Molekulaarbioloogia ldkursuse lhikonspekt Prof.

Jaanus Remme

Philine pik on B. Lewin Genes V ja VI vljaanne, edasises tekstis on viiteid Genes VI joonistele (kui pole eraldi mrgitud) ja ksikutel teemadel detailsematele materjalidele. Kursiivis on esitatud ligud, mis on meldud tindavaks lugemiseks aga ei ole kohustuslikud. Sissejuhatus

Molekulaarbioloogia on termin, mis veti kasutusele selle sajandi teisel poolel peale esimeste makromolekulide ruumilise struktuuri kindlakstegemist. Esialgu thistaski see termin just struktuurset bioloogiat molekulaarsel tasemel. Seega on molekulaarbioloogia oma algses thenduses keemia ja fsika meetodeid kasutav bioloogia osa, mis tegeleb bioloogiliste makromolekulide ruumilise struktuuri ja struktuuri ning funktsiooni vaheliste seoste kindlakstegemisega. Hiljem, kui sama teaduse piirid on hmastunud seoses teadmiste laienemisega ja uute probleemide kerkimisega, on kasutusele vetud termin molekulaargeneetika. Sisulist vahet nende kahe termini vahele ei ole. Molekulaarbioloogia (vi molekulaargeneetika) tegeleb priliku inforamtsiooni kodeerimise, silitamise ja lekande mehhanismide uurimisega, aga samuti priliku informatsiooni realiseerumise molekulaarsete mehhanismidega st. kuidas geenides sisalduv informatsioon mrab elusorganismide ehituse ja nende funktsioneerimise. Seejuures ongi molekulaarbioloogia ks keskseid probleeme fsikalis-keemiliste struktuuride ja bikeemilis-fsioloogiliste funktsioonide vastavuse uurimine. Molekulaarbioloogia sndi on kirjeldanud J. Watson oma raamtus Double helix (e. k. Kaksikspiraal, Loomingu Raamatukogu, 1972). DNA on ilus nide selle kohta kuidas makromolekuli struktuuri tundmappimine li eelduse prilike protsesside - geneetilise informatsiooni silitamise ja paljundamise kindlakstegemiseks. Just DNA komemtmelise struktuuri kindlakstegemine pani aluse molekulaarbioloogiale.

1. Molekulaarbioloogia dimensioon
Molekulaarbioloogia on suures osas struktuurne teadus, mis tegeleb bioloogiliste makromolekulide ja nende funktsionaalsete komplekside struktuuriga ja uurib nende struktuuride tekke fsikalsis-keemilisi aluseid. See osa molekulaarbioloogiast on analoogiline anatoomiale, ainult et molekulaarbioloogia tegeleb molekulide ehitusega ja seega mikromaailmaga. Kovalentse keemilise sideme pikkus on keskmiselt 1,4 (ongstrmi, 1 = 10-10 meetrit). Sellest piirist viksemate suurustega molekulaarbioloogia reeglina ei tegele. Suuremad makromolekulide kompleksid on kuni 300 lbimduga, mis on enamasti molekulaarbioogia lemine piir. Suuremate struktuuridega tegeleb juba rakubioloogia. Jrelikult on molekulaarbioloogia dimensioon hest kuni mnesaja ongrstrmini ehk 1010 - 310-8 meetrit.

Mned nited: kaheahelaline DNA ja kaheahelaline RNA, biheeliksi (kaksikspiraali) diameeter - 20 keskmine globulaarne valk, molekulmassiga 50 000 daltonit, diameeter - 50 bakteriaalne RNA polmeraas (koosneb neljast globulaarsest valgust) molekulmassiga 500 000 daltonit, dimensioonid 90x90x160 nukleosoom (DNA valkudega pakitud struktuuriksus kromosoomides), molekulmassiga 300 000 daltonit, dimensioonid 60x110x110 bakteriaalne ribosoom, molekulmass 2,5 megadaltonit, dimensioonid 200x200x230 Rakubioloogia viksemad uurimisobjektid on niteks tuumapoorid, molekulmassiga 100 megadaltonit ja dimensioonidega 120x120x75 nm (1 nm = 10 ). Teine osa molekulaarbioloogiast sarnaneb fsioloogiale ja tegeleb vastavalt molekulide funktsioonidega ja omavaheliste seostega. Nii nagu fsioloogiat ei saa mista ilma anatoomiat tundmata, ei saa ka molekulide funktsioone uurida ilma nende struktuuri tundmata. Molekulaarbioloogia philine lesanne ongi tundma ppida molekulide anatoomiat ja fsioloogiat ehk nende struktuure ja funktsioone ja eriti struktuuri ning funktsiooni vahelisi seoseid.

