Mikrobiyoloji Agar Sayım Biyokimyasal Testler

1.
M ik r obiyoloj ik Ana lizle r ve G da Güve nir li i

Aç s nda n D e e r le ndir ilm e le r i
Sterilize edilmedikçe ve steril ambalaj materyali içinde muhafaza

edilmedikçe g dalar çe itli faktörlere ba l olarak de i en say ve
cinslerde mikroorganizma içermekte; hasat a amas ndan itibaren her
üretim basama nda mikrobiyal kontaminasyona maruz kalmaktad rlar.
Kontaminasyon etkeni mikroorganizmalar g da bozulmalar na, g da
zehirlenmelerine (intoksikasyon) ve g da kaynakl hastal klara
(infeksiyon) neden olmakta, sonuçta önemli ekonomik kay plar ve sa l k
sorunlar ortaya ç kmaktad r (Snyder, 1986; 1993). Günümüzde bu
sorunlar n giderilmesinde kabul edilen en etkin yakla m HACCP
sistemidir. Sistemin prensibi ürünle ilgili tehlikelerin belirlenmesi ve
kontrol alt nda tutulabilmeleri için gerekli önlemlerin al nmas d r. HACCP
uygulamas nda üretimin belli basamaklar nda fiziksel, kimyasal ve
mikrobiyolojik analizlere gereksinim duyulmaktad r. Mikrobiyolojik
analizler ürün güvenirli i ve raf ömrünün belirlenmesi aç s ndan büyük
önem ta makta, ancak sonuçlar n al nmas için geçen sürenin uzun
olmas sorun yaratmaktad r. Bu kapsamda, son y llarda h zl test
yöntemleri üzerinde yo un çal malar yap lmakta ve uygulamada ba ar l
sonuçlar al nmaktad r. Geli tirilen h zl yöntemler uluslararas resmi
kurulu lar taraf ndan da incelemeye al narak, resmi yöntem olarak
önerilebilmektedir.
1.1. Ür ü n Gü ve n ir li in in D e e r le n dir ilm e sin de

Ya r a r la n la n M ik r obiyoloj ik Ana lizle r
G da analizlerinde sonuçlar n güvenirli i aç s ndan ürün tipine uygun

örnekleme planlar n n seçimi büyük önem ta maktad r (ICMSF, 1978).
Ürüne uygulanacak mikrobiyolojik analizlerin seçiminde ürünle ilgili resmi
kurulu lar taraf ndan önerilen mikrobiyal kriterler dikkate al nmaktad r.
Bu amaçla g da maddeleri toplam mikroorganizma say s , indikatör ve
patojen mikroorganizmalar, mikrobiyal metabolitler yönünden
incelemeye al nmaktad r.
1
Toplam canl mikroorganizma say s n n belirlenmesi: Fermente g dalar
d nda g da maddelerinde kalite kriteri olarak kullan l r. Toplam canl
mikroorganizma say s ürünün raf ömrü ve ortam ko ullar n n patojen
bakteri geli mesi için uygun olup olmad n n bir göstergesidir. Bu
amaçla aerobik mezofilik bakteri say m yap l r. Her ne kadar mezofilik
bakteri say s ile patojen mikroorganizma say s aras ndaki korelasyon
kesin olarak belirlenmemi se de, say n n yüksek olmas genellikle
patojen bakteri mevcudiyetini dü ündürmektedir. G da zehirlenmelerine
neden olan g dalarda mezofilik bakteri say s nadiren 105/g in alt nda
olup, genellikle 106-107/g düzeyindedir (Bourgeois ve Cleret, 1995).
ndikatör mikroorganizma say s n n belirlenmesi: ndikatör

mikroorganizmalardan koliform ve di er Enterobacteriaceae grubu
bakteriler ürünlerin yetersiz hijyen ko ullar nda i lendi ini
göstermektedir (ICMSF, 1978). Escherichia coli ve di er fekal koliformlar
do rudan patojen bakteri indikatörleridir. Enterokoklar da indikatör
bakteriler aras nda yer almaktad r. Enterokoklar insan ve hayvan
ba rsaklar nda bulunan Enterococcus faecium ve E. faecalis den
olu maktad r. Genellikle E. faecium insan ve hayvan, E. faecalis sadece
insan ba rsa nda bulunmaktad r. Enterokoklar baz durumlarda su
analizlerinde fekal kirlenme indikatörü olarak kullan l rlar. E. coli den
daha dirençli olmalar avantaj sa lar, ancak E. coli den farkl olarak fekal
ortam d ndaki ortamlardan da s kl kla izole edilebilmektedirler. Bu
nedenle fekal kirlenme aç s ndan her zaman do ru fikir vermemektedirler
(Harrigan, 1998).
G da bozulma etkeni mikroorganizmalar n belirlenmesi: G dalar n

mikrobiyolojik analizlerinde ba vurulan di er bir yöntem bozulma etkeni
mikroorganizmalar n belirlenmesidir. Bozulma etkeni mikroorganizmalar
g da maddelerinin duyusal niteliklerinde olumsuz de i iklere neden
olmakta, bozulman n varl n veya olas l n , dolay s yla ürünün ticari
kalitesini göstermektedir. G dalarda mikroorganizma say s 106-108/g in
üzerine ç kt nda bozulma görsel olarak da izlenebilmektedir (Jay,
1986). Mayalar, baz Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium,
Alcaligenes ve Lactobacillus türleri g da bozulmalar na neden olan
mikroorganizmalar aras nda yer almaktad r (Forsythe ve Hayes, 1998).
2
Patojen ve toksik mikroorganizmalar n belirlenmesi: Patojen ve toksik
mikroorganizmalar infeksiyon ve intoksikasyon etkeni organizmalardan
olu maktad r. Virüslerin hepsi patojen olmakla birlikte, baz lar insanlarda
hastal klara neden olurlar. G da maddelerinin tüketici sa l aç s ndan
olu turabilecekleri risklerin belirlenmesi amac yla ürün patojen
mikroorganizma ve toksin analizlerine tabi tutulur. Bakteriler içinde
Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Aeromonas
hydrophila, Shigella sonnei, S. flexnuri, enteropatojenik Escherichia coli,
Vibrio cholerae ve V. Parahaemolyticus Gram negatif; Staphylococcus
aureus, Streptococcus (enterococci) spp. ve Listeria monocytogenes Gram
pozitif; Clostridium perfringens, C. botulinum, ve Bacillus cereus spor
olu turan patojenler grubunu olu tururlar. Baz patojen bakteriler
g dalarda, baz lar vücutta toksin üretmektedirler (Anon, 1988; Aran, 1993;
Doyle ve ark. 1997; Mortimore and Wallace, 1994; Pierson ve Stern, 1985;
Tunail, 1999). G da kaynakl küfler de toksik metabolitleri nedeniyle canl
sa l n olumsuz etkiledikleri gibi, infeksiyonlara ve alerjik reaksiyonlara da
neden olmaktad rlar (Austwick, 1984; Bullerman, 1986; Schlatter, 1988).
Bir g da maddesi patojen mikroorganizmalar veya toksinlerini yüksek

düzeylerde içermesine ra men tat, koku ve görünü ünde belirgin bir
de i iklik her zaman gözlenmeyebilir. Zehirlenme etkeni
mikroorganizmalar n infeksiyon dozlar mikroorganizma ve ki iye ba l
olarak de i mekle birlikte, genel olarak 105/g ve üzerindeki
düzeylerdedir (Bouergeois ve Cleret, 1995). Bebekler, ya l lar ve hastalar
gibi riskli gruplarda çok dü ük kontaminasyon seviyelerinde de (10/g)
sa l k sorunlar ortaya ç kabilmektedir (Anon, 1988; Frazier ve Westhoff,
1988; Jay, 1986; Synder, 1986).
Mikrobiyal metabolitlerin analizi: Mikroorganizma geli mesi sonucunda

ortamda olu an toksinler, laktik asit, diasetil, uçucu ya asitleri, etanol,
merkaptanlar, H2S, serbest amino asitler, asetik asit, amonyak,
histamin, tiobarbütirik asit, trimetilamin vb. bile ikler belirlenerek
ürünün kalitesi konusunda bilgi sahibi olunabilmektedir. H zl yöntemler
bu metabolik ürünler dikkate al narak geli tirilmektedir (Jay, 1986;
Sheridan, 1995).
3
1.2. G da la r da M ik r oor ga n izm a Sa y m Te k n ik le r i
1.2.1. Örnek Alm a ve Ör n e in An a liz e H a z r la n m a s
Analize al nan örnek al nd g da grubunu temsil etmeli (ICMSF, 1986),

analize kadar uygun ko ullarda saklanmal d r. Al nan örneklerin
ta nmas nda k r lma riski gözönüne al narak cam malzeme
kullan m ndan kaç n lmal , geni a zl , steril, ürün hacmine uygun kaplar
veya plastik torbalar (sadece kuru ve dondurulmam g dalar için)
kullan lmal d r (Harrigan, 1998).
Örnekler laboratuara orijinal depolama ko ullar na en yak n ko ullarda

ta nmal d r. S v g dalardan örnek al n rken ve örnekler laboratuara
ula t nda s cakl k ölçümleri yap lmal ve kaydedilmelidir. Dondurulmu
ve so utulmu g dalar n s cakl klar nda de i im olmadan laboratuara
ta nmalar sa lanmal d r. Örneklerin ta nmas nda kullan lan kaplar
dondurucuda bekletilerek so utulmal , dondurulmu ürünler çözünmeden
laboratuara ula t r lmal d r (Harrigan, 1998).
Laboratuara getirilen örne in genel fiziksel görünümü kaydedilmeli,

mümkünse hemen analize al nmal d r. Örnek hemen analize al nam yorsa
dondurulmu g dalar -20°C de, kolay bozulabilen (so ukta muhafaza
edilmesi gereken) ürünler 0-4°C de en fazla 36 saat muhafaza edilmelidir
(FDA, 1998).
Dondurulmu g dalar çözündürülmeden analize al nabilirler. Ancak blok

halindeki g dalardan örnek al m nda örne in çözündürülmesi
gerekebilmektedir. Bu amaçla örnek 2-5°C de 18 saat içinde; h zl
çözündürme gerekiyorsa örnek 45°C nin alt nda 15 dakikada
çözündürülmelidir (FDA, 1998).
1.2.2. Homojenizasyon ve Seyreltim
Toplam canl say m yöntemlerinde g da örne i homojenize edilir, gerek

görülürse (kat ise veya s v örnekte de mikroorganizma say s yüksek
ise) uygun oranlarda (1:10, 1:100, 1:1000...) seyreltilir. Seyreltimlerde
4
10 gram yerine 25 gram (225 ml steril seyreltim çözeltisi içine) veya 50
gram (450 ml steril seyreltim çözeltisi içine) örnek al m tercih edilmelidir
(FDA, 1998; FAO, 1992). Haz rlanan bu 10-1 lik (1:10=1+9)
seyreltimden 1 ml al narak 9 ml steril seyreltim çözeltisi içeren tüplere
aktar l r (10-2 ). Ayn ekilde ileri seyreltimler haz rlanarak (10-3, 10-4,
10-5...) her seyreltimden uygun besi ortamlar na ekim yap l r, belirli süre
ve s cakl kta inkübe edilir. Seyreltimler ayn pipetle yap lmamal , her
aktar mda yeni pipet kullan lmal d r. Homojenizasyon çe itli ekillerde
yap labilir; ancak, önerilen en uygun yöntem filtreli stomacher torbalar
kullan larak stomacher da 2 dakika homojenizasyondur. Seyreltimlerde
yayg n olarak peptonlu su (%0,1 lik pepton; pH 6,8-7,0) kullan l r. Son
y llarda ISO standartlar nda peptonlu fizyolojik su çözeltisi (%0,1 pepton
ve %0,85 sodyum klorür içeren) genel amaçl seyreltim çözeltisi olarak
önerilmektedir (Harrigan, 1998).
1.2.3. Be siye r le r inin H a z r la n m a s ve M u h a fa z a s
Kurutulmu haldeki besiyerleri higroskopik özellikte olup, s ya, a ve

neme duyarl d rlar. Muhafaza ko ullar orijinal kutular üzerinde
belirtilmekte olup, genellikle toz besiyerlerinin 25°C nin alt nda, dü ük
rutubetli ortamda saklanmalar önerilmektedir. Kullan m s ras nda son
kullanma tarihleri dikkate al nmal , belirtilen süre içinde tüketilebilecek
miktarlarda sat n al nmal d r. Topaklanm , ak kanl kaybolmu
besiyerleri kullan lmamal d r.
Besiyerinin haz rlanmas s ras nda deiyonize, dam t k veya ters osmoz
yöntemiyle elde edilmi sular kullan lmal d r. Suyun pH kontrol edilmeli
5,5 de erinin alt nda ise s t larak CO2 uzakla t r lmal d r. Homojen bir
kar m sa lanmas , kolay kar t r labilmesi için besiyeri toplam hacminin
iki misli hacimde bir erlende haz rlanmal d r.
Besiyeri önce gerekli miktar n yar s kadar su içinde kar t r lmal , geri
kalan su erlenin kenarlar na yap an besiyerini y kayacak ekilde erlene
ilave edilmelidir. Bu basamak önemlidir, çünkü erlen kenarlar nda kalan
toz halindeki besiyerleri otoklavda tam sterilize olmamakta ve
kontaminasyona neden olabilmektedir.
5
Agar içeren besiyerleri otoklavlama öncesi, yanmaya neden olmayacak
ekilde kaynama noktas na kadar s t larak eritilmelidir.
Otoklavlanmayacak besiyerleri bu kaynatma i lemini takiben petrilere
veya uygun muhafaza kaplar na da t ma haz r duruma gelmi olur.
Besiyerlerinin ço unlu u 121°C de 15 dakika sterilize edilmektedir.
Besiyerleri sterilizasyon sonras 25°C de orijinal ambalajlar üzerinde
belirtilen pH de erlerini sa layacak ekilde formüle edilmi tir. Bu
nedenle sterilizasyon öncesi pH ayarlamas yap lmamal d r.
Haz rlanan besiyerleri 50°C deki su banyosuna al nmal ve bu s cakl a

indikten sonra petrilere dökülmeli, su banyosunda 3 saatten fazla
bekletilmemeli ve hava kabarc olu mayacak ekilde kar t r lmal d r.
Petri kutular n n kapaklar nda yo unla ma olmas ve foto-oksidasyon
sonucunda inhibitör bile ikler olu mas nedeniyle besiyeri içeren petriler
güne nda bekletilmemelidir. Is ya duyarl katk lar besiyeri s cakl
50°C ye dü ürüldükten sonra ortama ilave edilmelidir. So uk s v haldeki
bir katk ilavesinde agar n kat la abilece i gözönünde bulundurulmal d r.
Katk lar n ilavesinden sonra besiyeri iyice kar t r larak (köpük
olu turmadan) petrilere veya muhafaza edilecekleri kaplara mümkün
oldu u kadar k sa sürede da t lmal d r.
Haz rlanm olan besiyerlerinin muhafaza süreleri besiyeri cinsine göre

farkl l klar göstermektedir. A z vidal kapakl kaplarda nutrient broth
veya agar 12-16°C de 6 ay muhafaza edilebilmektedir. Besiyerleri ktan
korunmal , agarl petri kutular kurumalar önlemek için, hava almayacak
ekilde ambalajlanarak, önerilen sürelerde 2-8°C de muhafaza edilmeli
ve hiçbir ekilde dondurulmamal d r. Baz besiyerleri k sa sürede inaktive
olan katk içerdikleri için muhafaza süreleri oldukça k sad r. Genel olarak
besiyerlerinin fazla bekletilmesinden kaç n lmal d r.
Kullan lan besiyerleri ve di er malzemeler sterilize veya dezenfekte

edildikten sonra at lmal , çevrede kontaminasyonlara neden olmamal d r
(Bridson, 1998).
6
1.3. lk Ya r d m Ön e r ile r i
Genel kural olarak çal rken besiyerleri solunmamal , deri ile temastan
kaç n lmal d r. Besiyerleri sodium azide , barbiton , cycloheximide vb.
toksik bile ikler içerebilirler. Bu nedenle besiyerlerinin haz rlanmas
s ras nda gerekli uyar lara dikkat edilmelidir. Herhangi bir kaza
durumunda ilk yard m uygulamalar bilinmelidir. Deri ile temasta
kontamine giysiler hemen ç kar lmal , etkilenen yüzeyler su ve sabun ile
y kanmal , t bbi tedavi uygulanmal ; göz ile temasta su ile y kanmal ve
t bbi tedaviye gidilmeli; a z yolu ile al nmas durumunda ½ Litre su
içirilmeli ve hemen t bbi tedaviye ba lanmal ; solunum yolu ile al nd ysa
ki i o ortamdan uzakla t r lmal , serin bir yerde dinlendirilmeli, t bbi
tedaviye ba vurulmal d r. Bu tip bir besiyerinin dökülmesi halinde
koruyucu eldiven, gözlük ve maske kullan larak dökülen materyal
uygun bir kap içinde toplanmal ve lokal düzenlemelere uygun olarak
at lmal , kal nt lar bol miktarda su ile y kanmal d r (Bridson, 1998).
1.4. H a z r la n a n Be siye r le r inde Laboratuar Kalite Kontrol

Testleri
Haz rlanan her parti besiyerine baz kalite kontrol testleri uygulanmal d r.
Bu amaçla önerilen testler a a da verilmi tir (Bridson, 1998):
(i) Besiyerinin pH oda s cakl nda (25°C) kontrol edilmelidir.

(ii) Haz rlanan besiyerlerinden al nan örnekler sterilite kontrolu için
2-5 gün 35-37°C de inkübe edilmelidir.
(iii) Stok mikroorganizma kültürleri veya taze mikroorganizma
izolatlar ile besiyerinin performans incelenmelidir.
(iv) Stabilite testi için depolanm olan besiyerleri ekim i lemine tabi
tutularak önerilen s cakl kta ve ko ullarda inkübe edilmelidir.
1.5. Ku lla n la n La bor a t u a r M a lz e m e le r in in Te m iz le n m e si ve

Sterilizasyonu
Yeni al nan cam malzemenin kullan m öncesi su ve bir temizlik

malzemesi ile y kanmas yeterlidir. Kullan lm cam malzeme ve di er
7
aparat için y kama öncesi 121°C de 40 dakika sterilizasyon
önerilmektedir. Daha sonra uygun temizlik malzemeleri ile y kanmal ve
deterjan kal nt s olmayacak ekilde durulanmal d r. Kullan lan pipetler de
dezenfektan çözelti içeren ortama at lmal d r. Bu amaçla kullan labilecek
uygun dezenfektanlardan biri Hycolin dir. Pipetler patojen bakteri
inokülasyonlar nda kullan ld ise Hycolin , Virkon veya uygun ba ka bir
dezenfektan içeren kavanozlara konulmal d r. Analiz bitiminde pipetler de
sterilizasyona tabi tutulmal d r.
Plastik petriler, pipetler ve i eler gibi bir kullan ml k malzemeler

at lmadan önce otoklavlanabilir plastik torbalarda ( Sterilin vb. marka)
121°C de 40 dakika sterilize edilmelidir.
Mikrobiyolojik analizlerde kullan lan özeler bunzen alevinde kor hale

gelinceye kadar yak larak sterilize edilir. Spatül vb. malzeme etanolden
geçirildikten sonra alevde yak l r. Cam pipet ve petriler uygun muhafaza
kaplar içinde, di erleri mikrobiyolojik analizlerde kullan labilecek ekilde
(pamuklanarak, kapaklar ile birlikte vb.) haz rlanarak etüv s cakl
160°C ye ula t ktan sonra minimum 2 saat b rak larak kuru s cakl kta
sterilizasyon sa lan r. Otoklavda sterilizasyon daha ziyade besiyerlerinin
sterilizasyonunda tercih edilen bir yoldur. (Harrigan, 1998).
1.6. Topla m Ca n l Sa y m Yön t e m le r i
G da güvenirli ini belirlemede kullan lan en basit ve yayg n analiz

yöntemlerinden biridir ve g dadaki mikroorganizma say s n n kabul
edilebilir s n rlarda olup olmad konusunda fikir vermektedir. Tek ba na
hiçbir besiyeri ve inkübasyon ko ulu mevcut mikroorganizmalar n
hepsinin geli ebilece i ortam sa layamamaktad r. Toplam canl say m
herhangi bir mikroorganizma grubu belirtilmediyse genellikle toplam
bakteri say s n ifade etmektedir. Uygulanan inkübasyon derecesine göre
saptanan mikroorganizmalar toplam mezofilik bakteri, toplam psikrofilik
bakteri, toplam termofilik bakteri olarak de erlendirilir. Toplam bakteri
say s Standard Plate Count (SPC) veya Aerobic Plate Count (APC)
olarak da belirtilmekte ve sadece belirtilen ko ullarda geli ebilen
mikroorganizma grubunu temsil etmektedir.
8
Toplam canl say m nda kullan lan ba l ca geleneksel analiz yöntemleri
koloni say m ve en muhtemel say yöntemleridir. Son y llarda k sa
sürede sonuç al nan çe itli h zl analiz yöntemleri, besiyerleri ve kitler
geli tirilmi ve uygulamaya geçmi tir.
1.6.1. Koloni Say m Yönt em leri
Aerobik mikroorganizma analizlerinde petriler ekimi takiben; anaerobik

analizlerde ise ortamdaki oksijenin çe itli yöntemlerle uzakla t r ld
ko ullarda inkübasyona b rak l r. Aerobik bakteri say m için önerilen
standart yöntem a a da verilmi tir:
1.6.1.1. Dökme plak yöntemi
1. Steril petrilere 10-1, 10-2, 10-3... lik seyreltimlerden paralelli veya

üçlü olarak 1 er ml (inokulum) aktar l r.
2. Agarl kültür ortam su banyosunda veya mikrodalga f r nda eritilir,
44-46°C ye so utulduktan sonra petrilere 10-15 ml dökülür.
3. nokulum ve agarl besiyeri petrilere ileri-geri ve dairesel hareketler
uygulayarak 10-15 saniye kar t r l r.
4. Sterilite kontrolu için orijinal besiyeri ve seyreltim s v s ile ayn
i lemler tekrarlan larak, inkübasyona tabii tutulur.
5. Besiyerleri kat la t ktan sonra petri kutular ters çevrilerek, önerilen
s cakl kta ve sürede inkübe edilir.
6. nkübasyon bitiminde 25 ile 250 (veya 30-300) aras nda koloni
içeren seyreltimlerin petrileri seçilir ve say l r. Aritmetik ortalamalar
al narak seyreltim faktörü ile çarp l r, örne in gram veya
mililitresindeki mikroorganizma say s (kob/g: koloni olu turan
birim/gram) olarak belirlenir.
Not 1. Seyreltim ve ekim i lemlerinin 15-30 dakika içinde tamamlanmas

