Professional Documents
Culture Documents
רקע
רקע
1תודות
בהגיענו לחלק זה של העבודה נאלצנו לחשוב על כל התקופה בה עסקנו במחקר וגילינו רשימה לא קצרה
של אנשים אשר בלעדיהם לא היינו מסוגלים להתקדם אפילו צעד קטן אחד .אנו תקווה שלא שכחנו אף אחד
מהם ,מכל מקום סליחה ממי שנשכח בלהט הרגע.
התודה הגדולה מכולן מגיעה לדר' רבקה כהן אשר ליוותה אותנו לכל אורך התהליך הקשה של ביצוע מחקר
בפעם הראשונה בחיינו.היא תמיד הייתה קשובה אלינו והיתה מוכנה לעזור ולקדם אותנו.
תודה מעומק הלב לדר' מיכאל פירר אשר הקדיש לנו מזמנו היקר והדריך אותנו וייעץ בכל בעיה שפנינו אליו
בתחום גידול התאים האנימליים .תודה לדר' אדוארד בורמשנקו ולכל הצוות שלו שעזרו לנו מאוד להכין את
הפולימר המשמש כמצע לגידול התאים :לנה ,אלבינה ו
תודה מיוחדת מגיעה ליעקב לנגזם מאוניברסיטת בר-אילן אשר סייע לנו רבות בכל הקשר למיקרוסקופ
האלקטרונים.
3
2תקציר
4
3תוכן עניינים
2 1תודות
3 2תקציר
7 5רקע
.............................................................................................................................10חיידקים 5.2
..........................................................................................................................20תאים 6.1.1
.............................................................................................................................20חיידקים 6.2
21 7תוצאות
.............................................................................................................................21חיידקים 7.2
23 9ביבליוגרפיה
4רשימת איורים
8 איור - 1אתרי מגע בין משטח לתא.
הקו המרוסק מייצג התפשטות תאים בהעדרות חלבוני סרום,הקו המלא מייצג התפשטות תאים בנוכחות חלבוני סרום9...............................
איור - 5השפעת תנאי הזרימה על צפיפות הביופילם (עגולים מלאים) ועובי הביופילם (עגולים ריקים) ))15......Chang et al.,1991
איור - 10השיפור בקישור של משטח חלק כפונקציה של רדיוס החריץ עבור חריצים בצורת Uו19...............................................V-
7
5רקע
5.1תאים אנימליים
)aמוקד הדבקות )bמגע קרוב )cמיקום אתרי ההדבקו השונים -MF .מיקרופילמנטים -M ,ממברנת
התא -AP,חלבון הדבקות -FN,פיברונקטין -ECMC,מגע עם -ECM, Cמגע קרוב -F,מוקד הדבקות.
תאים יכולים להדבק ל ECMאו לתאים אחרים .המגע שנוצר באינטרקציות מסוג זה שונה בצורה משמעותית
מאשר זה הנוצר מאינטרקציות תא-משטח ,ניתן לתאר זאת על ידי ארבעה סוגי אתרים מקובלים :נקסוס )
– )nexsusרשת ,שנוצרת על ידי מערך קשרים דמויי פלאק בין ממברנה פלסמטית של תאים קרובים; דסמוזום
) – )desmosomeקישור מכאני הנוצר מעיבוי ממברנה פלסמטית של שני תאים קרובים ,ומכיל חומר סמיך;
המידסמוזום ) -)hemidesmosomeבדומה לדסמוזומים אך בין תאים ל ;ECMוחיבור צמוד -הנוצר כאשר
ממברנות תאים קרובים נדבקות אחת לשניה.
כאשר תאים נקשרים למשטח הם מתפשטים עליו כתוצאה מתהליך משולב של הדבקות מתמשכת והתכווצות
רשת ציטופסמטית .הדבקות והתפשטות תאים מושפיחם ישירות על ידי המאפיינים הכימופיזיקליים של
המשטח.
5.1.3אינטרקציות תא-משטח
באופן כללי ,חומרים סנתטיים הופכים לפעילים ביולוגית רק לאחר אינטרקציה ראשונית עם חלבונים
ממומסים .חלבונים שנספחו הופכים חומר אינרטי למשטח פעיל ביולוגית שיכול לווסת הדבקות תאים,
התפשטותם ותפקודם.