2. Molekulaarbioloogia phidogma
Geneetilise informatsiooni lekande suunda DNA RNA valk nimetatakse oma keskse thtsuse tttu molekulaarbioloogia phidogmaks. Kuni 1969. aastani oli molekulaarbioloogia phidogma DNA RNA valk. 1969. aastal avastati uus ensm - RNA-stuv DNA polmeraas ehk prdtranskriptaas ehk revertaas, mis katalsib DNA snteesi RNA matriitsilt ja seega sai selgeks, et DNAd snteesitakse nii DNA kui RNA alusel. Revertaas leiti esialgu imetajate RNA viirustest (retroviirustestest), aga hiljem selgus, et see ensm on looduses vga laialt levinud nii eu- kui prokarootides. Geneetilise informatsiooni lekande kolm philist protsessi on: 1. Replikatsioon - priliku materjali (mis vib olla nii DNA kui RNA) kahekordistumine. Elusorganismide geneetiline informatsioon on silitatud kaheahelalise DNA kujul. Erandi moodustavad mned RNA viirused, mille gneetilise materjali kandjaks on RNA. RNA viiruste puhul on replikatsioon RNA kahekordistumine. lejnud organismidel on replikatsioon DNA kahekordistumine. Replikatsioon on DNA sntees. DNA sntees toimub liskas replikatsioonile veel rekombinatsiooni ja reparatsiooni kigus. Teiselt poolt on replikatsioon laiem miste kui DNA sntees hlmates ka RNA praimeri snteesi, DNA ja kromosoomi struktuuri muutusi ja replikatsiooni regulatsiooni. DNA snteesi viib lbi ensm - DNA-sltuv DNA polmeraas kusjuures substraatideks on desoks-nukleosiid 5trifosfaadid. 2. Transkriptsioon - RNA sntees. Transkriptsioon thendab mahakirjutamist ja thistab molekulaarbioloogias RNA snteesi DNA matriitsi alusel. RNA snteesi regulatsioon on geeni aktiivsuse regulatsiooni philine tase. Seega on transkriptsiooni regulatsioon vga

oluline makromolekulide snteesi kontrollmehhanism. Transkriptsiooni viib lbi DNA-sltuv RNA polmeraas. RNA polmeraase on vga palju erinevaid tpe. Eukarootides on kolm erinevat RNA polmeraasi, mis snteesivad erinevaid RNA molekule. RNA snteesil on substraatideks (ribo-) nukleosiid 5-trifosfaatidest. Snteesitud RNA ahel vastab ks-heselt temaga antiparalleelsele DNA matriitsahelale komplementaarsusprintsiibi alusel. RNA jrjestusega identset DNA ahelat nimetatakse kodeerivaks ahelaks. RNA snteesi kigus toimub DNA ahelate lahtiharutamine. Algne DNA struktuur taastub peale transkriptsiooni lppu. Transkriptsiooniga on seotud RNA protsessing ja modifitseerimine. 3. Translatsioon - valgu biosntees. Translatsioon thendab tlkimist. Molekulaarbioloogias thendab translatsioon RNA (seega ka DNA) nukleotiidse jrjestuse tlkimist valkude aminohappeliseks jrjestuseks. Valkude snteesiks vajalikku geneetilist informatsiooni kannab mRNA (matriits- ehk informatsiooniline-RNA). Valgu biosnteesi viib lbi ribosoom, RNAst ja valkudest koosnev organoid. Aminohapped seatakse ribosoomi abil vastavusse mRNAs sisalduva geneetilise informatsiooniga tRNA (transport-RNA) vahendusel. Aminohappe sidumine vastava spetsiifilise tRNA molekuliga toimub ensmide aminoatsl-tRNA sntetaaside ehk aminoatsl-tRNA ligaaside (ARS e. ARL) vahendusel. Aminoatsl-tRNA (aa-tRNA) sntees on valgu biosnteesi esimene, preribosomaalne etapp. Ribosoomides, kus toimub valgusnteesi teine ehk ribosomaalne etapp, seatakse vastavusse mRNAs paiknev kolmest jrjestikusest nukleotiidist koosnev koodon tRNAs sisalduva antikoodoniga. Ribosoom snteesib tRNA kljes olevate aminohapete vahele peptiidsideme. Kasvav peptiidahel on snteesi kigus tRNAga kovalentselt seotud. Valgu biosnteesil osalevad veel paljud valgulised faktorid, ATP ja GTP ning veel mitmed molekulid, mida ksitleme valgusnteesi peatkis. Valkude ruumilise struktuuri moodustumine toimub nii translatsiooni kigus kui peale seda. Valgud viiakse organismis vajalikesse kohtadesse valkude transpordi teel.