önerilmektedir (Harrigan, 1998).
Not 2. Normal 8-10 cm çap ndaki petrilerde 25 den az 250 den fazla
(30-300) say da koloni olu mu petriler dikkate al nmaz. Ancak yakla k
say belirtilmesinde petri kutular dörde veya sekize bölünerek bir
9
de erlendirme yap lmaktad r. Konu ile ilgili dikkat edilmesi gerekli di er
hususlar American Public Health Association (APHA) (1993), Association
of Official Analytical Chemists (AOAC) (1990) ve Borcakl ve ark. (1994)
gibi kaynaklarda yer almaktad r.
Not 3. Toplam bakteri say m nda APHA, (1978) taraf ndan farkl s cakl k
gereksinimleri olan bakteriler için 5-7 C de 7-10 gün, 20°C de 3-5 gün,
45°C de 2-3 gün veya 55°C de 48 saat inkübasyon önerilmektedir.
1.6.1.2. Yayma plak yöntemi
1. Agarl besi ortam (10-15 ml) steril petrilere dökülür, kat la mas ve
yüzeyin kurumas sa lan r.
2. Yukar da belirtildi i ekilde haz rlanan seyreltimlerden 0,1 er ml
petrilere ekim yap l r, steril drigalski spatülleri ile besiyeri üzerinde
homojen da l m sa lan r.
3. nkübasyon ve say m, dökme plak yönteminde oldu u gibi yap l r.
Mikroorganizma say lar n n belirlenmesinde ekimlerin 0,1 er ml
yap ld dikkate al narak, bulunan de erler seyreltim faktörü
yan nda 10 ile de çarp larak örne in gram veya mililitresindeki
mikroorganizma say s olarak belirtilir. (kob/gram)
Not. Staphylococcus aureus gibi baz bakterilerin analizlerinde 3 ayr

petriye toplam 1 ml (0,3ml, 0,3ml ve 0,4ml) ekim yap lmas ve
sonuçlar n tek bir petri kutusu gibi de erlendirilmesi gerekmektedir
(FDA, 1998).
1.6.1.3. Spiral plak yöntemi
Besiyeri içeren petri kutular na spiral eklinde ("Archimedes" spiral),

konsantrasyon merkezden kenarlara do ru seyrelecek ekilde ekim
yap lmaktad r. Bu yöntemde agarl besi ortam n n her bölmesine
b rak lan s v miktar bellidir. nkübasyonu takiben say m sisteme ait bir
ablon kullan larak gözle veya lazerle çal an elektronik say c larla yap l r
(Fung, 1995). Yöntem çe itli g da maddelerinde bakteri, maya ve küf
analizlerinde AOAC (Association of Official Analiytical Chemists)
10
taraf ndan onaylanm , APHA (American Public Health Assocation) ve
FDA taraf ndan da önerilen bir yöntemdir (Karwoski, 1996).
Spiral plak yönteminde ayn petride oldukça geni aral ktaki seyreltim
sonuçlar n bir arada görmek mümkündür (500 ile 500 000 kob/ml gibi).
Yöntemin ba l ca avantajlar mikrobiyolojik analizlerde ekim i lemlerinin
kolayla t r lmas , tekrar say s n n azalmas , kültür ortam tüketiminin
%61, petri sarfiyat n n %83 oran nda azalmas olarak s ralanmaktad r
(Grappin ve Piton, 1995; Harrigan, 1998).
1.6.1.4. Mem bran filt rasyon t ekni i
Membran filtrasyon yöntemi ile klasik say m yöntemlerinden farkl olarak

çok daha fazla miktarlarda örnek analize al nabilmekte, dolay s yla
örnekte mikroorganizma yükünün çok dü ük düzeylerde olmas
durumunda da mikroorganizma say s n n saptanabilmesi mümkün
olmaktad r. Membran filtrelerin yap s selüloz asetat, selüloz nitrat veya
selüloz ester kar mlar d r. Membran filtrelerin gözenek büyüklükleri 10
nm ile 8 µ m aras nda de i mektedir. Mikrobiyolojik analizlerin
ço unlu unda 0,3-0,7 µ m gözenekli filtreler kullan lmaktad r. Örnek
do rudan veya seyreltilerek membran filtreden vakum alt nda süzülür,
membran n yüzeyinde kalan bakteriler membrana uygun bir besiyeri
veya besiyeri emdirilmi absorban ped üzerinde inkübe edilerek
saptanmaktad r. Besiyerinden besin elementlerini absorbe eden filtre
üzerinde mikroorganizmalar geli me göstermektedirler. Standart
besiyerlerinden farkl olarak membran filtrasyon için geli tirilmi
besiyerleri vard r. Membran filtreler su, içecekler, eker çözeltileri ve
havan n rutin mikrobiyolojik analizlerinde kullan lmaktad r (Harrigan,
1998).
Yöntem, su ve berrak içeceklerin analizlerinde ba ar ile

kullan labilmektedir. Kat g dalar n analizlerinde ise seyreltim çözeltisi
içindeki partiküller filtrenin t kanmas na neden olabilmektedirler. Bu
dezavantajlar n giderilebilmesi için ön filtreler geli tirilmi tir.
11
1.6.2. En Muht em el Say Yönt em i
G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 lik peptonlu su ile homojenize edilir
(10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her bir
seyreltimden içinde s v kültür ortam bulunan üçer/dörder/be er/onar
tüpe 1 er ml inokule edilir. noküle edilen tüp say s artt kça analizin
hassasiyeti artmaktad r. Ancak uygulamada yayg n olarak üçlü tüp
yöntemi uygulanmaktad r. Ara t r lmakta olan mikroorganizma için tipik
geli me gözlenen (bulan kl k, gaz olu umu, renk de i imi vb.) tüplerin
say s kaydedilir (FAO, 1992; FDA, 2002; Harrigan, 1998).
Üründe mikroorganizma say s dü ük düzeyde ise tüplere daha fazla

miktarda örnek ilave ederek, mikroorganizma say s n tespit etmek
mümkün olabilmektedir. Bu durumda s v örneklerde tüplere ilk
seyreltim yerine örne in kendisinden 1 er ml (100) ekim
yap labilmektedir. Kat örneklerin ise ilk seyreltimlerinden 10 ar ml
al narak içinde 10 ml çift güçlü s v besiyeri (orijinal besiyerinin iki misli
konsantrasyonunda) bulunan üç veya be tüpe 10 ar ml, tek güçlü 10
ml s v besiyeri bulunan di er üçlü (veya be li) seriler halindeki tüplere
ilk ve ileri seyreltimlerden 1 er ml ekimler yap larak uygun ko ullarda
inkübe edilir.
Seyreltim oranlar dikkate al narak En Muhtemel Say (EMS) (Most

Probable Number=MPN) Çizelgelerinden örnekteki mikroorganizma say s
bulunur (FAO, 1992; FDA, 2002; Harrigan, 1998). Seyreltim say s n n
üçten fazla oldu u ekimlerde EMS Çizelgesinden seyrelti seçiminde
izlenecek yol örneklenerek a a da verilmi tir (FDA, 1998).
Örnek 1g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g Pozitiflerin EMS/g

(100) (10-1) (10-2) (10-3) (10-4) Kombinasyonu
A 5 5 1 0 0 5-1-0 33
B 4 5 1 0 0 5-1-0 33
C 5 4 4 1 0 4-4-1 40
D 5 5 5 5 2 5-5-2 5400
12
1.6.3. H zl Analiz Yöntemleri
Yeni geli tirilen besiyeri formülasyonlar (MUG, kromojenik agarlar vb.)

daha k sa süreler içinde sonuç al nmas na olanak tan maktad r (Boer,
1998; Bridson, 1998).
1.6.4. Yöntem Seçimi
G dalar n laboratuar analizlerinde kullan lan yöntemler farkl l klar

gösterebilmektedir. Yöntem seçiminde uluslararas standartlardan (ISO,
BSI vb.) uluslararas resmi kurulu lar taraf ndan yay nlanm
kitaplardan, veya uluslararas hakemli dergilerde yay nlanm makaleler
gibi kaynaklardan yararlan lmal d r. Bu amaçla yararlan labilecek baz
kaynaklar a a da verilmi tir:
APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Dairy products . 14th APHA,
Washington, D.C.
APHA. 1993. Standart Methods for the Examination of Dairy products 16th Ed.
APHA, Washington, DC.
De Boer, E. 1998. Update on media for isolation of Enterobacteriaceae from foods.

International Journal of Food Microbiology 45, 43-53
FAO, 1992. Manual of Food Quality Control. 4. Rev. 1. Microbiological Analysis .

Food and Agricultural Organization
of the United Nations, Rome.
FDA, 1998. Bacterial Analytical Manual . 8th ed., Revision A. AOAC International,
Washington D.C.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology .

Academic Press, San Diego.
ICMSF. 1986. Microorganisms in Foods. 2. Sampling for Microbiological Analysis:

Priciples and Specific Applications . 2nd. ed. University of Toronto Press, Toronto.
Pitt, J.I., Hocking, A.D. 1997. Methods for isolation, enumeration and
identification. Fungi and Food Spoilage . s. 21-57. Blackie Academic and
Professional. London.
Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. 1995.

Methods for the detection and isolation of food-borne fungi.
13
Introduction to Food-Borne Fungi . (Ed. Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad,
J.C., Filtenborg, O. ) s. 235-242
Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn.
Konu ile ilgili Türkçe kaynaklar aras nda Türk Standartlar Enstitüsü nün
ilgili standartlar ve bu konuda haz rlanm eserlere ba vurulabilir. Bu
amaçla yararlan labilecek baz kaynaklar a a da verilmi tir:
Borcakl , M., Kalafato lu, H., Aran, N., Topal,, ., Karaku , M. 1994. G dalarda
Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri , TÜB TAK-MAM, G da ve So utma
Teknolojisi Bölümü Yay nlar , Yay n No. 128, Gebze-Kocaeli.
Halkman, A., Akçelik, M.A. 1999. G dalar n mikrobiyolojik analizi 1. Temel ilkeler.
G da Mikrobiyolojisi ve Uygulamalar . s. 105-126. Ankara Üniversitesi Ziraat
Fakültesi, G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara
Halkman G dalar n Mikrobiyolojik Analizi 2. Mikroorganizma say m . G da

Mikrobiyolojisi ve Uygulamalar . s. 127-146. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi,
G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara
Halkman, A.K. G da Mikrobiyolojisi Laboratuar ; Genel Bilgiler. G da

Mikrobiyolojisi ve Uygulamalar . s. 91-104.Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi,
G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara
1.6. 5. Baz G da Gruplar çin Önerilen Mikrobiyoloj ik Analizler
G da maddelerine uygulanacak mikrobiyolojik analizlerin

seçiminde ilgili ulusal ve uluslararas standartlardan
yararlan lmal d r. A a da baz g da gruplar için önerilen
mikrobiyolojik analizlere ait örnekler verilmi tir (Fung, 1995).
G dalar Mikroorganizmalar
D o a l M a de n Su la r Koliform bakteri
Fekal streptokok (enterokok)
Anaerobik sülfit indirgeyen bakteri
sporlar
Süt ve Süt Ürünleri

Peynir Koliform bakteri
Fekal koliform bakteri
Patojenik stafilokok
Salmonella
14
Süt Tozu Aerobik mezofilik bakteri
Koliform bakteri
Dondurma Aerobik mezofilik bakteri

Koliform bakteri
Staphylococcus aureus
Salmonella spp.
Et ve Et Ürünleri Aerobik mezofilik bakteri

( dondurulm u / so ut ulm u ) Anaerobik sülfit indirgeyenler
Salmonella spp.
K ym a Aerobik mezofilik bakteri

Anaerobik sülfit indirgeyenler Salmonella
spp.
Tavuk Eti Aerobik mezofilik bakteri

Kemiksiz parça et Fekal koliform bakteri
Anaerobik sülfit indirgeyenler
Salmonella spp.
Bal k Filet osu Aerobik mezofilik bakteri

( t aze/ so ut ulm u ) Fekal koliform bakteri
Salmonella spp.
Kabuklu su ürünleri Fekal koliform bakteri

Fekal streptococci
Salmonella spp.
Derin Dondurulm u Sebzeler Aerobik bakteri

Koliform bakteri
Salmonella spp.
Maya
Küf
15
Haz r Yem ekler Aerobik mezofilik bakteri
Koliform bakteri
Salmonella spp.
Baz g da gruplar nda ve farkl kaynaklarda bu analizler d nda

Bacillus cereus, Enterobacteriaceae, Listeria monocytogenes ve
Vibrio parahaemolyticus da yer almaktad r.
Ya r a r la n la n Ka yna k la r
Anon. 1988. New bacteria in the news. Food Technology (8) 16-26
APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Dairy products .
14th APHA, Washington, D.C.
APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Water and
Waste Water . APHA, Washington, D.C.
16th Ed. APHA, Washington, DC.
Aran, N. 1993. G da kaynakl mikrobiyal toksinler. G da Sanayii 7 (1)
31-46.
Aran, N. 1997. G dalar n mikrobiyolojik analiz yöntemlerinde son
geli meler . G da Teknolojisi 1 (10) 55-64.
Austwick, P.K.C. 1984. Human mycotoxicoses in the past, present and
future. Chemistry and Industry.6, 547-551.
Bell, R.G., Gill, C.O. 1990. Microbiological Applications in Food
Biotechnology. Elsevier Applied Science, London.
Borcakl , M., Kalafato lu, H., Aran, N., Topal,, ., Karaku , M. 1994.
G dalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri ,
TÜB TAK-MAM, G da ve So utma Teknolojisi Bölümü
Yay nlar , Yay n No. 128, Gebze-Kocaeli.
Bouergeois, C.M., Cleret, J.J. 1995. Basic principles of industrial
Microbiology testing and uses of its findings. Microbiological
Control for Foods and Agricultural Products (Ed.
D.Y.C.Fung). s. 23-34. VCH Publishers Inc., New York.
Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition . Oxoid Ltd.,
Hamshire.
Bullerman, L.B. 1986. Mycotoxins and food safety. Food Technology
(7) 59-85.
Doyle, M.C., Beuchat, L.R., Montville, T.J. 1997. Food
16
Microbiology, Fundamentals and Frontiers . ASM Press,
Washington, D.C.
FAO, 1992. Manual of Food Quality Control. 4. Rev. 1.
Microbiological Analysis . Food and Agricultural Organization
FDA, 1998. Bacterial Analytical Manual , 8th ed., Revision A. AOAC
International, Washington, D.C.
Forsythe, S.J., Hayes, P.R. 1998. Food Hygiene, Microbiology and
HACCP . Aspen Publication, Gaithersburg.
Fung, D.Y.C. 1995. Control for Foods and Agricultural Products .
VCH Publishers Inc., New York.
Giese, J 1999 Developments in rapid microbial testing. Food-
Technology 53 (5) 88, 89, 91.
ICMSF, 1978. Microorganisms in Foods . Vol. 1. University of
Toronto Press, Toronto
ICMSF. 1986. Microorganisms in Foods. 2. Sampling for
Microbiological Analysis: Priciples and Specific
Applications , 2nd. University of Toronto Press, Toronto.
Jay, J.M. 1986. Microbial spoilage indicators and metabolites.
"Foodborne Microorganisms and Their Toxins". (Ed. M.D.
Pierson, N.J. Stern). s. 219-241. Marcel Dekker, New York.
Karwoski, M. 1996. Automated direct and indirect methods in food
microbiology: a literature review. Food Review International,
12 (2) 155-174.
Mortimore, S., Wallace, C. 1994. HACCP: A Practical Approach .
Chapman & Hall, London
Pierson, M. D, Stern, N.J. 1986. Foodborne microorganisms and their
toxins: Developing Methodology . Marcel Dekker, New York
Sheridan, J.J. 1995. The role of indicator systems in HACCP
operations. Journal of Food Safety 15, 157-180.
Snyder, O.P. 1986. Microbiological quality assurance in foodservice
operations. Food Technology 40 (7) 122-130.
Snyder, O.P. 1993. Developing a total quality management based
food safety programme for a chilled food system. Cleveland
Range, Inc. and Hospitality Institute of Technology and
Management, Cleveland.
Tunail, N. 1999. Mikrobiyal enfeksiyonlar ve intoksikasyonlar. G da
Mikrobiyolojisi s. 59-90. Ankara Üniversitesi Ziraat
Fakültesi, G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k
Ltd. ti., Ankara
17
2. Ae r obik Ba k t e r i Sa y m
Toplam bakteri say s ürünün genel mikrobiyolojik kalitesi, raf ömrü ve

üretim s ras ndaki hijyen ko ullar n n belirlenmesinde kriter olarak önem
ta maktad r (FAO, 1992).
2.1. Standard Plate Count Agar (APHA) (CM463)

Be siye r in de Topla m Ba k t e r i Sa y m *
Standard Plate Count Agar (APHA)(CM463) besiyerinden 23,5 gram

tart l r, 1 litre dam t k su içinde s t larak eritilir ve uygun miktarlarda
erlenlere da t l r. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize
edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere
dökülür.
G da maddesi 1:10 oran nda % 0,1 lik peptonlu su ile homojenize edilir
(10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her
seyreltimden besi ortam içeren steril petrilere 0,1-0,5 ml al narak
yayma plak yöntemiyle ekim yap l r. Ekimi yap lan petriler 32-35 C de
48 saat inkübasyona b rak l r.
nkübasyon bitiminde besiyerinde üreyen koloniler say l p seyreltim

faktörü ile çarp larak bakteri say s saptan r.
2.2. Plate Count Agar (CM325) Besiyerinde Toplam

Ba k t e r i Sa y m
Plate Count Agar (CM325) besiyerinden 17 gram tart l r, 1 litre dam t k

su içinde s t larak eritilir ve deney tüplerine (12-15 ml) bölünür. Daha
sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; Besiyeri 45 C ye
so utulur.
* th
Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8 Edition. Oxoid Ltd., Hampshire
th
Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8 Edition. Oxoid Ltd., Hampshire
18
G da maddesi 1:10 oran nda % 0,1 lik peptonlu su ile homojenize edilir
(10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her
seyreltimden bo steril petrilere 1 ml al narak üzerine 50 C ye
so utulmu 15ml besiyeri dökülür. Ekimi yap lan petriler 32-35 C de 48
saat inkübasyona b rak l r.
nkübasyon bitiminde besiyerinde üreyen koloniler say l p seyreltim

faktörü ile çarp larak bakteri say s saptan r.
Not. Farkl inkübasyon s cakl klar uygulanarak sonuçlar aerobik mezofilik

bakteri ( 30-37°C / 48 - 72 saat), aerobik psikrofilik bakteri (5-7°C / 7-
10 gün), aerobik termofilik bakteri (45°C / 48 - 72 saat veya 55°C / 48
saat) olarak belirtilebilmektedir (APHA, 1978)
Süt ve süt ürünlerinde bakteri say m nda besiyerine %1 lik ya s z süt

tozu kat lmas önerilmektedir. Kullan lan ya s z süt tozunun antibiyotiksiz
olmas önemlidir. Bu amaçla besiyeri içerisine Skim Milk Powder (L31)
kat labilmektedir ya da içeri inde Antibiyotiksiz ya s z süt bulunan Milk
Plate Count Agar (CM 681) kullan labilir.

14th APHA, Washington, D.C.
19
3. Enterobacteriaceae Grubu Bakteriler ve Analiz
Yöntemleri
Enterobacteriaceae familyas safra tuzlar (bile salts) mevcudiyetinde

geli en ve glukozdan asit olu turan bakteriler olarak tan mlanmaktad r.
Escherichia ve Enterobacter gibi baz grup üyeleri laktozu da fermente
edebilmektedirler. Toplam Enterobacteriaceae say s ile fekal
kontaminasyon aras nda yak n bir korelasyon oldu u saptanm t r
(Harrigan,1998). Enterobacteriaceae familyas Citrobacter, Escherichia,
Enterobacter, Edwardsiella, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Morganella,
Proteus, Salmonella, Serratia, Yersinia, Vibrio, Aeromonas ve
Plesiomonas cinsi bakterileri içermektedir. (Ray, 1996).
Koliform bakteriler Enterobacteriaceae familyas içinde yer alan indikatör

organizmalar olarak tan mlanmaktad rlar. Koliform grubu organizmalar
brillant green lactose bile broth ta laktozdan 37°C de 48 saatte asit ve
gaz olu turan bakterilerdir. Klebsiella ve Citrobacter de ayn özelliklere
sahip olmalar na kar n Escherichia coli ve Enterobacter aerogenes
ba l ca koliform organizmalar olarak dikkate al nmaktad r. Escherichia
coli insan ve di er s cak kanl hayvanlar n ba rsaklar nda, Enterobacter
aerogenes bitkilerde (ender olarak ba rsakta) bulunurlar.
Fekal koliformlar ise 44,5 0,2°C de EC ortam nda laktozdan asit ve

gaz olu turan bakteriler olarak tan mlanmaktad r. Inkübasyon s cakl
çok kritik olup, test su banyosunda gerçekle tirilmelidir G dalarda fekal
kontaminasyonun indikatörü olarak Escherichia coli bakterisi
aranmaktad r. E. coli metil red pozitif, Voges-Proskauer negatiftir; sitrat
karbon kayna olarak kullanamaz. Indol pozitif tipleri E. coli tip 1 olarak
adland r l r. Entropatojen E. coli türleri klasik koliform bakteri analizleri
ile de il, özel analiz yöntemleri ile saptanmaktad r (Harrigan, 1998;
Forsythe ve Hayes, 1998; FAO, 1992 )
Enterobacteriaceae ve koliform grubu bakteri analizleri ile g dalar n

hijyenik ko ullarda i lenip i lenmedi i konusunda de erlendirme
20
yap labilmektedir. Is l i lem görmü g dalarda bu grup organizmalar n
bulunmalar (Harrigan, 1998):
(i) ba lang ç bakteri say s n n yüksek olmas nedeniyle s l i lem
uygulamas n n yetersiz kald n ,
(ii) s l i lem sonras ortam ko ullar n n bakteri say s n n tekrar
artmas na uygun oldu unu,
(iii) s l i lem sonras kontaminasyon olu umunu ifade etmektedir.
*
3.1. Topla m En t e r oba ct e r ia ce a e Sa y m Yön t e m i
1. G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir ve ayn

ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3...) yap l r.
2. Her seyreltimden steril petrilere 1 er ml konur, üzerlerine 15 ml
45°C ye so utulmu Violet Red Bile Glucose Agar VRBGA (CM 485)
dökülür ve inokulum ile kar m sa lan r.
3. Kar m n kat la mas beklenir ve kat la m yüzeyi tamamen
kaplayacak ekilde 5 ml 45°C ye so utulmu VRBGA eklenir.
Kat la t ktan sonra ters çevrilen petriler önerilen s cakl k derecesinde
inkübe edilirler. ISO standartlar nda belirtilen inkübasyon s cakl klar
35-37°C dir. Ancak baz Enterobacteriaceae familyas üyeleri 35°C ve
üzerinde iyi geli me gösteremezler. Bu durumda 30°C de inkübasyon
sonucunda daha yüksek bakteri say m sonuçlar elde
edilebilmektedir. Gerek görüldü ü takdirde istatiksel bir çal ma ile
ürüne uygun inkübasyon s cakl belirlenebilir.
Not. VRBGA agarda koliform bakteriler 1-2 mm çap nda, çevrelerinde

mor renkli zon bulunan tipik koloniler olu tururlar. Koloni çaplar
genellikle 1-2 mm olmakla beraber çe itli faktörlere ba l olarak
de i iklik gösterebilirler, bu nedenle k rm z renkli tüm koloniler say l r
(Bridson, 1998).
*
ISO 7402: 1993
21
3.2. Koliform Bakteri ve Escherichia coli Analizleri
Koliform organizmalar n varl laktozdan asit ve gaz olu umu ile

saptanmaktad r. nkübasyon s cakl tart mal d r ancak 30-37°C
aras ndaki s cakl klar yayg n olarak uygulanmaktad r. Koliform bakteri
analizlerinde Violet Red Bile Agar VRBA (CM 107), Lauryl Sulphate
Tryptose Broth LST (CM 451) , Brillant Green Bile 2% Broth BGLB
(CM 031) ve MacConkey Broth(CM 005) gibi besiyerleri kullan lmaktad r
(Harrigan, 1998).
Koliform bakteri ve E. coli saptanmas nda yararlan lan h zl test

yöntemleri aras nda MUG ilaveli besiyerleri (Modified Lauryl Sulphate
Tryptose Broth with MUG - CM 967; FAO, 1992; FDA, 2002) ile kromojen
içeren kültür ortamlar (Selective E. coli / Coliform Chromogenic
Medium-CM1046, Tryptone Bile X-Glukuronide Medium-CM 945)
(Bridson, 1998) da yer almaktad r.
3.2.1. En M u h t e m e l Sa y Yön t e m i ile Kolifor m Ba k t e r i ve

