ten.ece:n a. uno de estes jue gos de mues tras. Ademas, Ia mayorfa de las ~ fotomicrograffas que i 1 ustran los tejidos y organos en Ias cl ases y conferencias de h i stoIogia S'f; obtienen de estos cortes" En ocasiones Se" usan otras tecnicas para mostrar -componentes celulares y ti sulares especfficos; varies de enos se descri ben a contin uacion,

EI primer paso en la preparacion de una muestra

- - - ~ - ~ - ,J:'. f

de tejido 0 de organa es la fijacion parapreservar

la estructura

La. fij acion, por rnedio de un agente qufmico 0 una. mezcla de enos; detiene el metabolismo celnlar y censerva la estructura celular para su tn taro tra tami en to, La for ...

ma c·li' ina a - ra -, a ""O"~'~ r- ,'~6· c r'ii '3' C:'U,ii'"'Ii'S' 'a' d·'- e form aldeh fdo al 3,:7 cr/ es

"""'~~- __ . ,_~~-, un~ _ s· Jl!d ~ _ [~, .', ,_. .v-. .._.'. ,tv, , ,,- ...... , J1.·:v ., .. ' 10, .• ..:J!

li'

el fijador mas usado en distintas concentraciones y combi-

nada con otras sustancias qufmicas 0 amortiguadores (buf _ fers) ~ El forulaldehfdo preserva la es tructura general deo :la. c:~H.ula y ·d,e, los co:m-ponentes exrr,atcelulares, al reaccionar oon los grupos amino de las pl'oteinas; como no :reacciona con los 11p1dos" es un deficiente f~jador de m,ernbranas~

En el segundo paso, Sf! prep'ara la muestra; para ser inc.lui,da en p-arafinaj, io c.ual !J,(!,-rmite' que sea s'eccio:n,ada

£l'n' c·o ~"..toQ' ir" fl' :,' M /lS ~ .... :.: ".: ':1 I '~~I ,_ ·I~rl~u.·-:··

P',ru~a :p ernlitir eM lUl,al~s i s de la m.ues tn~" se ~,Bi :infH tr,a coOn un 'med.i() de i:nc,~us:i6n que permite su secci6n e:n

. .......' - "f'~'··.· d-:-' 5" lIS··· Il:iI'in [-1- :.:' ,. 6'-' - .c··t.-~··· '(I~ I' ) 'I;' "~I···

-COlLes .1008;: ,e _:_ _ 111.. _ r.L.L . m efme, 10 .Fm, equi'y.ale at

Cuadro 1 ... ,1 .. Caracteristicas tintoriales de distintas estructuras con H'E

Coloracior '

Nticleo Heterocromatina Bucromatina Nucl~olo

Azul Negativa Azul

Ci top] t]S111a

Ergastr plasma Citoplasma en general

FU amen to'S c j, ropl as In at i cos

Azu) Rosada Rosada

M aterial e xtracelu lar tibia colagenas Fi bra', elasticas *

Rosada

Ro sada, pero en general no se distinguen de [as fi bras col agenas Rosada, pe "0 ell general nc - se di st inguen de las, f bras colagenas Azul; pero s 610 8i es abundante -CO~ 1110 en .~ a matriz c artilaginosa

Rosada _

Rosada

Sus tanci a fu ndame n tal

Matrtz osea (descalciflcada) Mem br ana basal t

:!!: Para verl as se usa una tecnica e: pee • lid • como fuesl lUI IJJi orcefna,

t Para verlas . "J; U-' a UiHl 'l,~cn,ic8, especial, como PAS 0 'i,n1[lregnmdom]es argenti a ces

'~/:' '1- '0(0" -0' d -- , n '00·· :~'11,"', ..... trc (n ,- n); ' , c., ' : I r-.' dr -. - "1 A] E··· ''I''.

,J), , '. ....- '_e u_. '" lJl,rum,.f; ro _mm,. veas,e COiL ,0 -~ 'S'!i.O

se logra por medic de'], lavado de Ia muestra despues de

• d

su fijacion y de su deshidrataci6.n por pasaje por una se-

rie de soluciones alcoholicas de graduacion creciente, has ta llegar al 1. 00'0/0, para, eliminar e 1 agua. Lue go se emplean solventes organicos tales como el xilol 0 el toluol, que son miscibles en alcohol y en p,Qra_/i'n"a,; para eliminar el alcohol antes de la infiltracion de 'la muestra

!

con parafina fundid.a.. .

Cuando la parafina 'fundida se enfrfa y ge, endurece, se empareja hasta formar 'un bloque de tamano adecuado, denom in ad .: 0' taco Este taco se C,' oloca en un ,fl" -m-- a,il'q, "I U' in a

. . ~ _ _' ~ __ ~ I!l Il .. . .. !3. . .. . '. _ ~__ ~'" ._ . .. ". _ . _ ~ ~

cortadora especial, el microtomo, que 10 corta con una cuchilla de acero. Los cortes se colocan sobre un portaobjetos, a] cual se ha agregado albumina COl110 adhesive,

En el tercerpaso, se colorea la muestra

". du

para permitir su estua ,lO

La: muestras todavfa no son aptas para SUI examen

'11" 1 - f d

con ei rmcroscopio, puesto ,que O'S' cortes para manos

d- 1 p: lId' 'd

• ~ ill! .~._. • '. ..', ',,' -~ • lil~ ~jf," , • " -, .' ~ " - .. - . ", 'I - ~'I '. - '. • '... -,

carecen ,e c 0' O~, - ell,at CO or ear 08 COl tes '- -e teJ 1. .... ,0 Sf

e~.imina lat parafina con un solvente oi_g,anico COlno xilol o toluol y ]uego se rehidrata por pasajes pOl' un,a, serie de soluciones a'-,cob6Ycas de graduaci6n decreciente basta Uegar:al ,a.glla~ L'uego'e 'colorea,]a ,mueslra COIl he,mato~ xilt.na acuosa" Dado que el colorante de contraste" la ,eo',..' s,iJla,~ es mil. soluble iel1 aL~cohol que en ,agUal, se desh.id~r.ata n UeVaJIll1en te "a, ~ln uestra par 'p~.8Jlsa'i e p>or una seri,e; de

['!~ '1 ~

soluciones alcoh6Hcas de gradu,aci6n cn~cile:nte; basta

Uegru: a] 1000/0, Y se co].orea con eos,"na en alcohoL Des-, pues se pasa. pOl" xilol 0 toluol- se coloca en un Inedio de Ulontaje. no acuoso y se prot,ege con un C'tibreobjle.;tos;, de e ta Inane:ra" se abtlene un :prep'arado pel·ln.anent,e sim.i- 1 ar a los u t:m [i zad os en ilia. ,en .enan za y en los 1 aboratori 0 s de diagn6istico. En el'cuadro l-1 se presenta un r-esum,en d.e los colores con ,que ]a tecnica de HE tine dL,tintas celliulas y componentes tisuiares.,

Laf) l · d l "'I l · ajorma ina no preserva toe as as cetutas III

todos los componentes tisulares

Si bien las muestras fijadas con formalina y coloreadas con HE son titiles porque permiten apreciar detalles de la estructura general, este procedimiento es inespecffico v no pone en evidencia la cornposicion quimica de

, , -' ,01 " -' - - _- '.- -' , '" - ,~" ~'.. '_ _-. " .- '. ~ _.- =, ,--' '- -- , ,-

]05 componentes celulares, Ademas, en la preparacion de la rnuestra se· pierden muchos de ellos, Cuando se desean estudiar algunos de estes componentes 0 estructu-

. d 1 f '6- f 'I'

ras, que se pier en con a njacion eon ormanna, se. pue ...

den emplear otros metodos de fijacion. P'Ot ]0 general estos se basan en el analisis qufmico correspondiente. AsL el uso de alcoholes " sol ventes org -,anicos elimina

i' J'

]-O,',,:S: 11'''P~';ld" 0-' rs neutros ,;;;;Jo'n--- lo :--'S-' P .• ···l,.ep~- arados de rutina

,_ J!l. .' - j,~ ._._ ....... ._ - _ ._ ••. __ .- . _. __ "M ~(:_.

Para retener los ltpidos neutros, como los contenidos

- ~

POf los adipocitos, se emplean cortes- nor conzelacion de

'-- " -- ,,' _ _ . ~ _ - -, - -- ~ _ " . - 1""- - ' , - 0 - - _ ,. _ -- -

tej idos fijados en formalina y colorantes Iiposoluble: '; para retener las estructuras de- las- mernbranas se deben utilizar fiiadores especiales que contienen metales pesados como permanganato U osmio que se fijan a los fosfollpidos. E,) uso habitual de tetroxide de osmic como fijador para microscopia electronica e.s la razon principal de 131 excelente conservacion de, las membranas en las fotomicrograffas electronicas,

L '- "'" h 'l-" . I

a tecnica con r ematoxutna-eostna se emptea

hi l~ "" ." ,.'! .'

en _ IstO:O gia porque permite aprectar caractertsttcas

estructurales; 11.,0 proporciona informacion sobre

las caracteristicas quimicas

A pesar de los meritos de ia. coloracion con HE·. el nro-

,J: .' .. .. . - •.. - .. - . . - ~~ ['! - • -, - r-

cedimiento no pone en evidencia adecuadamente ciertos componentes estructurales de los cortes histologicos, tales COITThO elastina fibras reticulates membranes basales v-

" ,_..:;! _ _ "._ _, .","iIc" _.- , __ , __ _, _ . _, "' ".- ,,_, " __.. _ . ,,,._

lipidos. Cuando se desea estudiar estos componentes, se pueden emplear otros metodos de coloracion, en sou mayorfa selectivos, Estos incluyen el lJSO de orcefna y fucsina-resorcina para. el material elastico y de impregnacion

.i' '. I fib . 1 l~ b b

argenuca para as nbras rencu ares y as memoranas I; a,-

sales, No siempre esta aclarado el fundamento qutmico de estos procedinliellttos, pero son e.feictivos" A vec'es es lnas hnportante s,aber 10 ,que e] metodo permite observ.ar que conocer su ,me,c.anismo :intimo de ,acci6n.

HISTOQ-u1MICA Y CITOQU[l\1ICA

Los proced.imit!ntos quimi.cO's espec(fi'cos p'roporcionan

'" I"r. ';11' J - fl' d' 1. l fl· , ". ,I l- "'1- l

In.yorrna,cl(;n ael'a"a.:.a SO'f)r:eaunClon cte -as ceo u~as

-\1 de los ,Co.lnpo ne:ntes extr:ace lula re s de los tei idos

Los procedimielltos '~is,toqU'inticos y citoqufmic.os se basan en .la uniOn espe,cfjica de un colorante 0 en ',,] an~, tic,uerpo ,marcad'o c,on C'olorante jlu,oT,esC'e'l'lt,e contra

de''te~-'I''n'--lin: ,a'd<o-:: - c,---'o':'m-_. 'po--:'nc e'n···te celular- - o~ en;· '[a a,ctividad ,en~i' ... ,

.. l~ . =. H~_ ' "~ _ •• _ • ~ _ "'~ _._ _.. ., • • _ t _ ~ . • ••.. _ '_ _ _ _ _ _ ~

",' ~ ~'h· . ... , -~: 1 Ad' . ( ]

mattca: r.R,erente at un componente c,eJIlU ar.11elTI,HS, a

,au,torrtuliogr.ajfa detecta la. incorporaci6n, pot' las celu~

las y los tejidos, de precursores con :i sotopos radiacti vos de muchas de las grande'S nJOh3CU~as q ue se encuentran normalrnente en las eel ulas, antesde la fijacion. Muchos de estos procedimientos se pueden usar en los preparados para. microscopic optico .Y microscopic electronico,

Antes de estudiar la qufmica de Ja coloracion de rutina y de algunos de los metodos histoqufrnicos y citoquimicos, conviene examinar brevemente como se fija e incluve una muestra,

. .,

La composicion quimica de un tejido preparado para let coloracion de rutina es muy diferente de La del tejido :vivo

Los componentes que quedan despues de la fij acion son, en gran m edi d a.~ gran des In 0~ ecul as que no se di = suelven con. facilidad, en especial' despues de aplicar el fiji ad or. E s ta s gran de s mo lee u 1 as, en partie u lar las que reaccionan con otras moleculas de gran. tamafio para for= mar complejos macromoleculares, son las que mejor se conservan en. un corte histologico .. Algunos ejemplos de e s tos C ompl e j 0 S son:

_. Nucleoproteinas, forrnadas por .acidos nuclei-cos' ligados a, protefnas,

. ~

.' Proteinas intraeelulares del citoesqueleto, que for=

[nan complejos con otras proteinas ..

• Proteinas extracelulares en grandes agregados inso] ubl e s asoc i adas con m alec u 1 as similare s a tra YeS de en] aces cruzado s con mol ecul as veci n as, CQ1TI 0 . ocurre en la fcrmacion de fibras de colageno,

'. Complejos fosfolipido-pretetna (0' hidrato 'de carbono} de las membranas.

'En su mayor parte, estas molecules constituyen la estructura de las celulas y de los tejidos, puesto que representan los elementos morfoaenicos texturales, Son la

, ~

base de la organizacion visible en los tejidos con el :mi.-

C fOSCOoP] 0' opti CoO.,

En muchos cases. un elemento estructural es al misrna tiernpo una unidad funcional, POor ejemplo, en el caso de las protefnas que forman los filamentos contracts- 1 e s de 1 as ce lu las m u sell 1 are s .:' estos filamerr tos son los componente:s estructura.les visibles y ademas participan en el proceso de c.ontracci6u_" E] RNA del citoplasma se ve eomo pa.rte de un componente estruchJ.f·a! (e'rgasto-, 'r)i aSl11.a. de la.s eel'lll as g~' 1 and'll.! are s... sustancia de N i s s1 de

t ~,

] as n eu fO nas) y al m i sm.o ti empo e sun p.arti c ipante act] =.

vo en la s']'ntesis de p-roteinas ..

.Muc".l1os cornjJonentes tisulores se .picr:rJ'en durante

I "". d' I d' ·"d

a preparaClon, ···e ·,QS muestras ,':(? tCjl···',O para

fa c· o· ·1' '0' ''''Q' :.(_:'i i:o"n #""0· ·n· ·'~·e·m· .. ·a· . t·/1iX· ·,~l' ;·~'a·· . ~·e:·o·· ··s- ;·!'1'a·

t 1". • II': ., ,"' ~. ", " ....... . tJ.-, '" .~'V . ·.:,~;.r 4:', . '1" ", ~ ~~! ~:'" .