I Bioloogiliste makromolekulide struktuur ja seda mjutavad jud

Geneetiliselt kodeeritud makromolekulid (nukleiinhapped ja valgud) on polmeerid, mis koosnevad suhteliselt vikesest arvust monomeeridest. Monomeerid sisaldavad identset osa, mis omavahel hendatuna moodustavad polmeeri selgroo. Viimase kljest hargnevad monomeeride klgahelad. Geneetiliselt on kodeeritud biopolmeeride monomeeride jrjestus ehk primaarstruktuur. Samast jrjestusest vib moodustuda mitu erinevat ruumilist struktuuri (sekundaar- ja tertsiaarstruktuuri tasemel). Praeguste teadmiste juures ei ole veel vimalik tpselt ennustada valkude (aga ka RNA) ruumilist struktuuri tuginedes ksnes nende primaarstruktuurile. Mitme valgu puhul on ka teada, et nad vivad looduses eksisteerida mitmes erinevas ruumilise struktuuri vormis (kuigi primaarstuktuur on sama). I 1. Valkude struktuur Valgud koosnevad 20+1 kodeeritud aminohappest. +1 thistab siin selenotssteiini (Sec), mis esineb vaid vhestes valkudes ja on kodeeritus UGA koodoniga, mis tavaliselt on stop-koodon (vt. valgusnteesi peatkk). Lisaks kodeeritud aminohapetele esinevad valkudes veel mitmed aminohapped, mis lisatakse peale valguahela snteesi ribosoomides (post-translatsioonilised modifikatsioonid). Siia kuuluvad modifitseetitud aminohapped nagu hdroksproliin ja atsetleeritud aminohapped. Paljude valkudega on hendatud suhkrujgid (vt. valkude glkosleerimine) vi fosforhappe jgid (valkude fosforleerimine). Aminohapped on omavahel hendatud peptiidsideme abil. Peptiidside on amiidsideme vorm, mis moodustub -amiknohapete vahel. -aminohapetel on amino- ja karbokslrhm hedatud sama ssinuku

aatomi ( -ssiniku) klge. Valguahel moodustub -ssinike ja peptiidsidemete abil, kus ssinike kljest hargnevad aminhapete klgahelad (joon 1.7). Valguahela otsad on erinevad ahela alguses (otsas millest valgusntees algab) on valgu selgrool aminogrupp (-NH2) ja ahela lpus on karbokslrhm (-COOH). Vastavalt nimetatakse valguahela algust N-terminuseks e. amino-otsaks ja lppu C-terminuseks e. karboksl-otsaks. Aminohapped on erinevate keemiliste omadustega erinevate klgahelate tttu. Erinevad aminohapped seonduvad omavahel lisaks peptiidsidemetele, mis moodustab valgu selgroo, ka erinevate keemiliste sidemete varal, mille abil moodustub valgu ruumiline struktuur. Eriline thtsus on siinjuures vesiniksidemetel (H - sidemed). Peptiidsidemes on olemas nii H - sideme doonor kui aktseptor, mis osalevad valgu sekundaarstruktuuri moodustamisel. Vga olulised valkude ruumilise struktuuri tekkel on tssteiinjkidel, mis moodustavad stabiilseid disulfiidsidemeid ja nende abil hoitakse valgu ruumiline struktuur stabiilsena. Aminohapped jaotuvad mitmesse klassi vastaval oma keemilisele koostisele ja omadustele. Siinkohal nimetan ainult klassid vastavalt laengule, mis on olulised valkude ruumilise struktuuri tekkel: Laetud aminohapped e. hdrofiilsed aminohapped, mis jagunevad omakorda happelisteks ja aluselisteks vastavalt klgahela laengule. Laetud aminohapped osalevad valgu seondumisel teiste molekulidega ja nad on enamasti valgu ruumilises struktuuris vljaspool. Apolaarsed e. hdrofoobsed aminohapped, mis ei sisalda laetud rhmi ja on seega hdrofoobsed e. vett trjuvad. Need aminohapped on sageli valgu ruumilises struktuuris sisemuses, olles ksteise lheduses ja trjudes vett eemale. Valmis valkudele lisatakse sageli mitmesugusei rhmi (snteesijrgsed modifikatsioonid), mille tulemusena tekivad modifitseeritud e. mittekodeeritud aminohapped. Olulisemad modifikatsioonid on fosforleerimine (foforhappe jgi lisamine), atsetleerimine (NH2 rhmale dikhappe jgi lsamine amiidsideme abil, esineb sageli N-terminaalselt ja lsiinidel), metleerimine ja glkosleerimine (suhkrujkide lisamine OH ja NH2 rhmadele). Lisaks on veel mitmeid post-translatsioonilisi (snteesijrgseid) modifikatsioone, niteks proliini hdroksleerimine, mille tagajrjel tekib hdroks-proliin (esineb suure sagedusega kollageenis). Modifitseeritud aminohapped esinevad enamsti valgu pinnal. Eriti sageli on modifitseeritud need valgud, mis on raku pinnal vi lahustuvad rakkudevahelises ruumis st. on kttesaadavad teistele molekulidele. Modifikatsioonid kaitsevad valke lagundamise eest, osalevad rakusiseste signaalide lekandel (vt. signaali lekanne ja rakutskli regulatsioon), moodustavad raku pinnamarkereid ja on olulised valkude aktiivsuse regulatsioonil. Valkude ruuminilne sruktuur sltub mbritsevast keskkonnast. Vee keskkonnas surutakse hdrofoobsed aminohapped valgu sdamikku ja vljapoole jvad hdrofiilsed (laetud) aminohapped. Vee molekulid on omavahel seotud vesiniksidemetega. Nende sidemete eluiga on lhike (ks side psib ligikaudu10-9 sek.). Sellegipoolest on suurem osa vee molekule igal ajahetkel omavahel vesiniksidemetega seotud. Vee keskkonna struktuur (vesiniksidemete moodustamise vime) suunab valkude struktuuri teket ja psimist. Valgu sekundaarstruktuur moodustub samuti vesiniksidemete varal. Sekundaarstruktuuri moodustavd H-sidemed tekivad valgu selgroo peptiidsidemete amino- ja karbokslrhmade vahel. Valkude sekundaarstruktuuri philised elemendid on -heeliks ja -kiht (lamepoogen) vt. joonised 1.18 ja 1.19