Escherichia coli Analizleri
FAO (1992), FDA (2002) ve ISO (4831:1991) taraf ndan önerilen

koliform bakteri yöntemi Lauryl Sulphate Tryptose Broth ta tahmin,
Brillant Green Bile Broth ta do rulama, fekal koliform bakteri yöntemi ise
bu testleri takiben 45 0,2°C de EC Broth da inkübasyon testlerini
içermektedir. Yöntemin ayr nt lar a a da verilmi tir:

ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3... ) yap l r.
2. Her seyreltimden 10 ar ml Lauryl Sulphate Tryptose Broth içeren
üçer tüpe 1 er ml ekim yap l r. Ekim yap lan tüpler 35-37°C de 24-48
saat inkübe edilir (24 saat sonunda gaz olu an tüpler kaydedilir,
negatif olanlar 24 saat daha inkübe edilir). Gaz olu umu gözlenen
LSTB tüplerinden 10 ar ml Brilliant Green Bile Broth içeren tüplere
birer öze dolusu ekim yap l r, tüpler 35-37°C de 24-48 saat inkübe
edilir. BGLB ortam nda gaz olu umu koliform bakterilerin
mevcudiyetini do rular ve pozitif tüplerin say s kaydedilir.
22
3. Fekal koliform bakteri analizi için pozitif BGLB tüplerinden a a da
belirtilen ortamlara öze ile ekimler yap larak inkübasyona b rak l r
(Eijkman test). Pozitif sonuçlar genellikle E. coli mevcudiyetini ifade
etmektedir:
(i) EC ortam su banyosunda 45,5 0,2°C de 24 saat
inkübe edilir; veya
(ii) BGLB 44,0 0,1°C de 24 saat inkübe edilir.
4. Gaz olu umu gözlenen tüplerin say s kaydedilir (Deneylerde inokule
edilecek s v ortamlar n önerilen inkübasyon derecelerinde olmalar
önerilmektedir). Rutin çal malarda Eijkman testi indol testi ile
desteklenerek E. coli tip 1 44-45°C de saptanabilmektedir. Bu
amaçla tripton (veya triptoz) (10 g/L) ve sodyum klorür (5 g/L)
içeren s v ortama ekim yap larak 24 saat inkübasyona b rak l r ve
indol testi uygulan r.
Not.1. Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth (CM 967) ortam

triptofan da içermektedir. Bu nedenle inkübasyon bitiminde besiyerine
Kovac s ay rac eklenerek indol reaksiyonu da gözlenebilmektedir
(Harrigan, 1998).
Not 2. Koliform bakterilerin tür düzeyinde belirlenebilmeleri için ekimler
yap larak saf kültür elde edilir. Bu amaçla pozitif EC tüplerinden Eosin
Methylene Blue (EMB) Agar(CM 069) gibi tipik geli me gözlenebilecek
kat besi ortamlar na ekim yap l r. nkübasyondan sonra üpheli E.coli
kolonileri (5 adet) e ik Plate Count Agar(CM 325) a aktar l r. 35°C de 18-
24 saatlik inkübasyondan sonra safla t r lan kültürlere IMVIC testi (Indol,
metil red, Voges-Proskauer ve citrate) uygulan r (FDA, 2002).
BGLB de pozitif sonuç veren tüplerin say s dikkate al narak örnekteki

koliform bakteri, EC broth ta pozitif sonuç veren tüplerin say s dikkate
al narak örnekteki fekal koliform bakteri miktar En Muhtemel Say
Çizelgelerinden (EMS) hesaplan r (FAO, 1992; FDA, 2002; Harrigan,
1998).
Gram boyama sonucunda Gram negatif, k sa çubuk olarak görülen tüm

kültürler IMViC testleri ile kontrol edilmelidir.
23
Indol Testi
Safla t r lm kültürden Tryptone Water Broth içeren tüplere ekim yap l r
ve tüpler 35°C de 24 2 saat inkübe edilir. 0,2-0,3ml Kovac s Reaktifi
damlat larak indol olu umu test edilir. Broth yüzeyinde olu en keskin bir
k rm z renk, testin pozitif oldu unu gösterir.
Voges-Proskauer (VP)
MR-VP tüplerini inoküle edilir ve 35°C de 48 2 saat inkübe edilir.
nokülumdan 1ml al n r 13x100mm lik tübe aktar l r. 0,6ml -naphtol
solüsyonu ve 0,2ml %40 l k KOH eklenir ve çalkalan r. Birkaç kristal
kreatin ilave edilir. Çalkalay p 2 saat kendi haline b rak l r. Eosin pembesi
rengi olu umu pozitif olarak kaydedilir.
Methyl-Red (MR)
VP testinden sonra MR-VP tüpleri ayr ca bir 35°C de 48 2 saat daha
inkübe edilir. Her bir tüpe 5 damla methyl red solüsyonu eklenir. Keskin
k rm z renk olu umu pozitif, sar renk ise negatif sonucu göstermektedir.
Sitrat testi
Koser Citrate Broth bulunan tüplere yo un olmayacak ekilde ekim
yap l r. Bulan kl k olmas ndan kaç n l r. 35°C de 96 saat inkübe edilir.
Bulan kl k olu mas pozitif olarak de erlendirilir(FDA,2002).
Yo un ekimlerde kar la labilecek yanl pozitif sonuçlardan kaç nmak
için Simmons Citrate Agar (CM 655) kullan labilir. Bu agar Koser Citrate
Medium un kat la t r lm halidir. Ayr ca Bromothymol blue indikatörü
ilavesi ile pozitif sonucun net ekilde görülmesini sa lar. E ik agara
yüzeye çizme yöntemi ile ekim yap l r. Pozitif üreme bazik reaksiyon
verir ve besiyerinin rengini parlak ye ilden maviye dönü türür. Negatif
sonuçta besiyerinin rengi ayn kal r. (The Manual,1998)
24
3.2.2 MUG laveli Besiyerleri ile H zl Escherichia coli Say m Yönt em leri
MUG Escherichia coli saptanmas nda kullan lan flöresan veren bir
reaktiftir. Oxoid MUG(BR071), 4-methylenebelliferyl- -D-glucuronide
subsrat n n 50 mg l k liyoflize formudur.
Besiyerlerinde önerilen MUG konsantrasyonu a a da belirtilmi tir:
Violet Red Bile Agar (CM107) 100 mg/litre

MacConkey Agar 100 mg/litre
Brillant Green Bile (%2) Broth (CM31) 50 mg/litre
MacConkey Broth Purple (CM005) 50 mg/litre
Lauryl Tryptose Broth (CM451) 50 mg/litre
Bu besiyerlerine sterilizasyon öncesi ilave edilebilen MUG, E. coli

analizlerinde hassasiyeti art rmaktad r. Hassasiyetin yüksek olu u kar k
kültürlerdeki anaerogenic(gaz negatif) E. coli türlerinin saptanmas na
ba l d r. Formülde bulunan 4-methylenebelliferyl- -D-glucuronide
(MUG), -glucuronidaz enzimi taraf ndan parçalan r, UV (ultraviole) (366
nm) alt nda mavi/ye il bir floresans veren bir florofor olan 4-
methylumbelliferon aç a ç kar. (Bridson, 1998).
Not. FAO (1992) ve FDA (2002) taraf ndan önerilen standart

yöntemlerde de MUG içeren Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LST) yer
almaktad r. MUG içeren kat besiyeri olarak da VRBA kullan labilece i
belitilmektedir (FDA, 2002).
3.2.2.1. Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LSTB) with

MUG (Oxoid CM 967) Besiyerinde Koliform Bakteri ve
E. coli Say m *
Tek Güçlü: MUG içeren LST (CM 967) besiyerinden 36,7 gram tart l r, 1
litre dam t k su içinde s t larak eritilir, oda s cakl na so utulduktan
sonra durham tüpleri içeren deney tüplerine 10 ar ml da t l r. Tüpler
121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
25
Çift Güçlü: MUG içeren LST (CM 967) besiyerinden 73,4 gram tart l r, 1
litre dam t k su içinde s t larak eritilir, oda s cakl na so utulduktan
sonra durham tüpleri içeren büyük deney tüplerine (30-40 ml kapasiteli)
10 ar ml da t l r. Tüpler 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
lem

ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3...) yap l r. Her seyreltimden üç
veya be adet MUG lu 10 ml LSTB içeren tüplere 1 er ml ekim yap l r
ve 30°C de 24-48 saat inkübe edilir Üründeki dü ük bakteri
say lar n da saptayabilmek için izlenecek yol çift güçlü LSTB
kullan m d r (Bkz. S11).
Sularda koliform bakteri analizlerinde içinde 10 ml çift güçlü Lauryl
Tryptose Sulphate Broth bulunan üç veya be tüpe 10 ar ml, tek güçlü
10 ml Lauryl Tryptose Sulphate Broth içeren üç tüpe -veya be tüpe-
1 er ml, di er tek güçlü 10 ml Lauryl Tryptose Sulphate Broth içeren üç
tüpe -veya be tüpe- 0,1 er ml ekimler yap larak, analize devam
edilmektedir (APHA;1978).
*
Oxoid Culture Media Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth Folio No. 653
26
nkübasyon bitiminde tüpler bulan kl k ve gaz mevcudiyeti, floresan ve
indol olu umu yönünden de erlendirilir. Tüplerdeki bulan kl k ve gaz
olu umu olas koliform varl n , floresan gaz ve indol olu umu olas E.
coli varl n ifade eder.
Alkali pH floresan n iddetini art rmaktad r; bu nedenle gaz olu an

tüplere 0,5 ml 0,5 N NaOH ilave edilerek pH nötralize edilmelidir. Uzun
dalga boyunda (365 nm-6 watt l k) UV lamba alt nda tüplerde floresan
olu umu kontrol edilir.
Floresan veren pozitif tüplere 0,5 ml Kovac s ay rac damlat larak

kar t r l r ve 1 dakika sonra olu an k rm z halka indol pozitif olarak
de erlendirilir.
Her grup içinde gaz olu an tüpler kaydedilerek kullan lan tüp say s na
göre üç veya be li tübe ait EMS Çizelge lerinden koliform bakteri say s
belirlenir.
Not 1. Örnekler son seyreltim tüplerinden en az birinde negatif sonuç

al nacak ekilde seyreltilmelidir
Not 2. Baz camlara üretim s ras nda kalite kontrol amac yla cerium
oxide ilave edilmekte, bu tip cam tüpler UV alt nda kendili inden
floresans vermektedir. Bu nedenle kullan lan cam tüpler deney öncesi
kontrol edilmeli ve floresans veren cam tüpler kullan lmamal d r (FDA,
2002).
3.2.2.2. Violet Red Bile Agar with MUG (CM 978) besiyerinde
Escherichia coli say m *
VRBA (CM107) besiyerinden 38,6 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde

kaynat larak eritilir, (otoklavda sterilize edilmez) ve 48 C ye so utulan
besiyeri aseptik ko ullarda petrilere dökülür.
*
Oxoid Culture Media VRBA with MUG Lauryl Tryptose Broth with MUG Oxoid
Folio No. 655,
27
MUG çeren VRBA (CM978) besiyerinden de 38,6 gram tart l r, 1 litre
dam t k su içinde kaynat larak eritilir, (otoklavda sterilize edilmez) ve
48 C ye so utulur.

ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3... ) yap l r.
2. Her seyreltimden steril petri kutular na 1 er ml konur, üzerlerine 10-
15ml 45°C ye so utulmu Violet Red Bile Agar (VRBA) dökülür ve
kar m sa lan r. Kar m n kat la mas beklenir, daha sonra
kat la m yüzeyi tamamen kaplayacak ekilde 45°C ye so utulmu
MUG içeren 5-10 ml VRBA eklenir. Kat la t ktan sonra ters çevrilen
petriler süt ürünleri için 32 C, di er ürünler için 35 C de 18-24 saat
inkube edilir.
Laktoz pozitif bakteriler < 0,5-2,0 mm çap nda mor (koyu k rm z )

renkte, çevrelerinde ayn renkte zon bulunan tipik koloniler olu tururlar.
Ayn petriler 366 nm dalga boyunda UV lambas alt nda incelenir,
floresan veren koloniler E.coli olarak de erlendirilir.
Kolonilerin Koliform oldu unu do rulamak için en az 10 koloninin her biri

BGLB broth içerisine al n r. Tüpler 35 C de 24-48 saat inkube edildikten
sonra gaz olu umu kontrol edilir.
28
Not: Gaz pozitif tüplerde pelikül olu ursa gaz olu umunun Gram pozitif,
laktozu fermente eden basillerden kaynaklanmad ndan emin olmak için
Gram boyama yap l r.
3.2.3. Kromojenik Besiyerlerinde Koliform Bakteri ve

Escherichia coli Analizleri
3.2.3.1. Chrom ogenic E. coli / Coliform Medium ( CM956) da

Escherichia coli Say m *
Chromogenic E.coli / Coliform Medium besiyeri E. coli ve di er

koliformlar n ay rdedilmesi için -glukuronidaz ve -galactozidaz
enzimlerine spesifik kromojenik iki substrat içermektedir. Besiyerinde
kromojene ba l olarak ekerler bulunmakta, bu ekerler bakteri hücresi
taraf ndan tüketilmek üzere hücre içine al nmaktad r. Hücre içine al nan
kromojen- eker molekülündeki ekerler enzimler taraf ndan parçalan r,
renkli kromojen hücre içinde birikir. Kromojen eker komplekslerinden
biri E.coli nin % 97 sinin üretti i -glukuronidaz enzimi taraf ndan
parçalanarak kolonilerin mor renk almas n sa larken, di er kromojen
eker kompleksi koliformlar n büyük ço unlu unun üretti i -
galaktozidaz enzimi taraf ndan parçalanarak kolonilerin pembe renk
almas n sa lar. Bu nedenle E.coli su lar mor renkte gözlenirken,
koliform bakteriler pembe renkte, geli me gösterebilen di er
organizmalar ise renksiz olarak gözlenmektedir.
Chromogenic E.coli / Coliform Medium (CM 956) besiyerinden 55,8g

tart l r, 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15
dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik
ko ullarda petrilere dökülür.
G da maddesi 1:5 veya 1:10 oran nda 0,1% (a rl k/hacim) steril

peptonlu su (CM9) ile homojenize edilir. Bu seyreltimlerden besiyerleri
üzerine 0,5 veya 1 ml aktar larak yüzeye sürme yöntemi ile ekim yap l r.
29
Petriler 18-24 saat 37 C de inkübasyona b rak l r. nkübasyon sonras
besiyerinde üreyen mor ve k rm z /pembe koloniler say l p seyreltim
faktörü ile çarp larak koliform bakteri, mor koloniler say l p seyreltim
faktörü ile çarp larak E.coli miktar bulunur.
3.2.3.2. Selective E. coli / Coliform Chromogenic Medium

( CM1046) da Escherichia coli Say m
Selective E.coli/Chromogenic Besiyeri (CM 1046) de iki kromojen içerir:

Pembe renkli Rose Gal kromojeni : -galactosidase aktivitesini tespit
eder. Mavi renkli X-Glu kromojeni : -glucuronidase aktivitesini tespit
eder.
Koliformlar Rose-Gal kromojenini parçalad ktan sonra çözünmeyen
pembe kromofor hücre içerisinde birikir ve Koliform kolonilerinin pembe
renkli görünmesine sebep olur. E.coli türlerinin her iki kromojeni
parçalamas tipik kolonilerin (pembe+mavi =) mor renkli görünmesini
sa lar.
Chromogenic E.coli / Coliform Medium (CM 1046) besiyerinden 28,1

gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde tamam yla çözününceye kadar
kaynat l r, 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda petrilere
dökülür ya da dökme plak yöntemi için 45°C de erimi olarak tutulur.
G da numunesi %0,1 lik steril peptonlu su (CM 009) ile 1:5 ya da 1:10
oran nda seyreltilir ve Stomacher ya da blender yard m ile homojenize
edilir. Yüksek düzeyde kontamine olmu su örnekleri, koloni say lar
say labilir (örne in 20-100 koloni) olmas amac ile öncelikle Ringer s
Solution (BR 052) ya da Maximum Recovery Diluent (CM 733) içerisinde
seyreltilmelidir. At k sular santrifüj yard m ile ya da membran filtre
kullanarak konsantre edilmelidirler.
A a daki ekim tekniklerinden herhangi biri uygulanabilir:
*
Oxoid Culture Media Chromogenic E.coli Coliform Medium, Oxoid Folio No. 536
Oxoid Culture Media Chromogenic E.coli Coliform Medium, Folio.
30
1. Yayma Plak : Haz rlanm petrilerin yüzeyi kurutulur. 0,1ml
seyreltilmi numuneyi petri üzerine koyun ve yüzeye yayd r n.
Petriler 37°C de 24 saat inkübe edilir.
2. Dökme Plak: 1ml seyreltilmi numuneyi bo bir petri içerisine koyun.
15-20ml haz rlanm ve 45°C ye so utulmu besiyeri üzerine dökülür
ve yava ça zemin üzerinde daire çizerek kar t r l r. Petriler 37°C de
24 saat inkübe edilir.
3. Membran Filtrasyon metodu: Haz rlanm petrilerin yüzeyi kurutulur.
Uygun miktarda numuneyi filtreden süzdürülür. Membran alt nda
hava kabarc kalmayacak ekilde agar yüzeyine yerle tirilir.
Organizma - glucuronidase - Koloni

galactosidase rengi
E.coli + + Mor
Koliformlar - + Pembe
Di er organizmalar - - Renksiz
+ - Mavi
3.2.3.2. Tryptone Bile X- glukuronide Medium ( TBX) ( CM945) da

Escherichia coli Say m *
*
Trptone Bile X-glucorinide Medium (TBX). Oxoid Folio No. 535
31
G dalardan E. coli izolasyonu ve say m için, Tryptone Bile Agar (TBA)
(CM 595) baz al narak geli tirilmi olan kromojenik bir besiyeridir. TBA
özellikle donmu g dalar olmak üzere baz g dalardan
mikroorganizmalar n daha iyi geri kazan m n sa lamaktad r. Ayr ca
laktoz fermentasyonu zay f olan E.coli türlerinin tespitinde de h zl ve
do ru sonuç vermesi nedeniyle geleneksel E. coli analiz yöntemlerine
alternatif olarak geli tirilmi tir. TBX besiyeri içerisinde TBA n n bu
özelliklerine ilaveten glukuronidaz aktivitesini belirleyen 5-bromo 4-
chloro-3 indolyl-beta-D-glucuronide (X-glucuronide) kromojeni bulunur.
Glukuronidaz enzimi MUG reaktifi taraf ndan belirlenen enzimle ayn
olup, E. coli için oldukça spesifiktir. Ancak, özellikle E. coli O157:H7
olmak üzere E. coli türlerinin %3-4 ü glukuronidaz negatiftir. TBX
besiyeri içinde serbest hale geçen kromofor MUG dan farkl olarak
çözünmez ve hücre içinde birikir. Böylece renkli hedef koloniler kolayl kla
ortamda ay rdedilir.
TBX Medium (CM945) besiyerinden 36,6 g tart l r, 1 L dam t k su içinde

s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize
edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere
dökülür.
32
G da maddesi 1:5 veya 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir. Bu
seyreltimden besiyerleri üzerine 0,5 veya 1 ml aktar larak yüzeye sürme
yöntemi ile ekim yap l r. Petriler önce 30 C de 4 saat, daha sonra
44 C de 18 saat inkübasyona b rak l r. nkübasyon süresi bitiminde
olu an mavi/ye il koloniler say l r ve seyreltim faktörü ile çarp larak
örnekteki E.coli miktar saptan r.
Hamshire.
HACCP . Aspen Publishers, Gaithersburg.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology",
Ray, B. 1996. Characteristics of predominant microorganisms in
food. Fundamental Food Microbiology . s. 10-30.CRC
Press, Boca Ralton.
33
4. Staphylococcus aureus ve Analiz Yöntemleri
Staphylococcus aureus fakültatif aerob, spor olu turmayan Gram pozitif,

mikroskop alt nda üzüm salk m eklinde gözlenen bakterilerdir. Is ya
dayan kl toksin olu tururlar. Bakteri s l i lemle (66°C/10 dak.) kolayl kla
tahrip edilerken, toksin 100°C de (30 dak.) aktivitesini
koruyabilmektedir. Kusma, mide kramplar , diyare ve kar n a r s
eklindeki zehirlenme semptomlar 2-6 saat aras nda ortaya ç kmakta, 6-
24 saat sürmektedir. nsanlar n %70 inin bo az ve burunlar nda S.
aureus bulundu u, buradan kolayl kla özellikle eller olmak üzere cilde
bula t belirtilmektedir. S. aureus hayvanlarda ve sütte de
bulunabilmektedir. G dalara genellikle çal an personel vas tas yla (eller,
öksürme, hap rma vb. yollarla) geçebilmektedir.
G da zehirlenmesine neden olan g dalar aras nda so uk etler ve di er et

yemekleri, sütlü tatl lar, kekler, krema ilk s ralarda yer almakta; çi
etlerin de %38 inde saptand belirtilmektedir (Gaman ve Sherington,
1998).
S. aureus bakterilerinin yakla k %50 sinin toksin üretme özelli inde

oldu u saptanm t r. Analiz yöntemleri bakteri say s n n tespiti ve
enterotoksin analizi olmak üzere ba l ca iki grup alt nda
toplanabilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998 s.163). G dalarda S. aureus
say s 105/g n üzerine ç kt nda toksin riski olu maktad r (Jablonski ve
Bohach, 1997 s. 365).
Baird-Parker besiyeri hasar görmü hücreler de dahil olmak üzere S.

aureus un g dalardan do rudan izolasyonuna olanak tan yan bir ortamd r
(Forsythe ve Hayes, 1998). FDA (2002) ve FAO (1992) taraf ndan da
önerilen besiyeridir. FAO ve ISO/DIS6888-1 de önerilen yöntemde Baird-
Parker da say m takiben do rulama için koagulaz ve termonükleaz
testleri yer almaktad r (Harrigan, 1998).
34
4.1. Baird- Parker Agarda (Oxoid CM 275) Staphlococcus
aureus Sa y m *
Baird-Parker Agar, g dalardan Staphylococcus aureus izolasyonu ve

say m için seçici bir besiyeridir. Formülü Baird-Parker taraf ndan
geli tirilen besiyerine, hasar görmü hücreleri korumak ve üremesine
yard mc olmak amac yla sodyum piruvat, tan amaçl madde olarak
yumurta sar s emülsiyonu, örnekte mevcut di er bakterilerin
geli imlerini önlemek için de tellürit ve lityum eklenmi tir. Besiyeri,
eklenen yumurta sar s emülsiyonu nedeniyle sar renkte ve opak
görünümdedir. S. aureus tellüritin indirgenmesi nedeniyle gri-siyah
renkte, yumurta sar s ndaki lesitinaz reaksiyonu nedeniyle de etraf nda
effaf zon bulunan koloniler olu turur (Anon., 1998).
Baird-Parker Agar (CM275) besiyerinden 63 gram tart l r, 1 litre dam t k

su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda
sterilize edilir; sterilizasyon sonras 50 C ye so utulan besiyerine, oda
s cakl na getirilmi olan Egg Yolk Tellurite Emulsion (SR 54) dan 50 ml
eklenir ve homojen bir kar m sa lan r. Petrilere dökülen besiyeri
4°C de muhafaza edilebilir.
G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir (10-1) ve

ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her seyreltimden
besi ortam içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yüzeye
yayma metoduyla ekim yap l r. Ekimi yap lan petriler 35-37 C de 24-48
saat inkübasyona b rak l r. S.aureus 48 saat inkübasyon sonras nda
yuvarlak, 2-3 mm çap nda, düzgün kenarl konveks gri/siyah renkli opak
bir halka içinde ve etraf nda effaf bir zon bulunan tipik koloniler
olu turur. Ancak baz S. aureus su lar lesitinaz aktivitesi
göstermedi inden (özellikle süt ürünlerinde rastlan r) effaf zon
görülmeyen, atipik koloniler de olu turabilir. Besiyerinde gözlenen tipik
ve atipik koloniler say l r. Tipik ve atipik kolonilere koagülaz testi
uygulanmal d r. Koagülaz pozitif olan koloniler say l r ve seyreltim
faktörü ile çarp larak örnekteki S. aureus say s belirlenir.
* th
Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8 Edition . Oxoid Ltd., Hamshire.
35
4.2. Koagülaz Testleri
Baird Parker Agardan izole edilen kültürlere koagülaz testi uygulanarak

do rulama yap l r. Bu amaçla Staphylase Test (Oxo d DR595),
Staphytect Plus (Oxoid DR 850) veya Dryspot Staphytect Plus (Oxoid
DR100M) kullan labilmektedir.
4.2.1. St aphyt ect Plus ( Oxo d DR 850) *
Staphytect Plus DR 850 testi ile S. aureus su lar n n koagülaz enzimi

üretip üretmedi i tav an plazmas olmaks z n 20 saniye içinde lateks
aglütinasyon prensibine göre saptan r. Reaksiyon kart nda S. aureus
kolonileri ile lateks test reaktifi kar la t nda mikroorganizmada mevcut
ba l koagülaz, fibrinojenle birle erek gözle de görülebilen bir
aglütinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ile ise baz stafilokok su lar n n
olu turabilece i otoaglütinasyon saptan r.
nsan kaynakl S. aureus türlerinin yakla k %97 si ba l durumdaki
koagülaz ve ekstraselüler (hücre d ) stafilokoagülaz içermektedir.
Protein A, insan kaynakl S. aureus türlerinin yakla k %95 inin hücre

yüzeyinde bulunmakta olup immunoglobulin G nin (IgG) Fc k sm n
ba lama özelli ine sahiptir.
*
Staphylase Test The Oxoid Folio No. 346
36
Staphytect Plus, bu ay rdedici özelliklerden yararlan larak domuz vb.
hayvanlara ait fibrinojen ve tav an IgG ile kaplanm ve S. aureus
kapsüler polsakkaritlerine reaksiyon veren spesifik poliklonal antikorlar
içeren mavi lateks partikülleri kullan larak tasarlanm t r.
Staphytect Plus n bir di er özelli i de Metisiline Dirençli S.