חושבים שהתכונות הספציפיות של המשטחים ,וכן התכונות הספציפיות של החלבונים ביחד ,קובעים את ארגון
שכבת החלבונים שנספחה ,ואופי השיכבה קובע את תגובת התא למשטחים .לדוגמה ,התפשטות תאים נמוכה
קיימת על משטח הידרופובי והתפשטות טובה ישנה על משטח הידרופילי בנוכחות חלבוני סרום ואף בהעדרם
כמוראה באיור .2
תכונות אחרות של המשטח כגון קבוצות טעונות שלילית בפני המשטח ,טופוגרפיית המשטח ,חיספוס,
טקסטורה ,נקבוביות ,מביאים להשפעה שלא מוטלת בספק על תפקודי התא.
5.2חיידקים
בתהליך ההתיישבות החיידקים נדבקים במהירות לפולימר ומתחילים להתרבות במהירות על מנת לייצר
אשכולות תאים רב שכבתיות על פני שטח הפולימר המצויים בתוך חומר חוץ-תאי ))extracellular material
כמוראה באיור .3
הצטברות ביומסה של בקטריה וחומר חוץ-תאי על חומר מוצק נקרא ביופילם .לאחר יצירת ביופילם ,תאים
שלא נדבקו וקצת תאים שנדבקו משתחררים מהשיכבה שנוצרה ,או על ידי הפסקת ייצור חומר חוץ תאי
במנגנון ויסות פנוטיפי ,או על ידי exhaustion conditionsשתומכים בייצור חומר חוץ תאי שנקרא גם ,slimeואז
התאים חופשיים לנדוד לאתרי התיישבות אחרים על מנת לחזור על תהליך ההתיישבות.
זני חיידקים שאינם מייצרים slimeנדבקים פחות והינם פחות פתוגניים .הקונספט הנוכחי דוגל בכך שייצור
slimeחשוב במיוחד לארועים שבאים אחרי השלב הראשוני של ההדבקות ,הכולל יישוב מספר משטחים ,הגנה
מפני פגוציטוזה ,הפרעה לתגובה החיסונית של התא,והפחתת השפעה של חומרים אנטיביוטיים .יתר על כן,
הביופילם מגן על הבקטריה מפני הנתקות כתוצאה מתנאי זרימה.
11
דיפול אבל מבטאת אותם במונחים של אנרגיה חופשית ,שהיא מונח תרמודינמי .גישה זו דורשת הערכה של
ערכים נומריים של פרמטרים תרמודינמיים ,כלומר אנרגיה חופשית בפני השטח של החיידקים והמצע ואנרגיה
חופשית בפני השטח של התמיסה המרחיפה )או מתח פנים של התמיסה) ,במטרה לחשב את אנרגיית גיבס
של הדבקות עבור הדבקות חיידקים .הדבקות עדיפה במצב שבו אנרגיית גיבס ליחידת שטח הינה שלילית
כתוצאה מההדבקות ,כלומר הצמדות ספונטנית נלווית לירידת האנרגיה החופשית במערכת ,כצפוי מחוק שני
של תרמודינמיקה .מנקודת הסתכלות תרמודינמית ,ישנן שלוש תאוריות עיקריות המסבירות את הדבקות
התאים .משוואת ניומן ) ,)Neumann equationגישה זו מבוססת על רכיבים מתפצלים קוטבית ותאוריית חומצה-
בסיס של לואיס .כל אחת מהתאוריות הללו מסבירה פאן אחר של טבע המשטחים והמאפיינים המולקולריים
שלהם המעורבים בתהליך ההדבקות .תאוריות אלה אינן תואמות אחת את השנייה וקבלה של אחת מהן דוחה
את האחרת )1 .תאוריית ניומן – מקבלת שזוית מגע אחת מספיקה על מנת לאפיין את שדה הכוחות הנוצר בפני
המשטח והתכונות המולקולריות אינן משפיעות על תוצאות הניסויים )2 .גישת הפיזור הפולרי – מתאימה לחיזוי
העבודה של ההדבקות בין פאזות כאשר אין אינטרקציות ספציפיות באיזור הבינפני .מכל מקום ,ההנחה שחומר
מתקשר דרך כוחות הנוצרים מדיפולים קבועים וכן שאינטרקציות מסוג זה ,כמו הן סימטריות ,עומדת בסתירה
מוחלטת לקונספציה הנוכחית בתחום של אינטרקציות בין מולקולריות של פאזות מעובות )3 .גישת תורם
האלקטרון-מקבל האלקטרון היא הגישה המתקדמת ביותר והיא זאת שנעזרת בידיעות הפיזיקליות המקובלות
כיום בתחום של אינטרקציות באיזור הבינפני .גישה זו טוענת שהדיפול הקבוע שתורם לכוחות הבין
מולקולריים הינו קטן עד כך שהוא ניתן להזנה וכך שבסיס-חומצה ובפרט קשר מימן הוא שאחראי
לאינטרקציות .אולם ,נכונות התוצאה הכמותית המתקבלת מהתאוריה עדיין נמצאים בוויכוח.