A pesar de que la. u_l2hyor paTte. d.e los acidos nucleicos.~ las protein.as·y los fosfolfpidos s'e oonservan ,en los co1'-· tes histo16gicos~ muchos se pierdelL En general se p'ierden 'I as protei nas y los aci d'9~5 'flU.·C] eicos pequ~fi os, co 1110 eJ R.NA de transferencitt~ durant~ :Ia prepa.r.acion de la

muestra de tejido, Tambien se pueden perder molecules grandes, por ejernplo, al 'ser hidrolizadas por un pH desfavorable de las soluciones fijadoras. Son ejemplos de moleculas grandes que desaparecen durante ] a fijacion de rutina en fij adores nell.asos ~

'. Gluco geno (u n g] d.G] d o que se ,2111 macen a en e l .~ n teri or de las celulas, comnn en los hepatocitos y en las celulas musculares) .

._ Proteog lucanos y glucosamino gin COl1 O~~ (h i dratos de

carbono complejos extracelulares q ue se encuentran en el tejido conectivo [vease p a. ]0:3]).

Sin e:ITI barge, estos .componentes se pueden censervar, S1. se utilizan fiiadores no acuosos 'para e] glucogeno

I~~ ,~ '1"

OS] se agr~gan a fa so] uci on fij adora agen = li gadore s

. ] ~'1 1 ..... II 'll] .

especia es que preservan as motecuias oe .a sustancia

f d - ·n'· .• I"'" ·d·'· C···· d ib · ~ . UIL amentat que contienen giuci :1.:08 .•...• '0'010 se escnoio

antes" tambien se suelen perder los ltpidos neutros durante las preparaciones histologic-as de rutina, debido a

] bilid d 1- ~. ".

. 'I' . - r. '. - - . _" , ._. .' , . ", I _ '., ," 1'11' jI" - I . ," ", 'I

su sou _I I I 8. .. 11 en so ventes org"puGos .

_.., ,

, .

En fa preparacion de muestras de tejido para

.s u inc l us i on en pa rafina, iamb ien s e pierden componentes .. solubles, iones Y' moleculas pequeiias

'En lamuestra histologica ya 1100 se observan metaboli:t08 intermedios, gIUCQ,sa., -sodio, cloruro y' sustancias simi lares, Aunque estas P •. Ieg .. [uefias sustancias 0:- se pierden

I ,r'" r

durante la prep · .. aracion de cortes de rutina coloreados con

• ~"' , • -oj •

·H.E; muchas de ellas, pueden ser estudiadas en prepara-

dos especiales, ·en general con considerable perdida de ]at integridad estructural, Estos pequefios iones y molecules s 0:1 ub 1 es no constituyen elementos tex (ural es 111 orfo gen i~ COS,;. .sino que son las sustancias capaces de ser procesa',d- :~I S·. 0··· q .. ue pa rtic :; pan e'n' 'I as re -a , .. c .ci 0···: 'n· e·- s c ··e· ··l~ ul ".1 "me e. EJ ao u a

.. u . .," .. W t.1. .Jl ...• ._. " ._-"., . .~. . . . '-' I!;,.I!,.L - _ C!, . - . '- Ie - ;( .,

una molecule muy versatil, participa en estas reacciones y contribuye a Ia. estabilizacion de 18. estructura macromolecular por media de enlaces de hidrogeno.

Fundamentos qufmieos de Ia coloracion

La hematoxilina v La eosina son los colorantes usados

,'" '

con mayor frecuencia en histologia

Un colorante' de ida , comO. ~a ebsina- lleva una ca~ga

,

..... . ..

,

Cuadro,-l ~2·.. A,{gl:lnOS' coloran.tes dci'dos y basicD'S

Color

Colorantcs. bJ.sko(\ Verde de l:netilo

A '''"U 1 d' e 'Il-'iie't'\le"o

~ .i;,.. d' ._. ., ~ .. _ •. " ... _ ~IJI' .

Pironitta. G·

A.zu 1 de tolu i.dina

Verde

Azu .. '1

.~

Rojo AzuJ

, .,

Col orantes. ~c]d.os Puc sina ~.d.da A.zu 1 :de ani1ina Rusina · NarrlJ.nj a 'G

R.ojo

:1\ Z'lll'll -~'!i., ;_'u,.Il

Rojo Nat'~nja

neta negasiva en su porcion coloreada y su formula general es N a'anil i na,

Un colorante bdsico lleva una carga neta positiva en su porcion coloreada y SU formula general es anilina'Cl ..

La bematoxilinano es estrictamente un colorante basico, pero tiene pro piedade s ti ntorial es In u y seme j antes. EI color de una anilina no se relaciona con su caracter acido o basico, segiin se puede observar en eel cuadro 1 =·2,.

Los colorantes bdsicos reaccionan con los componentes

. '; '" d l ,;.,. J d 'J ." 'd (

aniorucos ae ' as ce utas y ae l)OS teju: os . componentes

que llevan carga neta negative}

Colorantes bdsicos. Los componentes anionicos incl u yen los grupos fosfato. de los acidos nucleicos, los grupos sulfate de los gluccsaminoglucanos y los grupos carboxilo de las protefnas. La capacidad que poseen estos grupos anionicos de reaccionar con un colorante basica se denomina basofilia. Se dice que los componentes tisulares que se colorean con la hematoxilina exhiben basofilia.

La reaccion de los grupos anionicos varia. con. el pH.

En consecuencia:

• A" un jJ'H alto (alrededor de 10), los tres grupos estan ionizados y di sponibles par~ rcaccionar con el (:0]0- rante basi co poi med io de un iones el ectrostatic as,"

,. A un p'R' l ig erame nte de ido o neutro (5 -7); se ionizan los grupos sulfate y fosfato; que quedan disponibles para. reaecionar con el col oran te basi en p or medi 0 de uniones electrostaticas.

,. A un pH bajo (menor de 4), solo los grupos sulfate permanecen ionizados para reaccionar con las anilinas bas icas "

En consecuencia, se puede usar la tincion con colorante s bas icos a p'H control ado para central" eJ estudio en grupos anionicos especfficos, y dado que estos aniones e s pecffi c os predomin an en ci ertas m acrom 0 lee ulas, l81 tincion sirve como un indicador de estas macromolecu-

las"

Un prccedimiento adicional que se emplliea junto con

1 as {i n c ion es a pH con tro.lado es I a digestion enzim.ati c a. se'].ectiva de s u stratos del c.orte his to 1.6 gfuco antes de pro= ceder a la co] o.raci 6n (fig. 1-1).

COfll0 y.a se mencion6;, la bematox.ilin.a n:.o es un. colorante b,asico en sentido estricto. Se utiliza con un lnor ~ d'ie!r.lte, 0 sea un intennediario entre el componente tex'= tural v la, .anilina~ que hace q.·i-ue la tinci6n con este 'ultimo

.J ... II

se asemeje ,a la' de un colorante· b,asieo~ La' unfu6n en - el

ocnnplejo tejido= m"ordien.te-hematoxilina no consis,te en un slln'p--le enlace e'~ectfostatico v cuando la he]1uatoxHina

. ~

se ooio-ca en agua. no se disocia del t~jido+ A. cau.sa de

'est'o, lao he1na.toxilin.a. se pn~:.sta para. .los procedimientos fntodai,es en los que es seguid}a por soluciones acu.osas de colorantes acidos~ 'L-Qs color.antes basieos v,erda.dtrrQs~ a di lere.n.cia de ~,a. hem attox iIi na ~ por 10 general nos e usao en s,ecuenc i as en ~.as' q ne .al coM oran t.e basico Ie ·s i - ,gne uno acido; p orq ue 1 a an H ina basw ca tiende a di S'0- cial'se del tej Th do. d u:ra.nte los '],av.ado s e'n sol tIC iones .a.cuosa.s que :se reaHzan entre ambas coloraciones.

L l .... 'd ., -

os cotorantes aciaos reaccionan con ,t,.O'S grupos

cationicos de las celulas y de los tejidos, en particular los grupos amino ionizados de las proteinas

Colorantes dcidos ~ 'La reaccion de estos grupos cationicos con un colorante acido se denomina acidofilia, Las reacciones de los componentes celulares y tisulares con colorantes acidos no son tan especfficas ni precisas como las reacciones con colorantes basicos.

Si bien 13. union elecrrostatica constituye el principal factor 'en 1 a un ion primaria delco 1 oran te con el tej ido, . 11 0 es el fin ico y p or ill 0' tanto 10's colorantes acidos a veces se cmplean combinados para colorear en forma selectiva distintos componentes de los tejidos, Por ejernplo en In. tecnica de MalloTY' se usan tres colorantes aci =

.... '

dos: azul de anilina, fucsina a.cida y naran ja G,. Estes ti ~

fien con sel ecti vidad el colageno, el citopl asma en gene= ral y los eri trocitos, respectivamente. La fucsina ,acida tambien tine los micleos.

En otras tee ni cas con ani 1 i nas acid as nni 1 tipl es se em ~ plea 1.8. hernatoxilina para tefiir los micleos primero '.I despues se aplican los colorantes acidos con. el fin de tefiir selectivamente el citoplasma y las fibras extracelulares. La tincion selecti va de los componentes texturales pOi los colorantes acidos no. se debe. a propiedades especfficas de la anilina 0 el tejido sino mas bien a factores relatives, entre 108 cuales figuran el taman 0 :y el grado de agreg acion del coloranee y 1 a permeabil i dud y ,e~ gra = do de "densidad" del tejido.

Los colorantes basicos tarnbien se pueden emplear combinados 0' en secuencia (p.ej., verde de metilo y pi.ronino, para estudiar la sfntesis y la secrecion de protei-

n as'): p··~r'o estas c'''o' m bin "JI;Cl" o n es no "'0" n d Ci!; US" 0····· ta n e x "if I' , e n

1.1',' .': ",.0.,1' ~'·I!J.,· "" ,:.1, 1', :. ""'.:-_,1 ~.:.I ' .. '. ~ji. ,!,. .. I~ ,I : .. IIJ..~ ,·IIJ.-. =

dido como las de los colorantes acidos,

d l 'id -

Los componentes e ios tejtaos que reaccionan con .

coloranies bdsicos 0' con hematoxilina se denominan

b .... fil

.. -,., I" .-.' -,-: .....

. asol N,OS

Basofiliay acidofilia" Algunas sustancias intracelulares v la matriz extracelular presentan basofilia (gr. de

J .' .

. amar 10 basico)" 'es decir, ~reaccionan con colorautes ba=

sill co S '. Estos :iJ;l:c] Ulyen :

• La heterocromatina y los nucleolos del nu.cleo (debili-· dos pri:ncipa.lmente a los grupos fosfato ionizados de 10's ,ficidos :ouc'~eicos).,

• Componentes citoplasmtit.icos C-OillO e] e:rgastoplasm.a. (tambien debido a los. grupos fosfato ionizados del RNA)+

.. Sustanci'as extracelulares tales como los hidratos. de carbono eomp~.ejos de fa lna.trrz del ca:rH1a.go (debido a gru.pos sulfato ]onizados)~

Los COrJ1ponente,;r;; texturales que se linen con colo.ran.tes acidos se ,denominan. acid6filos

L,,· t"'_·· "'·6······ ··1" , ~. t "} /" ~'"d' 'J~ :. .'. -.' ··· f,·····,·'·

a InCln eon co oran 'es aCl_·O", es menos espeCl lea,

pe.ro una cantidad mayor de sustancias intracelula.res .y

].. ,- ,jO'_. ... tr~ .'. '. '1 ' i1 . '". - ... , - .:. ··t--· -: "'. " d-' ··f-' ll', ·S,,:' . '." ~ .. :·d-' ·''''f:''·

,,a malik-lIZ ex ace .ul,m presen"an aCl,- 0 <hla., .. on aCl_O.,l-

l;:.·s +

i!uJ.~_·J.l

.. -

j

, ..

Fig, 1 .. ·1 ~ l\,. Germen dentario en desarrol 10 tefiido con azul de to! uidina a pH 6:05. Obscrvese Ia tincion del ci topla .. m at de 10's ameloblastos (A. C) de. la dentine CD)" de '[a predentina tPd), del citoplasma de los odontoblastos (OC) y de. los componentes de la'papila dentaria (DF). 'E:I esmalte (E) en des arrollo no aparece tefiido, Eli azul de toluidina colorea lo So grupos anionicos (p .ej ."; CO Or" PO ~ 3-, SO II?") Y en. consecnencla presenta escasa especi ~ ficidad, B. Esta muestra (un corte de ] a misma serie que el de la fig. 1-1 A) fue tratada con la enzima ribonuclease para, eliminar el RNA del- tej do antes de tefiirlo con azul de toluidine, tambicn a pl 6.5. Notese que el citoplasma de los ameloblastos (~,C') y odontoblastos (Oi(.) ba perdido sulntensa coloracion dcbido a la digestion del R·NA. Como los micleos contieuen principalmente ON A., que 'no es afectado por la ribonucleasa, se tifien con gra a ,ir r tensidad y s u aspecto es simi L~ a] que a pa:rcce en la figura 1-·1 A '. Del mismo modo, 1(11 rnatriz dentinal (D), ] a predentina (Pa,) y lit]. papila dentaria retienen sus propiedades tintoriales, quiza debido ala presencia de compuestos sulfatados en la ·11::-UI!'tr1Z. EI:l este ejemplo.Ia enztma tibo~ nucleasa se aplico COll10 reactive antes de tenir la muestra, con el 11.n de contribuir a Ia idemificacion del RNA cuando se la 1J.1~a en forma combinada, segun se puede apreciar en las figuras ], -1 A Y D .. De acuerdo con los. mismos principios se pucden emplear varias otras enzimas, par ejempio lao

desex irribonucleasa y enzi mas para [a dcteccion de polisacaridos _ .'

'* Cas i todos ]OS filamentos citoplasmdticos, en especial los de las ce 111:~ as 'museu] are s "

• La mayor parte de los componentes membranosos intracelulares y gran parte del citoplasma no espec .. i ali~ zado de 0 tro modo,

'. La mayorfa de las fibras extracelulares (debido princi pal mente at grupos amino ionizados).