Aureus(MRSA)lar n kapsüler polisakkaritlerine kar spesifik antikorlar
içermesidir. Bu özellik sayesinde di er koagülaz testleri ile tespit
edilemeyen MRSA lar da yakalar.
Kit içeri i
Tek kullan m l k reaksiyon kart lar DR500

Staphytect Plus test reaktifi DR 851 M
Staphytect Plus kontrol reaktifi DR 852 M
Kulan m k lavuzu
Kullan m
1. Lateks reaktifleri oda s cakl na getirilir ve kuvvetlice kar t r larak

(vortekste) homojenizasyon sa lan r.
2. 1 damla Test Reaktifi kart üzerindeki test halkalalar ndan birine

damlat l r.
3. Steril bir öze ile petriden 5 üpheli koloni al n r.
4. Koloniler test halkas na yayd r larak Test Reaktifi ile iyice kar t r l r.
Öze yak l r.
5. Kart 20 sn dairesel olarak hareket ettirilerek normal k alt nda

aglütinasyon olup olmad gözlenir. Sonuç pozitif ise test 1. ad mdan
5. ad ma kadar, Kontrol Reaktifi ile tekrar edilir.
6. Test bitiminde reaksiyon kart uygun bir dezenfektan içine at l r.
37
ncelenen kolonilerde lateks test reaktifi ile aglütinasyon olu tu u
gözlenirken, kontrol reaktifi ile aglütinasyon gözlenmiyorsa izole edilmi
olan S.aureus un koagülaz pozitif su oldu u do rulanm olur. Kontrol
reaktifi ile aglutinasyon olu mamal d r; her iki reaksiyonun pozitif olmas
testin do ru uygulanmad n göstermektedir. Bu gibi durumlarda test
tekrarlanmal d r. lem bittikten sonra reaksiyon kart dezenfektan içine
at lmal veya otoklavda dekontamine edilmelidir.
*
4.2.2. Dryspot Staphytect Plus (Oxoid DR100M)
Dryspot Staphytect Plus belli baz kapsüler polisakkaritlere sahip

stafilokoklar di erlerinden ay rdetmek için kullan lan lateks slide
aglütinaston testidir. Staphytect Plus (DR 850) den fark reaktiflerin kart
üzerinde kurutulmu olmas d r. Bu özellik kitin daha uzun süre
kullan lmas n ve oda s s nda muhafaza edilebilmesini sa lar.
Kit içeri i (120 testlik)
DR 101M Dry spot St aphyt ect Plus reaksiyon kart lar

Her biri 10 kart ve nem em ici t orba içeren 4 po et
Aç lan po et lerin kapat lm as için plast ik po et klipsleri
Her birinde 3 t est 3 kont rol reaksiyon alan olan kartlar
*
Staphytect Plus The Oxoid Folio 561; Kullanma k lavuzu
38
Gerekli malzemeler
Fizyoloj ik t uzlu su ( % 0,9 a rl k/ hacim )

Laboratuar saati
Pipet veya dam lal k ( 50 l)
Öze
Laborat uar dezenfekt an
lem
1. Alüminyum po eti bir

makasla açma çizgisi
boyunca kesin.
2. Paket içerisinden gerekli

miktarda reaksiyon kart
ç kar n ve paketi kit
içerisinde bulunan k skaç ve
çubukla tekrar kapat n.
3. Oval test ve kontrol

halkalar n n alt k sm nda
yeralan küçük daire
içerisine bir damla tuzlu su
damlat n
39
4. Steril bir öze yard m ile
petriden 3-5 tipik koloni
al n.
5. Kültürden al nan
numuneyi tuzlu su ile
homojen süspansiyon elde
edinceye kadar kar t r n.
6. Tuzlu su-kültür kar m n

reaksiyon halkas içerisine
yayarak kurutulmu latex
reaktifi ile kar t r n
7. Kart 20 sn. çevirin ve

normal k alt nda
aglütinasyon olu up
olu mad n inceleyin. Test
sonunda test kart n
dezenfektan içerisinde
bekleterek at n
40
Sonuçlar n de erlendirilm esi:
20 saniye içinde test dairesinde gözlenen aglutinasyon S.aureus un

koagulaz pozitif su oldu unu gösterir, 20 saniye geçtikten sonra olu an
aglutinasyon dikkate al nmamal d r. Kontrol halkas nda aglutinasyon
olu mamal d r. Her iki halkada da aglutinasyon gözlendi inde test
tekrarlanmal d r. Reaksiyon kart i lem bittikten sonra dezenfektan içine
at lmal veya otoklavda dekontamine edilmelidir.

Microbiological Analysis .Food and Agricultural Organization of the United
Nations, Rome.
Jablonski, L.M. Bohach, G.A. 1997. Staphylococcus aureus. Food
Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R.
Beuchat, T.J. Montville), s. 353-375. ASM Press, Washington.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology
5 . Salmonella spp. ve Analiz Yöntemleri
Salmonellae aerob, spor olu turmayan Gram negatif bir bakteridir. G da

zehirlenmelerinde infektif doz yakla k 106 olarak belirtilmektedir.
Vakalardan s kl kla izole edilen Salmonella türleri S. typhimurium ve S.
enteridis dir. Hastal n inkübasyon süresi 12-36 saat aras nda
41
de i mekte, kar n a r s , diyare, kusma, ba a r s ve ate gibi belirtiler
göstermektedir. Hastal k 1 ile 8 gün (bazen 14 gün) sürebilmektedir.
Bebek, çocuk, ya l ve hasta bireyler riskli grubu olu turmaktad r
(Gaman ve Sherington, 1996).
Salmonellae insan ve bir çok hayvan n ba rsaklar nda bulunmakta ve

d k yla at lmaktad r. ki tip ta y c vard r:
(i) Sa l kl ta y c lar: Herhangi bir hastal k belirtisi göstermeyen

sa l kl bireyler.
(ii) Hastal geçirmi olan ta y c lar: Hastal k geçtikten sonra aylar,
hatta y llarca bakteriyi ta yan bireyler.
Salmonellae et ve sakatatta, özellikle tavuklarda yayg n olarak, bazen

yumurtan n d yüzeyinde ve içinde bulunabilmektedir. G dalara ha ere
ile, insanlar vas tas yla ve kontamine hammadde ile bula abilmektedir
(Gaman ve Sherington, 1996).
*
5.1. Geleneksel Salmonella spp. Analiz Yöntemleri
G dalardan Salmonellae izolasyonunda önemli 5 a ama vard r:
(i) Selektif olmayan zenginle tirme.

(ii) Selektif besiyerinde zenginle tirme.
(iii) Selektif kat kültür ortam na ekim.
(iv) Biyokimyasal analizler.
(v) Serolojik testler.
Selekt if olm ayan ön zenginle t irm e
1.1.1. Az say daki veya zarar görmü hücrelerin de izole edilebilmesi

için 25 gram örnek aseptik ko ullarda 225 ml tamponlanm
peptonlu su (buffered pepton water-CM 509) içine al n r ve 24
saat 37°C de inkübe edilir. Süttozu, kuru bebek mamalar gibi
çözünebilir kat madde oran yüksek g dalardan 25 gram dam t k
*
ISO 6579:1993
42
su içine al n r, hacim 250 ml ye tamamlan r ve 24 saat 37°C de
inkübe edilir.
1.1.2. Donmu ve s l i lem görmü g da numunelerinde zarar görmü
hücrelerin geri kazan labilmesi için 25 g (veya 10 g) g da örne i
250 ml (veya 100 ml) özel besi ortamlar içine al nabilir. Analize
al nan g da maddesinin özellikleri dikkate al narak farkl ön
zenginle tirme ortamlar kullan labilir. (ICMSF, 1978) (Çizelge 1).
Not: Ortam pH s 6,8-7,0 de erleri aras nda de ilse steril 1 N sodyum

hidroksit veya 1 N hidroklorik asit kullan larak 6,8-7,0 de erlerine
ayarlanmal d r.
Çizelge 1 Salmonella analizlerinde baz g da gruplar na

uygulanabilecek ön zenginle tirme ortamlar
G da maddesi Ön zenginle tirme ortam
Yumurta ve ürünleri, bisküvi, Lactose Broth veya

Bebek mamalar , et, makarna, boyalar Buffered Peptone Water
Kuru maya (inaktif) Dam t k su

Ya s z süt tozu, süt %0,02 Brillant Green içeren
dam t k su
ekerlemeler Brillant Green içeren ya s z süt
Et ürünleri, hindistan cevizi %1 Tergitol içeren Lactose Broth
veya %0,22 tergitol içeren
peptonlu su
Jelatin %0.25 jelatinaz(*) içeren
Lactose Broth
(*)
%5 lik jelatinaz çözeltisinden 5 ml 225 ml Lactose Broth a kat larak haz rlan r.
Selekt if zenginle t irm e
1.2.1. Ön zenginle tirme ortam ndan 10 ar ml al narak 100 ml selenite

cystine broth ve 100 ml Rappaport Vassiliadis-RV Broth (CM
669) ortam na ekim yap l r.
43
1.2.2. Ön zenginle tirmeye gerek görülmeyen g dalarda ise 25 g örnek
250 ml Selenit Cystine Broth a, ayn ekilde 5 g örnek 500 ml RV
ortam na al n r.
Selenit Cystine Broth 37°C de 48 saat, RV ortam 42°C de 24
saat inkübe edilir. Seçici kat ortamlara 18-24 saat ve tekrar 48
saat sonra sürme ekimler yap l r.
FDA (1998) taraf ndan önerilen yöntemde selektif olmayan ön

zenginle tirmeyi takiben yap lan selektif zenginle tirme a amas nda
uygulanan i lemler a a da verilmi tir:
(i) Çi et ve kontaminasyon düzeyi yüksek g dalardan Salmonella

izolasyonunda selektif olmayan ön zenginle tirme ortam ndan
0,1 er ml al narak 10 ar ml Rappaport-Vassiliadis (RV) ve
tetrathionate (TT) broth içeren ortamlara; di er g dalardan
Salmonella izolasyonunda ise selektif olmayan ön zenginle tirme
ortam ndan 1 er ml al narak 10 ar ml selenite cystine (SC) broth
ve TT içeren ortamlara ekim yap lmaktad r.
(ii) Belirtilen inkübasyon ko ullar , çi et ve kontaminasyon düzeyi
yüksek g dalardan yap lan ekimlerde RV için su banyosunda 42
0,2°C de 24 2 saat, TT için su banyosunda 43 0,2°C de 24 2
saat; di er g dalardan yap lan ekimlerde ise SC ve TT için
35°C de 24 2 saattir.
Selekt if kat ort am lara ekim
Her zenginle tirme ortam ndan öze ile Brillant Green Phenol Red agar
(BGPRA) ve Taylor s Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD) agara
ekim yap l r. Üçüncü bir seçici ortama gerek görülüyor ise Hektoen
Enteric Agar, Salmonella-Shigella agar veya Blair s Bismuth Sulphite
Agar (BS) kullan labilir. Petriler 24 ile 48 saat 37°C de inkübe edilir ve
tipik koloni olu umu incelenir. Tipik Salmonella kolonileri BGPR agar da,
pembe veya k rm z (nadiren renksiz) renkte, çevrelerinde k rm z bir zon
olu turararak üreme gösterirler. XLD ortam nda merkezleri siyah pembe
koloniler olu tururlar (baz türler tamamen siyah koloniler olu turabilir).
44
Atipik baz Salmonella türleri ise sar renkli, merkezi bazen siyah koloni
geli imi gösterebilir. BS Agar da koloniler kahverengi, gri veya siyah
renkte üreyebilirler, bazen metalik bir parlakl k da gösterebilirler. Koloni

çevreleri ba lang çta kahverengiyken, zamanla siyaha dönü ür. Baz
türler çevrelerinde koyu renk bir zon olu turmadan ye il koloniler
olu turabilmektedir.
Biyokimyasal ve serolojik testler
Salmonella analizlerinde biyokimyasal testlerde Triple Sugar Iron (TSI)

agar, Urea agar, Lysine Decarboxylase ortam kullan lmakta; -
galactozidaz; VP ve indol testlerinden yararlan lmaktad r. Do rulamada
alternatif olarak kitler de kullan lmaktad r. ( O.B.I.S. Salmonella gibi )
Serolojik testlerde taze kültürler kullan lmal , gerekirse nutrient agara
ekilerek, 35°C de 24 saat inkübe edilmek suretiyle taze kültür
haz rlanmal d r. Polyvalent 0 (somatik), Polyvalent H (flagellar) ve vi
antijenleri ile serolojik testler uygulanarak do rulama testleri
gerçekle tirilir (Borcakl ve ark. 1994; Harrigan, 1998; ICMSF, 1978).
O.B.I.S. Salmonella Kiti
Özellikle Citrobacter, Proteus ve Morganella kolonileri besiyerinde

Salmonella ile kar t r labilir ve yanl pozitiflik verebilirler. Bu tür üpheli
kolonilerin Salmonella olup olmad n anlamak için daha ileri do rulama
45
testlerine gidilmesi gerekmektedir. Geleneksel biyokimyasal ve serolojik
yöntemlerde sonuçlar 24 saatlik bir inkübasyondan sonra elde
edilmektedir. Bu kromojenik test ile bu koloniler 5 dakikada negatif
sonuç vermektedir.
OBIS Salmonella test kart n n üzerinde iki basit biyokimyasal reaksiyon

gerçekle ir:
Bunlardan birincisi olan PYR, Citrobacter lerdeki PYRase aktivitesini tespit
eder. PYRase aktivitesi ile hidroliz meydana geldi inde, olu an mor renk
kolayl kla ay rt edilebilir. Fig. 2a. (PYR: L-pyrrolindonyl arylamide)
kinci reaksiyon olan NPA, Proteus ve Morganella türlerinin özelli i olan
deaminase aktivitesini temsil eder. Pozitif reaksiyon test halkas nda
keskin bir turuncu renk ile gözlenir. Fig. 2b. (NPA:p-nitrophenylalenine
deaminase.
5 .2 . I SO Sa lm on e lla st a n da r d n da k i de i ik lik le r
ISO standartlar nda (6579:2002) belirtilen zenginle tirme besiyerlerinde

ve içeriklerinde baz de i iklikler vard r. ISO da belirtilen Buffered
Peptone Water n formülasyonunda enzimatik olarak parçalanan kazein
bulunmaktad r ve pH 7.2 den 7.0 ye dü ürülmü tür. Rappaport Vasiliadis
besiyerinin içerisine ortam tamponlamak için di-potassium hydrogen
phosphate ilavesi uygun görülmü , böylelikle haz rlanm broth un
saklanmas s ras nda pH n sabit kalmas sa lanm t r.
ISO (6579:2002) standartlar nda Selenite Cystine Broth yerine Mueller
Kaufmann Tetrathionate - Novobiocin Broth (CM1048) kullan lmas da
önerilmektedir.
I SO Buffered Pept one Wat er ( CM 1049) in haz rlanm as :

20 gram toz besiyeri, 1 litre dam t k suda çözündürülür. Çözülmesi için
iyice kar t r l r ve kaplara da t l r. Otoklavda 121°C de 15 dakika
sterilize edilir.
Rappaport Vasiliadis Soya ( RVS) Pept one Brot h un haz rlanm as :
46
26.8 gram toz RVS Broth CM 866, 1 litre dam t k suda çözündürülür
çözülmesi için yava ça s t l r. Kaplara da t l r ve otoklavda 115°Cde 15
dakika sterilize edilir.
Mueller Kaufmann Tetrathionate - Novobiocin Brot h( CM1048) un

haz rlanm as :
89,5 gram CM 1048, 1 litre dam t k su içerisinde çözündürülür, iyice
kar t r l r ve kaynay ncaya kadar s t l r. 45°C ye so utulur. Kullan mdan
hemen önce 20ml önceden haz rlanm iodine-iodide solüsyonu* eklenir.
4 adet suland r lm Novobiocin Selective Supplement (SR 181e) içeri i
ilave edilir. yice kar t r l r ve steril kaplara bo alt l r.
*iodine-iodide solüsyonu : 10ml su içerisinde çözündürülmü 25 gram

potasyum iyodür içerisine 20 gram iyot eklenir ve steril su ile 100ml ye
tamamlan r.
Haz rlanm olan MKKTn Broth (CM 1048 + SR 181 + iyot/potasyum

iyodür) iyot/potasyum iyodür eklendikten hemen sonra kullan lmal d r.
Katk lar olmadan besiyeri oda s cakl nda 2 haftaya kadar saklanabilir.
5.3. Salmonella H z l Te st Yön t e m i
Salmonella analizlerinde k sa sürede sonuç veren baz test sistemleri

geli tirilmi tir. Oxoid Salmonella Rapid Test, g da ham maddelerinde, son
üründe ve çevreden al nan örneklerde hareketli Salm onella lar n
saptanmas amac yla kullan lan, Association Française de Normalisation
Tour Europe AFNOR ve AOAC taraf ndan onaylanm , 42 saat gibi k sa
sürede (geleneksel yöntemlerde pozitif sonuç al nmas için geçen süre
be gündür) sonuç veren ve kolayl kla uygulanabilen bir yöntemdir.
Kit, A ve B olarak adland r lan iki tüp içeren bir kültür kab ndan
olu maktad r. Her tüp gözenekli bir yap yla birbirinden ayr lan, altta
seçici , üstte indikatör özellikte bir besiyeri içerir. A tüpünün alt
k sm nda Modified Rappaport Vassiliadis Medium, üst k sm nda Lysine
Iron Cystine Neutral Red Medium; B tüpünün alt k sm nda Lysine Iron
Desoxycholate Medium, üst k sm nda Modified Brilliant Green Medium
47
bulunmaktad r. Homojenize edilerek uygun bir ortamda ön
zenginle tirmesi yap lm g da örne i Salmonella Elective Medium ve A, B
olarak belirtilen iki adet tüp içeren kültür kab na inoküle edilir.
Salmonella lar alttaki seçici ortamdan, üstteki indikatör ortama aktif
olarak hareket ederler ve varl klar renk de i ikli i olarak belirir.
Hareketli Salmonella su lar n n Elektive mediumdan seçici indikatör
ortamlara geçi i ve geli meleri, A tüpünde H2S olu umuna ba l siyah
renk olu umu, B tüpünde ise laktoz fermentasyonunun negatif oldu unu
gösteren k rm z renk olu umu eklinde gözlenir. Hareketsiz su olan S.
pullorum ve S. gallinarum tipleri ise bu yöntemle saptanamamaktad r.
Analiz 18 saatlik ön zenginle tirme a amas dahil 42 saatte tamamlan r.

Pozitif reaksiyon gözlenen tüpler daha sonra Oxoid Salmonella Latex Test
kullan larak 2 dakika içinde do rulan r.
Bu yöntemle analizi yap labilecek g dalar aras nda su, süt, peynir,
margarin, tereya , yo urt, so utulmu tatl lar, hayvansal, ve bitkisel
kökenli g da ham maddeleri, kuru g dalar, bal k ve bal k ürünleri ve baz
dondurulmu g dalar ve hayvan yemleri gibi çe itli g dalar yer
48
almaktad r.
Kit içeri i
Kült ür kaplar ( be li po et içerisinde)
Novobiocin disk (FT207)
Kapak açm a anaht ar
Enjektör ve ucu
Bu kitle birlikte besiyeri olarak Buffered Pepton Water (CM509) veya

uygun bir ön zenginle tirme ortam (Çizelge 1) ile Salmonella Rapid Test
Elective Medium (SRTEM) (CM 857) kullan lmaktad r.
1. Buffered Pepton Water (CM509) dan 20 g tart larak 1 L dam t k su

içinde eritilip, 225 er ml olarak erlenlere da t l r,121 C de 15
dakika otoklavda sterilize edilir.
2. Salmonella Rapid Test Elective Medium ( SRTEM) (CM 857)
besiyerinden 61 g tart larak 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir ve
121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
18-20 C de kuru ortamda saklanan

kültür kaplar po etinden ç kar l r ve
kalanlar n nem almamas için po et
kapat l r. Kültür kab belirli bir aç
alt nda laboratuar tezgah n n
kenarlar na vurularak, yap m
besiyerlerinin kap çeperlerinden
ayr lmas sa lan r ve kab n kapa
aç l r.
49
Kültür kab n n üzerinde i aretlenmi 1
numaral seviyeye kadar steril dam t k
su konur (yakla k 27 ml) Kap
içerisinde yer alan A ve B tüplerinin
tabanlar n n su seviyesinin alt nda kal p
kalmad kontrol edilir.
Kit paketinde yer alan steril enjektörle

kültür kab n n üzerinde i aretlenmi 3
numaral seviyeye kadar A ve B
tüplerine su çekilir. Bu i lem yakla k 5
saniyede tamamlanmal d r. Enjektör
i nesinin tüpler içindeki ortamlara
de memesine, tüplerin kap içinde
yerlerinden oynamamas na ve
kapaklar n n gev ememesine dikkat
edilmelidir.
Kültür kab n n kapa kapat l r ve kap,

tüp kar t r c (vorteks mikser vb.) ile
kar t r l r. Burada önemli olan husus
tüplerin içindeki s v n n yakla k 5
saniye kadar kuvvetlice çalkalanmas d r.
Kar t rma i lemi sonras kap
kar t r c dan al n r ve en az 5 dakika
dinlendirilir. Dinlendirme süresi 4 saati
geçmemelidir.
50
Kültür kab n n kapa dikkatlice aç l r,
steril ve oda s cakl ndaki (18-25°C)
Salmonella Rapid Test Elective Medium
(SRTEM) kab n geni haznesi içine 2
numaral seviyeye kadar bo alt l r.
Bir adet Novobiocin diski aseptik

ko ullarda kültür kab na ilave edilir. Kit
paketinde yer alan anahtar ile tüplerin
kapaklar aç l r. Kapaklar el yard m yla
açmak da mümkündür. Burada dikkat
edilecek nokta, kültür kab n n içine veya
tüplere do rudan temastan
kaç n lmas d r. Kültür kab n n kapa
kapat l r ve böylece kap kullan ma haz r
hale gelir.
51
1. 25g örnek 225 ml Buffered Pepton Water içinde homojenize edilir,
35°C de18 saat inkübasyona b rak l r. Yeni haz rlanm kültür kab na
örne in tan mlanmas için gerekli bilgiler (örnek ad , tarih vb.)
yaz larak yap t r l r.
2. Kültür kab n n kapa aç l r ve ön zenginle tirme yap lm kültürden
kap içine 1 ml aktar l r. Kültür kab n n a z kapat larak 41°C de 24
24 saatlik inkübasyon süresi sonunda kültür kab inkübatörden al n r ve

iyi k alan bir ortamda kap içindeki tüplerin üst k sm ndaki indikatör
bölümleri renk de i ikli i yönünden kontrol edilir (bu i lem asla tüpler
kap içinden ç kar larak yap lmamal d r). Muhtemel Salmonella varl
indikatör ortamda renk de i ikli ine neden olur (bir tüpte renk
de i ikli inin olmas bu sonuç için yeterlidir).
TÜP A nkübasyon sonras A tüpünün üst bölmesindeki renk de i imleri

ve de erlendirilmeleri a a da verilmi tir:
1. nkübasyon öncesi alt bölme mavi, üst bölme k rm z d r.