באופן כללי ,הגישה התרמודינמית מניחה שהתהליך הוא הפיך ,אך זה איננו המקרה .יתר על כן ,בתאוריית
,DLVOאנרגיית האינטרקציה תלויה במרחק ,בעוד שבגישה התרמודינמית יצירת איזור בינפני חדש של תא-
מצע על חשבון איזור בינפני של מצע-מדיום הינו מחושב,דהיינו חוזק האינטרקציה בנקודת המגע הוא זה
שמחושב .אם לא נוצר איזור בינפני חדש ,התאוריה אינה מתאימה .שאלה נוספת היא איזה איזור של התא
נמצא בפועל במגע עם המצע .יתר על כן ,הגישה התרמודינמית היא מודל שיווי משקל שאינו מתייחס
לקינטיקה .בכלליות ,קשה מאוד לקבוע ערכים מדוייקים עבור האנרגיה החופשית של פני שטח החיידקים
משום שהם בעלי כימיה מסובכת ונמצאים בסביבה מימית .in vivoלפיכך ,חישובי אנרגיה חופשית משתנים
בזמן ההדבקות ויכולים להיות שגויים .בנוסף ,התאוריה התרמודינמית תואמת מערכות סגורות שבהן אין כניסה
של אנרגיה מבחוץ ,אך חיידקים הינם אורגניזמים חיים שממירים מצע גידול לאנרגיה ,וההדבקות עשויה להיות
מושפעת מאנרגיה שנצרכת במנגנונים פיזיולוגיים או סינתזה של פולימרים נדבקים.
לפיכך ,יישום התאוריה התרמודינמית לא מצליחה להסביר או לחזות את כל ההתנהגויות בתחום ההצמדות
שנצפו בחיידקים .מכל מקום ,גישה זו עזרה להסביר תובנה מקובלת :במספר מקרים עלייה בהידרופוביות של
המשטח המוצק או של החיידק נוטה להביא לעלייה במספר התאים שנצמדים .על מנת ששני משטחים יבואו
במגע ,ויצרו אינטרקציות ברמה המולקולרית ,חייבים להוציא מים שנספגו שם .אם המשטח מאוד רטוב ,יציאת
המים אינה מתבצעת ספונטנית ויכול להיות שלא ניתן להתגבר על זה על ידי ניטרול אינטרקציות משיכה.
מהאמור לעיל ברור כי גישת DLVOוהגישה התרמודינמית אינן מסבירות באופן מלא את תופעת הדבקות
החיידקים .ולכן פותחה תאוריית DLVOהמורחבת שבה נלקחים בחשבון אינטרקציות הידרופוביות/הידרופיליות.
הביטוי הבא מבטא את אנרגית ההדבקות:
14
∆Gadh=∆Gvdw+∆Gdl+∆GAB
כאשר – Gvdw∆ :אינטרקציית ואן דר ואלס – Gdl∆ ,אינטרקציית שיכבה כפולה – GAB∆ ,אינטרקציות בסיס-
חומצה.