Aminohapete klgahelate omavahelise seondumise tulemusena tekib valkude tertsiaarstruktuur. Tertsiaarne struktuur on igale valgule spetsiifiline. Kindel ruumiline struktuur on valkude bioloogilise funktsioneerimise alus. Kuna valgud koosnevad paljudest erinevatest aminohapetest, siis on ka nende ruumiline struktuur vga mitmekesine. Eraldiseisvaid ruumilise struktuuri elemente nimetatakse struktuuri motiivideks. Ruumilise struktuuri motiivid sisaldavad sageli sarnaseid aminohappe jrjestusi - jrjestuse ehk primaarstruktuuri motiive. hesuguste biokeemiliste funktsioonide lbiviimine phineb enamasti sarnastel ruumilise struktuuri motiividel. Niteks sisaldavad kik tuntud guanosiinnukleotiidi siduvad valgud 4-6 antiparallelsest -kihist ja 1-3 nendega risti olevast heeliksist koosnevast domnist, mis on G-nukleotiidi sidumise motiiv. See motiiv moodustab valgu he domni. Valgu struktuurne domn on suhteliselt iseseisva struktuuri ja funktsiooniga ksus, mis moodustub pidevast jrjestusest. Valgu struktuursed domnid kannavad ka kindlaid funktsioone. Struktuurse domni ja struktuurse motiivi kattumine on pigem erand kui reegel. Motiiv on ldjuhul domni osa. Niteks vib tuua kahe-ahelalise nukleiinhappega seondumise motiivid: heeliks-ling-heelis (helix-loop-helix), heeliks preheeliks (helix-turn-helix), positiivselt laetud -heeliks, Zn-srm ja mitmed teised. Need on kik erinevad struktuursed motiivid, mis aga ei moodusta iseseisvaid domne. Biokeemilisi funktsioone viivad lbi enamasti mitmest polpeptiidist koosnevad valgu kompleksid. Enamus ensme koosnevad kas mitmest subhikust vi esinevad multiensmkompleksidena. Sellised funktsionaalsed kompleksid tekivad valkude omavahelise seondumise tulemusena ja seda struktuuritasandit nimetatakse ka valgu kvaternaarseks struktuuriks. Valkude omavaheline seondumine phineb aminohapete klgahelate interakstsioonidel, nii nagu valgu domnide omavaheline seonduminegi. Valkude ruumilist struktuuri on uuritud suure eduga juba ligi pool sajandit. Vga paljude (le 1000) valkude ruumiline struktuur on teada atomaarsel tasemel kasutades kristalliseeritud valkude uurimist rntgenkiirte hajumise ja lahustunud valkude analsi tuumamagnet resonantsi abil. Need andmed vimaldavad mista valkude struktuuri tagavaid jude ja struktuurse dnaamika ning struktuuri stabiilsust mravaid tegureid. Samas on aga valgu ruumilise struktuuri ennustamine primaarastruktuuri jrgi jnud suurel mral fenomenoloogilisele tasemele. Kige tulemuslikum meetod valkude ruumilise struktuuri ennustamiseks primaarstruktuuri alusel phineb primaarstruktuuri homoloogia otsingul mne juba tuntud ruumilise struktuuriga valguga. Kui primaarstruktuurid on piisavalt homoloogsed, siis vib suure tenosusega oletada, et ka ruumilised struktuurid on sarnased. Valkude ruumilise struktuuri ennustamine on vga oluline probleem nende omaduste mistmisel ja seega bioloogilistest protsessidest arusaamisel. Tnapeval on kllalt lihtne kindlaks teha DNA jrjestust. Terve inimese genoomi jrjestuse mramine on mne lhema aasta ksimus. Seega on peagi vhemalt teoreetiliselt vimalik ennustada kigi inimorganismis leiduvate valkude primaarstruktuuri. Kuigi ka see probleem vib mnel juhul osutuda vga komplitseerituks nagu edaspidi neme, saab enamuse valkude jrjestust ennustada. Valkude omaduste ja funktsioonide mistmiseks oleks aga vajalik ennustada valkude ruumilist struktuuri. Ruumilse struktuuri ennustamine on vimalik aga ainult neil valkudel, mille homoloogi jaoks on see juba teada. Veelgi keerulisem probleem on valgu funktsiooni ennustamine jrjestuse alusel. See on ksimus struktuuri ja funktsiooni vahekorrast. Valkude puhul oleme paraku struktuuri ja funktsiooni seoste mistmisel ksikute valkude kirjeldamise tasemel. Ksimusele, millised on valkude struktuuri ja funktsiooni vahelise sltuvuse ldised printsiibid ja kas neid ldse olemas on, ei ole praeguse teadmiste taseme juures veel vimalik tpselt vastata. On kll selge, et valgulistel ensmidel on eraldi struktuurne domn ensmaatilise reaktsiooni lbiviimiseks - aktiivtsenter. Teades ainult