Ai {lunas colorantes bdsicos reaccionan

Ib _

con componentes texturales de

manera tal que su colpr normal varia de azul a rojo .0 purpura; este cambio de absorbancia se denomina metacromasia

Metacromasia. El mecanismo subyacente de este fe-

. .

nom en 0 es I a presen cia de po li ani on es en el tej ido ... ,AI

tefiir con una solucion colorante basica concentrada, co= 1]10 el azul de toluidina, las rnoleculas del colorante estan suficientemente .cerca 'COIn,o para format agregados dimericos y polimericos cuyas propiedades de absorcion son diferentes de -J/as .de las molecules de color-ante individuales no agregadas.

. Presentan rnetacromasia las estructuras celulares y tisulares que poseen elevadas concentraciones de .grup.os s u l fat ',0:' y. fo sfa to..,s~, J" [0'0' >n z ad [0'· c' tal es co: m o '1 ":I[ S' :···lIS:~ t q n c 1~ a, f -U" "1'1' ~

"" . -, u .'. .. .li .. '.. . , .. ' .....l poIrU., .. 'rill, l"u." 'LlI '.' ';" . lIJ.u .'. . lltl~A p_ 'Jli; ,

damental del carnlago, los granules de los mastocitos que. contienen be .. parina y el retfculo endoplasmatico rugoso de las celulas plasmaticas, En consecuencia, el azul de toluidina aparece de color purpura ,3 rojizo, cuando colorea estos componentes ..

G lid h .... d ~ d S hlff ru pOS 3JJ': e:, 1: 0 y reach vo e e ec · I :L

, .

La capacidad de la fucsina bdsica diluida [reactive

de Schiff) de reaccionar con los grupos aldehido

Pel fa cia. r un colo r rojo de te rminado e s La base de I as reacciones de acido peryodico-Schiff y de Feulgen

L '." d' I '" "d "'d" S~ h lff' . (P=!'AI,S) .'..... l

t.a reaccton ".·e,,~ actao ,peryi)"iC'O""_C,l-- !.: n'_:, 'tine . O'S

gl (lei do s y 1 as macro m oleculas ri cas en ghici dos, S e utiliza para. demo strar glucogeno len las eel ul as, mucus en di stintas celu las y", tej idos, 121 membrana b asal q".' , ue s u by ace a

• . ,_. • • •• • •• _ _I • ~ •• J , • ,., • ••• •••• - . _',. _' _. _.... •

los epitelios 'v la.s fi bras reticu lares del tej i do. conecti vo.

~ , 'III! _'

La reaceio« de F eulgen emplea una. hidrolisis acida debil

con cloruro de hidrogeno para. colorear el ,DI,N'A.

La reaccion del PAS se basa en los siguientes hechos:

, -,

'" Lo S" a- '1'11' 1-10.' '. s d" e 'i l'JIS'- h e 'W '0';;:' a' C' d" e '1-- 0' '. iC' :1'-110" nos ac a"" ri d'" 0 s 'p'if'!;

" J. . Jl .. , ",', ll!',;,ll,," 1.:,1-"\.":0''-' Ci' ... ,' . ·"0 .!Ii, .: I' .'v-w;,!l:;','.' . _" .. "",!v'~

seen carbonos adyacentes, cada uno de ellos con un grupo hidroxilo (-OH).

.. Las hex osami nas de los gl ucosamin oS1 uc a1),O S con ti enen carbonos adyacentes, con alternancia de grupos -OH 'H g···~rup·.:o" ·S··· amino (·_-·-N""H"·),,

) '._ ' '_" iQI;, "u" ,U .. :4 _-:"

.' El taJ,cido peryodico rornpe. la union entre estos atomos de carbona adyacentes y forma grupos aldehfdo,

'" Estes gru.pos aldehfdo reaccionan con el reacti vo de Schiff para obtener un producto de color magenta,

La ti nci 6 n de 1 PAS de 1 as mem branas bas ale s (vease fi g. 1 ~ 2) y de las fibras reti c ulare s se basa en e 1 con te ni = do '0 la asociacioa de proteoglucanos (hidratos de carbono complejos con un micleo proteico). La coloracion. del PAS es alternativa a los metodos de impregnaci 611 ar = zentica. basados tambien en la reaccion con las molecu-

~ ,

ilias de azu:c,ar de los proteoglu.canos,.

·a reacc i611 de eu 1gen sep,ara. las purinas de I a. d eso= x-:" rri.bosa del DNA pOl' hidr6F sis a,cida. de'bH; el anHlo del glucido se abre y forlna. grupos aldehfdo. Estos, a su vez., reae-cion-a.n con el reacH vo de Schiff p'ara dar un producto de color rnagenta., La re,accfu6n con el DNA es ,estequ,io.., metr.ica y, ell consecuencia, se puede usar en lnetodos espectrnfotornetricos para cuantificar e:l DN'A contenido en el nU,c.leo de una oe:~.ula,. El RNA no se colorea con el reactivo de Schiff pOl" carec-er de desoxirribosa,.

Fig!! 132~ Potomic rografta de tej ido renal tefiido con ~ a teeni c a del J?AS para demostrar y Iocalizar glucidos por metedos histoqufmicos, Las membranas basales son PAS positiv as, segtin se ev tdencia par su lntensa coloracion loj 0 pu r~ purea, Los tubules renales (T) se eneuentran bien deB neado s por la membrana basal tenida que los rodea Los capilares glornerulares (C) .'t el epltelio de In capsula de Bowman (Bel tambien poseen membranae basales PAS positives.

Digesti Oil eazimatlca

La digestion enzimdtica de un. corte histolo gico

que forma parte de- una serie colo reado para de tee tar

., .: . " , . .,.) ,'.", '-, _ .. _' . , " _. ". . _' ._.- ,', '_' . ' " , .,' . .,'

" ,

un componente especifico tal como glucogeno, DNA

o R'LVA, se usa para confirmar fa; identificacion

d l . l , ,.., 'do

et materia .. tentao

E] material intracelular que se colorea con la reac .. cion de P A,S se puede identificar como glucogeno par pretratarn i en to de los cortes hi sto 16 gicos con diastas a. 0 con a111Has~" La. eliminacion del material tefiido despues de estos tratamiento identifica posi tiv amente al glucogeno,

MICRt)'ESPECTROFOTOMETKiA ·D~ F,E[lL'GE:'

La ~nicroespectrofntom~tria de Feu]gen es una teenltc(t' d~s~r~llida,p',ar~- est~di;: 1'0;' iilcre111entos '-a,~

DN:~ 'en l!ts oe~pla~ en .desarro~lo y para anaijzH' La plaMta~ es decir las ~eces que se mnltip I~€a e] contemoo, flOl'mal de DN'A de una. celnla (se dice que una

of';,,1l::nla normal au ~ n o 'QI~ ,q..'ii.'df'~ dividiendo 6~ d;'~nloide

~~l.u l~ I, V.!L.l.!IL!J~ ~ ~:~ ~ 'of.' p~ ~'pt.Q u~~ At·, y I Uv,. ,,-~' l~ _ •••.•• _ • "~'

. un eseermatoeoide 0 un ,ovuillo 8011 hanLoNie'iC ~ vea.se n

--~~ '~r""'~ - ."_ .. - r._ • ."_ <." -. ". .' _'_'o ~-" .• - ~~' . r •. -_ ... .t-".;

SI)~ En 105 dldmQs afios se ha transformado en una herramieata muy vallosa para lO'S p,atolo,gos qui'rUfgi,.. cos, perna evaluar ,el potencial cm,etas.tatjco de Ul1 'tu=' mer lnlillguo y p.ar, facilitar las decisiones referidas atl p 'nno~tlco y al trat~m~ePto", L,~ tecniea de citome« tria t1std(lc(l de los cortes de tumeres tefildios con F~u~'g,en (a diferencia de la c,itfJmetrill Jle /lujQ', que s6Jo se pM~de ussr len cel1Jbu~ ahdadas) emplea micfoe:speott-ometrfa ~'copl~da a un sisterna de .i1TIJ1Ien.e's dlg<italiza6o J,lM,a medir La a:bS,Ol'ci6~ de Ius a 560 run POf las eelulas y los c'6mu~~r~ de c-tluiaos de los cortes coloreados Die esta manera 1'C~s patclogos pueden ,

.'_ -c- ,_.,'. ~ , , 'F-','" .I!i_~, __ ", -' '" ----''.' ~,~.,--.

A lbi ill d ~d' .;, ,- ;'t - •

u,'~~K~r]1.lr tOs. patrones e plOl :,ta de tli_j;enOcar:Cl.flOrnaS

(can~eres ;el~f't,eliaJ.@)s)~ Este. meru:odQ ha sido :pt1rticulilr .. ,

I lnente titil 'PlffJ3 !estndiar cancere:s de mama~ de I1n'On;, de colon i"1 otr'Qs ;,astroin$e8tina1,eJ5c~ de endome'trio

( '. '1· ") d ., S d· ~ d'

ep1te 10 U~61i.no·: y ,_e ()V~O~ :.~ ···.lce IqDe !Os, ,~<e:no ..

I ca:rcmornas. que 'Medlen pr-edooBn:io de patr'on diploid.e I est;!n bi\1n dif8renci~dos "i tiepen mejor pron,6~'tico ' que 1.0;8 mi.~,mog Ganceres, con an611ptoidla (m6J tip ill p-s,.

I ;OX) inte,lr~les de Ia cantidad. ha;plo~de de D,NA) y te~

traplaidla~ ..

I) . d . 'OJ ] di . .. d + ib

e lTI,O.,O smu ar, iapre ngesnon con .esoxirnnonu-

cleasa (D:NAsa) de cortes de tejido elimina Ia tineion de Feulgen en esas muestras, y la.digestion con ribonuclea- _ sa eRN,As.a) de cortes de epitelio secretor de .proteinas elimina la tincidn del ergastoplasma con colorantes basi- - cos (fig, i-I).

, .

T 'ambien se us-an metodos histoquimicos para identificar y localizar enzimas

en las celulas y los tejidos

Para Iocalizar enzimas len 108 cortes de tejido, se debe cuidar especialmente la fijacion para preservar la actividad enzimatica, POI' 10 general, el metodo de eleccion es 'la fijacion debil con aldehfdo.

En estes procedimientos se observa em producto de reaccion de la actividad enzimatica en lugar de 1211 enzima propiamente dicha, En general, se emplea un reactivo de atrapamiento ; un colorante 0- metal pesado, para atrapar -0 fijar el producto de reaccion de la acti vidad .enzimatica, que precipita en el sitio de la reaccion, En una reaccion tipica para detectar U Lla enzima hidrolftica, el corte histologico se co loca en un a solncion que contiene ,e] sus trato ,. (A.B)' Y un agente de atrapamiento (T) ,que precipitara uno de los. productos como se .sefiala a. continaacion:

. ~

,A,B -r; e4jzjm~? ATJ J + B

donde AT es el prodncto final atrapado y B es. el sustrato hidrolizado.

Con estos metodos el lisosoma (vease p. 85), identi ~ ficado en u.n principle por estudios de centrifugacion diferencial de celulas, fue equiparado a un componente vacuolar observado en fotomicrograftas electronicas,

~ . ~ .

En tejidos fijados debilmente, las .hidrolasas acidas y

las esterasas iicidas que contienen los lisosomas reaccionan con un sustrato adecuado, La mezcla reactiva co nti e ne ad e m '~~;Q io n ...... s p~. lom 0 pa" ra 'p' r e ci pita r po'· 'I"

" u ~ . d'" , __ ': "_ t'- !OILL,.') .I" .. VIl,.. . II L'_.!..··.' ":,, "', ~ ." ••

ejemplo, como fosfato de plomo derivado de la accion de la fosfatasa acida, Entonces se puede visualizar el

ducto nrecini d d l' . ... ,. .

pro ucto precaprta: .0 ce a reaccion con rmcroscopros

optico y electronico.

S h d ]1' d dimier h" _,.'.

e nan cesarroi a.' 0 procednmentos lustoquimicos

opticos .y electronicos para. demostrarla fosfatasa alcalina adenos intri fosfatasas (A TPasas) de rnuchos ti pos, entre ellos la A'TPasa activada por N-a+-K+, quees I~ base enzirnatica de la bomba d.e sodio de las celulas y de

l iid di ~ .

-. 'I ',', • ,IJ .: -[." ~.-' • 1, , . - • '''!'ito'',' \,' 1-' '. ,':r'. .. '. '. ." ,', . "!. -. ". ,. -:.- M . J ..... :.._

. os tejr lOS, I .• istmtas esterasas y nurnerosas- enZllnas les~,

piratorias (fig. 1=3) ..

Inmunocitoqnimica

Si" ,'}e inyecta una. plrotelna extra.fia U .o1'r'O antfgeno en un an.itnal se pr:oducen anticu~rpos

'U n alltic.uerpo es una proteina producida. pOl' deterrni~ n3:das ce]ulas sa.ngu:fneas que se une con la sustancia ex.'~ tr.a.fia que ,estimula. su producci6n y p,or lo generall31 p.re,-

Flg, 1 ... 3·., fin esta fotomicrograffa se aprecia la act~vid:ad. de la A'I'Pasa a ,[0 largo de, los plegamientos laterales complej os ~ en. Ia r1egi6n apical de celul as' epiteliales de vesicula bil iar- de conejo, Esta localizacion histoqufmica -corresponde ala localizacicn del: sistema de. transporte del sodio en estas celulas Icon transporte muy activo" x26 .. 0IJO .

r •• -

. ,

'. . .'

."

cipita, En e~ laboratorio se pueden purifi car y conj ugar los anticuerpos (es decir. unir por enlaces qufrnicos) con

.,. "." 1··' .. 'if:- fl·: , , ... -. ~."" "t-· ,'. n • 1 fl'" ., .,.' . ,.",~ , ... , -.. E - ~ ,

un co orante .' uorescen e ,como.a UOI escema, -, neon-

ces se a pli ca e ste reacti vo a. cortes de te j i do fij ados debilmente 0 congelados sobre portaobjetos de vidrio, con el fin de localizar el anttgeno en las celulas y los tejidos, Despues se examina y se fotograf a la reaccion con 'U11 microscopic de fluorescencia,

La especificidad de La reaccion entre aniigeno y anticuerpo es la base fundamental

d· I ' ~. _,;.". .

~a l.rununocttoqulmtCa .