הרכיב האחרון שבעקרון מבטא אינטרקציות משיכה הידרופוביות והשפעות דחייה ממיום ,שהם חזקים פי 10-
100מאשר אינטרקציות ואן דר ואלס של משטחים במגע ישיר .התלות במרחק ,נלקחת מתאוריית DLVO
הקלאסית עבור אינטרקציות vdwושכבה כפולה וערך הרכיב ∆ GABדועך אקספוננציאלית ככל שמתקרבים
לפני השטח .לפיכך ,אינטרקציות חומצה-בסיס אינן באות לידי ביטוי בשלב הראשון של ההדבקות .נראה כי
מודל זה מבטיח יכולת לחקור את הדבקות החיידקים אך הוא לא נבדק בצורה משמעותית.
בהינתן ידיעות אלה ניתן להסיק כי יישום תאוריה כימופיזיקלית ,למרות שעזרה להסביר חלק מהתצפיות ,היא
עדיין לא מצליחה לחזות בצורה טובה הדבקות חיידקים .היא מבליטה את הקושי ביישום תאוריה פיזיקלית
במערכות ביולוגיות .מורכבות הפולימרים בפני השטח של החיידקים ,כמו כן השוני בהרכב הפולימר והסינתזה
עם שינוי תנאי הסביבה או הזמן יכולים להסביר הרבה מהשונות בתצפיות שהתקבלו .ברור ,שתנאים
סביבתיים ,ובפרט סוגי הנוטריאנטים וריכוזם יכולים להשפיע על ההרכב הכימי של הפולימרים בפני השטח
של החיידק .לעיתים קרובות ,לאחר שחיידק נצמד למשטח במשך שעות או ימים ,מצטברים פולימרים
אמורפיים מיוממים ,ביחד עם כלייה במספר התאים שנצמדים .פולימרים אלה יוצרים מטריקס בינתאי )
)intercellular matrixשבו התאים נטמעים ומסמיכים את המטריקס ויוצרים חלק ניכר של הביופילם .יתכן כי
ההדבקות הראשונית למשטח מביאה לשינוי בסינתזת הפולימר שמחזקת את ההדבקות .הצמדות למשטחים
מעודדים ביטוי גנים המביאים למעבר מתא אחד למערך מורכב של תאים צמודים.
לכן ,חלבונים שעל פני שטח התא ,פוליסכרידים ,שכבות מקובעות על משטחים ,שינויים הדדיים וביולוגיים
בקישור חיידקים בהחלט יכול להשפיע על התנאים המקדימים להדבקות עד כדי כך שלא ניתן לחזות את
תהליך ההדבקות בהתבסס על מודלים כימופיזיקליים בלבד .אבל ,תרגום נכון של התאוריות שחוזות ספיחה
של חלקיקים קולוידליים מוגדרים היטב ,לתחום של הדבקות חיידקים ,מאוד יעיל במטרה ליצור מסגרת
שלתוכה ניתן להוסיף גורמים ביולוגיים.
5.2.4.1סביבה
גורמים ספציפיים של הסביבה ,כגון טמפרטורה ,זמן חשיפה ,ריכוז חיידקים ,נוכחות אנטיביוטיקה ותנאי
הזרימה משפיעים על ההדבקות .תנאי הזרימה נחשבים גורמים דומינטיים שמאוד משפיעים על מספר
החיידקים הנצמדים ,כמו גם מבנה הביופילם .באופן כללי ניתן לומר שערבול חזק מביא לשיעור הנתקות גבוה
יותר ,תוך כדי יצירת ביופילם צפוף וכחוש יותר כמוראה באיור .5
15
ברגע שהחיידק בא במגע עם המשטח ,הוא נתון להשפעות של מאפייני המשטח עליו ומאפייניו שלו .אם כל
קשר זקוק לכח ספציפי שישבור אותו ,מספר הקשרים בין החיידק למשטח יקבע את הלחץ שחיידק צמוד יוכל
לעמוד בו .ישנו קצב אופטימלי של הצמדות חיידקים המשקף את האיזון בין הספיקה והכח הפועל על חיידק
צמוד .כמוראה באיור ,6במקרה של יחס רצפטורים/תא גבוה ,הדבקות S. aureusלמשטח מצופה קולגן עולה
בין הלחצים s-1 50-300ויורדת בלחצים גבוהים מ .s-1 500
על המשטח ,מספר הקשרים יכול לעלות או לרדת .אם מספר הקשרים צונח מתחת למספר קרטי אזי החיידק
יתנתק .יתר על כן ,ישנה הוכחה לכך שחיידקים מורחפים יכולים להגיב ללחצים על ידי שינוי קצב הגדילה,
מורפולוגיה ,גודל חיידקים/צפיפותם והמטבוליזם שלהם .ניתן לראות פעילות גבוהה יותר של דההידרוגנזות
וירידה בגדילה כאשר הכח המופעל עולה .הירידה בגדילה ,ביחד עם פעילות קטבולית מוגברת ,מרמזת
16
שהפרדת קטבוליזם מאנבוליזם יכולה להתרחש כאשר הזרימה גבוהה יותר .לכן ,תופעה ביולוגית ,חוץ
מהשפעה פיזיקלית פשוטה ,יכולה להבליט את הקשר בין הקצב הזרימה ומבנה הביופילם הנובע ממנו.