valgu aminohappelist jrjestust on aktiivtsentri asukohta valgus ja selle poolt katalsitavat reaktsiooni seni vimalik ennustada vaid homoloogia phjal. I 1.a.Valgu struktuuri tekkimine snteesi kigus Valgud snteesitakse vastavalt mRNA programmile ribosoomides. Enamusel valkudest tekib funktsionaalne struktuur juba snteesi kigus ja see protsess toimub vga kiiresti (alla 1 min.). Siinjuures on oluline millises keskonnas toimub valgu sntees. Paljud valgud snteesitaks membraanseoseliste ribosoomide poolt nii, et valk satub peale snteesi kohe membraani ja sel juhul toimub valgu struktuuri teke (jrjestuse voltumine) membraanis. Membraanis on tegemist hdrofoobse keskonnaga, mis aitab tekitada spetsiifilisel valgu konformatsioonil. Teised valgud aga snteesitakse vabade ribosoomide poolt ja nad satuvad peale snteesi tstoplasmasse vee keskonda (hdrofiilne keskond), mis ei jta oma mju avaldamata valgu voltumisele ja sel juhul tekib teistsugune valgu ruumiline struktuur. Valkude struktuuri teke ei toimu siiski ainult keskonna toimel n.. iseenese tarkusest. Valgu struktuuri teket snteesi kigus ja selle jrgselt suunavad erilised valgud - molekulaarsed chaperonid e. lapsehoidjad. Need valgud vtavad snteesitava polpeptiid juba ribosoomis oma rppe ja aitavad valgu struktuuri tekkimisele kaasa vi takistavad lpliku ruumilise struktuuri teket enne kui valk on viidud oma lplikule kohale rakus. Chaperonid suunavad enamuse valkude voltumist snteesi kigus. Mnede (peamiselt viksemate, alla 150 aminohappe jgist koosnevate) valkude ruumiline struktuur tekib iseeneset snteesi kigus ja ei vaja lisafaktoreid. Sel juhul on kogu ruumilse struktuuri tekkeks vajalik informatsioon olemas valgu primaarstruktuuris. ks hstiuuritud nide on ribonukleaas A (RNaas A). Kui RNaas A molekul denatureerida st. lhkuda tema ruumiline struktuur kas kuumutamise vi keemiliste ainetega, siis jb valguahela primaarstruktuur muutumatuks ja lagunevad ainult nrgad sidemed, mis hoiavad valgu ruumilist struktuuri. Sobivates keskonnatingimustes tema aktiivne konformatsioon taastub. Seda protsessi nimetatakse valgu renatureeumiseks. Mnede valkude renatureerimiseks on vajalikud kofaktorid, valgu ligandid, mis stabiliseerivad tema ruumilst struktuuri. Sellised kofaktorid vivad olla niteks metalli ioonid, mis moodustavad valgu struktuuris koordinatiivseid sidemeid. Renatureerimine on aeglane protsess vrreldes valgusnteesi kigus toimuva struktuuri tekkega. Renatureerumist kiirendavad mitmed ensmid (valgu disulfiid isomeraas, peptidl-proll isomeraasid), mis kiirendavad disulfiidsidemete vahetust vi proliini konformatsiooni muutust. Need reaktsioonid on iseenesest vga aeglased ja vajavad seeprast kiirendamist (proliini isomerisatsioon joonisel 1.9). Valkude renatureerimist kiirendavad ka eelnimetatud molekulaarsed lapsehoidjad (chaperonid). Chaperonid on vga suur molekulide klass, millest osa toimivad valgusnteesi kigus, teised osalevad valgu transpordil ja hoiavad ra lpliku struktuuri tekke, kolmandad aga osalevad valkude renatureerimisel. Viimaste hulka kuulub Hsp 60 (heat shock protein nn. kuumaehmatuse valk) valkude perekond (bakterites GroE), mis koosneb 14st 60 kDa molekulmassiga subhikust. Hsp 60 moodustab toru, millesse siseneb denatureeritud valk, kus ta ATP hdrolsi abil lahti harutatakse ja seejrel tema aktiivne struktuur taastatakse. Kuna temperatuuri tusuga kaasneb paljude valkude ruumilise struktuuri muutus ja seega ak fsioloogilise aktiivsuse kadu, siis on kuumaehmatuse valgud vajalikud rakkude temperatuuritaluvuse tagamiseks. Seega on valkude ruumilise struktuuri tekkimiseks mitmeid erinevaid teid: kotranslatsiooniline (valgu snteesi kigus), lokalisatsioonist sltuv (peale transporti raku kompartementi), iseeneslik ja mbervoltumine (molekulaarsete lapsehoidjate poolt suunatav struktuuri muutus).