•

En un procedim iento tfpi co se afsla una protefna especffica, por ejemplo actina, de las celu as musculares de una especie, porejemplo rata, y se inyecta en la circulacion Ide otra especie, CQ1TI:O el conejo, La actina estimula la formacion de anticuerpos antiactina que circulan e:n la sangre: del conejo. Se extraen los anticuerpos de la sangre de conejo se conj ugan con un colorante fluorescente y se usan para tefiir tejidos 0 celulas que supuestamente contienen actina, como los fibroblastos del tej ida conecti v 0., S i hay act] na.'r J os .anti cuerpos se u nen a ella. y se pued.e ver la reacci6n en v'irtud del coJorante fluorescen ~ t,e fU ado a Jos anticuerpos (fig+ 1 =4)~ Se usa un micros,copio d.e fl U ore.scenc.i a para mo strar la flu(}resceina; aho-.Fa unida indirectamente a] ant.igeno.· amb~.en es posible conjugar sustanc:ias como oro 0 ferritina (~una. Jnolecula q,ue contiene bjerro) a 1a fll0lecula de .anticue:rpo,. Estos marcadof'es se puedell. ver directamente con eJ. Jnicroscoplio eillectr6nico~

Fig, 1 .. "4,. Flbroblasto de pie] humans fotografiado en. eultivo con el microscopic de fluorescencie u La celula fue "tefiida" con un anticuerpo antiac-

. 'fi . d 1 I te fl "L .. ", ~' .' d id d , 1 1" 'J 1 1 '~'

tina especinco conJu~,a 0 con e coiorame "_', uorescetna. a reaccion a[ ttgeno-anncucrpo, pro~ucl a' irectamente en e en '~l'VO, resuna en a ocan-

zacion de la actina. LQ~ fllamentos de actina or.gan izados en fasefculos lineales aparecen fluorescentes y muestran sa distribucion 'ell esta celula fija, (Genti ~ eza del Dr" :E" S" Lazarides, 1 984.)

Los metodos histoquimicos enzimdticos se combinan con los metodos inmunocitoquimicos tradicionales

liti " l' "'; d l li · ""

para amp ,lj'lcar aun mas . a reaccton ze . ocauzacton

que se puede obtener con la fluoresce-ina

En esto. metodos se conjuga la enzima pe .oxidar a con el a,,,ticuerpo primario y una vez producida la reaccion anttgeno-anticuerpo, se demuestra la actividad de peroxidasa pOl' el procedimiento hi stoqufrnico, para detectar la localizacion del complejo (reaccion directa),

- ste meto do se puede ref nar aun mas por fij aci on de la peroxidasa a una anti-y-globuhna (anticuerpo secunda ...

.' ) f" ., 'lIJ· ~ ~ 'II .' r-' ]

1""'''0 - que : e ija at anticuerpo pnmano y amptrnca ra

reaccion (reaccion indirecta), Como el producto final de la reacc i 6n de. perox idasa tam bien es visible con el rni-

," , '". -.',- ,- ," ,,-, . ,,] . 0-"6' - ,~, ... *,. ,'. 't' «k ,-~ ," d"I ... '.---f- . ~'l'-.',~II ',- f.. ..

c:rOSCOpIO e eet omco, este metouo se aoapra racurnente

a la inmunocitoqufmica 'para ME. Se pueden usar anticuerpos monoclonales conju gados con ferritina -0 'con partfculas de oro como marcadores de anticuerpos pri-

m- ari 0' .1[.' P a ra 0'''' b . te ner I' 'D'C' all' z .. ';i,C'lIQ: : n es m i~;S" e xa ,At a: S··:· de l 0:' : S"

~(~~~ .. ~~ ":.. .. '. ,,_._~. ,v.. . ... .l[.,~.iIJ. ".1!2 ~ I'~ 'I < ... l'l[ ... __ ~_( ... __ L-l .-._ b .. "',

antigenos [en los cortes histologicos estudiados con el microscopic electronico de transmision de 10 que es posible C,' '0' "'n'- 1'0, '5·'. an ti cu erp'os p'. olic '1-10' •. ·n· ale so, tr,a·: d', 1" ci 0·'11'1 al e s .

. JL . . ...... ~.... ...... . .... , _ _" L .JJ. . . . .. \J1. . . . , . . _. JLJJ _._", .... .,_ ~

E[ metodo de marcacion indirecta tiene la ventaj a adi ~ clonal de que un unico anticuerpo secundario se puede 'us- ar para Joe-a.'! 'I zar 'na·.. union e specffi c a intra icelu lar ,-_ 0: ti su-

_, Q ' ii;IL , ' __ ,' , .,.,iIOJI,.l l , II.. '''~. iJi.. .It .,~'.Jl. 11.£, _ '_ ,_ J _ _ ,,[ ~") .

, ,

Iar con varies anticuerpos primaries diferentes. En los estudios con el microscopi 0 optico, se puede conjugar el anti cue: "PO secundario con di ferentes colorantes fluorescentes, pot llio que se pueden demostrar varias marcas en el m + smo corte de tejido,

, dl f''''

Autorrac mgrai Ia

En la autorradiografta se coloca una emulsion iotogrdfica sabre un corte de teiido p, -ara localizar

J' . ,r:}". 'J

material radiactivo dentro de este

. '

. Muchos precursores moleculares pequefios de moleculas de mayor tamafio, tales como los aminoacidos que son in corporados a las protef 11 as y ill os n ucl eotidos

, , " 1 ;' id I' ~ d

que se mcorporan a. os ac .• os nuc elCOS.-, se pue- en

IT areal' por sustitucicn por un atomo 0 atomos radiactivas en su estructura molecular y la consecuente radiac-

. id d ili d 1 t: 1 11;' ~I d

t - Vi, a ·1: utnrza a para ocahzar . a. moiecuras u e mayor

tamafio en las celulas y los tejidos. Se ha usado eficazmente este procedimiento pOI inyeccion de las molecula s pre ',C,' ursoras 'me . arc .ada S··: a an' 1" I]] a Ies a. p.or intr ,0.'·. d." uccion

,1.. . ._ ~ .. ~'" ~ __ ,L_. .,. . . u . . .l!!. -.....!. _ ~._ i;,. _. . . _ _ lIJ.... _"

de los precursores marc ados a Ins cui ti vos de celulas a de organos. De esta marie-fa se han estudiado la sintesis de Di"I····~A,:.'" y II:a' oosterio if division celula r la sfntesis y se-

" , . . . __ l' ~.!'L,_""'" '_' '.', 'V, .. Jt "_ ,' __ ,,' L ' , "" '-

crecion deprotefnas por las celulas. y la localizacion de

produetos sinteticos dentro de las celulas v en. la matriz

,,,.

extracel u 1 ar, .

Con esta tecnica .se montan sobre portaobjetos' los corte s h tstolo gic os que incorporaron el material radiactivo, 'En un cuarto OSCUl'O se sumerge e'] portaobjetos en una emulsion fotografica, p.al.'a formar una delgada pelfcula en la superfici e. Des pues de una ex pas] c i 011 adecuada, por ]0'

'1 d df 1 1· lsi if .

g enerai "~. e cnas 00 semanas ~ se reve a 'a emu S ton expuesta

del portaobjetos par medio de tecnicas fotograficas estandar y se menta permanentemente con un cubreobjetos, Se pueden colorear los tejidos antes o despues d~ la exposicion y del revelado. Con este procedimiento se exponen y revelan 108 granules de plata, de la emulsion sobre las. moleculas con marca radiactiva y aparecen como puntos negros sabre las p orci on es del tej ido, al examinar los con el microscopic optico (fig, 'ill ~ SA),.

Los granules de plata de la emulsion revelada se pueden emplear simplemente para indicar 10, localizacion de una s ustancia, 0 se pueden con tar 'para proporc ionar in ..

"j;" '6 . "'. b 1 id dl d

l ormacion semicuan u tab va sor re a cantida :.I~:. e una sus ..

. "' de '" d .' · .... ;r::. p.. . 1

tancra determinada en un S]lUO especmco. ror ejemp o,

de ~'p- ·ues de 1': nyectar en I· el .at),' m al ti mi di n . a tri i'~ ada. 1 as.

. ~ _ . _ _ _. _ ,,I. _ _ _ . _ _ _ . . _ _ .... II ... __ .. Jl]L. _ _..... !;.JI! llo,!ll, _. _ _.:> .... _ ,

celulas que incorporaron este nucleotido al DN',A antes de la 'divisi on" pero que aun no s,e 'hall di vididc, tendran alrededor del doble de granulos de plata .sobre sus nuoleos que las que se dividieron despues de incorporar el

nucleotide marcado, . .J- -,. .. -'<

Tambien se puede realizer autorradiograffa en cortes delgados de material plastico que se examiaan con el ME~ En esencia se usan 108._ mismos procedirnientos, pe .. ro como ocurre con. todas las, tecnicas de preparacion pa .. , ra MET" los procesos son. mucho mas delieados y diffciles. Sin embargo, tambien se obtienen resultados .con re.s001 ucion y 1 oc aliz acion muebo mayores (fig ~ 1 ~:5 B) '.

Historradi,o',gr,afla

La historradiografta es unafotografia par rayos X (microrradiografia} de una muestra colocada sabre

un portaobjetos ~ .

. ' \

La historradiograffa expone la masa igual que una ra-

diograffa cormin-Aunque los, rayos X se pueden usar

." • _ tI _ .,

nara examinar tei fudos bl andes, 18:U mayor utilided ,es para

Jt ... ... J .. . . .. I. J.... . ...

"

. .

Fig, ] .. s~ A,~ F utomicrograffa de un corte de ganglio linfatico de un animal a] que se le admimstr6, dm idina trltiada.. En algunas de las celulas se ven con glomerados de granules de plata metalica con el aspecto de peq uefias partfculas negras (flee-has). Estas oelulas se estsn preparando para la di vision y han incorporado la timidina a sus. nncleos. Al incidir contra los cristales de- haluro de plata de una: emulsion 'fotogr~f]ca que cubre la muestra por un cierto perfodo (exposicion), las parnculas radiactivas de haJj a energfa emitidas pOl" lao timidina tri tiada crean una imagen latente (como hace 13. 1 U z al incidir sabre la pelicula de una camara foto grafica). Tras el revelado del portaobi etas cubierto con la emulsion, la imagen latente, 'gue no es .... otra cosa que el hal urn de, plata act~ vado, se hace visi hie porque la sal se reduce a pl ata meta] ica, la cual aparecc como granules negros en el examen rn lerose .. opico, (Preparado original genrileza de E. Kallen bach.) B~ Autorradiograffa pOl' microscopic clectronico de la region apical de un a, eelola absortiv 3J, ] ntestinal, En esta muestra S~ inyectc en el animal t:251 unido a factor de crecimiento nervioso (NG F)~ y se extrajo el eejido li hora mas 'tarde. Se prepare la muestra en forma similar a la usada pm .. a el microscopic optico, como en la figura l- 1 A, S in embargo, debido a la mayor resolucion y a 105 detalles citologlcos y al tamatio relati vamente pequefio de los granules de pl ata, la local iZaJ,cl6n de'! 1251 - N!G F !es.· ]n1!ly precis~. N 6tese que los gr,atHl]Os de pi ~,ta se ,conoe·ntl"an 80 ore j nvagina,ciones ~,pic~les (h'i'V) Y to hulas et1docftko\S (tub). (Fotolnicl"Qg_rafiaJ" cOftesia de Marj.sm 'R, N'eus:tr.a,)

Fig~ l-61,. Microrradiograffa de un corte de hueso de 200 urn de espesor. Las 6- teas en neg 1'0 corresponden a tc j idos b landos; las ,i reas blanca. contienen altus concentraciones de sales die calcio: y las areas g rise s 'cl a ras Y 'OSCUJYlS reflej an mayor y m enor concentrac ion del mineral de calcic, respecti vamente. (Gentileza del Dr, J. Jowsey i '~984.)

el exarnen de 'COI''l,eS de hueso U otro tejido rnineralizado. En la practica, e:1 corte de hueso se coloca en. contacto

1 .; f. ,. fica sob b '. "

con una emu 8100 rotogra lea so re un portaobjetos y se

expone .a un haz de rayos X~ Despues se revela '[a ernulsi,611 fotograf oa y se observa con cl microscopic optico (fig. 1-6). En el portaobjetos se pueden agregar estanda-

de masa conocid b· . 'OJ'"

. • I .... "1 . ",',1. ..' I ",. - ,". -::::t. ,',:,,,, . . ,:' <3', ," ,'" • • 'I I .• iIl-

res e masa conocu a 0 preparar un portao jetos aux: Jar

tratado de la misrna manera, para. obtener datos semicuantitativos de la cantidad de-material ,6s'eoen distintas partes del corte. .

MICROSCOPIA

Micro copfa optica

Un microscopic, simple (de una .lente) '0 compuesto (de v ar i as Mente s) ~ es un instrumen to que amp '[] f ca. una imagen y permite la observacion de :mlayores detalles de los posibles a simple vista" El microscopic mas simple es una lentc de aumento 0 un par de anteoj os ..

E'I poder de resol ucion de] 'OJ 0 humane, es decir la

d· . fj,,' .•• r· •. 1 .. ~ - .~, do .: ·b· .' to d· b ." t- " . - ..' ..... do: ..' rstancia a ,,3 cuai . t?s 0 Jle os ie en es ar separa os pa-

ra verse COl.UO dos objetos (0,2 mm) se determina par el espaciamiento de las celulas fotorreoeptoras de ]a retina. EI microscopi.o tiene: por objeto aunlentar und in1agen

d ..._

h.a .. ta el rri v e] de rcsol uc:i on de la re ti na " para . cap tar la

Cuadro 1-3t Resolucion del ojo vs de instrumentos

Distancia entre dos puntos qu,(;: Sf! ven sepa rados

Ojo humane . Microscopic de campo clare rv~EB

MET

Teorico

Corte de. tej ido

O~05 nm l.O nm.

informacion. que d.e otra manera estana por debajo de cse nivel. E1 cuadro l~-3 compara la resol ucion del ojo

11 d di .

con la .•. ,e "J isnntos mstrumentos ..