2. Negatif sonuç -siyahla ma yok
3. Pozitif sonuç: -hafif siyahla ma
4. Pozitif sonuç: -kuvvetli siyahla ma
52
TÜP B nkübasyon sonras B tüpünün üst bölmesindeki renk de i imleri
ve de erlendirilmeleri a a da verilmi tir:
1. Ünitenin orijinal rengi

2. Negatif sonuç -de i iklik belirgin de il
3 ve 4. Negatif sonuç -sar , üstü ye il
5. Pozitif sonuç -sadece k rm z la ma
6. Pozitif sonuç -hafif k rm z la ma ve siyahla ma
7 ve 8. Pozitif sonuç -k rm z ve siyah renk olu umu
53
Pozitif reaksiyon veren tüplerdeki kültürlere OXOID Salmonella Latex
Test (FT 203) kullan larak aglutinasyon testi uygulanmal d r.
8.2.2. Do rulam a Test i ( Aglüt inasyon Test i) *
Oxoid Salmonella Rapid Test (FT201) den izole edilmi olas Salmonella
spp. nin do rulanmas için uygulanan bir testidir. Bu amaçla Oxoid
Salmonella Latex Test (FT203) kullan labilmektedir.
Kit içeri i
Test Lateks (FT 204)
Kontrol Lateks(FT205)
Pozitif Kontrol Süspansiyonu (FT206)
Reaksiyon Kart lar
1. Lateks i eleri oda s cakl na getirilir ve kuvvetlice

çalkalan r (vortekste).
2. Reaksiyon kart ndaki dairelerden birine bir damla test lateksi
damlat l r.
3. Yan ndaki daire içine bir damla kontrol lateksi damlat l r.
4. Steril bir öze kullan larak her iki tüpte pozitif ise A tüpünden, A tüpü
negatif ise B tüpünden bir öze kültür al n p test lateksine kar t r l r,
i lem 10-15 saniye sürdürülür, daha sonra kar m öze ile dairenin
içine yay l r.
5. Öze yak l p, so utulur (so utma i lemi tüpün iç yüzeyinin s v
kenar na özeyi de direrek yap l r). Pozitif tüpten bir öze al n p kontrol
lateksi ile kar t r l r, i lem 10-15 saniye sürdürülür. Daha sonra
kar m öze ile dairenin içine yay l r. Karta iki dakika boyunca
dairesel hareket yapt r l r (süre 2 dakikay geçmemelidir).
*
Oxoid Salmonella Latex Test kullan m K lavuzu X4991A
54
Not. Test lateksinde aglütinasyon, kontrol lateksinde negatif sonuç
gözlendi inde kültür Salmonella spp. POZ T F olarak de erlendirilir
(aglütinasyonu gözlemlemek için büyüteç veya mikroskop
kullan lmamal d r).
Not. Kullan lm kültür kaplar at lmadan önce otoklavda sterilize

edilmelidir
Ya r a r la n la n Ka yn a k la r
Gaman, P.M., Sherrington, K.B. 1996. Food poisoning. The

Science of Food . 235256. Pergamon Press
Borcakl , M., Kalafato lu, H., Aran, N., Topal,, ., Karaku , M. 1994.
G dalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri ,
TÜB TAK-MAM, G da ve So utma Teknolojisi Bölümü
Yay nlar , Yay n No. 128, Gebze-Kocaeli. 53.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology ,
ICMSF, 1978. Microorganisms in Foods. Vol. 1 . University of
Toronto Press, Toronto
6 . Sü lfit ndir ge ye n An a e r obik Ba k t e r ile r
Sülfit indirgeyen bakteriler g dalarla ilgili çe itli mikrobiyal kriterlerde yer

alan Gram pozitif, endospor olu turan anaerobik çubuk eklindeki
bakterileridir. Bu grupta yer alan g da kaynakl zehirlenme etkeni ba l ca
bakteriler Clostridium perfringens ve Clostridium botulinum dur. Sülfit
indirgeyen bakteriler g dalarda hijyenik kalite belirlenmesinde
kontaminasyon indikatörleri olarak de erlendirilirler. Say mlar nda
kullan lan kullan lan kültür ortamlar ve inkübasyon s cakl klar daha
ziyade C. perfringens üzerinde yo unla m t r (Poumeyrol ve Billon
1995).
6.1. Clostridium perfringens ve Analiz Yöntemleri
C. perfringens Gram-pozitif, spor olu turan, anaerobik, hareketsiz ve

çubuk eklinde bir bakteridir. Ancak di er anaerobik bakterilere göre
oksijene daha toleransl d r (McClane, 1997). Yüksek s cakl klarda (28°C)
55
aerobik ko ullarda da h zl geli me gösterebilmektedir (Juneja ve
ark.1994a,b) Toprak kökenli olup, çevreden, çi et, insan ve hayvan
ba rsaklar ndan izole edilmektedir. Enterotoksin A, C ve D tipi C.
perfringens türlerinden izole edilmektedir. A tipi daha hafif seyreden
klasik g da zehirlenmesine neden olurken, C tipi nekrotik enteritis olarak
adland r lan önemli sa l k sorunlar na neden olabilen zehirlenme
etkenidir. C. perfringens A tipi zehirlenme belirtileri kar n a r s , diyare,
bulant ve ate eklinde, kontamine g day (106-107 hücre/g) tüketimden
8-12 saat (6-24 saat) sonra ortaya ç kmaktad r. G da ile vücuda al nan
hücrelerden mideyi geçerek canl kalanlar ince ba rsakta ço almakta ve
spor olu turmaktad r. Baz ülkelerde C. perfringens in Salmonella dan
sonra en önemli g da zehirlenme etkeni oldu u belirtilmektedir. Nekrotik
enteritis ise daha seyrek görülmekte beraber s kl kla ölümle
sonuçlanmaktad r. Belirtileri iddetli kar n a r s ve diyare (ço unlukla
kanl ), bazen kusma ve ince ba rsakta tahri eklindedir (Granum,
1990).
Perfringens zehirlenmesi genellikle s l i lemi takiben uygun ko ullarda

so utulmayan g dalardan kaynaklanmaktad r. Et ve et ürünleri riskli
g da gruplar n olu turmaktad r. Hastadan al nan fekal materyalde veya
bakteri izolatlar n n kültür s v lar nda enterotoksin analizi zehirlenme
tan s nda önemli rol oynamaktad r.
G dalardan dü ük düzeylerde C. perfringens izole edilmesi her zaman

g da zehirlenme riskini göstermez. Ancak yüksek miktarlarda
mevcudiyeti tehlikenin varl n ifade etmektedir. Bu nedenle say m
yöntemi bu mikroorganizma için özellikle önemlidir. C. perfringens
g dalardan Tryptose Sulphite Iron Citrate Cyloserine (TSC) agar (ISO
7937:1977) veya neomycin içeren kanl agar kullan larak 35-37°C de
20-24 saat anaerobik ko ullarda inkübasyon ile izole edilebilmektedir
(Forsythe ve Hayes, 1998; Harrigan, 1998). Do rulamas hareketlilik,
nitrat indirgeme, laktoz metabolizmas ve gelatin testleri ile yap l r. C.
perfringens antitoksini içeren egg yolk agar kullan m da alternatif bir
do rulama yöntemi olarak önerilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998).
56
Selektif ortamlar kullan larak çoklu tüp yöntemi ile C. perfringens say m
mümkündür (Harrigan, 1998).
C. perfringens hücreleri so uk muhafaza ve donmaya kar çok hassas

olmalar na ra men sporlar canl l klar n korumaktad r. Ön
zenginle tirme gerekti inde Cooked Meat Medium veya Reinforced
Clostridial Medium kullan m önerilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998).
Analize al nacak örnekler dondurulmadan, yakla k 10°C de ta nmal , 8

saat içinde analize al nmal , aksi takdirde tamponlanm gliserin-tuz
çözeltisi içinde bekletilmelidir. Bu amaçla 25 g örnek gliserin-tuz çözeltisi
içine al n r, ortamdan oksijen uzakla t r larak aseptik ko ullarda
ambalajlan r. S v örnekler de ayn ekilde e it hacimdeki gliserin-tuz
çözeltisine konularak kar t r l r. Haz rlanan örnekler 20 ile 30°C deki
derin dondurucuya al n r veya kuru buz içinde dondurulur. Örnekler
analize al n ncaya kadar bu s cakl kta muhafaza edilmelidir. Analiz
s ras nda homojenizasyon k sa sürede gerçekle tirilmeli, hücrelerin
oksijenle temas minimum seviyede tutulmal d r (FAO, 1992)
Tryptose- Sulphide- Cyclose r in e Aga r da ( Ox oid CM 587)

*
Clost r idiu m pe r fr in ge n s Sa y m
Besiyeri Perfringens Selective Medium a (CM587), Perfringens (TSC)

Selective Supplement B (SR88), Egg-Yolk Emulsion (SR47) ilavesi ile
haz rlan r. C. perfringens bu besiyerinde siyah renkli ve çevresinde opak
zon bulunan koloniler olu turur. Siyah renk, besiyeri içinde bulunan
sülfitin indirgenmesi, opak zon ise lesitinaz aktivitesi nedeniyle
olu maktad r. Ancak, lesitinaz negatif C. perfringens su lar n n da
bulundu u dikkate al narak siyah renkli di er tipik koloniler de
do rulama testlerinde dikkate al nmal d r. Besiyerine D-cycloserine
kat lmas ise besiyerine seçicilik kazand rmaktad r. Besiyeri istenirse egg
yolk emulsiyon kat lmadan da kullan labilir, bu durumda olu an koloniler
daha küçüktür ve say m kolayla maktad r.
* th
Hamshire.Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8 Edition . Oxoid Ltd.,
57
Perfringens Selective Medium (CM587) besiyerinden 23 gram tart l r, 500
ml dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika
otoklavda sterilize edilir; sterilizasyon sonras 50 C ye so utulan
besiyerine, 2 ml steril dam t k su içinde çözündürülmü bir vial
Perfringens Selective Supplement B (SR88) ve 25 ml egg yolk emulsion
(SR47) ilave edilir, kar t r l r ve aseptik ko ullarda steril petrilere
dökülür. Ekim yap lan petrilerin üzerine ikinci bir tabaka olu turmak
üzere haz rlanan TSC agara egg yolk emulsion ilave edilmez.
Haz rlanan besiyeri 2-8°C de muhafaza edilmelidir.
1. G da maddesi 1:10 oran nda (25gram/225 ml, 50gram/450ml)

seyreltilerek homojenize edilir ve ayn ekilde (10-2, 10-3...)
oranlar nda ileri seyreltimleri yap l r.
2. Her seyreltimden egg yolk emulsiyon içeren TSC agar üzerine sürme
yöntemi ile 0,1 ml ekim yap l r. Yay lan seyreltim absorbe olduktan
sonra yüzey tabakas olu turmak üzere egg yolk emulsiyon
içermeyen TSC agardan yakla k 10 ml kadar ilave edilir.
Bu i leme alternatif olarak dökme plak yöntemi ile de ekim
yap labilir. Haz rlanan seyreltimlerden steril petri kutular na 1.0 er ml
inokule edilir, üzerlerine 25 ml 45°C ye so utulmu egg yolk
emulsiyon içermeyen TSC agar dökülür ve inokulum ile kar m
sa lan r. Bu teknikle C. perfringens kolonilerinde lesitinaz
aktivitesinin gözlenmesi zordur.
3. Petriler anaerobik kavanozda Gas Generating (BR38) kit ve katalizör
(BR 042) kullan larak 35 C de 18-24 saat inkübasyona b rak l r.
Alternatif olarak Anaerogen AN025A veya AN035A kullan labilir.
Anaerogen su veya katalizör ilavesi gerektirmez.
Anaerobik kavanozun bulunmad durumlarda ortam gaz s zd rmayan

Anaerobik po etlerde(AG 020) gerçekle tirilebilir. Bu po etler içerisine
ortam olu turmak için Anaerogen Compact AN 010 konulmas ve
po etlerin a z n n Sealing Clips (AN005) ile kapat lmas gerekir. Bu
po etler 4 petri alabilmekte, böylece inkübatörde yer kaplamamaktad r.
Ayr ca effaf olduklar için üremenin istenildi i zaman kontrol
edilebilmesini sa lar.
58
Anaerobik ko ullar n sa land ndan emin olmak için indikator olarak
ortama Oxoid Anaerob c Indicator BR55 konulabilir. Anaerobic
Indicator striplerindeki renk de i imi ortam n olu tu unu gösterir.
C. perfringens, egg yolk emulsiyon içeren TSC agarda etraf nda opak zon
bulunan, 2-4 mm çap nda siyah koloniler olu tururken, egg yolk
emulsiyon içermeyen TSC agarda sadece küçük siyah renkli koloniler
gözlenir. Besiyerinde üreyen tüm siyah koloniler do rulama testlerine
al nmal d r.
Do rulama testi için seçilen koloniler Thioglycollate Broth a (CM 173)

al n r, 35 C de 18-24 saat inkübasyona b rak l r. Daha sonra üreme
gözlenen tüplerden boyama yap larak mikroskopta incelenir. Gram
pozitif, k sa ve kal n çubuk eklindeki bakteriler saf kültür halinde ise
biyokimyasal testlere geçilir. Kültür saf de ilse tekrar TSC agarda
safla t r ld ktan sonra testlere devam edilir.
Do rulama testleri için International Comission on Microbiological

Specifications for Foods taraf ndan önerilen biyokimyasal testlerden
yararlan l r. Nitrat indirgeme (pozitif), laktoz fermentasyonu (pozitif),
jelatin eritme (pozitif) ve hareket (hareketsiz) testleri uygulan r.
Bu testlerle do rulanan koloni say lar seyreltim faktörü ile çarp larak
sonuç kob/g olarak bulunur.
59
Not. Tryptose-Sulphide-Cycloserine Agar FDA (1998) ve FAO(1992)
taraf ndan da besiyeri olarak önerilmektedir.

Granum, P.E. 1990. Clostridium perfringens toxins involved in food
poisoning. International Journal of Food Microbiology 10,
101-112.
Juneja, V.K., Marmer, B.S. and Miller, A.J. (1994a) Growth and
sporulation potential of Clostridium perfringens in aerobic
and vacuum packaged cooked beef. Journal of Food
Protection 57, 393-398.
Juneja, V. K., Call, J.E., Marmer, B.S. and Miller, A.J. (1994b) The
effect of temperature abuse on Clostridium perfringens in
cooked turkey stored under air and vacuum. Food
Microbiology 11, 187-193.
McClane, B.A. 1997. Clostridium perfringens. Food Microbiology,
Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R. Beuchat,
T.J. Montville), s. 305-326. ASM Press, Washington.
Poumeyrol, M., Billon, J. 1995. The genus Clostridium and sulfite-
reducing anaerobes. Microbiological Control for Foods and
Agricultural Products . s. 347-360. VCH Publishers, New
York.
60
7. Bacillus cereus ve Analiz Yöntemleri
Bacillus cereus Gram pozitif ve spor olu turan g da zehirlenme etkeni

bakteriler aras nda yer almaktad r. Sporlar s l i leme oldukça dirençlidir.
Genellikle 107/g düzeylerinde intoksikasyon etkenidir. Emetik ve
diyaretik tipte olmak üzere iki ayr enterotoksin üretir. (Notermans ve
Batt, 1998). Do ada yayg n olarak bulunur, çe itli g dalarda dü ük
miktarlarda saptanabilmektedir. zolasyonunda do rudan ekim yöntemi
ve Mannitol Egg-yolk Phenol red Polymixin (MYP) Agar gibi selektif
ortamlar kullan lmas önerilmektedir. Kültür ortam ISO 7932:1993 say l
ISO standard nda tan mlanm t r. Ancak MYP besiyerininin asit
tamponlama özelli i dü ük oldu u için ortamda mannitolu fermente eden
bakteriler (B. cereus mannitolu fermente edemez) kolayl kla
geli ebilmektedir. Bu nedenle ekimlerde Oxoid taraf ndan üretilen
Polymixin Pyruvate Egg-yolk Mannitol Bromthymol blue Agar n da
(PEMBA) paralel olarak kullan m avantaj sa lamaktad r. Piruvat ve
pepton içermesi nedeniyle bu ortamda lesitinaz aktivitesi ve spor
olu umunu te vik edilmektedir. Ancak bu ortam n da tamponlama
özelli i dü ük oldu u için sonuçlar 24 saatlik inkübasyon sonucunda
de erlendirilmelidir. Analiz edilecek g da maddesinden yap lan
seyreltimler (10-4 e kadar) MYP Agar ve PEMBA besiyerlerine 0,1 er ml
paralelli olarak ekilmekte, 30°C de 24 ve 48 saat inkübe edildikten sonra
61
sonuçlar de erlendirilmelidir. MYP Agar üzerinde muhtemel B. cereus
kültürleri yüzeyleri kuru ve pürüzlü, tersi mor-k rm z ve etraflar nda zon
bulunan koloniler olu turmaktad r. PEMBA üzerinde ise turkuaz mavi
renkli, etraflar nda presipitasyon bulunan koloniler eklinde üreme
gözlenmektedir.
Do rulama testleri Hugh Leifson s besiyeri kullan larak, glukozun

anaerobik disimilasyonu, gelatin hidrolizasyonu, nitrat indirgeme testleri,
mannitol ve glukozu fermente etmeme özellikleri incelenerek
yap lmaktad r. G dalarda B. cereus enterotoksini Reversed Passive Latex
Agglutinasyon kitleri kullan larak do rudan saptanabilmektedir
(Harrigan, 1998).
7.1. Mannitol Egg Yolk Polymixin Agarda (MYP) (CM929)

Bacillus cereus Sa y m *
Mannitol Egg Yolk Polymixin Agar (MYP) içeri indeki mannitol, yumurta
sar s ndaki lesitin ve polymyxin B nedeniyle Bacillus cereus için oldukça
seçici bir besiyeridir. Mannitolu kullanmayan B. cereus su lar
besiyerinde pembe koloniler olu turmakta, lesitinaz aktivitesinden dolay
koloni etraf nda presipitasyon sonucu opak bir zon gözlenmektedir.
Mannitol pozitif bakteriler ise phenol red indikatöründen dolay farkl
renkte koloniler olu tururlar. Polymyxin B ise Gram- negatif bakterileri
inhibe ederek besiyerine seçicilik kazand r r.
Mannitol Egg Yolk Polymixin Agar (MYP) (CM929) besiyerinden 21,5

gram tart l r, 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra
121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Sterilizasyon sonras
besiyeri 50 C ye so utulduktan sonra oda s cakl na getirilmi 50 ml
Egg Yolk Emülsiyon (SR47) ile 2ml dam t k su içerisinde çözündürülmü
bir vial Bacillus cereus Selektif Supplement (SR99) eklenerek kar t r l r,
petrilere yakla k 20 er ml da t l r.
*
Monograph No.4 Oxoid Folio No.569
62
G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 lik peptonlu su (Oxoid CM 009)ile
homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2,
10-3, 10-4 ....). Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na
0,1-0,5 ml al narak yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 18-40 saat
30 C de inkübasyona b rak l r.
Petri yüzeyinde 5 mm çap nda, pembe/mor renkli, etraf opak zon ile
çevrilmi , kuru, yüzeyi pürüzlü tipik koloniler say l r. Tipik kolonilerden
be er adet al narak Nutrient Agar da (CM4) geli tirilir.
7.2. Bacillus cereus Selective Agarda (PEMBA) (CM617) Bacillus

cereus Sa y m
Bacillus cereus Selective Agarda (PEMBA)(CM617) besiyerinden 20,5

gram tart l r, 475 ml dam t k su içinde tamam yla çözününceye kadar
s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
Sterilizasyon sonras besiyeri 50 C ye so utulduktan sonra oda
s cakl na getirilmi 25 ml Egg Yolk Emülsiyon (SR47) ile 2ml steril
dam t k su içerisinde çözündürülmü bir vial Bacillus cereus Selektif
Supplement (SR99) eklenerek kar t r l r, petrilere da t l r.
G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 lik peptonlu su (CM 009) ile
homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2,
10-3, 10-4 ....). Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na
63
0,1-0,5 ml al narak yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 24 saat
35 C de inkübasyona b rak l r. nkübasyondan sonra petriler incelenir.
Tipik B.cereus kolonileri say l r. Petriler oda s cakl nda bir 24 saat daha
b rak larak tüm B.cereus kolonileri gözlenir. üpheli kolonilere anaerobik
glukoz fermentasyonu, nitrat indirgeme ve Voges-Proskauer testleri
uygulan r. Pozitif reaksiyonlar B. cereus varl n ifade eder.
Not: Kurutulmu g dalar 90 ml Tripton-tuz çözeltisi içerisine 20 gram konularak

oda s cakl nda 50 dakika kadar iyice slat l r. (Tripton-tuz çözeltisi haz rlamak
için %0,3 oran nda Tryptone LP 042 ve %0,8 oran nda Sodium Chloride LP 005
kullan l r.) 90ml %0,1 lik peptonlu su bu çözeltiye ilave edilerek 10-1 lik dilüsyon
yap l r.
7.3. Chromogenic Bacillus cereus Aga r da Kolon i Sa y m
20.5 gram Chromogenic bqacillus cereus Agar ( CM 1036) 500 ml

dam t k su içerisinde çözündürülür. yice kar t r l r ve tamam yla
çözünmesi içi,n kaynay ncaya kadar s t l r. 121 C de 15 dakika sterilize
edilir. 50 C ye so utulduktan sonra aseptik ko ullarda 1 vial
Chromogenic Bacillus cereus Selective Supplement (SR0230) eklenir.
yice kar t r ld ktan sonra steril petrilere dökülür.
G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 peptonlu su ile homojenize edilir( 10-
1)
ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r(10-1, 10-2, 10-3,.....) . Her
seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak
yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 24 saat 35 C de inkübasyona
b rak l r. nkübasyondan sonra petriler incelenir.
64
Ya r a r la n la n k a yna k la r