I 2. Nukleiinhapete struktuur Nukleiinhapete struktuur on bioloogiliselt vga oluline. Nende struktuur on nukleiinhapete funktsioneerimise aluseks. Kuna nukleiinhapped on priliku informatsiooni kandjad, siis on geneetilise teabe lekande ja silitamise mistmiseks vaja tunda nukleiinhapete ehitust. Priliku informatsiooni fsikaline olemus on peidus DNA kaksiheeliksis. Nukleiinhapped koosnevad nukleotiididest ja viimased omakorda kolmest komponendist: suhkur, lmmastikalus ja fosfaatjk. Kaks looduslikku nukleiinhappe liiki - desoksribo(DNA) ja ribonukleiinhape (RNA) erinevad omavahel suhkrujgi poolest. DNA sisaldab desoksriboosi ja RNA riboosi. Sarnaselt valkudega koosnevad nukleiinhapped selgroost, mis on hesuguse lli kordus, ja klgahelatest. Nukleiinhappe selgroo moodustavad suhkrujk ja fosfaatjk (joonis 1.5). Suhkrujgid on seotud fosfaatidega fosfodiestersidemete abil. Nukleiinhapete klgahelateks on lmmastikalused (joonised 4.4 ja 4.5). Nukleiinhappe monomeer on nukleotiid, mis koosneb hest suhkrujgist, lmmastikalusest ja fosfaatjgist (lmmastikaluseid ja fosfaatjke vib nukleotiidis olla mitu nagu niteks ATP vi NADP). Shkrujk koos lmmastikalusega moodustavad nukleosiidi. Kuna suhkur ja fosfaat on kigil nukleotiididel samad (suhkur vib olla kas riboos vi desoksriboos), siis nimetatakse nukleosiide ja nukleotiide lmmastikaluste jrgi (vt. tabel 4.1) Tabel 4.1 N-alus nukleosiid nukleotiid nukleotiidi RNA adeniin guaniin tstosiin tmiin uratsiil adenosiin guanosiin tstidiin tmidiin uridiin adenlhape guanlhape tstoslhape tmidlhape uridlhape UMP AMP GMP CMP lhend DNA dAMP dGMP dCMP dTMP

Lmmastikaluseid on kahte tpi: puriinid (joonis 4.5) ja primidiinid (4.4). Puriinid, mis koosnevad 9-aatomilisest heterotsklist on adeniin ja guaniin. Primidiinid koosnevad 6llilisest heterotsklist ja nende hulka kuuluvad tstosiin, tmiin ja uratsiil. Suhkrud riboos ja desoksriboos kuuluvad pentooside st. 5-ssinikuliste suhkrute hulka, kusjuures 1. ja 4. ssiniku aatomid moodustavad 4 hapniku aatomi varal tskli. Lmmastikalus on seotud alati suhkru 1. ssiniku aatomiga C-N glkosiidsideme abil (vt. joonised 4.6 ja 4.8). Kik aatomid nii suhkrujgis kui lmmastikalustes on nummerdatud vastavalt keemilisele nomenklatuurile. Selleks, et teha vahet suhkru ja N-aluse aatomite vahel, thistatakse suhkru aatomeid liskas numbrile ka -ga (C1, C2, C3, O3 jne). Fosfaatjgiga on seotud 3 ja 5 C-aatomid. Nukleosiid trifosfaatides on fosfaadid seotud C5-ga. Suhkru aatomite jrgi nimetatakse ka nukleiinhapete otsi 5 ja 3 otsteks. Nukleiinhapped snteesitakse 5 otsast alates 3 suunas. Seejuures lisatakse vabale 3OH rhmale nukleotiid nii, et suhkru OH hineb fosfaadi vesiniku aatomiga ja tekkiv vee molekul vabaneb ning 3C