El d d·' I '" ; I "d' d d I l

. poaerae re .. )"QUClOn esa capaciaaa ae 'a tente

dl . ..(. d . . d duci o ei sistema optico ae un microscopiode proauctr

imdgenes separadas de objetos que se encuentran

~ ,

muy proximos

L lJI··... d d ;'] d 1 . ,; + ., .

a reS0J1U:C10li:_ eperu e no. so 0 I'. e. sistema optico SIno

rambien die ilia longitud de onda de la fuente luminosa y de otros facto-res como el espesor del especimen, la calidad de la fij acion y 1a intensidad de la coloracion, Con una luz que tenga una Iongitud de onda de 540 nm (cuadro 1,-4), luz que pase p~r un 61trO' verde a la cual el oj:e humane es muv sensible, 'y: eon obienvos y' condensado-

~ ~ .' J .'

res. adecuados, el poder de resolucion maximo que se

puede ·alca:n.zar serfa de alrededor de ~OS" 0,2 J.lm. (vease

. . ,

en p. 17 06 no se calcula). Esta es la. resolucion teorica

,que; como ya dijimos, depende de que todas las condiciones sean optimas, lil ocular aumenta la inll1:gen pro-

d ~;" 1 bi ~ d~ l'

uctaa por et objetivo, pero no pne·.·:e aumentar ta re ...

I· .....

so ucton ..

Existen distintos microscopies opticos disponibles pa~

]- 11 .' l~ d '11" ~ • /' 11

ra e uso general y especia izaoo en ra mvesngacron y ell

es tu dio bi O'J () g'ru cos m odern os. Sus di ferencias se b asan,

ial b ~ 1 1 1· . '" em d

especia mente" sot re factores ta es como a ongitu ·~.e

fonda de la 'iluminacicn del. especimen, la alteracion ffsica de la Iuz que incide 0 sale de la mue stra y los proce-

alit . If den.anl + 1 "'-

sos an lIlUCOS especmcos que se pue _'len .apucar a ia ima-

zen final. En esta seccion se describen brevemente estes

e -

instrumentos y sus aplicaciones,

El mic roscopio que usan los estudiantes

e investigadores se denomina microscopio optico 0 dle campo claro"

.. MicTO.$,COp';:o de campo claro .. Este microscopic es descendiente direc to de los disp on i bl es a partir de rs 0 0 '.que inauguraron ilia primera era importante de investigacion en hi stologfa, En esencia, e'~ microscopic de campo c laro consiste en:

Cuadro 1. ~4~ Equ.i valencias en las Jnedidas .de longitud [ Angstrom '( A)- .... 0., 1 nanometro (run)

I 0' AngstlU1TIS. ;;;;;;; 1 ~O '1':1 an6me:l1'o (antes lniHn:li:cr6n m I-t) I JJOO nan6nletros - .~ .. 0 mjcro.rnetro ("un) [.atue~ (J-ll)J

1.000 luicrcj'me'tros ._ ~Jtrndfnletro (rum! I .

.' Fuente luminosa que ilumina la muestra es decir, una lampara por debajo de la pl atina,

'. Condensador que enfoca los -rayos de luz sabre la muestra,

., Platina sobre la cual se coloca el portaobjetos 0 muestra,

• Objetivo que recibe la 1 uz que atraveso la muestra,

• Ocular (0 par de oculares en JQS microscopies binocu'[ares de uso mas cOJlTI.·6n) a traves de los cuales se exa- 111]na directarnente la irnaaen formada p·or el objetivo ..

- -'

La muestra que se va a observar con el microscopic optico debe ser bastante fina COll10 para que la luz pueda atravesarla. Si bien parte de la luz es absorbida al pasar por el especimen, el sistema optico del microscopic de campo claro no produce un nivel util de contraste en la rnuestra no coloreada, Por este motivo se emplean los distintos metodos de tincion ya vistos. A continuacion se describen otros si stemas opticos que intensifican el contraste sin coloracion.

Ei" . ddt' . b

~ mtcroscopio ,. e contraste ae 'ase permue ooservar

... , I . id · I l " I·

ceiuias v tetiaos Sin co, orear v resu ta e soectatmente

~ ~ J ~

util para celulas vfvas

Microscopio de- contraste de fase. Este m icroscopio aprovecha las pequefias diferencias de 10's indices de. refraccion en las distintas partes de una celula v eon distin-

....

tas partes de una. muestra de tejido, La luz que piasa. por

. d .,!" d f ~ "( d )

regiones .. e mayor H1CllCe •.• e re rae CIon '·zonas '_ ensas:

experimenta una deflexion y queda fuera de fase con respecto aJ haz principal de las ondas de luz que atravesaron [a muestra, EI microscopic de contraste de fase aparea otras longitudes de onda fuera de. fase por medio de una serie de anillos opticos del objetivo y de] condensador, anula la amplitud de la porcion fuera de lase inicial del haz de luz y produce un contraste iitil sobre 13 imazen Las partes oscuras de la ima zen corresponden a

... ,' e·- " I . L· ., .. ·-'L: ,. L··· ,...... . .. ".'. I ".0· _._. .,1, ..

las porciones densas del especimen; las partes c]aras de la inldgen cor:responden a porci ones In.eno's densas del

"··E · I' . d

" 'I' -: ... Ii - - •• ' ."'. _. ;;::a... 1 '::!Ii ' ....... I . . '. ... ~. ,""I ,'-'. .", ..,,",". ~ .a.. .'

espec [m.en. _. n consecuenctaij e nllCJ oscop~,O . _ e contI as-·

'le de rase se l1 s a para observ.ar eel u 'I. as y tej idos vi va s .. ta·[es como [as celulas de. los cl~~tivos de teJido, Y p2lc'a e x ami nar cortes selui fi nos (de Ul1.o s 0,5 iJ;m) :no e 01 orea = dos de tejidos funcluidos en Inal'eriatl plastico.

D'os mod:ificaciones del mic:rosco'pio de contraste de fase son el fn,icrosC'op.i.o de inte,rjerencia, que permite ta.mbien cuantificrur la Inasa de tej ido y e.] .microscopio d:e' inte.t:/e,re'.ncia diferencial (que utihza e·~ siste·nla 6ptico de .N omarski) .. que es es:pecialuwente (itil para estudiar "[as propiedades de superficie de las. c~Julas y de otros elernent,o: bioI6gicos.~

E ,-.. . d' l h'· ..

n. e· mlcrosco.plO ,,;e campo osc.u:ro, e, o:''Jetlvo

n 0 r· :ei'" ,ib- e l:" i'" d· ·~l"·,~ec if n d·:a fa fu· e· nt·e· i:uml'n () '!:"a

. .• L~' . ·'IIi,,(, , . .", .... i"";"~ ":'i;.:..~ ... ,.: .. :.> . ' .. : :;, .• ),.

M~ ~ d E + •

lCrOSCQP·,tO :.' e c·a1[ipo 08curo., .. 11. este QIICIOSCOPIO,

el objetivo s610 lrecibe la ~uz dispersa 0 refractada .por las estructuras del'especiu1,en. Para ·~.og[ar]o" el m]CI"08~· copio de calnp'o oscuro esta. lequipado con un. condensa=· doOr esp'ecial que ilunli nat la muestra con luz fu·erte ind~~·

recta, En consecuencia, el campo visual se observa CO~ n10 un fondo oscuro sobre el eual aparecen pequefias parnculas brillantes de la muestra que reflej an parte de la luz hacia el objetivo.

E;Th efecto es similar a ]as partfculas de polvo que se 'len en e.l haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacion oscura. La luz reflejada por las partjculas de polvo Ilega basta la retin-a del ojo y las .ha-

ce visibles, ~

La resolucion del microscopic d.e campo oscuro no puede ser mejor ,que le del microscopic de campo clare, dado que emplea la misma fuente de longitud de onda. Sin embargo, se pueden detectar partfculas individuales mas p: eq u en- a s e n ·n a s l~ m ag en . es de· c am P 0··· o C' cur o deb ·;1 d·· o

l~ 1 ,:" ,.l ... " '·_.l.L t: ". , ",a .. _.I.: ,I, [,_. ," ... !~It!.. . ... _ 1 ~_ .:,!:_ '., I ... , r _ ••• "JIl. .. l~ ..

al mayor contraste creado,

, ~ .

EI microscopic de campo oscuro es titil para observar

au torradi ograffas ,. en. las eu al es los. granules de plata. ~e~ velados aparecen bJ ancos sabre el fondo oscuro .. Desde el punto de vista clinico es titil para observar cristales en la orina, tales CO]UO los de. acido urico y los de oxalate, y para detectar espiroquetas, en particular Treponema pallidum, e] microorganismo causal de la sffilis, una de las enfermedades de trarrsmision sexual, .

El microscopic de fluorescencia utiliza fa propiedad

. ... ,. .. .. l'" las bai

de tluorescerque ttenen ctertas motecutas .... ajo

~. ~

la luz ultravioleta .'

Microscopic de [luorescencia. Una molecule que fluoresce emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro .v is ib le, cuando es expuesta a una fuente de 1 uz ul travioleta (UV). El microscopic de fluore seen cia se u sa para rev el ar 1D 0 1 ec u I as flu ore-see n tes naturales (autofluoresce ntes) tales como la vitamina A. y algunos neurotransmisores. Como las moleculas autofluorescentes son. escasas, SUi aplicacion mas difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en eJ caso de la deteccion de antfgenos 0- anticuerpos en pro= cedirnientos de coloraci on inrnun {lei toqu f mica (fig. 1·~4). Tambi€n se _pueden inyeGtar mol€cuillas. tluores.centes es·pecificas en. un animal 0 difectan1ente .en celulas; y usar= las c.o:m.o mwcadores.. Estos lnetodos sirvie.ron p,aJ:'a ,es·tud i a-r I as II ni Ollle-S In t~l~C~ 1 u] ares (coOn hendi d Uf"1!)., pa.ra 11lar-car :~.a trayectoria de las f:ibras nerviosas ,en neurob ~ o·~o gi a y para detectar J:narcadores del c.[eCMln.ie·l1.t.o H.uoresce.ntes en tejidos Ininera~izados.,

Se insertan distintos filtros entre ilia fue-nte de luz . V v la mu,estra, para producfur luz fl10nocrom.atmca 0 casi

.., ,. '"

[nonoc:ro:nlat~.ca (iongitud de onda un:ica Or una banda es·-

. '. - , . ~

trecha)~ Un segundo grupo de filtros se inserta entre e:1

~ • llJ b·· 6J .. ·1 h

especfmen y elli oljetlvo, y' s, '.0 permlte. que .a estr.ec, .3.

banda de longitudes de onda de ][a fluorescenc:ia Begue hasta. eJ ojo 0 incida en una emulsi6n fotografica U otro procesador anaHtico ..

El rn,icroscopio de barrido co.nJl)cal con£b.ina

. d· . .,!' • •

componen.tes ··.·:e un m.lcroscolJ.lO opuco con un s,lsterna

de barri.do para dise,car op,ticarnenre ,el esp,ecirnen.

£~icr;osco.pi'o de barr,ido c',oll/ocal. .Este ·nicfoscopio es un siste..mBI! .:relativ.amente nuevo ,que se usa para estu~

1-

~---""""""~r IFoe'rrte.

IljJmino$o [(116 m pe re)

.:lente ·OO,nden.!1!C!dor'

'.: ,," .

-V

1\

I \

/ \

\ \

l \

I \.

I \

l \

/ \

\

I \

L~~~...... ~f~~·~~~

~ ,

I·

.. · ... lente

. ,obj e'TI'Vo

~ rmcgl€m '19 n . ',.1[0 p'ontall,k~ ~"""""'.:j;...[ ~. ~ vlsore

_ . ~'I']' ... ..J .... , -=-=

~ ~~

lerrfe 'oCH"Id e'n S(ldQr -,-

Hozde borrldo

[D·""'t-tor-

~"~-~~'-' -'

de· e I ectrenes

M~CROSCOP'IO OPfICO

" -I '.'

MICROSCOIPtO -IEiEc1i RON I CO Dr=- 'iRANSM ISI16N

Po rHa 11.01 de '~e ~evi$1i611

Fig~ l,,"~ Diagramas comparatives entre Ia marcha de rayos Iuminosos en el microscopic opticc (izquierda) como si estuvieran cebeza abajo, en e] MET (centro) y en el :MEB tderecha), Las.Jlechas representan ,el especimen y la Imagen aumentada proyectada,

dial" la estructura de los materiales biologicos, Emplea un sistema de iluminacion con rayo laser que es muy convergente y; en consecuencia, produce un punto de barrido muy POc.o profundo. La 1 uz que emerge del punta es di rigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada, Se utiliza un sistema de, espejos para. mover

_., e", '_"

el rayo laser a traves del especimen, il uminando un solo

punto por vel (fig. l-8)~ Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo movil y se guardan en una. computadora, Luego se puede llevar la informacion .a un monitor de video de alta. resolucion para crear una imagen visual .. La principal ventaja die este sistema es su capacidad de tomar imagenes de la muestra en cortes opti CoOS muy fines (aproximadamente W. um de e spesor) m Las regi ones fuera de foco se res tan de Ia imagen por medio del programs de ilia computadora, con 10 cual se cree una definicion maxima de la ima-

. , ... . .. _...... . . .." "" .. _." _. . . I ~ __ .. _ "'_. '" "

gen E- n e>l;,' tos a s"p" ectos la- m ic ro s c opi "Jir c o n- fo ('iI. al se ase

~. . .. ~ 'It, ...... ·._,L'-' _:. ' ,,1 ... :- . ~!~JI'."~_~"J". _',: ... i _ ',_ ~ ,:._ ',I ~ .. ~I~ __ ...... ~ ,:',6.-'~

. ,mej.a a 10', procesos de' imagene '.' par barrido de Ia tomograffa axial cornputarizada (rayos X) (barrido pOl' LT AC)., Las imagenes obtenidas con optica comun, 0 no confocal, contienen partes del especimeu en foco y fuera de foco superpuestas, por 10, cual no son tan definidas,

Ademas, al utilizer s610 la estrecha profundidad de la imagen e 1 foco e·.; posible crear imagenes multiples ,a ~diferentes profundidades dentro del esp6cimen~ AsJ, Iiteralmente se p,uede disec8:r cap,S! por ca:pa del especi-· 'me'n'" e·.n· fio.· ,d-: o· '.' sou e's· ·p.·e. ·S· o· "r- T',O:~iI-"If'fIb':'~en" e· s:· p' 0: 'IS," b:'m:e el'n" r'p' .}' e··:"JJ· .... la'

•. . ~.. L_~. _ ... _ .. . ~ !i;1:b ,ilLJI.... _J ~ ._ ... •• • • I _ _.~ _J!'!J • iWbII. '

- .

computadora para lograr reconstrucciones tridimensio-

. ][·1 .. " d" . .' '. . '. -. ";"" de ,.:.jl . .' -' /. . ... - - - 'D" I· d .... '.-' '-,'_ ~ ''''; .', . "'- '" .

naies ue una senet e estas imagenes .. _3l' 0 que es muy

definida cada imagen individual localizada a una profundidad especffica dentro del especimen, la imagen

• ',+. • . ltant bie d f-" id

tridimensional resu tante tarnbien es muy ue In .. a,

Ademas, una vez que la computadora reunio cada una de las irnazenes parciales se puede rotar la imazen tri-

_'- .... b "_ .. -" .. ".. - .. -' ... ".. . -_. ' . .0- .,.

do, ~ 1 . d b l' "1"

imensiona reconstruida y onservarta en cua quier

..... d

orientacion que se .:' esee,

El microscopic de lu; ultravioleta utiliza lentes de cuarzo y una fuente de luz ultravioleta

M'·' · d. I' r.A.... ,0, l L" I' ·

icroseopto .. te .·UZ uuravioteta.L« Imagen en e mi-

croscopio de luz UV depende de. la absorcion de ese Iuz par las moleculas de la muestra .. La fuente de luz U'V

ti ", . , . ~l mzit .d de ,:"' ',d-' ~ d' .' ", : ..... 2··0"'0"'[ ". p·:··, 'lli:-, tar to

uene una lI!on,t:::'I~"_u. .. · .. e on .. a "e unos '. ". nrn., or 0_8n-o,; .