Notermans, S., Batt, C.A. 1998. A risk assessment approach for
food-borne Bacillus cereus and its toxins. Journal of Applied
Microbiology Symposium Supplement 84, 515-615
8 . Listeria monocytogenes ve Analiz Yöntemleri
Listeria monocytogenes bakterisinin neden oldu u g da kaynakl

listeriosiz vakalar n n %30 unun ölümle sonuçlanmas , g dalarda L.
monocytogenes analizlerinin de önem kazanmas na neden olmu tur
(Gaman ve Sherington, 1996; Harrigan, 1998). Ancak Listeria
monocytogenes analizi Salmonella ve Campylobacter analizlerinden çok
daha komplikedir.
lk listeriozis vakas I. Dünya Sava nda ortaya ç km t r. Ancak görülme

s kl çe itli etkenlere ba l olarak art göstermi ve son on y lda en
önemli g da kaynakl hastal k etkenleri aras nda yer alm t r. Listeriozis
çe itli belirtilerle ortaya ç kan bir hastal kt r. Hamile kad nlar s kl kla
hamileliklerinin ilk üç ay nda etkilenmekte, hastal k ate ve ba a r s ile
seyretmekte ölü do umlar, dü ükler ve menenjit gibi sa l k sorunlar na
neden olmaktad r. Di er bireylerdeki listeriozis vakalar nda merkezi sinir
sistemi etkilenmekte, menenjit ve septisemi s kl kla gözlenmektedir
(Gaman ve Sherington, 1996; Roccourt ve Cossart, 1997). L.
monocytogenes i g da kaynakl patojenlerin büyük ço unlu undan ay ran
ba l ca özellikleri do ada yayg n olarak bulunu u, dü ük pH ve yüksek
NaCl konsantrasyonlar na dirençlili i, mikroaerobik ve psikrotrofik
özellikte olu udur. Dü ük s cakl klarda (2-4°C) geli me özeli ine sahiptir.
Böylece g da üretim zincirinin her a amas nda ürüne bula mas söz
konusudur. L. monocytogenes do ada toprak ve su kaynaklar ndan
65
s kl kla izole edilebilmekte, g da i letmelerinde kontaminasyonlar çal an
personel, ekipman ve hammaddeden kaynaklanmaktad r. L.
monocytogenes çi ve i lem görmü g dalarda yayg n olarak
gözlenmektedir. Riskli g da gruplar aras nda süt ve süt ürünleri, et ve et
ürünleri, lahana, salatal k ve patates gibi dü ük asitli sebzeler ve su
ürünleri ilk s ralarda yer almaktad r (Roccourt ve Cossart, 1997). Baz
yumu ak peynir çe itleri ile et ürünlerinde ve tüketime haz r salatalarda
yüksek miktarlarda (106/g) L. monocytogenes saptanabilmektedir. Öte
yandan g dalar n büyük ço unlu unda dü ük miktarlarda bulunmaktad r
(Harrigan, 1998a). nsanlardan izole edilen L. monocytogenes
serotiplerinin %95 ini 1/2a, 1/2b ve 4b olu turmaktad r (Roccourt ve
Cossart,1997). L. monocytogenes in infeksiyon dozu çe itli faktörlere
ba l olarak de i iklik göstermektedir. Bu konuda yap lan
de erlendirmelerde genellikle g dalardaki 100 kob/g n üzerindeki
kontaminasyon düzeylerinde hastal n ortaya ç kabildi i belirtilmektedir.
Ancak daha gerçekçi de erlendirmeler yap labilmesi için daha fazla
epidemiyolojik verilere gereksinim duyulmaktad r (Roccourt ve Cossart,
1997).
Baz mikrobiyolojik standartlarda bakterinin say s , baz lar nda 25 g g da

örne inde Listeria monocytogenes bulunup bulunmad belirtilmektedir.
Say sal de er elde edilmesi gerekti inde ön zenginle tirme ve
zenginle tirme a amalar uygulanmamaktad r. Listeria monocytogenes
analizlerinde FDA, USDA (Forsythe ve Hayes, 1998) ve ISO taraf ndan
onaylanm kültürel yöntemler ile resmi kurulu lar taraf ndan onaylanm
h zl test kitleri kullan labilmektedir .
*
8.1. Kolon i Sa y m Yön t e m i
1. 25 gram g da örne i tart l r, 225 ml Fraser broth a al n r ve

stomacher da kar t r l r.
2. Pepton (%0,1) içeren seyreltim çözeltisi kullan larak seyreltimler
yap l r.
3. PALCAM veya Oxford agar içeren petrilere 0,1 ml ekim yap l r.
*
ISO 11290-2:1997 (Harrigan, 1998)
66
4. Petriler 37°C de 48 saat inkübe edilir. Oxford agar petrileri aerobik,
PALCAM agar mikro aerobik (%5-10 oksijen ve %10 karbon dioksit
içeren atmosfer) ko ullarda inkübe edilmelidir. Mikro aerobik ko ullar
Oxoid Campylobacter Gas Generating Kit (BR56 3,5 litrelik anaerobik
kavanoz için ve BR60 2,5 litrelik anarobik kavanoz için) kullan larak
ayarlanabilmektedir.
Not: Campylobacter Gas Generating Kit yerine CN 025 veya CN 035 de

kullan labilir.
8.2. Ze n gin le t ir m e Yön t e m iyle Listeria monocytogenes

Analizi *
1. 28,7 gram Fraser Broth Base (CM 895) 500 ml dam t k su içerisinde
çözündürülür. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 50C ye
so utulduktan sonra içerisine suland r lm 1 vial Half Fraser
Supplement (Oxoid SR 166) ilave edilerek ön zenginle tirme çözeltisi
olan Half Fraser Broth haz rlan r. 225 ml lik kaplara da t l r
2. 28,7 gram Fraser Broth Base (CM 895) 500 ml dam t k su içerisinde
çözündürülür. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. çerisine
suland r lm 1 vial Fraser Supplement (Oxoid SR 156) ilave edilerek
ikinci zenginle tirme çözeltisi olan Fraser Broth haz rlan r. 10ml lik
tüplere da t l r. Otoklavda sterilize edilir.
3. 27,75 gram Oxford Agar Base (CM 856) 500 ml dam t k su içerisinde
çözündürülür. Çözününceye kadar s t l r. 121C de 15 dakika
otoklavda sterilize edilir. 50C ye so utulduktan sonra aseptik
ko ullarda içerisine 5 ml etanol:steril dam t k su(1:1) kar m ile
suland r lm 1 vial Oxford Selective Supplement (SR 140) eklenir.
Petrilere dökülür.
67
4. 34,5 gram Palcam Agar Base (CM 877) 500 ml dam t k su içerisinde
çözündürülür. Tamam yla çözünebilmesi için kaynay ncaya kadar
s t l r. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 50C ye
so utulduktan sonra çerisine 2ml dam t k su ile suland r lm 1 vial
Palcam Selective Supplement (SR 150) eklenir.
25 gram g da numunesi 225ml Half Fraser broth içerisine al n r. ..C de ..

saat inkübe edilir.
(a) nkübasyon bitiminde ön zenginle tirme ortam ndan bir öze gözü
Oxford agara, bir öze gözü PALCAM agara ekim yap l r. Oxford agar
petrileri aerobik, PALCAM agar microaerobik (%5 -10 oksijen ve %10
karbon dioksit içeren atmosfer) ko ullarda inkübe edilmelidir. Bu
atmosfer ko ullar n sa lamak amac yla 2,5 litrelik anaerobik kavanozla
birlikte Campygen (CN 025) kullan labilir.
(b) Ön zenginle tirme ortam ndan 0,1 ml al narak 10 ml Fraser broth
içeren ikinci zenginle tirme ortam na aktar l r. 35 veya 37°C de 48 saat
inkübe edilir. nkübasyon bitiminde ikinci zenginle tirme ortam
kullan larak (a) da belirtilen uygulama tekrar edilir.
68
*
8.3. Listeria monocytogenes D o r u la m a Te st i
Oxford agar üzerindeki tipik koloniler 2-3 mm çap nda, etraf nda
koyu kahverengi veya siyah zon bulunan (eskülin hidrolizine ba l
olarak), ortas çukur görünümdedir. Listeria PALCAM agar üzerinde
ise 1,5-2 mm çap nda, ye il renkli ve siyah zonla çevreli (merkezleri
de siyah olabilir) koloniler olu turmaktad r. Do rulama testinde
kültür safla t r l r, Henry I kland rma sistemi kullan larak mavi,
mavi-ye il veya mavi-gri renkte ve granüler yap daki koloniler seçilir,
kültüre hareketlilik ve Gram boyama testleri uygulan r. Patojen
Listeria türlerinin yuvarlanarak hareket etmesi onlar h zl ve
do rusal hareket eden patojen olmayan Listeria türlerinden ay r m n
sa lar. Listeria yap kan, k sa, Gram- pozitif, spor olu turmayan
çubuk eklindedir. Katalaz ve oksidaz testleri yap l r. Listeria katalaz
pozitif, oksidaz negatiftir. Daha sonra D-glukoz, D-salisin, L-ramnoz
ve D-ksiloz testleri, nitrat indirgeme, ve Staphylococcus aureus ve
Rhodococcus equi ile CAMP testleri uygulan r. Alternatif olarak kit
sistemleri de kullan labilmektedir.
O.B.I.S. Mono
Listeria seçici besiyerindeki benzer görünü lerden dolay Gram-pozitif,

katalaz pozitif, oxidase negatif koloniler Listeria türlerinden biri
olabilir. Listeria monocytogenes in do rulanmas ise uzun süren pek
çok identifikasyon i lemi gerektirmektedir. O.B.I.S mono ile bu
ihtiyaca hemen cevap verebilmek mümkündür.
*
ISO 11290-1:1997 (Harrigan, 1998)
69
OBIS Listeria monocytogenes d ndaki tüm Listeria türleri taraf ndan
üretilen mono D-alanyl aminopeptidase (DALAase) i tespit eder. Bu
enzimin varl üpheli kolonilerin Listeria monocytogenes olmad n
do rulayan keskin bir renklenme ile belirginle ir. Renklenme
olmamas durumunda üpheli koloniler Listeria monocytogenes olarak
ele al nmal d r.
List e r ia Biyok im ya sa l de n t ifik a syon Kit le r i

Listeria n n tür tayini için ticari olarak identifikasyon kitleri
bulunmaktad r. Bunlardan biri de Oxoid Microbact Listeria Kiti dir.
(Microbact 12 L) Bu sistem klinik ve g da numunelerinden izole edilen
Listeria spp. in identifikasyonu için kullan l r.
A a daki türler Microbact 12L sistemi kullan larak tan mlanabilir.
L.monocytogenes
L.innocua
L.seeligeri
L.ivanovii
L.welshimeri
L.grayi
Microbact 12 L Sistemi Listeria spp. nin identifikasyonu için kullan lan

geleneksel biyokimyasal substratlara benzeyen standardize edilmi
mikro-substrat sistemidir. Her bir identifikasyon sistemi 12 testten
olu ur (11 farkl eker kullan m testi ve h zl hemoliz testi).
ekerlerin ya da koyun k rm z kan hücresinin bulundu u
kuyucuklarda inkübasyon periyodu s ras nda olu an reaksiyonlar renk
de i imi ile gözle görünür hale gelir.
Microbact 12L tek bir koloniyi 18-24 saat inkübe ederek

kullan labilece i gibi, inokülum 0,5 MacFarland a ayarland nda, 4
saatlik h zl bir test olarak da kullan labilir.
nkübasyon sonras nda, reaksiyonlar ç plak gözle okunabilir ve

bilgisayar program ile yorumlanabilir.
70
Organizman n identifikasyonu, yay nlanm referans metodolojilerde
bahsedildi i gibi pH de i iklikleri ve substrat kullan m esas na
dayand r lm t r(1,2). Her bir kuyucuktaki substrat, reaksiyon prensibi
ve renk de i imleri için a a daki reaksiyon tablosuna bak n z.
REAKS YON TABLOSU
Kuyucuk Substrat Reaksiyon Reaksiyon Yorum

No sonucu
Negatif Pozitif
1 Esculin Esculin hidrolizi Sar Siyah
2 Mannitol Spesifik Mor Sar Bromocresol
3 Xylose ekerlerin Mor Sar Purple
4 Arabitol kullan m asit Mor Sar indikatörü asitli
5 Ribose özelli i ta yan Mor Sar ortamda
6 Rhamnose son ürünlerin Mor Sar renk de i tirir.
7 Trehalose olu mas na Mor Sar
8 Tagatose sebep olur. Mor Sar NOT: 4 saatlik
9 Glucose-1- Mor Sar inkübasyonun
Phosphate ard ndan
pozitif reaksiyon
10 Methyl-D- Mor Sar
pozitif
Glucose
sar ya geçi
11 Methyl-D- Mor Sar
gösteren
Mannose
kahverengi/saman
sar s renk
sergileyebilir
E er hemolizin
varsa, kuyucukda
12 Hemoliz K rm z kan K rm z Kahve kahverengile me
hücrelerinin hücre rengi ile sonuçlanan
hemolizi k rm z hücre
hemolizi
gerçekle ir. *
71
* Hemolizinin yoksa bozulmam k rm z hücreler kuyucu un alt na çöker ve
k rm z tortu olu ur.
8.4. Listeria spp. H zl Ana liz Yön t e m le r i
H zl tarama testlerinde ön veya ikinci zenginle tirme ortam ndan al nan

kültür uygun bir ELISA kiti kullan larak analiz edilebilir (Harrigan, 1998).
Ox oid List e r ia Ra pid Te st K T ( FT4 0 1 ) ile List e r ia An a liz i *
Oxoid Listeria Rapid Test kolay uygulanabilen ve g dalardan ve

çevreden al nan örneklerde 43 saat içerisinde kesin sonuç veren, AOAC
ve AFNOR (Association Française de Normalisation Tour Europe)
taraf ndan onaylanm bir yöntemdir.
Testte Listeria türlerinin ortamdan maksimum düzeyde geri kazan lmas

ve flagella geli iminin sa lanmas amac yla iki a amal zenginle tirme
i lemi uygulanmaktad r. Her biri 21 saat süren zenginle tirme
i lemlerinden sonra s t l p ard ndan so utulmu olan örnek test ünitesi
üzerindeki bölmeye aktar l r ve 20 dakika içinde sonuç al n r. Ba l ca
Listeria türleri di er bakterilerden farkl olarak ortak bir B flagella antijeni
içerirler. Is l i lem (80 C) uygulamas ile Listeria bakterileri içindeki
flagellin proteininin aç a ç kmas sa lan r.
Oxoid Clearview Listeria Test Ünitesi gözenekli bir membran eritten

olu maktad r. Bu erit üç pencereden ibaret olan plastik bir k l f
içerisindedir. Bu pencerelerden birincisi örne in eklenmesi, ikincisi test
sonucunun gözlenmesi, üçüncüsü ise test ünitesinin do rulu unun
kontrolu içindir. Test ünitesi Listeria türlerine özgü B flagella antijenlerine
spesifik monoklonal antikorlar içerir. Ekstrakte edilen antijen, membran
üzerindeki; antikor ile i aretlenmi mavi lateks içeren örnek penceresine
ilave edildi inde antijen/lateks kompleksi olu ur. Bu kompleks hat
üzerinde k lcal hareket ile sonuç penceresindeki sabitlenmi monoklonal
anti-flagellin antikoruna do ru yönelir. Antijen/lateks kompleksi ve
* TM
The Oxoid Listeria Rapid Test incorporating Clearview Listeria , Folio No:460,
(**) th
461 Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8 Ed., Oxoid Ltd., Hampshire.
72
sabitlenmi spesifik monoklonal antikor aras nda reaksiyon olu tu unda
sonuç penceresinde mavi bir hat gözlenir. E er hiç flagella ant jeni yok
ise sonuç penceresinde renk de i imi gözlenmez. Antijen ile kompleks
olu turmayan antikor ile i aretlenmi mavi lateks fazlas hat üzerinde
ilerlemeye devam eder ve kontrol penceresinde sabitlenmi spesifik
olmayan poliklonal antikor ile reaksiyona girerek kontrol penceresinde
mavi bir hat olu turur. Kontrol penceresinde olu an bu mavi hat testin
do ru ekilde uyguland n gösterir.
Kit içeri i
Oxoid Half Fraser Supplement (SR 166M)
Clearview Test Üniteleri
Pozitif Kontrol Reaktifi
Kullan lan besiyerleri ve gerekli m alzem eler

Oxoid Fraser Broth (CM 895)
Oxoid Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB) (CM 897)
Oxoid Listeria Selective Enrichment Supplement (SR 141E)
nkübat ör 30 2°C
Su banyosu 80 2°C
Cam tüpler 5- 8 ml kapasiteli
St eril su/ et anol kar m 1: 1 ( hacim / hacim )
1. Ön Zenginle t irm e: Oxoid Fraser Broth (CM895) besiyerinden 28,7 g

tart larak 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir, erlenlere 225 er
ml da t l r ve 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 225 ml
Fraser broth içerisine; Listeria rapid test kiti içinde bulunan Half
Fraser Supplement (SR166M), 4 ml distile su/etanol (1:1)
kar m nda eritilerek ekimden hemen önce ilave edilir (Half Fraser
Broth). G da örne inden 25 g tart larak, Half Fraser Broth a ilave
edilir ve homojenize edilerek 30 C de en az 21, en çok 24 saat
olmak üzere inkübasyona b rak l r.
73
2. kinci Zenginle t irm e: Oxoid Buffered Listeria Enrichment Broth
(CM897) besiyerinden 23,5 g tart larak 500 ml dam t k su içinde
s t larak eritilir, deney tüplerine 10 ar ml da t l r ve 121 C de 15
dakika otoklavda sterilize edilir. 10 ar ml lik Buffered Listeria
Enrichment Broth ortam na, % 70 lik 2 ml etanolde eritilerek
haz rlanm olan 40 l Listeria Selective Enrichment Supplement (SR
141E) eklenir. Haz rlanan bu ikinci zenginle tirme ortam na ön
zenginle tirme ortam ndan 0,1 ml inoküle edilir ve 30 C de en az 21,
en çok 24 saat olmak üzere inkübasyona b rak l r.
74
nkübasyon sonras ikinci zenginle tirme ortam n n üst k sm ndan
sarsmadan 2 ml al n p küçük bir deney tübüne ( 5 ml lik ) aktar l r ve
80 C de su banyosunda 20 dakika tutulurak flagella antijeninin
ekstraksiyonu sa lan r. Daha sonra su banyosundan al narak oda
s cakl na kadar so umas beklenir.
1. Test kiti orijinal ambalaj ndan ç kar l r, düz bir zemine konularak
oda s cakl na gelmesi beklenir. Test kitinin alt penceresine,
yukar da belirtildi i ekilde s l i lemden geçirilerek haz rlanm olan
ekstrakttan mikro pipetle 135 l (pencere d na ta rmadan) aktar l r
ve 20 dakika içinde reaksiyon vermesi beklenir.
75
Sonuç penceresinde mavi hat olu uyorsa Listeria pozitiftir. Kontrol
penceresinde ise her zaman mavi hat olu ur; bu durum kitin çal t n
gösterir. Sonuç ve kontrol pencerelerinde geli en mavi hatt n renk
yo unlu u farkl olabilir, ancak bu farkl l k sonuçlar n
de erlendirilmesinde dikkate al nmamal d r. Çok az bir olas l kla da olsa
sonuç penceresinde kuvvetli bir mavi hat olu mas na kar l k kontrol
penceresinde mavi hat görülmemesi flagella antijeninin oldukça yüksek
düzeyde oldu unu gösterir. Bu durumda kontrolün sonuç vermesi için
ekstrakt tamponlu Listeria zenginle tirme besiyeri ile 1:10 oran nda
seyreltilerek test tekrar edilir. Ekstrakt n bir saatten fazla beklememi
olmas na dikkat edilmelidir.
Not: Çal maya ba lamadan önce kitin denenmesi için test paketi
içinden ç kan ve liyofilize flagella antijenini içeren pozitif kontrol tüpü 2
ml steril su içinde çözündürülür ve test kitinin alt penceresine 135 l
aktar l r. ki pencerede de mavi hat olu umu beklenir.
Pozitif sonuçlarda Listeria n n tür düzeyinde belirlenmesi istendi inde

ikinci zenginle tirme besiyerinden Oxford Agar (CM 856) veya PALCAM
Agar (CM 877) gibi selektif bir agara ekim yap l r, üreyen tipik koloniler
seçilerek biyokimyasal testlere geçilir.
Hamshire.
Gaman, P.M., Sherrington, K.B. 1996. Food poisoning The
Science of Food . s. 235-256. Pergamon Press
Roccourt, J., Cossart, P. 1997. Listeria monocytogenes. Food
Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R.
Beuchat, T.J. Montville), s. 337-352. ASM Press, Washington D.C.
76
9. Escherichia coli O157:H7 ve Analiz Yöntemleri
Escherichia coli nin baz alt türleri patojendir. Enterovirulent E. coli (EEC)
olarak adland r lan bu türler çe itli alt gruplara ayr l r. Patojen özellikteki
E. coli tipleri ve neden olduklar hastal klar a a da verilmi tir (Doyle ve
ark., 1997; FDA, 1998):
E. coli Neden Olduklar Hastal klar

Enterotoksijenik E. coli (ETEC) Mide ba rsak rahats zl klar
Enterotopatojenik E. coli (EPEC) Bebeklerde diyare
Enterotohemorajik E. coli (EHEC/VTEC) Kolit
Enterotoinvazif E. coli (EIEC) Basilli dizanteri
Enteroadharent E. coli (EAEC)
Enteroaggregative E. coli (EaggEC)
EHEC kolit benzeri hastal k etkenidir. Üretti i verotoksinin kanl diyare ve

iddetli kar n a r lar na neden oldu u belirtilmektedir. Bakterinin ba l ca
bula ma yollar yeterince pi irilmemi et ve et ürünleridir. Verotoksijenik
E. coli O157:H7 (EHEC/VTEC) bakterisi 44°C de çok zay f geli me
göstermektedir. Taksonomistlerin ço unlu u enteroinvasif E. coli nin
(EIEC) belli Shigella türleri ile benzer özellikte oldu unu
belirtmektedirler. EIEC hareketsiz olup, laktozu çok yava fermente
etmekte veya hiç etmemektedir. VTEC ve EIEC koliform bakteri analiz
yöntemleri ile saptanamamakta, özel test yöntemlerine gereksinim
duyulmaktad r (Harrigan, 1998).
lk izole edilen insan patojeni E. coli VTEC tir ve çe itli ülkelerde

kaydedilen vaka say lar nda art lar görülmektedir. Neden oldu u
hastal klar n ciddiyeti dikkate al narak çe itli g da gruplar nda
ara t r lmas büyük önem ta maktad r. Bu amaçla çok say da teknik
geli tirilmi ve geli tirilmektedir. Ancak, infeksiyon dozunun dü ük
olmas laboratuar çal anlar için de bir tehlike kayna olu turmakta,
laboratuar kaynakl vakalar da kaydedilmektedir (Harrigan, 1998).
77
E. coli O157:H7 analizi yap lacak örnekler laboratuarda hemen analize
al nmal , örne in dondurulmas ndan kaç n lmal d r. Örnek mikrobiyolojik
bozulmaya u rayabilecek nitelikte ise so ukta bekletilmelidir. Ancak,
patojen tiplerinin büyük ço unlu u canl l klar n 6°C de
kaybedebilmektedirler (FDA, 1998).
9 .1 . Kolon i Sa y m Yön t e m i
E. coli O157:H7 izolasyonunda laktoz yerine %1 sorbitol içeren