ja jrgmise nukleotiidi fosfaadi vahele tekib fosfoester side. Seega on nukleiinhappe snteesil tegemist polkondensatsioonireaktsiooniga. Lmmastikalused on aromaatsed hendid st. kik heterotskli aatomid paiknevad hel tasapinnal. Lmmastikalused moodustavad vesiniksidemeid, mille abil nad teineteisega seonduvad. Seda nimetatakse aluste paardumiseks. I 2.a DNA struktuur J. Watson ja F. Crick esitasid 1953.a. DNA ruumilise struktuuri mudeli, mis hiljem leidis eksperimetaalse testuse. Selle mudeli kohaselt koosneb DNA kahest nukleiinhappe ahelast moodustades kaksikspiraali lbimduga 20 , milles suhkur-fosfaat selgroog on vljaspool ja lmmastikalused asuvad heeliksi sisemuses. Lmmastikalused paarduvad omavahel vesinisidemete abil. Paarid moodustuvad puriinide ja primidiinide vahel. Adeniin paardub tmiiniga kahe H-sideme ja guaniin tstosiiniga kolme H-sideme varal. See mudel selgitab ka miks on DNAs A sisaldus vrdne Tga ja G sisaldus Cga (joonis 4.11). Vastavaid nukleotiidipaare nimetatakse seeprast komplementaarseteks paarideks. Teisest kljest seletab Watsoni ja Cricki mudel ka selle, et DNA on regulaarne ja htlase jmedusega kaksikspiraal. Ainult komplemetaarsed paarid on isostruktuursed. Selline struktuur meenutab keerdtreppi, mille astmeteks on komplemetaarsed aluspaarid ja astmed on omavahel seotud mlemast otsast suhkur-fosfaat karakssi abil. DNA kaksikheeliks teeb he tisprde 34 kohta. Aluspaaride vahe on 3,4 . Seega on he tisprde kohta 10 aluspaari. DNA ahelad on kaksikheeliksis antiparalleelsed st. suhkru ja fosfaadi vahelised fosfoester sidemed on vastasahelates vastassuunalised (vt. joonis 4.11). Jrelikult on ka ahelate otsad erinevad - hes heeliksi otsas on esimese ahela desoksriboosi 5 ssinik (vi sellega seotud fosfaatjk) ja teise ahela 3 ssinik ja sellega seotud OH rhm. Heeliksi teises otsas on vastas-ahela desoksriboosi 5 ssinik ja esimese ahela 3 ssinik ja sellega seotud OH rhm. DNA kaksiheeliks moodustab parempoolse vindi. Iga kaksiheeliksi tisprde kohta toimub ks kord ahelate teineteisest leminek ehk seotumine. Seeprast on ahelate lahutamiseks vajalik et kaksiheeliks teeks mber oma telje sama arv prdeid kui temas on vinte. Kuna DNA ahelad on omavahel seotud nrkade, kuigi arvukate, vesiniksidemetega lmmastikaluste vahel, on DNA ahelad omavahel lahutatavad. Temperatuuri tstmisega on vimalik vesiniksidemed lhkuda ja DNA ahelad dissotseerida. See protsess on prduv. Tuleb aga silmas pidada, et DNA ahelate paardumisel tekivad paljud struktuurid, kus ahelad on osaliselt iseendaga paardunud, mis takistab kaksikahela teket. Samuti vivad tekkida struktuurid, kus eri ahelad on kll omavahel paardunud, aga juhusliku komplementaarsuse alusel. Korrektse kaksikahela tekkeks peavad kik valed struktuurid lahti sulama ja see protsess vtab aega kuni realiseerub korrektne kaksiahel, mis on kige stabiilsem struktuur. Selleks, et saada terves ulatuses paardunud DNA kaksikheeliks, on vaja ahelate paardumine pika aja jooksul temperatuuril, kus ahelad on osaliselt paardunud ja valed struktuurid ei psi. DNA ahelate lahutamist temperatuuri toimel nimetatakse ka DNA sulamiseks. DNA sulamise iseloomustamiseks kasutatakse sulamsitemperatuuri - Tm, mistet. Tm on temperatuur, mille juures nukleiinhappe ahelates on lahti sulanud. See ei pea thendama, et pooled ahelad on eraldi, vaid vib thendada ka, et kik ahelad on pooles ulatuses paardunud. Kuna G-C paaril moodustub 3 vesiniksidet A-T paari 2 vastu, siis on G-C paarid stabiilsemad ja jrelikult DNA piirkonnad, mis sisaldavad rohkem G ja C nukleotiide on stabiilsemad ja sulavad krgemal temperatuuril. DNA kaksikahel vib eksisteerida mitmes erinevas vormis olenevalt keskkonnatingimustest (A, B, C, D ja Z vormid). Rakkudes on DNA philiselt B-vormis, mida iseloomustavad

aluspaaride vike kalle heeliksi telje suhtes, aluspaaride asumine heeliksi keskel (teljel) ja suur ja vike vagu (klgvaates, vt. joonis 5.8). B-vormis DNA biheeliks on kige painduvam DNA kaheahelaline vorm, mis vib iseenesest moodustada rnga umbes 200 aluspaari pikkuse ligu kohta. See viimane omadus vimaldab DNA tihedat pakkimis kromosoomidesse ja nukleosoomide moodustumist. RNA struktuurset omapra ksitleme edaspidi koos valgusnteesiga. DNA krgemat jrku struktuurid ja seda mjutavad ensmid helikaasid, topoisomeraasid

II Valgu biosntees e. geneetiline translatsioon

Nagu eespool kirjas, seisneb geneetiline translatsioon nukleiinhapetes kodeeritud geneetilise inforamtsiooni (nukleotiidse jrjestuse) tlkimises valkude aminohappeliseks jrjestuseks. Valgu biosntees jaotatakse kaheks etapiks - preribosoomseks ja ribosoomseks. Esimese, vjaspool ribosoome toimuva protsessi kigus toimub aminohappe aktiveerimine ATPga ja aminohappe hendamine spetsiifilise tRNAga, snteesitakse aminoatsl-tRNA (aa-tRNA). Ribosoomides viiakse lbi valgu biosntees vastavalt mRNA programmile kusjuures substraadina kasutatakse aminoatsl-tRNAd. Selles protsessis on oluline osa adaptormolekulil - tRNAl. Just aa-tRNAs seotakse aminohape vastava nukleiinhappe jrjestusega - antikoodoniga. Igal tRNA molekulil on oma 3-st nukleotiidist koosnev antikoodon. Nukleiinhppe jrjestusest valgu jrjestueks leminek toimub geneetilise koodi alusel.