'p-: uede alcanzar una resolucion de O.'~ H m En princip rio ..

.~. _ ..... _- . - _._ .!l.... !l _. _"_ ._.. '!i ",. r-. . . '" I _J •• ' •

. Ia microscopia UV' no es muy diferente del funciona-

.miento de un espectrofotometro, pero sus resultados son registrados en fotograffas, No se puede observar la muestra directamente a traves del ocular porque Ia luz

UV no es visible y dafia la retina, ,

El metoda- sirve para detectar acidos nucleicos, espe-,

If . I b ;' '. .,.. -"'''':;'-; de I 6' ..

C 1 icamen te . as ease s purl cas y pmmini cas! e '11 uc e .. ~tl-

d "T' . bi ,. , '1! det t t '" +.

o. am. nen es tItIJIl para 1· .. etectar pro .emas que conne-

d . d a, .. id S·~ l' 1 .

'Den '_ etetm·I'·na'.os am~noaCl_OS., '~:.J se e'mp .ean ongrnl-

d~S.· d •. ·I,,@,O·.··:n,--d·'a, e ~p';c e.c· "1If:1' C: :·a·· s· 'Pl •. ?I'ra l' a l'lul m:-" 1'11:' ,ae;' 6"[n . se" P'U' - eden

......._,.,.. .' . J!;.l!._ a . _ ._.. . . .. .. >Q!i.= _-_ '.' .. ~ _. _. ... , .' . _ _ _ .

ob:·t~·ne,::,·r" m'e·.'d-':l~C···;o···;nl-· e.::.:s· 'e-s·'pie.ctro-·· ··:.f:o.·· ... ,'t· o'ru' re .. t·r~'c.a~, CO.:.···n' e·.l mll'~CrO-

__ v _, ' .. _ _.l.~ ., __ " "_ " .. _. _ • _ . ,'. i= A·_· ~,_':" . .. .. ~ ~ _"'"_ I _ L

copio 'UV para cuantificar eli DINA y el RNA de cada celula. Segtin se describe en la pagina 6; tiene utilidad elfnica para eval uar e] grade de ploidfa (rmiltiplos de la cantidad de DN.A normal) en cortes tumorales,

El microscopic de polarizacion emplea la propiedad de las moleculas 0 espectro de moleculas

nU.I.;V ordenadas para rotar el angulo del plano de la lui; polarizada

Microscopic de polarizacion. Este microscopi 0' es una si mple modificacion de]. microscopic optico donde se coloca un filtro polarizante, denominado polarizador entre la fuente de luz Y' le muestr.a y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador, entre el objeti YO Y el 0: bservad o',r

....... [ .-:.. ...... , , ;(. . .. ,

Se pueden rotar el po I arizador y el anali zador; Ia diferencia entre sus angulos de rotacion se usa para dete .minar e] grade en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. 'La capacidad que tiene un cristal 0 estructura paracristalina de rotar el plano de la luz polari zada se denomina birrefringencia (doble refraccion). Exhiben birrefringencia, entre otras estructuras comunes, el musC1Ll[O estriado y las inclusiones cristaloides de las celulas intersti ciales testiculares (celulas de Leydig).

Mlcroscopla electrenica .

Dos t:i pO's de microscopic electroni co nos perm iten obtener datos morfologicos y analiticos sobre celulas y

iid 1- ~ '. I: .' ~ d .....

tej lOS:: e microscopio eiectronico o e transmision

IEspe'jo<s

de borrldc

(MET) Y el microscopic electronico de barrido (ME'B)+ E,] ME aven ta ja al mi cro scopic opti co en que 1 a 1 ongi tud de onda del haz de lu.z del ME es aproximadamente

.1200 de la del micioscopio optico ],0 cual aume:nta la resol uc ion en un factor de 1 03 ~

El microscopic electronico de transmision emplea

la interaccion de un ha; de electrones con una muestra para producir una imagen

Microscopic electronico de transmision. En principio, la "optica" del M.E'T es mu y similar a la del microscopio optico (fig: 1,-7), salvo rque el 'MET usa un haz de electrones en lugar de un haz de Iuz visible. Este microscopio se basal en los siguientes principios:

;;

• Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que ern ~ te electrones tcdtodo).

• Un dnodo, hacia el. cual son atrafdos los electrones,

• Una diferencia de potencial entre el catodo y el anodo irnparte un voltaje de acel eracion entre 20.000 y 200.,000 v 01 ts a los e:1 ectrones ~ que crea e 1 haz s.

~ .

'.' El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que. ] as lentes de vidrio de un microscopic optico.

E'~ condensador forma el haz y modifica el diametro del haz que incide en ·e] plano del especimen, :EI haz que atraviesa la rnuestra se co:1 oca en foco y se aumenta par medio de un objetivo, y se aumenta ann mas con una 0 mas lentes proyectoras ~ La imagen final se visualiza 80-

Hoz. 116ser

AperfUJre.

de I detectot

foto

mu Ifi P'~ ti co dor

Se porcdor de hcees d ncrlO'j.(~(j,

Fig~ 1 .. ·8.. D i agrarna de I a 111 arch a de ray 0 s en e i -rn iCtO;SiCOpl.O confoc al, (Gentileza de Sarastro, Inc., US A.)

D:ESARROLL,O DE LA MIC~OSC'OP1A

" , ',_- ELE,CTRO:NICA-c- ", c, - ,

'Los principios electronicos del MET 'J del MEB

, ~ t '1 d b d ... ...;a,~

80.0 simnares 1} .os I~ e un rueo c e ra.:yos catodrcos

(TRC" '~I d +..-.. d' iii' .' ~ ....

I~<;), como lOS U$,f3r_OS en un aparatoc e tesevision.

Los primeros ME constnndes a principios ge la ,d~ .. cada de 1 93o_, fueron desarrollados independie rte-

mente en V~Fl'~'Q''-'C' ,p""t:lfu'>e'e,C1 por cientfficos ,g;; ineenleros

~' .~' _" ~I. ',~. "._ .~I Af;~~._·.·~ _' ,.,1 ~ \iJJ,.lIj,ll.. .JJ:.] .. ':....~ "-1 '_ 1~~~JIj ~~'U-Q

que trabajaban con televisores, Aunque entonces Eire 'I estudtaroi1, a(i.u~~s. virus y -otf~'S' lltIti1tt~lia]es p,iracrts:' 1 talinos desecados con el M¥E~ recien en la deea,d,ll. de, 19'50 se desarrollaron metodos adeeuados de fiJa ..

ci An in C}U' l~l·.A'n-- ''\1 c 0'" rte que n~r- nu .. ':;)t~~ili\'"'O-'iII"ii l' fj anlicaei A'tOic

~ ,IV ~, .. ' 11., IF'-I'V ,~,. I .. 1.11j.;1 - -::' W llt~,.~1 ,I ._'~VllJ, ,' .. ~W;.l ~ ~~-'.!I!.JJ.~ln\.? V.l1lL

del rvrn~r como herramieuta de rutina en la investi,~aci6n. biologlca.

• I., 'Il

bre una pa'lZta'l'la cubierta pOl" fosforo, Las porciones de ilia mue s tra que. han sido atra vesadas po.l' ill O'S electro nes ap"'il"ece;n brillantes: las p. rorciones que absorbieron 0 es-

_!. _',_ (:. • ,'", ' .' , .':' " .'. r '~ .' .. ' J : •• : •• :.' •• '. '", ",' I . ", I • " _ . .:._. • __ • _ I; . ~. ," _ ~.' _ •• .:........ ': _ . :.'

parcieron los electrones POl" su densidad inherente 0 debid 0:" al a 0'[- eg .. ad 0':' d -e metale ',S: ·p'es.- ados d u ran ":,' te lac prep "",i;J'~:<:!i,=

..' 'c"_" ,:_ '.:~,,,,,,,=«,, '. "', ,1..1' ,111"_.1.,,,. :',:,",~_va ',,', " ' ,,_' . ¥ "~_I;(J!,,

C 't 6;11 del ,e; s pe c i me n, .aparecen os cu.ra s , Sec oloca una placa fotosrafica 0"" un de te "C, "to" "f' d -e· vid e 0" p "10'-' r e n cim a 0""

.'" c",i;:-, JIJ. "I_·O'· , .... u. ..... , .... ' t),,i . : r '_.:.". , ... I~', ., 1,.:_,~llc' ...

POt debajo de Ia pantalla del visor, con la finalidad de

ob t-~ n' ~ 1,' un··· '~",~: 0";'8< ~t·(,;; p .. ,~'~"'m' a> n· . ente d e }' a··· ';1 '~-n ';IiI 0' e :If'I' S,"'" ob ~'a 1 ';i.

v,!l,.Ii;,.o,I ..... :Jl. c-" ,l ...... ellL 'Il,J.v. ._ ....... .1, .,.._. .'!l., "_. ' J!L~ ·~o ~ ,.lI!."" oQI;.

pantalla,

Las m ue st ras para e I ,~itic'r:(}s co p,io el ectr6 n.ico

.de transmisi6n se preparan sabre La base del ,misrno princ.ipia que las para el mi'croscopio .opticoj,

pero requ.ie ren rJ1.et.odos rruls fi'nos

Los principios sobre los euales se basa la prep'ar.Elci6n de Jos cortes hjsto16gicos para lat observaci6n con ,eI MET S'Oll en eserrucla liguales .a los em,pleados para el mi= croscop i 0 6pti co, con :~ a. res tricci on adicfu onal de que eli cad,~t paso se trabaj.a con e.specfme:nes de magnili tud .3-4- o,.fdenes InenOl'es 0 Inas finos que los utiUzados para el 'Ollicroscopio o.ptico. El MET coOn una longitud. de oIlda en eJ haz de electrones de aproxilimadaillente 0,,1 ,!run, tie= ne una l"'e.soh~ci on te6rica de 0, OJ nln.

'D,ebj,do a. la gran ill·,eso~uci6.n del MET la. calidad de la fij aci6n, ,es dec i:r; eo! grado de preservac ion d.e la. e stru c=' tu.l'a s ubce1 ul a1' debe ser :~,a. me j .or pas i hie ~

I' .... , "" d "d l "" I"

La p'f'ep',(j racton ,,~e' ru:tl na ... >e .. os e s:pectme ne s pa r:CIa

. "I' "" '. d" · '''" · t,

nuc.rOSCOjJla e _ectronu:"G: e transmlSlOn. COffldenza con a

fl" . .... l ld 1. "d ·d' d- " d'

r ~Q' ,,"c···· ~()'}" c· ""'f'l o'ut·n ra······ ·.o,"u'n t'eg~ui~Q,:'e un ··a, ."V' 'f1·,0"" c· /'iin"

tt ~". l~ .. "._." . V'~ ~ 0 !JI"I 11.1~. ~~ _~l __ ~~ ~V'~ L.J! . .:_. ::- _ ' .~ ~. I~_ I.~ , ,I. 1_ !l,A.'.~' v

Un. b";!':ln/jr y," d··'o una .fi,'ac··· i'o··""n ""'/)11 tetr()'xid'o de osmi'o

- _~ "~:JJ~- ,_ "-~~ - . ~ J·~I!..·: ~_~ ... -.'. ~I~}..,. I· ... } I. ... .'.}. .. I ' I'" . '

El g1.utaraJdehido, un dialdebfdo,~, con.s,erva los con1po= nentes p:fioteicos al form,ar en la.ces cru zados entre ellos; el tetr6.xido de os'mio imparte densidad electrol1ica a las estructuras ceJ u lares y tj,g ul ares por ser un IlletaJ pesado, y as f aIJ1nentar I a ul ted or fornla!ci.6n de la imagen en el MELT"

En cond:i,c'ruones 'rudeales, se deben perfundLr los tej ~ dos con glutatra.ldehfdo y buffer antes d.e co:[tarlos del ani ... ,

mal" POI .10 general, se fijan para eJ ,ME piezas de tej ido no may ores de 1 mm 3 (comparado con 1 as mue stras para. microscopic optico, que se pueden medir en cln ),. ,61 proceso de deshidratacion es identico al empleado en 1. a mi era s copi a. opti c a ~ y se in fi ltra el tej ido con resi n a monomerica, p~or '10 zeneral una resina epoxi 'qi ue lueao

, '_' . . . . .., . . ,'=' ~ - . - --, '" . . ".. .. f.~, _, _ ,~~ e

']" '.

se poumenza.

El tejido incluido en material pldstico se secciona por medic de m. Icrotomos Q specialmente di sehados.