MacConkey s agar (Oxoid CM 813) kullan labilmektedir. Bu ortam
Cefixime-Tellurite Supplement (SR 172) ilave edilerek (CT-SMAC) daha
seçici bir hale getirilebilmektedir. Petriler 37°C de inkübe edilmeli ve
sorbitolü fermente etmeyen koloniler incelenmelidir. Hafnia ve
Escherichia hermanii de ayn reaksiyonu gösterdikleri için E. coli
O157:H7 nin do rulanmas için serolojik testlere gereksinim
duyulmaktad r. Laboratuar incelemelerinde sorbitol pozitif E. coli
O157:H7 mutantlar seçilmelidir (Harrigan, 1998).
Dü ük miktarlardaki E. coli O157:H7 say mlar nda g da maddesinin VCC

(vancomycin-cefixime-cefsulodin) Selective Supplement (SR 190) ya da
Novobiocin Supplement (SR 181) içeren Modified Tryptone Soya Broth
(CM 989) ile 10-1 lik seyreltimi haz rlan r, 37°C de inkübe edilir ve
ard ndan CT-SMAC üzerine ekim yap l r. En hassas sonuçlar n s v
zenginle tirme ortam ndan immunomanyetik ay rma ve ard ndan
manyetik bilyeleri CT-SMAC üzerine inokule ederek al nd
belirtilmektedir (Harrigan, 1998).
9.1.1. Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG (Oxoid CM 981)
Besiyerinde Escherichia coli O157: H7 Say m *
*
Oxoid Culture Media Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG Oxoid Folio
No.657
78
Besiyeri , -glucuronidaz enzimi için bir substrat görevi yapan 5-bromo 4-chloro-
3-indol - - D-glucuronide (BCIG) içerir. E. coli O157:H7 su lar nda -
glucuronidaz enzimi yoktur. E.coli O157:H7 su lar besiyerindeki sorbitolu
fermente edememeleri ve -glucuronidaz enzimi içermemeleri nedeniyle
aç k sar (saman) renkli koloniler olu turmaktad rlar. -glucuronidaz
aktivitesine sahip olan mikroorganizmalar BCIG substrat n parçalayarak
indoksil (halojen indoksil) olu umuna neden olurlar. Olu an indoksil de
oksitlenerek kolonilerin mavi/ye il renk almas n sa lar. Besiyerindeki
sorbitol pozitif koloniler pembe-k rm z ; glukuronidaz pozitif koloniler
mavi, sorbitol pozitif / glucuronidaz pozitif koloniler ise mor renk
olu tururlar.
Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG (CM981) besiyerinden 51,6
g tart l r, 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15
dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik
ko ullarda steril petrilere dökülür.
Not: E.coli O157:H7 aranacak örnekte yüksek say da Gram negatif

bakterilerin bulunabilece i tahmin ediliyorsa ortama Cefixime tellurit
selektif katk maddesi (SR172) ilave edilerek besiyeri daha seçici hale
getirilebilir. Bu amaçla sterilizasyon sonras 50 C ye so utulan 500 ml
SMAC besiyerine 2 ml dam t k su içinde eritilmi olarak 1 vial SR172
kat l r.

besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yüzeye yayma
yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 24 saat 35-37 C de inkübasyona
b rak l r.
Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG besiyerinde E.coli O157:H7
su lar sorbitolu fermente etmez ve renksiz koloni olu tururken di er
E.coli su lar sorbitolu fermente eder ve pembe renkli koloniler
olu tururlar. Saman sar s renkteki sorbitol negatif ve glucuronidaz
negatif koloniler E.coli O157:H7 Latex Test (DR 620) veya Dryspot E.coli
O157:H7 (DR120M) de do rulanmal d r. Do rulama i leminden sonra
79
saman sar s koloniler say l r ve seyreltim faktörü ile çarp larak E.coli
0157:H7 say s belirlenir.
9.1. D r yspot E.coli O1 5 7 La t e x Te st ( DR 1 2 0 M) ile

*
D o r u la m a Te st i
Dryspot E.coli 0157 latex test, sorbitolu fermente etmeyen renksiz E.coli
O157 kolonilerinin aglutinasyon testi ile do rulanmas esas na dayan r.
DR 121M kartlar antikor emdirilmi mavi lateks partikülleri ile
kaplanm t r. E. coli O157:H7 antijenleri ile reaksiyonlara giren antikorlar
kart üzerinde aglütinasyon (p ht la ma) olu tururlar.
Dryspot lateks kitleri k sa sürede sonuç veren bir yöntem olmas
yan nda, oda s cakl nda saklanabilmesi, raf ömrünün uzunlu u ve ayr
bir lateks ve kontrol aglutinasyon çözeltisine gerek duyulmamas gibi
avantajlara sahiptir.
Kit içeri i
DR 121 M Dryspot E.coli O157 reaksiyon kart lar

DR 122M Pozit if kont rol erit leri ( st rips)
DR 123M Negat if kont rol erit leri
Kar t rm a çubuklar
Plast ik po et klipsler i
1. DR 121M kartlar po et üst k s mdan aç larak ç kar l r, gerekli

miktarda kart al nd ktan sonra nem almamas için po etin a z kitin
içinden ç kan klipslerle kapat l r.
80
2. Reaksiyon kart nda bulunan test ve kontrol dairelerine birer damla
fizyolojik tuzlu (%0,85 NaCl a rl k/hacim ) su damlat l r .
3. Steril öze kullanarak üpheli kolonilerden 2-5 adet al n r, test

halkas ndaki ve kontrol halkas ndaki fizyolojik tuzlu su içinde
parçac k kalmayacak ekilde süspanse edilir. Bu i lemler s ras nda
her iki dairedeki kültür ayr bir öze ile kar t r lmal d r.
* (**)
Dryspot E.coli 0157:H7 latex test Oxoid Folio No. 650, Bridson, E.Y. 1988. The
th
Oxoid Manual, 8 Edition . Oxoid Ltd., Hampshire
81
4. Kitin içinden ç kan kar t rma çubuklar yard m yla fizyolojik tuzlu su
ve kültür süspansiyonu kurutulmu mavi parçac klar ile halkan n
ucuna kadar yay l r. Kart 60 saniye boyunca dairesel olarak kar t r l r
ve normal k alt nda aglutinasyon incelenir.
60 saniye içinde test halkas nda gözlenen aglutinasyon su un E. coli

O157 oldu unu gösterir. 60 saniye geçtikten sonra olu an aglutinasyon
dikkate al nmamal , kontrol halkas nda aglutinasyon olu mamal d r. Her
iki halkada da aglutinasyon gözlendi inde test tekrarlanmal d r. lem
bittikten sonra reaksiyon kart dezenfektan içine at lmal veya otoklavda
dekontamine edilmelidir.
Doyle, M.P., Zhao, T., Meng, J., Zhao, S. 1997. Escherichia coli
O157:H7.. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers
(Ed. M.C. Doyle, L.R. Beuchat, T.J. Montville), s. 171-191. ASM Press,
Washington, D.C.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology
Roberts, D., Hooper, W., Greenwood, M. 1995. Practical Food
Microbiology. Public Health Laboratory Service, London
(Al nm t r; Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in
Food Microbiology , Academic Press, San Diego).
82
10. Campylobacter jejuni ve Analiz Yöntemleri
Campylobacter A.B.D. de pek çok barsak hastal n n en önemli unsuru

olarak dü ünülmektedir. (20,26). Campylobacter türleri hafif ishal ya da
kanl ishale kadar iddetli ishale sebep olabilir. nsanlardan elde edilen
izolatlar n %99 undan fazlas n C. jejuni, C. coli, ve C. lari
olu turmaktad r. (C. jejuni %90). Campylobacter türlerinin enfeksiyon
yap c özellikleri oldukça yüksektir. C. jejuni nin hastal k yapma dozu
su a, çevresel etkilerden dolay zarar görmü olmas na ve ki inin
hassasiyetine ba l olarak 500 ile 10.000 hücre aras nda de i mektedir.
Enfeksiyonlar menenjit, pnömani, dü ük ve Guillain-Barré sendromunun
iddetli bir formudur. Hastalardan C. fetus un 42°C de üreyen s ya
toleransl su lar izole edilmi tir.
Campylobacterler pek çok vah i ve evcil hayvan n özellikle ku lar n
barsaklar nda bulunur. Campylobacter ili kili hastal klar n %70 i bu
hayvanlardan bula m g da ve sular n tüketilmesinden
kaynaklanmaktad r. Bu g dalar aras nda pastörize edilmemi süt, et,
tavuk, kabuklu deniz hayvan , meyve ve sebze bulunmaktad r.
C. jejuni nemli, 4°C de, dü ürülmü oksijen ko ullar nda 2-4 hafta
canl l n devam ettirebilir. -20°C de 2-5 ay dayanabilirler , ancak oda
s cakl nda yaln z birkaç gün ya ayabilirler. Havaya maruz kalmak,
kurutma, dü ük pH, s tma, dondurulma ve uzun süreli saklama gibi
çevresel etkiler hücrelere zarar verir ve bakterinin izolasyonu zorla r.
Daha eski ve çevresel etki alt ndaki organizmalar yava yava koka
benzer ekil al r ve besiyeri ortam nda izole edilmesi zorla r.
Önzenginle tirme, ve mikroaerobik ko ullar n sa lanmas n n yan s ra
besiyerinde hemin ve kömür gibi oksijen giderici maddeler
Campylobacter in geri kazan m n art r r.
Süt Ürünleri
Örne in pH 7,6 ya getirilir. 12,000xg de 40 dakika Santrifüj yap l r.

Süpernatan at l r. Çöken k s m 10 ml Antibiyotikli Bolton Broth içerisine
al n r. 90 ml Bolton Broth içerisinde 35 C de mikroaerobik ko ullarda 4
83
saat önzenginle tirme yap l r. 42 C de mikroaerofilik ko ullarda 20-44
saat zenginle tirme için inkübasyonda tutulur.
11. Vibrio parahaemolyticus ve analiz yöntemleri
Vibrio ailesi Gram negatif, iki türü d nda Oksidaz pozitif çubuk ya da
k vr ml çubuk eklinde fakültatif anaeroblard r. Pek çok Vibrio türü
insanlarda hastal k yap c d r ve g da zehirlenmelerinde rol oynar. V.cholerae
ve V.mimicus d ndaki Vibrio türleri sodyum klorürün az bulundu u
besiyerlerinde geli emez, bu sebeple halofilik bakteriler olarak
nitelendirilirler.
Vibrio parahaemolyticus analizi
30 gram toz Alkaline Peptone Water (CM 1028) 1 litre dam t k su içerisinde
çözündürülür. yice kar t r l r ve 9 ar ml olacak ekilde tüplere aktar l r.
Otoklavda 121 °Cde 15 dakika sterilize edilir. 88 gram toz TCBS Medium
(CM 333) 1 litre dam t k su içerisinde çözündürülür. Tamam yla çözünmesi
için kaynay ncaya kadar s t l r. Otoklavda sterilize edilmez. Petrilere
dökülür.
Aseptik ko ullarda 50 gram deniz ürünü 450 ml %2-3 lük dilüsyon s v s ya

da PBS (pH: 7,2-7,5)içerisine al n r, steril bir blend r kab nda 2 dakika
yüksek h zda çevirilerek homojenize edilir. PBS kullan larak ileri
seyreltimleri yap l r. EMS yöntemi ile ekim yap l r, her bir seyreltimden 1ml
al narak 10ml Alkaline Peptone Water içeren 3 er adet tüpe aktar l r.Tüpler
16-18 saat 35-37Cde inkübe edilir.
Not: Tüplere yap lan ekimin seyreltim haz rland ktan 15-20 dakika
içerisinde gerçekle mesi gerekmektedir.
nkübasyondan sonra tüpler sallanmamal d r. Vibrio parahaemolyticus

izolasyonu için bulan k bir tüp içeren tüm dilüsyonlar ve en az bir dilüsyon
büyü ü herbir zenginle tirme besiyerinin üstünden 1 öze dolusu al narak
TCBS Agar petrilerine çizilir. TCBS petrileri 35-37Cde 18-24 saat inkübe
edilir. nkübasyonun ard ndan TCBS agar petrileri kontrol edilir. Her bir
petriden 3 ya da daha fazla tipik, üpheli koloni al n r ve ileri testlere geçilir.
84
11. Bakteriyel Toksin Analizleri
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ve C. perfringens enterotoksinleri

gibi toksin analizlerinde kullan lan kitler immunolojik teknikler esas
al narak haz rlanmaktad r. Bu amaçla ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay) veya RPLA (reversed passive latex agglutination
assay) yöntemlerinden yararlan lmaktad r. ELISA yönteminde kullan lan
baz kitler microtitre plaklardan olu urken, di er kitlerde kaplanm
tüpler veya polistren bilyeler kullan lmaktad r. Sonuçlar gözle
(pozitif/negatif) veya bir cihazdan yararlan larak de erlendirilmektedir.
RPLA sisteminde spesifik bir antikorla veya normal serumla kaplanm
lateks boncuklar örne in mikrotitre plak içindeki seyreltimlerine ilave
edilir. Antijen mevcutsa lateks boncuklar antijen-antikor reaksiyonuna
ba l olarak kafes eklinde, yoksa dü me eklinde bir yap olu maktad r.
Kontrol ve duyarl hale getirilmi lateks aras ndaki fark gözle
izlenebilmektedir (Brett, 1998).
10.1. Staphylococcus aureus Enterotoksinleri Analiz Yöntemi
10.1.1. SET - RPLA (TD 900) Kiti ile Stafilokok Enterotoksinleri A, B, C

ve D Analizi *
SET-RPLA Testi pek çok g dada ve kültür filtratlar ndaki S. aureus

izolatlar nda enterotoksin varl n saptamak için kullan lan bir
yöntemdir. Testin duyarl l 0.5 ng/ml dir.
Polistren lateks partikülleri safla t r lm A, B, C ve D tipi stafilokok

enterotoksinleri ile immünize edilmi tav anlardan elde edilen
safla t r lm antiserumla duyarl hale getirilmi tir. Bu lateks partikülleri
enterotoksinlerin varl nda aglütinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ise
immunize edilemeyen tav an globülinleri ile duyarl hale getirilmi lateks
partikülleri içerir. Test V kuyucuklu mikrotitre plaklar nda gerçekle tirilir.
G da ekstraktlar n n veya kültür filtratlar n n seyreltimleri, kuyucuklar n
be s ras kullan larak yap l r, uygun hacimde lateks suspansiyonu her bir
*
SET-RPLA Staphylococcal Enterotoxins A, B, C and D Test Kit, Folio No. 255A
85
kuyucu a ilave edilir ve kar t r l r. Stafilokok enterotoksinlerinden biri
mevcutsa kafes yap l aglütinasyon olu ur, kuyucu un taban nda yay lm
bulan k bir tabaka meydana gelir. Stafilokok enterotoksinleri yok ise
veya konsantrasyonu testin saptama limitinden daha dü ükse, kafes
yap s olu maz, s k yap l dü me görünümünde bir yap gözlenir. Kitin
içinde bulunan seyreltim s v s , g da matriksi bile enleri ile olu abilecek
spesifik olmayan reaksiyonlar n görülme s kl n azaltan sodyum
hekzamatafosfat içermektedir.
Kit içeri i
TD 901 anti- ent erot oksin A ile duyarl hale get irilm i lat eks
TD 902 anti- ent erot oksin B ile duyarl hale get irilm i lat eks
TD 903 anti- ent erot oksin C ile duyarl hale get irilm i lat eks
TD 904 anti- ent erot oksin D ile duyarl hale get irilm i lat eks
TD 905 Lateks kontrol
TD 906 Staphylococ enterotoksin A kontrol
TD 907 Staphylococ enterotoksin B kontrol
TD 908 Staphylococ enterotoksin C kontrol
TD 909 Staphylococ enterotoksin D kontrol
TD 910 Dilüent ( seyrelt im s v s )
Gerekli ekipman ve malzemeler:
Blender vb. homojenizatör

Mikrot it re plaklar ( V kuyucuklu ) ve kapaklar
Mikropipet (50µl), Santrifüj
0,2 0,45 µm gözenekli membran filtre (Millipore SLGV gibi)
Sodyum klorür çözeltisi (% 0,85 a rl k/ hacim )
Sodyum hipoklorit çözelt isi ( > % 1,3 a rl k/ a r l k)
1 N hidroklorik asit
G dalar dan t oksin ekst raksiyonu
1. 10 g örnek üzerine 10 ml % 0,85 lik NaCl çözeltisi eklenir,
86
kar t r l r/ homojenize edilir.
2. So utmal santrifüjde 900g de 30 dakika 4°C kar m satrifüj
edilir (so utmal santrifüj yoksa kar m önceden 4°C ye
so utularak i lem yap l r).
3. Üstteki k s m (yüzen k s m) 0,2-0,45 m gözenekli filtreden
süzülür.
4. Elde edilen filtrat toksin analizinde kullan l r.
Kültürden toksin ekstraksiyonu
1. zole edilen mikroorganizmalar Tryptone Soya Broth a (CM129)

inokule edilerek tercihan çalkalanarak 18-24 saat 37 C de inkübe
edilir.
2. Geli me gözlendikten sonra örnek 900g de 20 dakika santrifüje edilir
veya 0,2-0,45 m gözenekli dü ük protein-ba layan membran
filtreden süzülür.
3. Elde edilen filtrat toksin analizinde kullan l r.
Kontrol
Her toksin kontrol solüsyonu kendine uygun duyarl lateks ile

aglütinasyon olu turur. Toksin kontrol solüsyonlar , pozitif sonuçlar
bulundu u zaman referans olarak kabul edilebilecek gözlem sa lamak
veya test lateksinin do ru çal p çal mad n do rulamak amac yla
kullan lmal d r.
lem
1. Lateks reaktifleri (TD901, 902, 903, 904, 905) ve seyreltim s v s

(TD910) kullan lmak üzere haz rlan r. Lateks reaktifleri kullan lmadan
önce iyice çalkalanarak homojenize edilmelidir. Kontrol reaktiflerini
suland rmak için her bir vial içerisine 0,5 ml seyreltim çözeltisi ilave
edilir ve tamamen çözününceye kadar çalkalan r.
2. Her bir s ra 8 kuyucuk içerecek ekilde microtitre plaklar düzenlenir.
Her bir numune için bu ekilde düzenlenmi 5 s raya ihtiyaç vard r.
3. Mikropipet kullan larak 25 µ l seyreltim s v s 5 s ran n her bir
kuyucu una bo alt l r.
87
4. 5 s ran n her birisinin ilk çukuruna 25 µ l test örne i eklenir.
5. Pipet veya seyreltim s v s kullan larak her bir s ran n ilk
kuyucu undan ba layarak 25 µ l al n p her 5 s ra boyunca paralelli
seyreltim yap l r. Son kuyucuk yaln z seyreltim s v s içerecek ekilde
7. çukurda i lem durdurulur.
6. Birinci s radaki her bir kuyucu a 25 µl anti-enterotoksin A'ya duyarl
lateks eklenir.
7. kinci s radaki her bir çukur içerisine 25 µ l anti-enterotoksin B'ye
duyarl lateks eklenir.
8. Üçüncü s radaki her bir çukur içerisine 25 µ l anti-enterotoksin C'ye
9. Dördüncü s radaki her bir çukur içerisine 25 µl anti-enterotoksin D'ye
10. Be inci s radaki her bir çukur içerisine 25 µ l kontrol lateksi ilave
edilir.
11. Kuyucuk içeriklerini kar t rmak için mikrotitre plak mikromikserle
veya elle çalkalan r.
12. Buharla madan sak nmak için, mikrotitre plak bir kapak ile örtülür
veya nemli bir ortama yerle tirilir. Plak 20-24 saat boyunca oda
s cakl nda sa lam bir zemin üzerine sars lmayacak ekilde b rak l r.
Mikrotitre pla n siyah bir ka t üzerine yerle tirilmesi sonuçlar n
kolayl kla gözlenebilmesi aç s ndan yarar sa layacakt r.
13. Her s rada kuyucukda aglütinasyon olup olmad siyah zemin
üzerinde kontrol edilir.
14. Deneylerde kullan lan santrifüj tüpleri, membran filtreler, mikrotitre
plaklar , kapaklar ve pipet uçlar 121°C 'de 15 dakika otoklavda
sterilize edilmeli veya at lmadan önce hipoklorit solüsyonu (%1,3
a rl k/a rl k) içinde dezenfekte edilmelidir. Kültür ve g da
ekstraktlar , numuneler ve toksin kontrolleri de hipoklorit
çözeltisinde dekontamine edildikten sonra at lmal d r.
Sonuçlar n de erlendirilm esi
Dü me görünümü negatif, a /kafes eklindeki bulan k görünüm pozitif

olarak yorumlanmal d r. Kontrol lateksi içeren son kuyucuklar negatif
olmal d r. Aglütinasyon olu umu a a daki örnek dikkate al narak
88
de erlendirilmelidir.
(+) , (++) ve (+++) olarak s n fland r lan sonuçlar pozitif olarak kabul
edilir
Not: Baz Staphylococcus su lar n n birden fazla enterotoksin

üretebildi i, ayr ca koagülaz (-) stafilokoklar n da enterotoksin
olu turabildi i dikkate al nmal d r.
Testin duyarl l test ekstrakt nda 0,5 ng/ml dir. G da ekstrakt 1:1
oran nda seyreltilerek haz rland nda duyarl l k 1 g g da matriksi için 1
ng olmaktad r. Testin saptama limiti g da matriksinin türüne ba l olarak
belirlenen seyreltim oranlar na göre de i ecektir. G da ekstrakt nda
bulunan enterotoksin konsantrasyonu, uygulanan ekstraksiyon
metodunun farkl l ndan (örne in ultrafiltrasyon) etkilenebilmektedir.
Stafilokok kültürlerinin enterotoksin üretimleri geli me ko ullar na

ba l d r. Kültür ortam nda bir veya daha çok Stafilokok enterotoksini
üreten su lar n, in vivo olarak da bu seviyelerde toksin üretimi olaca n
göstermez.
10.2. Clostridium perfringens Enterotoksin Analiz Yöntemi
C. perfringens den kaynaklanan vakalar n belirlenmesinde g dan n en az

105 kob/g C. perfringens içermesi veya d k da enterotoksin saptanmas
olmak üzere ba l ca iki kriter dikkate al nmaktad r. C. perfringens in
serotiplerinin belirlenmesi dünyada birkaç laboratuarda yap labilmekte,
organizma so uk muhafazada canl l n k sa sürede yitirebilmekte ve
ya l bireylerde hastal k gözlenmese de d k da yüksek düzeylerde C.
perfringens saptanabilmektedir. Bu nedenle toksin analizi bir g da
89
zehirlenme vakas nda zehirlenme etkeni g dan n bulunmamas ,
antibiyotik tedavisi gibi durumlarda yararlan labilecek en güvenilir
yöntem olarak ortaya ç kmaktad r (Brett, 1998).
10.2.1. PET- RPLA (TD 930) Kiti ile Clostridium perfringens

Enterotoksin Analizi *
PET-RPLA test kiti bakterilerin kültür filtratlar nda veya fekal materyalde
C. perfringens tip A enterotoksininin h zl ve güvenilir olarak belirlenmesi
amac yla geli tirilmi tir. Fekal materyal toksini yüksek miktarlarda
içerdi i için bakteri kültürüne göre daha fazla tercih edilen analiz
materyalidir. Test, standart aglutinasyon testlerine göre daha duyarl d r.
Standart aglütinasyon testlerinde çözünebilir antikorun spesifik bir
antijen ile reaksiyonu, RPLA testinde ise lateks partiküllere ba l
antikorlar n çözünebilir antijen ile reaksiyonu esas al n r. Lateks
partikülleri reaksiyona kat lmazlar, ancak antijen-antikor reaksiyonunu
belirginle tirirler.
Polistren lateks partikülleri safla t r lm C. perfringens A tipi
enterotoksin ile immünize edilmi tav anlardan elde edilen safla t r lm
antiserumla duyarl hale getirilmi tir. Bu lateks partikülleri
enterotoksinlerin varl nda aglütinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ise
immünize edilemeyen tav an globülinleri ile duyarl hale getirilmi lateks
Kit içeri i
Duyarl hale get irilm i lat eks TD 931

Kontrol Lateks TD 932
Kontrol Enterotoksin TD 939
Seyreltim çözeltisi TD 934
Kült ür s v s nda ent erot oksin olu t urulm as
1. Seçici bir ortamdan izole edilen C. perfringens kolonisi, Cooked Meat

Medium a (CM81) al n r ve 37 C de 18-20 saat inkübe edilir. Bu süre
90
sonunda üreme gözlenen deney tüpleri merkezi s cakl klar 75 C (su
banyosunda) olacak ekilde s l i leme tabii tutulur ve 20 dakika bu
s cakl kta bekletilerek vejetatif hücreler inaktive edilir.
2. naktive edilen hücrelerde sporulasyonun te viki için Duncan and
Strong ortam na 1:20 oran nda inokulasyon yap larak 37 C de 24
3. nkübasyon sonras test örne i santrifüj edilerek veya membran
filtreden süzülerek ekstrakte edilir.
lem
1. Reaktifler h zla kar t r l r.