הערכה כמותית של הלחצים המאפשרים הצמדות ואלו המביאים להנתקות חיידקים מראה שיש הבדל של סדר
גודל .הלחץ הדרוש להנתקות עולה עם העליה בזמן האינקובציה עד לערך מקסימלי ,עובדה המרמזת על כך
שאינטרקציות נוספות נוצרות לאחר ההצמדות הראשונית.
יתר על כן ,ריכוז אלקטרוליטים ,כגון ,KCl, NaClוערכי pHבסביבת התרבית גם כן משפיעה על הדבקות
חיידקים .ה pHוהחוזק היוני של הבופר משפיעים על הידרופוביות פני שטח החיידקים .ההדבקות הטובה ביותר
למשטחים הידרופוביים נצפתה ב pHבין 2.2ל ,4מסביב לנקודה האיזואלקטרית שבה אין לחיידקים מטען,
וחוזק יוני .1Mנראה כי השפעת החוזק היוני נובעת מדיכוי salvation barrierואינטרקציות )דחייה)
אלקטרוסטטיות זניחות .לכן ,חוזק יוני ו pHמשפיעים על הדבקות חיידקים על ידי שינוי מאפייני פני השטח של
החיידקים והמשטחים ולכן משפיעים על האינטרקציות של שלב ראשון.
נוכחות אנטיביוטיקה מורידה את יכולת הדבקות החיידקים וזאת לפני רגישותם וריכוז האנטיביוטיקה.
הגורמים המשפיעים על הדבקות החיידקים למשטחים מחומר ביולוגי כוללים את ההרכב הכימי של החומר,
המטען בפני השטח ,הידרופיביות ,וחיספוס המשטח או הקונפיגורציה הפיזיקלית.
5.2.4.2.1ההרכב הכימי
כימיית המשטח משפיעה על הדבקות החיידקים ויכולתם לשגשג .חומרים בעלי קבוצות פונקציונליות שונות
משנים את הדבקות החיידקים על פי המטען וההידרופוביות שלהם .הדבקות S. aureusעל פולימרים חד-
שכבתיים מורכבים עצמאית
) )self assembled monolayers-SAMsבעלי קצוות מתיל ,חומצה קרבוכסילית ,הידרוכסיל ו-טרי אתילן אוקסיד,
כאשר ההדבקות הנמוכה ביותר התקבלה במשטחים בעלי קצוות אתילן אוקסיד לאחר מכן קבוצה
הידרוכסילית והגבוהה ביותר עבור קבוצות קרבוכסילית ומתיל )איור .)7
17
נמצא כי אי סדירויות בפני השטח של הפולימר מעודדות הצמדות חיידקים ויצירת ביופילם .ניתן להסביר זאת
בכך ששטח הפנים גדל והאזורים שבין האי סדירויות מספקים אתרים מועדפים לקולוניזציה.
עלייה קטנה בחיספוס של PMMAהביאה לעלייה משמעותית בהדבקות חיידקים ,ואילו עלייה גדולה יותר
בחיספוס לא הביאה לשינוי משמעותי בהדבקות חיידקים בהשוואה למשטח חלק.