!v, ", __ ',,' _ 'co, ~ , L . U,jI... ,. i!:o ;.}!!.:;.-!.J 'I;r. _'~ _,' , . '~' ,_".;l< . -. ,

Ql'19 usan "",U' ch -ill' 11- as de di an '1·· an te

i!lt,l9 !YI'.;l'" ....,. _ "_Q _ _," ~ __ _ ",. , _

Debido al linntado poder de penetracion de los electrones el espesor de los cortes preparados para el mi-

Cf'O:"S"''"C' opio ele .... tron ~00''- d ',g,;, 'U- "'a''- nsrn Ision var rfa entre 5."" 0":-',' n ['TI

...... L .••.. ',i,..... .'~..:.'" _ ~~ .. ~ .. _' V : 1.-.' .,", .:.. _ •. _: '_, ~ JJ1I~1 ~ _' ... ','

y 150 nm Estos cortes son demasiado fines para poder ser manipulados; se la-s hace flotar desde el fila de la cuchi II a en la s uperficie de una bandej a 11 ena de lfqui do, se recuperan y se cOIOC~Ul en rejillas de malla de cobre re=' cubiertas par plastico. Bstas rejillas tienen .50=400 orifiClOS por pulgada 0 hendiduras especiales para observer cortes seriad os.

Noes necesari 0- elimi n ar el plas tico de las m uestras para .observarlas por el MEeT; mas bien es esencial su

presencia p"ar· i al e st ab 1.1";17 '11,1" '11.:"1'8.. estruc ~U' ras d ~ lo '$'-' co rtes

vriJil~" ·.:·.lL'~ ' .. ' U .~' ~~.~" 1J11!"":"'~_ ,W.I~·" ~O~·· .. : ... I!Jr. .. _:, M·· .' _ ~ Jl -'. - ~ .. '" _ :Vi;!

extremadamente delgados, EI haz pas,a por los agu jeres de la rej ilia de cobre, despues pOor la rnuestra y luego se enfoca la imagen so bre 1 a pantalla de! visor 0 sobre un a pelfcula fotografica,

. ·-T··~TC'···'I'·O·~::·:i vS.',"-p·:'-~D'C''':':'I':A:'L'D;-C·· 'E~·· L' ..~' C"'---!O····· DT'E:"'S-':·

P·~~i~~;~I"~'C···~O/'i:C':O~'TA.1'-E""'"L"",E:C,''-:'T_:"'·R- .• ,,6···.--,N~I,C.·.-A\' ~ ~~~ A'~nE ;RA'NSMISION ' .,'.' "'> .

Muehos ,d.e Ntls me(~odos hiistoquin~eos u8a:dos ,e,n 1ar micros1copia 6ptica baf,i, sjdo .adaptados para la, mic;ros~opia elect(6nicaJ. Em. ~mp~Leo dediaIdehfd.os de, baj 0 peso molectlla.i-; en p,mtictilar gl u[it~n .. alde.hfdol~ C.Q- .,

m- In ~ '1."....l1'''~ ~ p'-' I'~ n"!iloQi'li"l'"f'!;.;j;i! h·· g 'n,;i;li;'t"l"Ii"iIi~tl' d·· C"ii 1 o<j, '!!ip.-"ll'· t"" a,r'1" ~,n" d, iP.

._ v rl.f~ ~'"-'A. ~'~' _ ,.JIJ.:,I!_~" ~U~ Ur ~'~~AAU. " _ V .I~ ~ '_.:.' ~!t1i~. V I, •. ' '!iJ

I lllU'chos metodo~ his1togufmicos enzimii:ticO$ estand,ar '

1 ·'·d I 'b " A MET- d;'

,a tell L_ QS pa~~ . ,~ ~o. '~Ierv~caon ~c'Ou '. I _.1 _ ij' g, mW1U'~ 0' SIO~

10, COil m,edliflc.alciones meno,res _d;e buffers. y de Ieacti=, vn~ de ;atrapamiento~ Los pooerdimiento~ :p,9!Ia ;fosfa= '~,tl; 'Y e8,t~risa, :$e pan :adaptado bfuen plata el MET., POf' 10 ge~eJ?al Sie efectuiin las reaccion.es sobre cort68 de

, fe-jido de :SO ~ Qll,'~ d~spue.s se fiJa:n con tett~xLdo ~e osmie y: se h1a~uyen para 61 cOFte pima 1v1ET (fig. 1-3).

:- . L,a $ustttu,CiOfl del com:flueS't~ q lle QOl1tieJ}~ Ul~n. metal .p ei,ado por un c-clofante fluo:res,cenoo,.. pox 10 geI\eral'oomjug.adtl con un an~iGuerpo~ permite m~a: adatpt~cion de metodos ilTm~nQcitoqu.ftnio>~)8 p\i«,a, ~~ m·'= c,ro's(~opi.a ~lootr6nic~~, como. OeU11"!! ell J,a adaptCl[ci6n de Ia t;-eacci6n de 1a peroxidasa bps~d~ en el u.so de Qiaminobenciidjna~ Estas ,teicmcas '~ienen par .icuiar u.tiLidad ~ar,a, dil",c~dar las fuente8 celulares 3f' las vias intracelulares d,e de~ermin[1dos, p'loductos de seCfl8- cj_,Qn~ 1.a 10caliz~cm6tl de rooep:tores e~'pecifieCHs soble 1.8. s up erfic ie de -~as: celplas y lat 1 oc;aliz~cio'n illtta£8- 11Jl~r d~ ill'maCQS ~l s'ustratos ingeridosO;' D·e Plod,Q smnUhu~" las teclli oa.a- mils refinadas. perm,! tj,e1on e~1 de ... smroUo' de 311'tcn:radiograf(as de rutin.~ con ME como nJJ6todo d_e .jn~v~sti~~ci6D (vease fig" 1 ~$B).

.. -, Conde'Fi so dQr

Aiu$t~ .

- de, 10 - IPtoti fH:;:I

D~'of FOig mo b¢~~r··-' de compo

Es n ece sari a la colora clan de rutin a de los cortes para microscopia electronica

de transmision para incrementar el contraste,

~ ,

,'8"", ;j>"/'j n~'~n' l';{JI puedan o···'·'IJ' ·,snrv"" r v fotog raiia r

,l:J'!b~ l .t,._'I; ~:i ~~ L)l ~ s» ,. 1~ ~. > > i'~: l~ .'. ,"':'~ ,~. _," Il.r-~~: ~..: <4J Lt· ~ IV' .' .... e .. ,":fj ~ ~:.-

con focilidad los detalles de las estructuras celulares

Por 10·, zeneral la coloracion de los cortes p··.··a-ra mi-

'- e- .t~,_ ,_-, "'-_ '. , '_ .. ' .,' -' "

croscopi 0 electroni co de tran s rni s ion se real iza por m eel -i 0 del a ore or ado a ] ,8. m uestra de materi al es de ei e vada

~, - ._' - -,~ .-,~ -- _ -- --- ~~.- - . " .,' _., . ,. -, . _ ..

densidad tales c .omo l' ones d· f.l;, 1'0-": etales p'-. esad 0'''';;:' 'E, '. sto ...... io-

'. ·iJiJj_,- , ... ; i!t-ll. '........_ .__;. __ v 'V ~'i,;;.<~ __ 'r;,..,. ,!I, ¥I~" _JIl'l,;;.;-O ..... !.3'"1 _ .. a., ... ··'iJi J!. .:.'

nes de merales pesados se unen a los ted idos durante la fiji ac ion 0- 1 a des h i dra tack 611 -0 al sumerg ir 1 as mues trag en soluciones de tales iones despues del corte. El tetroxido de osmic que S~ emplea de rutina en el fijador se une a los componentes fosfolipidicos de las membranas, 10 cual agrega densidad a la membrana.

A menudo se agrega nitrate de urani 0 a las solucio- 11 e S alcoh 61 i cas usadas en 1~1l des h i dra taci on, con e I fi n de ag rezar densidad a los componentes de las uniones

1."_ I~

C el ul are s y a 0 tro S 8i ti 0 s La inmers ion secuen cia] en 80-

luciones de acetate de uranilo y citrate de plomo se usa ru tin ad am ente para. tefii r los cortes antes de observ arl os can el MET. S:I bien ann no se conoce con exactitud la qufmica de estas reacciones, los procedimientos empfricos derivados permiten la obtencion de fotomicrograffas el ectronicas de. gran contras te.

Iubo

Aius,i11~ .....iI-11 f~ ~e ..............

FIU'ent'e _ ! U'lm i rlIQ$(l , .•

L/'~ c -O··I'l'g' elacion -tr 'actura ~)"l' un m -,;;to· sd 'o .. - i"~ special

, W-.1;a _. P"il- .. ~ ,'~) .. _ (iV. .' ~~} .. _ MjI' ~~]' 1!;-lJ! iYI;a ~ l!;-]' ':'l]," ~~./._ '.~' .: _

, ' ,

de preparacion de to, mue stra para microscopia

l _"" d - , · _" d · - "

e. ec tron tc a , . - e t rans misi on.« . - e g tan ,l mportanc ta

en el estudio de membranas

El material a examinar puede estar fijado 0 no; en e] primer caso se e lim i na el f'] j ador del tej ~ do por m edi 0 de lavados. antes de procesarlo Se inl '1· ltra eOI tei ido ...• con un

_ '_ ._ __ _ L;! ", i(;-c,, __ " '__ '_ _ __ 0~ _ .• '_'.!Ii,.. ,'I;,.lI;._ ~_' Jl '~-'J A_ ._' v , _ ,~~,

cri OP,I· rotector como el 0: 1 icerol '\I' se cOon gela rap i d amen s=

.- .~.,,-._ -.-'.-.- ' ", . __ '. .- .-, .0- - ._ .-. . ',/ ,.-. '_ '- ' ... _' -- "-- .. _ .--,," '_'

te a unos ~ 160°C., Se previene la tormacion de crisrales mediante el uso de crioprotectores, el congelamiento ra,~ pido y muestras de tejido muy pequefias, Se coloca el te-

.'. ,- - d 'J- ., d ]- '6: f

, , .' . . ., '-,.. ." ." - - " •. , •...... ~. l -, ", ...• ," ..... 'J' ",' "," ,- .... ,". -.!i!!".. .-;I!!""

jido congelac 0 en e aparato c 'e conge, acr .. on- ractura,

- _

qu' e p' "0···, S/;;!I;~ una f'!'~ m : '''JI ra de vacfo v se fractura con el f '11 0-

_ . .!!;,;.o ...... _, Q ..... (ll. iQLJL, U _ ""'" -_.. ~ ,,J oJ' _ " ,.___ (; __ "_ J!, ,,ill, .~.

d hlll a

... ,',- '., .... ,. _., .... , ... " •. , 'v':' ,. , ..

e una cue, 1. . a 0 nav aJ.a .

De prefe rencia, elplano de fractura pa sa po r-

ia porcion hidrofobica de la membrana plasmdtica y expone $'U superficie interne

La fracture resultants de ~a membrana plasmatica pro= duce dos nuevas superficies. Se denomina cara E a la superficie que tiene detras at espacio extraeelular; se de~ n omi n a cara P a 181 superficie que tiene detras a'[ proto ~ plasma (citoplasma), Se puede dejar e:l tejido fracturado e n e-] ·'?IP·I' ar .at '0.'· •.. du r --"iI nte U'·· n per fodo . variab 1- e p- iero bre ve

_ . , . l Q. " !t-t_. . , . 0(,11;, ";,.;-" _ " . __ . __. _ _ 11, ,_, '_, '\f_ ,11,_ _ ",

para. que se evapore ~I agua congelada (sublimacion) y

Ilmogen -f'ino~

IP~ pile ~e $.'01' ldc .... ~~~=' (_PVi'il'ro, eculer) ~- ~~~:::!