2. Her bir s ra 8 kuyucuktan olu acak ekilde (her örnek için iki s raya
gerek duyulmaktad r) mikrotitre plaklar düzenlenir.
3. Her s ran n 1. kuyucu u hariç, iki s ran n her kuyucucu una 25 l
seyreltim çözeltisi (diluent) konur.
4. Her bir s ran n 1. ve 2. kuyucu una 25 l test örne i ilave edilir.
5. 2. kuyucuktan al nan 25 l hacim ile 7. kuyucu a kadar paralelli
seyreltimler yap l r. Son kuyucuk yaln z seyreltim s v s içerecek
ekilde 7. çukurda i lem durdurulur. 8. kuyucukta seyreltim
yap lmaz, bu kuyucukta sadece seyreltim çözeltisi bulunur.
4. 1.s ran n her bir kuyucu una 25 l antikor ba lanm lateks (TD932)
ilave edilir.
5. 2.s ran n her bir kuyucu una 25 l kontrol lateks ilave edilir.
6. Kuyucuk içeriklerini kar t rmak için mikrotitre plak mikromikserle
veya elle çalkalan r.
7. Mikrotitre plak bir kapak ile örtülür ve 20-24 saat boyunca sa lam
bir zemin üzerine sars lmayacak ekilde b rak l r.
8. Mikrotitre pla n siyah bir ka t üzerine yerle tirilmesi sonuçlar n
kolayl kla gözlenebilmesi aç s ndan yarar sa layacakt r. Deneylerde
kullan lan santrifüj tüpleri, membran filtreler, mikrotitre plaklar ,
kapaklar ve pipet uçlar at lmadan önce hipoklorit solüsyonu (%1,3
ekstraktlar , numuneler ve toksin kontrolleri de hipoklorit çözeltisinde
dekontamine edildikten sonra at lmal d r.
*
PET RPLA Closridium perfringens Enterotoxin Test Kit Oxoid Folio No. 257B
91
Dü me görünümü negat f, a /kafes eklindeki bulan k görünüm pozitif

edilir
Not. Duncan and Strong Medium un bile imi a a da verilmi tir.
Modified Duncan and Strong Medium
g/L dam t k su
Yeast extract (Oxoid L21) 4,0

Proteose pepton (Oxoid L85) 15,0
Soluble starch 4,0
Sodium thoglycollate 1
Na2HPO4.7H2O 10,0
121°C de 15 dakika otoklav edilir. pH 7,8 0,1 olacak ekilde filtre-

sterilize 0,66M sodyum karbonat ilave edilir
10.3. Bacillus cereus Enterotoksin Analiz Yöntemi
92
*
10.3.1. BCET RPLA ( TD 950) ile Bacillus cereus Enterotoksin Analizi
Polistren lateks partikülleri safla t r lm Bacillus cereus diyare

enterotoksiniyle immünize edilmi tav anlardan elde edilen safla t r lm
antiserumla duyarl hale getirilmi tir. Bu lateks partikülleri benzer
enterotoksinlerin varl nda aglutinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ise
immunize edilemeyen tav an globulinleri ile duyarl hale getirilmi lateks
G da ekstraktlar n n veya kültür filtratlar n n seyreltimleri, kuyucuklar n
iki s ras kullan larak yap l r, uygun hacimde lateks suspansiyonu her bir
kuyucu a ilave edilir ve kar t r l r. B. cereus enterotoksini mevcutsa
kafes yap l aglütinasyon olu ur, kuyucu un taban nda yay lm bulan k
bir tabaka meydana gelir. B. cereus enterotoksini yok ise veya
konsantrasyonu testin saptama limitinden daha dü ükse, kafes yap s
olu maz, s k yap l dü me görünümünde bir yap gözlenir.
Gerekli ekipman ve malzemeler :
Blender veya hom oj enizat ör ( sadece g da örnekleri için)

Mikrot it re plaklar ( V kuyucuklu ) ve kapaklar
Mikropipet (25µl )
Santrifüj
0,2 0,45 µm gözenekli membran filtre (Millipore SLGV gibi )
Brain Heart Infusion Besiyeri (Oxoid CM 225)
Sodyum klorür çözelt isi ( % 0,85 a rl k/ hacim )
Sodyum hipoklorit çözelt isi ( > % 1,3 a rl k/ a r l k)
Kit içeri i
TD 951 Duyarl hale get irilm i Lat eks

TD 922 Kontrol Lateks
TD 910 Seyreltici
G da m addelerinden t oksin ekst raksiyonu
*
BCET-RPLA TD950 Toxin Detection Kits, Folio No. 539
93
1. 10 g örnek 10 ml % 0,85 lik sodyum klorür çözeltisi içinde
homojenize edilir.
2. So utmal santrifüjde 30 dakika 900g de kar m santrifüj edilir
(so utmal santrifüj yoksa kar m önceden 4 C so utularak bu
i lem yap l r).
3. Üstteki s v k s m (supernatant) 0,2-0,45 m gözenekli ve protein
ba lama kapasitesi dü ük filtreden süzülür. Önemli husus ekstrakt n
berrak olmas ve ya içermemesidir.
Kültürden toksin ekstraksiyonu
1. Selektif besiyerinden izole edilen B.cereus su u Brain Heart Infusion

besiyerine (CM 225) inokule edilir ve 32-37 C de çalkalamal
inkubatörde 250 devir/dakika h zda 6-18 saat inkube edilir.
2. nkübasyon sonras kar m 4°C de 20 dakika 900g de kar m
santrifüj edilir veya 0.2-0.45 m gözenekli ve protein ba lama
kapasitesi dü ük filtreden süzülür.
Not. B.cereus NCTC 11145 gibi enterotoksin üretti i bilinen standart bir
kültürle kültürel yöntemin kontrolu önerilmektedir.
Kontrol
Toksin çözeltisi duyarl lateksi aglutine etmektedir, bu nedenle kontrol

numunesi olarak kullan lmamal d r. Toksin kontrolu pozitif sonuçlar n
de erlendirilmesinde referans olarak kullan labilmektedir. Kontrol zaman
zaman test lateksinin do ru çal p çal mad n n do rulanmas için
kullan lmal d r. Miktar belirlemede toksin kontrolu bir anlam ifade etmez.
lem
1. Lateks reaktifleri (TD 951 ve TD 952) ve seyreltim çözeltisi (TD 954)

kullan ma haz r hale getirilir. Lateks reaktifleri kullan lmadan önce
iyice çalkalanarak homojenize edilmelidir. Toksin kontrol reaktiflerini
(TD953) suland rmak için her bir vial içerisine 0,5 ml seyreltim
94
çözeltisi ilave edilir ve tamamen çözününceye kadar çalkalan r.
2. Mikrotitre plaklar her s ra 8 kuyucuktan olacak ekilde düzenlenir.
3. Mikropipet kullan larak her bir s ran n birinci kuyucu u hariç iki
s radaki bütün kuyucuklara 25 µ l seyreltim çözeltisi konur.
4. Her iki s ran n birinci ve ikinci kuyucu una 25 µ l test örne i ilave
edilir.
5. 25 µl test örne i her bir s ran n ilk çukuruna eklenir. Her bir s ran n
2. kuyucu undan ba lanarak mikropipet ile 25 µ l al n r ve 7.
kuyucu a kadar paralelli seyreltimler yap l r. Son kuyucuk yaln z
seyreltim s v s içerecek ekilde 7. çukurda i lem durdurulur. 8.
kuyucukta seyreltim yap lmaz, bu kuyucukta sadece seyreltim
çözeltisi bulunur.
6. Birinci s radaki her kuyucu a 25 µ l duyarl lateks (TD951) eklenir.
7. Birinci s radaki her kuyucu a 25 µ l kontrol lateks (TD951) eklenir.
8. Mikrotitre plaklardaki kuyucuk içerikleri mikromikser veya elle
kar t r l r. Kuyucuk içeriklerinin dökülmemesine özen gösterilmelidir.
9. Buharla madan sak nmak için, mikrotitre plak bir kapak ile örtülür
veya nemli bir ortama yerle tirilir. Plak 20-24 saat boyunca oda
s cakl nda sa lam bir zemin üzerine sars lmayacak ekilde b rak l r.
Mikrotitre pla n siyah bir ka t üzerine yerle tirilmesi sonuçlar n
kolayl kla gözlenebilmesi aç s ndan yarar sa layacakt r.
10. Her s radaki kuyucukda aglütinasyon olup olmad siyah zemin
üzerinde kontrol edilir.
11. Deneylerde kullan lan santrifüj tüpleri, membran filtreler, mikrotitre
plaklar , kapaklar ve pipet uçlar 121°C 'de 15 dakika otoklavda
sterilize edilmeli veya at lmadan önce hipoklorit solüsyonu (%1,3
ekstraktlar , numuneler ve toksin kontrolleri de hipoklorit
çözeltisinde dekontamine edildikten sonra at lmal d r.
12. Kültür ve g da ekstraktlar , örnekler ve toksin kontrollar da hipoklorit
solüsyonu (%1,3 a rl k/a rl k) içinde dezenfekte edilmelidir.
Dü me görünümü negat f, a /kafes eklindeki bulan k görünüm pozitif

95
edilir
Not. Testin duyarl l n n 2 ng/ml oldu u belirtilmektedir. G da örne i 1:1

oran nda seyreltilerek haz rland nda duyarl l k 4 ng/g eklinde olacakt r.
G da ekstrakt nda bulunan enterotoksin konsantrasyonunun, kullan lan
ekstraksiyon metodunun farkl l ndan (örne in ultrafiltrasyon)
etkilenebilece i gözönünde bulundurulmal d r.
Bacillus cereus enterotoksinlerinin olu umu ortam ko ullar na ba l d r.
Kültür ortam nda Bacillus cereus enterotoksini üreten su lar, in vivo
olarak ayn seviyelerde toksin üretmeyebilmektedir.
Brett, M.M. 1998.Kits for the detection of some bacterial food

poisoning toxins: problems, pitfall and benefits. Journal of
Applied Microbiology Symposium Supplement 84, 11S-118S.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology,
96
11. Küf ve Maya Analiz Yöntemleri
G dalarda küf kontaminasyonu üretimin çe itli basamaklar nda ortaya

ç kabilmektedir. Küf geli imi için uygun olan s cakl k ve ba l nem
ko ullar nda sert kabuklu meyvelerde, ya l tohumlarda, tah llarda,
baklagillerde, çe itli sebzelerde ve meyvelerde de mikotoksin olu umu
s kl kla gözlenebilmektedir (Moss, 1996).
Mikotoksin üreten g da kaynakl küflerin ba l calar l man iklimlerde

Fusarium graminearum, F. culmorum, Penicillium verrucosum, P. freii,
P. cyclopium, P. expansum; (sub)tropikal iklimlerde Aspergillus flavus,
Fusarium verticillioides ve di er Fusaria, P. aurentiogriseum, P. citrinum,
P. crustosum, P. polonicum, P. viridicatum ve P. oxalicum dur (Frisvad,
1988).
Küf analizlerinde do rudan ekim ve seyreltim yöntemleri uygulan r.

Do rudan ekimde tah l kuru meyve vb. g dalar besiyeri üzerine
yerle tirilir, 25°C de 5 gün inkübasyona b rak l r. Ürüne özgü floran n
belirlenmesi amac yla yap lan çal malarda yüzeysel kontaminasyonlar
gidermek için ürüne yüzey dezenfeksiyonu uygulan r. Küf say mlar nda
uygulanan di er yöntem seyreltim yöntemidir. Seyreltimlerde %0,1 lik
peptonlu su, homojenizasyonda stomacher kullan m (2 dk.)
önerilmektedir. Sert kabuklu meyveler, tah llar gibi sert taneli ürünlerin
30 dakika ile 3 saat aras nda de i en sürelerde suda slat lmas ve
homojenizasyonda blender kullan m (60 saniye) tavsiye edilmektedir
(Pitt ve Hocking, 1997).
Kuru g dalardan veya meyve konsantrelerinden maya izolasyonunda

%20-30 glukoz, sakaroz veya gliserol içeren seyreltim çözeltileri
kullan larak mikroorganizma hücrelerinin osmotik oktan korunmalar
sa lanm olur (Pitt ve Hocking, 1997).
Küf analizlerinde de seyreltimler di er mikrobiyolojik analizlerde oldu u

gibi yap l r. Ancak, küf sporlar çok kolay dibe çökerler, bu nedenle
ekimin mümkün oldu u kadar k sa sürede, tercihan bir dakika içinde
97
yap lmas önerilmektedir. Sürme yöntemi ve optimum 0,1 ml lik ekimler
tercih edilmektedir. 10-15 ile 150 aras nda küf içeren petriler say mlarda
dikkate al n r. Maya say mlar küflere göre daha kolayd r. Ortamda
flamentli küf bulunmad takdirde 30 ile 300 aras nda koloni içeren
petriler de erlendirmeye al n r (Pitt ve Hocking, 1997).
Standart inkübasyon ko ullar 25°C de 5 gündür. Küf ve maya

say mlar nda genel amaçl olarak kullan labilecek ba l ca besiyerleri
Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) agar ve Dichloran
18% glycerol (DG18) agard r (Pitt ve Hocking, 1997).
DRBC agar daha ziyade taze ve yüksek su aktivitesindeki g dalar n

analizlerinde tercih edilir. 25 mg/litre rose bengal, 50 mg/litre
chloramphenicol içermesi nedeniyle yayg n üreme göstererek petri
yüzeyini kaplayan küflerde geli meyi s n rlayarak say m
kolayla t rmaktad r. Bakteri geli iminin yo un oldu u g da gruplar nda
chloramphenicol yan nda chlortetracycline (50 mg/kg) kullan m ile
ba ar l sonuçlar al nd belirtilmektedir (Samson ve ark. 1995).
Rutin kullan mda haz rlanm olan DRBC plaklar n n 25°C de 5 gün k
almayacak ekilde muhafaza edilebilece i belirtilmektedir. I a iki saat
maruz kalmas durumunda önemli düzeylerde toksik bile ikler olu tu u
saptanm t r (Samson ve ark. 1995).
DG18 depolanm tah l, f nd k, un vb. kuru g dalar n (aw >0,90) analizleri

ve kserofilik küflerin izolasyonu için geli tirilmi bir besiyeridir (Pitt ve
Hocking, 1997).
98
11.1.Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agarda (DRBC)
( CM 7 2 7 ) Küf ve M a ya Sa y m Yön t e m i *
DRBC agar bile iminde bulunan Chloramphenicol sayesinde örneklerde

mevcut bakteri geli imini önleyerek küf ve maya izolasyonuna ve
say m na olanak sa layan bir besiyeridir.
DRBC agar (CM727) besiyerinden 15,75 g tart l r, 500 ml dam t k su

içinde s t larak eritilir; besiyerine 3 ml etanolde çözündürülmü bir vial
Chloramphenicol Supplement (SR78) kat l r ve kar t r l r. Daha sonra
121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri
aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür

besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yüzeye yayma
metoduyla ekim yap l r. Petriler 25°C de inkübe edilir, 3., 4. ve 5.
günlerde incelenir.
Petri yüzeyinde uygun say m aral ndaki (10-100) üremeler say l p,
seyreltim faktörü ile çarp larak küf-maya say s ayr ayr , veya toplam
olarak saptan r.
* th
Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8 Edition. Oxoid Ltd., Hampshire.
99
11.2. Dichloran Glycerol Agarda (DG18) (CM729) Küf ve Maya
Sa y m Yön t e m i
DG18 agar dü ük su aktivitesine sahip kuru ve yar kuru g dalarda

kserofilik küflerin say m amac yla kullan l r. Kuru meyveler, baharatlar,
ekerlemeler, tah llar, kurutulmu et ve bal k ürünlerinden kserofilik küf
izolasyonu için ideal bir ortamd r. DG18 agar (CM727) besiyerinden
15,75 gram tart l r, 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir; besiyerine
110 gram gliserol (analitik safl kta) ve 3 ml etanolde çözündürülmü bir
vial Chloramphenicol Supplement (SR78) kat l r ve kar t r l r.
121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri
aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür. lem DRBC agardaki gibidir.
100
Frisvad, J.C., Thrane, U. 1995. Mycotoxin production by food-borne fungi. (Ed.

Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg). Introduction
to Food-Borne Fungi . s. 251-260. Centraalbureau voor
Schimmelcultures, Baarn.
Frisvad, J.C. 1988. Fungal species and their specific production of
Mycotoxins. (Ed. Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg).
Introduction to Food-Borne Fungi. s. 239-249. Centraalbureau voor
Schimmelculture
Moss, M.O. 1996. Mycotoxins. Mycological Research 100 (5) 513- 523.
Pitt, J.I., Hocking, A.D. 1997. Methods for isolation, enumeration and
identification. Fungi and Food Spoilage , s. 21-57. Blackie Academic and
Professional. London
Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. 1995. Methods for the
detection and isolation of food-borne fungi. Introduction to Food-Borne
Fungi . s. 235-242. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn.
101
This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com.
The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.

Mikrobiyoloji Agar Sayım Biyokimyasal Testler

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Mikrobiyoloji Agar Sayım Biyokimyasal Testler

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

1.

M ik r obiyoloj ik Ana lizle r ve G da Güve nir li i

Sterilize edilmedikçe ve steril ambalaj materyali içinde muhafaza

1.1. Ür ü n Gü ve n ir li in in D e e r le n dir ilm e sin de

G da analizlerinde sonuçlar n güvenirli i aç s ndan ürün tipine uygun

ndikatör mikroorganizma say s n n belirlenmesi: ndikatör

G da bozulma etkeni mikroorganizmalar n belirlenmesi: G dalar n

Bir g da maddesi patojen mikroorganizmalar veya toksinlerini yüksek

Mikrobiyal metabolitlerin analizi: Mikroorganizma geli mesi sonucunda

1.2.1. Örnek Alm a ve Ör n e in An a liz e H a z r la n m a s

Analize al nan örnek al nd g da grubunu temsil etmeli (ICMSF, 1986),

Örnekler laboratuara orijinal depolama ko ullar na en yak n ko ullarda

Laboratuara getirilen örne in genel fiziksel görünümü kaydedilmeli,

Dondurulmu g dalar çözündürülmeden analize al nabilirler. Ancak blok

1.2.2. Homojenizasyon ve Seyreltim

Toplam canl say m yöntemlerinde g da örne i homojenize edilir, gerek

1.2.3. Be siye r le r inin H a z r la n m a s ve M u h a fa z a s

Kurutulmu haldeki besiyerleri higroskopik özellikte olup, s ya, a ve

Haz rlanan besiyerleri 50°C deki su banyosuna al nmal ve bu s cakl a

Haz rlanm olan besiyerlerinin muhafaza süreleri besiyeri cinsine göre

Kullan lan besiyerleri ve di er malzemeler sterilize veya dezenfekte

1.4. H a z r la n a n Be siye r le r inde Laboratuar Kalite Kontrol

(i) Besiyerinin pH oda s cakl nda (25°C) kontrol edilmelidir.

1.5. Ku lla n la n La bor a t u a r M a lz e m e le r in in Te m iz le n m e si ve

Yeni al nan cam malzemenin kullan m öncesi su ve bir temizlik

Plastik petriler, pipetler ve i eler gibi bir kullan ml k malzemeler

Mikrobiyolojik analizlerde kullan lan özeler bunzen alevinde kor hale

1.6. Topla m Ca n l Sa y m Yön t e m le r i

G da güvenirli ini belirlemede kullan lan en basit ve yayg n analiz

1.6.1. Koloni Say m Yönt em leri

Aerobik mikroorganizma analizlerinde petriler ekimi takiben; anaerobik

1.6.1.1. Dökme plak yöntemi

1. Steril petrilere 10-1, 10-2, 10-3... lik seyreltimlerden paralelli veya

Not 1. Seyreltim ve ekim i lemlerinin 15-30 dakika içinde tamamlanmas

1.6.1.2. Yayma plak yöntemi

Not. Staphylococcus aureus gibi baz bakterilerin analizlerinde 3 ayr

1.6.1.3. Spiral plak yöntemi

Besiyeri içeren petri kutular na spiral eklinde ("Archimedes" spiral),

1.6.1.4. Mem bran filt rasyon t ekni i

Membran filtrasyon yöntemi ile klasik say m yöntemlerinden farkl olarak

Yöntem, su ve berrak içeceklerin analizlerinde ba ar ile

Üründe mikroorganizma say s dü ük düzeyde ise tüplere daha fazla

Seyreltim oranlar dikkate al narak En Muhtemel Say (EMS) (Most

Örnek 1g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g Pozitiflerin EMS/g

Yeni geli tirilen besiyeri formülasyonlar (MUG, kromojenik agarlar vb.)

1.6.4. Yöntem Seçimi

G dalar n laboratuar analizlerinde kullan lan yöntemler farkl l klar

De Boer, E. 1998. Update on media for isolation of Enterobacteriaceae from foods.

FAO, 1992. Manual of Food Quality Control. 4. Rev. 1. Microbiological Analysis .

Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology .

ICMSF. 1986. Microorganisms in Foods. 2. Sampling for Microbiological Analysis:

Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. 1995.

Halkman G dalar n Mikrobiyolojik Analizi 2. Mikroorganizma say m . G da

Halkman, A.K. G da Mikrobiyolojisi Laboratuar ; Genel Bilgiler. G da

1.6. 5. Baz G da Gruplar çin Önerilen Mikrobiyoloj ik Analizler

G da maddelerine uygulanacak mikrobiyolojik analizlerin

Süt ve Süt Ürünleri

Dondurma Aerobik mezofilik bakteri

Et ve Et Ürünleri Aerobik mezofilik bakteri

K ym a Aerobik mezofilik bakteri

Tavuk Eti Aerobik mezofilik bakteri

Bal k Filet osu Aerobik mezofilik bakteri

Kabuklu su ürünleri Fekal koliform bakteri

Derin Dondurulm u Sebzeler Aerobik bakteri