18
הסיבה לתלות הלא הלינארית של הדבקות חיידקים בחיספוס המשטח היא שאלה למחקרים נוספים שיבדקו
טווח רחב יותר של חיספוס ,מדידת שטח פנים או ניתוח קונפיגורציית המשטח.
5.2.4.2.3קונפיגורציית המשטח
חיידקים מעדיפים להדבק וליישב איזורים מחוררים .יתר על כן ,חיידקים נדבקים יותר לחומרים מחורצים
וקלועים מאשר לחלקים ,כנראה לפחות חלקית בגלל הגדלת שטח הפנים .מכל מקום ,חיידקים מעדיפים
להדבק לאי סדירויות שמתאימות לגודלם וזאת משום שזה ממקסם את איזור המגע בין החיידקים למשטח
)איור .)9
איור - 10השיפור בקישור של משטח חלק כפונקציה של רדיוס החריץ עבור חריצים בצורת UוV-
5.2.4.3מאפייני החיידקים
עבור חומר נתון ,חיידקים שונים נדבקים שונה משום התכונות הכימופיזיקליות שאופייניות לכל סוג של חיידק.
5.2.4.3.1הידרופוביות החיידקים
באופן כללי ,חיידקים בעלי תכונות הידרופוביות ,מעדיפים משטחים בעלי תכונות הידרופוביות ,ואלו עם תכונות
הידרופיליות מעדיפים משטחים הידרופיליים .הידרופוביות המשטח בעלת חשיבות גדולה יותר לגבי ההדבקות
מאשר הידרופוביות פני השטח של החיידקים.
רב החלקיקים מראים מטען אלקטרוני בפני השטח בסביבה מימית עקב יוניזציה של הקבוצות בפני השטח.
חיידקים בתרחיף על בסיס מיימי כמעט תמיד טעונים שלילית .מטען פני השטח בחיידקים משתנה לפני סוג
החיידקים ומושפע ממדיום הגידול ,ה pHוהחוזק היוני של הבופר בתמיסה ,גיל החיידקים ,ומבנה פני השטח
של החיידקים.
מכל מקום ,התרומה היחסית של המטען בפני שטח החיידקים להדבקות עדיין לא ברור לחלוטין.
20
6שיטות וחומרים
6.1תאים אנימליים
6.1.1תאים
במהלך הניסוי נעשה שימוש בקו תאי שריר של עכבר המכונה ,C-2שנתקבלו ממכון וייצמן למדע ברחובות.
אלו תאי מיובלסט שנתקבלו משריר רגל של עכבר בוגר נורמלי .התאים מתחלקים המהירות ,מפיקים כמות
גדולה של חלבוני שריר אופיינים .הם משמשים כמודל ללימוד מיוגנציה ) )myogenesisוהתחלקות בשיטות in
.vitro
6.1.2תרבית תאים
לפני ביצוע הניסויים ,התאים נזרעו בבקבוקי גידול סטנדרטיים עם מצע גידול הכולל:
_________________________
ב 37°C-ו.CO2 5%-
יריעות פולימר פוליסטירן ) )PSמחוררות שימשו כמצע עליו גדלו התאים בניסוי .הפולימר עבר סטרליזציה על
ידי טבילה באתנול למשך 5דקות ושטיפה של שאריות האתנול.
לפני זריעת התאים על הפולימר הם נותקו ממיכלי הגידול בעזרת ,Trypsin-EDTA 0.05%לאחר מכן הם נזרעו
על הפולימר בתוך מצע הגידול הסטנדרטי למשך 24שעות.
הבקרה הייתה תאים שנזרעו למשך 24שעות אך ללא הפולימר כבסיס.
6.1.3הדבקות התאים
יכולת הדבקות התאים לפולימר נבדקה בעזרת צביעת גימזה לאחר 24שעות מהזריעה .לצורך התבוננות
בדגימה נעשה שימוש במיקרוסקופ אור רגיל.
6.2חיידקים
6.2.1סוגי חיידקים
6.2.2תנאי גידול
6.2.3הדבקות החיידקים
21
7תוצאות
7.1תאים אנימליים
לא נראה אף תא שהצליח להדבק לפולימר כלומר התאים נותרו בתמיסה במצב מרחף.
7.2חיידקים
22
8מסקנות ודיון
23
ביבליוגרפיה9