Objet'ivo

I'm'ogen

i ntermed iic rae I

Pvpij 'lode $0 I id~

1"'-=----' de II obi,et'i '1'0 ~~~;;;;;;;;;;;;;;(

l¢,n1~ oondel1,sado!F

G!".II.x ~ I i '0 II' ~~~=;::::i . O~ii et,o'

~~~- (mve'$fr,C1 de' t~,~'jdc} ,~. ~~::-'

D i crfro 9 m,o' de, COf'!1IPO

IFue-n te I vm.

'Tlra'(,ee:to die' los, hQ¢~$

q ~'Q form(:Hi loa i mC1QEH1

Fi.g~ ] .. '9 ~ Dj agrarna de u,n Jl1.lcroscopi,Q 6:pt:uco :mod.erno con un corte transveTsal de sus COl1'lpOnenles fund o':n-uties y d~ 1 a rr~ ~t'C ha. de los rayos" (Gen _ '~i I,®za de Cur:1 Zej SS,~ Inc, ~ ThurnwQo-d,; NY.)

se destaquen en relieve ciertos detalle estructurales de la sup erfi cie intern a d e '[ a ]~11··· en'" brana P .. lasma ti G':~· E.· n to" ::'011'"

" ,. • .' .'."J ,._ ,_"",. u-es e ~ " ,,I,~, .. ,' ",'. .. ,~, . ~.~ ,

ces se cubre la muestra con platino para obtener una re'~ plica de la superficie fracturada, Se disuelve el tejido y la replica de la superficie se coloca en . a rejilla para ser examinada COIl el MET .. Eta replica revela detalles a nivel macromolecular (fig. 2·-6 y.

Con el microscopic electronico de barrido el hal,

de electrones no atraviesa la muestra, sino que explora la s uperfi c i e

Micro scopio s elec -t'·'(J"·',~'l·C"· -',~ de bar -rido E. =-':0,-· m U,C," h 0.· S''-, a s.~

_ II!e,;- ~'~IIl;. _. It.~. ~ (;.. . I~ .. I !J-, U' _ ~ _ __ _",I. !I! '-' _' j , •• • • '--'

peetos, este microscopic se a ernej a J11a.s que el ,MET a. los tubes de television de donde deriva lao microscopia electronica. Para analizar la mayorfa de los tejidos se fija '[a muestra, se deshidrata pOl' desecacion de punto crftico, se eubre con una pelfcula evaporada de oro-carbon, se menta ,en un taco de alurninio y se coloca en 181 carnara de muestras del MEB,. En los tejidos mineralizados es posible eliminartodos los tejidos blandos con una. '[ ej'~ y anal izar I as .carac terf 8 ti. c ~s es tructurale s del mineral.,

Se Iogra el barrido con el mismo upo de rastreo que explora el hal. de electrones a tra ves de la superficie de un tuba de television. Los electrones reflejados desde la superfjcje telectrones dispersados hueia atrds) y. los electrones forzados hacia el exterior de la s u perficie (electrones secundarios) son. captados por uno 0 mas detectores y reprocesados para formar una imagen tridi ~ mensionai en un TR C de alta resoluci on (tubo de televi~ . ion). ~.

Se pueden tomar fotograffa. .. · del TRC para registrar los datos 0 la image 11 en una cinta de video, Se pueden usar otros detector, ,';:. para rnedir los rayos X emitidos desde la superficie, la catodolumiuiscencia de las moleculas del t'ejido pOl" debajo de la superficie y los ,eJectrones de .Auger enlitidos en la superfic.ie~

Esta br6v,e· utrod ucci10n al US€) CQIllS(:'fU del .mi cros,copio' OIPtiCO e.sta dirmgida' a. los ,e~l'tudiantes que usar~t.tl e1 mi'cros.copio para la Qbservaci6n d'e [UllIla de os preparados h'~i'.· tolo-gtcos~ Si los si,gui,e:nt~s comelltarios p'arec,en eh:unentale. 8610 se debe~ a que 1a Inal'Qria de los que tls,an el ll1icfOscop,io no ap.rovlecha ' todas. sus

,ventajas~ A p - Co ar de 1.a actual dispo rtibilidad de .. ofisticados equipo:c. ,en muc'hos casos se 'c,a;rece de la ins,trulccion for-mal Fequerida. para s,aber u~·ar correc~amellte el microscopio 6ptico ..

L ,0, .!' ,'I J.,.,. ·.rlf;!l

-0 Sl:t_ miSs _opocos oneros,os y !u1e'll cOlrre~ ;"iOS 80~

10 fun.(~···onan en forma oipuma euando los trayecto.$ de 10 haoes de jlun1inac~6n y observ.aai6n estan centmdos y tie:nen un ajuste COffi6ctO. El'u&o die aju;&.tes yalinearnientos adecuad:os contribuYJe s.ustan.cialmente al reconocilruento de detalles muy di~l' ures de la mTuestra y .a 1a fiel manifestac··on de los 'Rot-ar,es _g,ara la vi-

, ... ' d·' 1 0 f' n~""

51011 • mrecta,o ,;I mlCIt) otogr:ru,]!s ..

L· ~.l .. .,"', .... ' ,~.!', F. h··'·"·· . " ,"_. 'd 1·", .}':., ~ . ...;I. 1'"

a Idlmll~aClon· .n.oe, "eT es 'lI:na,e 'as c"aves. 'u€ ,,a

M·u" . C h': o's ~YI'l1l' E' 1-" .... ], ',.·c'o····'n io 's' c,o·, ·lYn·' b' i nan l·_-a' l' car, ;'JiI"j pi :t'.L:1 ~f,<'( st 1. .. , 'u· e

. ,!. _. ! .. ,: {"."., ~.,. V!~)i· . 'j;' " . ! •. ,-J-! .~'~"~. _ .. __ :.. tJ !¥I.~··· ~'¥-~~{ ~1!J1~.~/ 1. ,·IJI

de un m icroscop i o elect roni. '0 de t roans 111 is ion ,Y lao de un microscopic electronico de barrido

d·, . 1 -,,' d

para aar un nucroscopio e ectromco oe

" ,,_,. b ,. d · l mi "I·' ·

transrmsion-barnoo que permtte e. microana. UHS

por rayos X· con sonda electronica

Con la configuracion del J\1EB se puede obtener una imagen de transmis ion si se inserta un rejilla de sosten a nivel de la muestra, se reciben ].0, electrones transrnitidos con un detector .y ... se reconstruve la imagen sabre un

.. . ., -, .. ~ _.,., ,,' .. ,. .,: .. ,.- ~ ." .... ' . .l' . . ~-e~" L .. "

TRC. Esta ultima configuracion de un MEB 0' rnicroscopio electronico de transmision -barri do (METB) facilita eluso de los in: trumentos para el microandlisis por ra yos X COIl sonda electronica.

Se pueden adosar detectores al mi croscopio para reu . nil" los raves X emitidos cuando el haz bombardea el

_ >!I ~ ~ ,

corte: histologi co, y mediante analizadores apropiados, se construye un mapa que muestra la distribucion en los cortes de los- el ementos que tienen mimero atomico mayor de 12 en concentracion suficiente para oroducir ra~

• ,_,._,- <.= •• , I" •. ',' ~ =._.~_.~ -'.1'. r.... .. ",. I"' ," = .. ~.t-" -._ ....

yos X en cantidad tal que se pueda analizar, En consecuencia el.MET y el MEB, se pueden convertir en sofisticadas he r rami en tas an alfticas ademas de su utili dad

'_~J'._ I -~!I..;J! " '... _ ~~ I; (:.1 ,I ,,_ .. ' _ .. l .~ _ L. _. . !I.. .. . . _"_. ,

C 0, mo 11n' ·stru m iento c "op t ~ cos"

~ ~.' , .. ill'~: ._. '. .1,1j,. .. ...-., 'l) ._ • .1' .. ' i

Se han construido microscopios electronicos de alto voltaje con voltajes de aceleracion

.q ..... ue ll·a· 'r ta .. 'n entre ,~!O·.O'·, 0·' ·,·0',0" '}.~ l 2~:'O"O" c. 0·'·'",0. "'0, \)0' ,It

:.... ..;_~ IV:_. .~.'!:;. [ '." d ... !! .... ._:' • .,·rr..· II- -e

Los NiE de alto voltaje (M; AV) han sido particularmente U tiles para estudi ar cortes his tologicos entre O.~,25~O~5 ~un_,::' decir 3-5 veces el espesor de los que se US-3.n en e] ME,T" convencional. Por medio del uso de pares de fotograffas en estereo se ha logrado una mejor comprension de la estructura tridimensi onal de las organelas y de las superficies celulares y examinar Ias rela-· ciones entre l.as distintas o~rg.ane[a.s citoplasJlnatic('ls.

, -- --I

buena IUicfQSCopia y w~,tii inc.,orporad.a en el dl~eiio .de ca.'·' todps los ntiC[io('~o'pios moderno~ q.ue:&6 us·an en la,bo·ratorlos 0 ipar~ la investigac-i6n. En hl figu.ra 1~9,e llusttan los- dos trays(.?tos de les Fayos lumiritisos y todO$

108 c6ntroles d·. 2fjute de un mjcrQlsGopio mod,~rno d.'

'La oratorio, y se dehe elupleaP' como gui'a ru seguir las, ins.truc:ciQ ~ les que se dan' a continu,l;ci6n pard obtener una ilumjnaci6n .ade:cuada en e'J micro:soopio"

Los ojl! S'[>f:S n~ces,ariQ$ p3 -a_ corns,eguir una buena ilumil)Aol6n Koehi~r s.-on P06Q'S- y sencillos~ LO$ pa.8,QS .a

'.

5'egulf son:'

Bnfbcar lamuest'a.

• Cerrar lel di· ;fra~ma de earnpo~... .~ ~,'

• Enfocar el :conoeus,ador J11ovlendol'Q hAtCHi arriba 0 hacia abaj-o' hasta que el eCHltO,!'lJ.O- de s.u diaftagma de campo ap,flre.zca bien '~iHdo (en foco).

Centrar el diafragma de ,oampo can lo~ cOt1trnles de c,entrado- de Ia su.bplathla (donQe esta e~ condens.a-

dO':iil")' LUIAg' A 'Sl'b'·lf-ir. ,,~J d··~ ,.,._£!....l':!II'O'.'I"fliiO;} de~ C''l)I'-ilnt''liAlJ!lo h· ~,;;:,""n n'I'~le

"_.J!. • --' _~!!i.I .1 V ~l. I _u.- ~} r.--;.. llAiU.l-"Q,It-.l:.l~U' . ". ..: !Ql~~.1.~ V UrDLa·~" ..

cubra todo el campo obse.rvado. .

• Retirar el ocular (0 usar un t~lesqopi.o de ,cenkado a

'" 1 A' d ~ '., dl d

un accesono teiescopico "e. J. use" s" 'e.' ispone ae

ellos) y observer la _puplla de salida del oibJet IV~,. Se

. ver,a un campo cir-cular iluminado C1UYO radio es directamen te prepare ienal a 1 a aperture " ull'te.,rLca del objeti vo, A medida qlH~ '" e cjerrat 61 diafra.g:ma del condensador S'U contorno aparecera dentre de este ca npo circular. Para 18 maYQr!a de los preparados te~ fiido~ se debe cerrar el diafra~ma deli eondensador basta cubrir aproximadamente dos te.rcio~ de la apertara del objetivo, EI resultado de este ~j iste es la avenencia maxima entre reso lneion y. contraste,

S' ~ ;,'", · ~ 1

,I 86 ponen en pracnca estes c nee Slmp'_18S cease-

jo· la imagen obtenida sera la meier que germita In op lea del microscopic Veamos ahora las rezones.

Prlnelpins de la mier'oscopia de eampq clare

Prirnero, lpor que se ajusta el diafra,glna de camp'o para cubrir solo e c.ampo observado? El iluminar un 'campo mas grande del que el sistema optic,o puede "ver' s610 conduce a reflexiones internes 0 a una p,er ... dida de luz, 10 que trae como conseeueneia InaYOI' "ruido" 0 una dismlnucion del contraste de la im,agan,.

Segundo, ,~po~ .quese pone enfasis en e:l ajuste del diafragma del condensador 0, en otras 'palabras, en la apertura de Iluminacic l' Este diafragma ejerce gran influencia sob.l'€; "a resoluci on y e centraste .. con IQ1J.6 se pueden obse var ciertos detalles en la muestra,

~:anl, la mayo cia de las aplieacione~s ,P1."~ctLc-a.s, la resolucion es determinada par la ecuaclon

A

donde

d ~ d]stancta entre Iospuntos d~] de~a11ex-es.uel~,o (er~ tun)

~ = lon,gitu,d de onda de Ia luz us ada (¥erde ~ 54.0 ,m~

A·. .... apertura nnmerica 0 seno de la JJ.1)1;ad del ~Jgulo ] jlnjtado

P Of r,OS r,~.yOi5 m4~, pe:rife,ric'Os que, P§!:J:ti endo d~ 'tl;11 iJuntp eualquiera del obj eto penetr,ijUl en el Qbj eUvO' (0 c,ond~ns.ador-) y contribuyen ,3, la t;ornl~ci\6n de l:a h:nagoo fllldtfuplicada por e] i]1d)ilce de 'fe,fraccil6n del medio inte.rpnesto, e' " 'e ,~i o:iJ,. j etivo (0' eQ~d~nsru1o(f) Y' 1a n'ruue~tta

tC'omo ejercen influenciia dwec:m 80bre 1a reS()}UJciOll 'l(l longftud de onda y la apertur.a. numerica? Las estru;c ... ' mra~' de 1a muestra r-e~;'aetan Ia 1uz. EI angsulo de :reft-ate~\ 'ci,6n 'fiS directamente proporcionru .a la longitud die onda. e invlersarmente p.ropoJtional a1 esp,aciamiento entre ~as

_. . - - ~ ---

estrueturas. Segiin. E:rl1St Abbe, un espaciamienfo estroctural dado salo ~H~ reo uelve cuando em sistema optico de observacion (objetivo) puede ver una cierta cantidad de Ia Iuz refraetada producida POf; 61 espaciamiento. A mayor ,Rp,eJ1;llra del Qbj~"ti.vo, mayor- eantidad de luz refractada participa en la formaeion de - a imagen con 10 que 86 resue lien detalles menores y mas imagenes son mas nftides.

Sin embargo, ):lueS', ra sencilla formula. demuestra que la aperture del condens ador es tan importante CO~ mo l~ apertura del obje;tivo. ESlt'Q es 16gLcoi si se ()Ol1_S.idera el angulo de refraceion de un ha oblicuo 0 uno de mayor apertur,a.~ En esencia, este Angulo se mantlene constants, pero es presentsdo al objetiv; de maners

'tal que es captado eon facilidad, .

lCom,o afecta el ajus:te de la apertura al contraste (qu:e no es mas que Ia diferencia de intensidades entre las areas claras y oscuras de la muestra) 1 En t.eor{a 10 mas eercano a fa trsnsferencia real de eontraste entre Ia muestra y 1£1 im,a,3en se obtiene por la interaccion Eintelfm'encia~l entre los - ayos ne ref acta do y 10'" re- I .fraetados.

Para la transte encia -de eontraste entre transmision total y aib~or-ci6n completa en una muestra la relacion ' de iut,ensidad··l1!_· e la Iuz refractada y la no refractada debe ser 1 ~ 1 co - el fin de obtener una interferencia de ". tructi va total (negro) 0 una interferenci a constructi'La total (blanco), Cu~dlo Ia apertara del condensador es igu,al a la ,ap,e.rturag.el objefivo, la luz no r-efi:actada 'pe.netr~ en el obj~t"!l.: '0 con intensidad compl~ta; psr-o la' luz refractada solo 10 haee en '. orma parcial, 10 que pmduc~ disminucion del contraste, En' otras palabras, al cerrat la apertura del cendensador has ta tos dos terciosde la ap,erturil del objetivo Be consigue una relacion de intensidad entre Ia luz refractada y la no refractada cercana a ': 1 y en consecuencla SB optimiza el contraste, 8j se ci~-a la apertllra del condensador (0 see baja el eendensador) y se pierde este equilibrio se prgduc~n fenomenos de interferencia 0 artificiosde la imal~n, tales como anillos de refraccion 0 Ifneas que rodean las dlstintas estruemras de la muestra, La rnayor parte de las tec'lti\c~ microscopicas ,eu. pleadas pa- I ra aumentar el contraste (p.ej., campo oscuro Ilaminaoipn 0,bli:c)::1a, con..traste de fas,e~ modula,ei6n ~ei CGHtraste) <e 'basan en ,sl m~tim'9 principia, ,6$ de;cir:upr]~ m,en 0 I'ednsen 1& int'ensjd~-:' de la ]u~.no re.fracmd,a_ pa~ ra ··ejorar un contraste de. la mU6',t,ra inherentemen~e

1b',ajo~ . .

8i Se sig.,en mos pas;os de8crLto6 y ~e manti~:- en 1 ~ mpjia~, las lentes~ 111 Isali.dad y fidelidad de las jmagelles observad.as 8,610 s,e modificaran de acuer-do con eI ren,.,. diJ:»iie --,to del siBtema ap! cjeo~