IIa Geneetiline kood

Geneetiline kood tehti kindlaks selle sajandi 60ate esimesel poolel philiselt M. Nirenbergi, Ph. Lederi ja K. Khorona tde tulemusena. Geneetiline kood on snastik, mille abil tlgitakse nukleiinhapete jrjestuses sisalduv gneetiline informatsioon valkude aminohappeliseks jrjestuseks. Kolme nukleotiidiline jrjestus (koodon) vastab hele aminohappele. Kuna valgusnteesil on informatsiooni kandjaks RNA (mRNA), siis moodustuvad koodonid neljast erinevast nukleotiidist (A, C, G ja U). Nelja nukleotiidi kolme kaupa kombineerides saame 43=64. Seega koosneb geneetilise koodi snastik 64st kolmethelisest snast, millele vastavad 20 erinevat aminohapet. See elu seisukohalt vga oluline snastik on enamuses organismides sama nn. universaalne geneetiline kood (UGK). Erandeid ksitleme allpool eraldi. Koodi universaalsust kasutatakse elu monofleetilise pritolu argumendina, kuigi rangelt vttes nitab see ainult UGK monofleetilist pritolu. Ksimus, kas saab rkida elust ilma geneetilise koodita, jb molekulaarbioloogia kursusest vjapoole. Nukleotiididest moodustunud snu on rohkem kui aminohappeid, seega on osa koodoneid snonmsed st. neil on sma thendus ja nad kodeerivad samu aminohappeid. Lisaks aminohappeid kodeerivatele koodonitele on UGKs ka kolm stop koodonit, millele ei vasta htegi aminohapet, aga mida kasutatakse valgusnteesi lpetamisel nagu punkti lause lpus. Stop koodoneid e. terminaatoreid tunnevad ra terminatsioonifaktorid, mis osalevad valgusnteesi lpetamisel (vt. valgusnteesi terminatsioon). Stop koodoneid on kutsutud ka nonsens koodoniteks, aga see ei ole tpne termin, kuna stop koodonitel on kindel thendus. Tegelikud nonsens koodnid on need, millele ei vasta kski aminohape, ega ka mingi muu thendus (vt. allpool).

Koodonite ja aminohapete vastavust kujutatakse tavaliselt tabelina (vt. Tabel 2 Universaalne geneetiline kood). Koodi tabelis vastab hele aminohappele 1-6 koodonit. Geneetilise koodi mitmethenduslikkus, hele aminohappele mitme koodoni vastavust, nimetatakse koodi kdumiseks. Informatsiooni kdumine geneetilise informatsiooni kigus nitab, et nukleiinhappe jrjestuse tlkimisel valgu jrjestuseks lheb osa informatsiooni kaduma valgu jrjestusest nukleiinhappe jrjestuseks ei ole hethenduslikku tagasiteed. Tabel 2 Universaalne geneetiline kood. Koodoni perekonnad on rasvases kirjas ja stop koodonid on punased. 1.\2. tht U UUU-Phe U UUC-Phe UUA-Leu UUG-Leu CUU-Leu C CUC CUA CUG AUU-Ile A AUC-Ile AUA-Ile AUG-Met GUU-Val G GUC GUA GUG C UCU -Ser UCC UCA UCG CCU-Pro CCC CCA CCG ACU-Thr ACC ACA ACG GCU-Ala GCC GCA GCG A UAU-Tyr UAC-Tyr UAA-Stop UAG-Stop CAU-His CAC-His CAA-Gln CAG-Gln AAU-His AAC-His AAA-Lys AAG-Lys GAU-Asp GAC-Asp GAA-Glu GAG-Glu G UGU-Cys UGC-Cys UGA-Stop UGG-Trp CGU-Arg CGC CGA CGG AGU-Ser AGC-Ser AGA-Arg AGG-Arg GGU-Gly GGC GGA GGG 3.tht U C A G U C A G U C A G U C A G

Geneetilise koodi organisatsioon ei ole juhuslik. Aminohapped on organiseeritud koodis nii, et hele aminohappele vastavad koodonid paiknevad tabelis lhestikku. Erandid on seriin (Ser) ja arginiin (Arg), millele vastavad 6 eri koodonit. Neist 4 koodonit asuvad koos, nende koodonite 1. ja 2. tht on identsed. lejnud 2 koodonit aga asuvad eraldi. Sellist koodonite rhma, mille thendus on mratud 1. ja 2. the abil st. olenemata koodoni 3. positsioonist ja mis vastavad kik hele aminohappele, nimetatakse koodoni perekonnaks.

Erinevatel koodoni positsioonidel on erinev osakaal aminohappe mramisel. Kige olulisem positsioon on koodoni teine tht st. keskmine positsioon. Thtsuselt jrgmine on koodoni esimene tht. Kige viksema thtsusega aminohappe mramisel on koodoni kolmas tht. UGKs on 8 koodoniperekonda, st. 8 aminohappe puhul ei ole koodoni kolmas tht oluline aminohappe mramisel. Ka lejnud aminohapete puhul on koodoni kolmas tht viksema thtsusega, 7 aminohappe puhul on koodoni thendus mratud kolmanda positsiooni puriini vi primidiiniga. Enamasti mrab koodoni thenduse kolmandas positsioonis olev puriin (A vi G) ehk siis primidiin (C vi U). 20st UGKs esindatud aminohappest on kolmas tht hethenduslik ainult kahe aminohappe puhul, metioniinil (Met) ja trptofaanil (Trp). Neile kahele vastab vaid ks koodon kummalegi. Seejuures on nii Met kui Trp koodonitel viimane tht puriin (G). Primidiin koodoni kolmandas positsioonis ei mjuta koodoni identsust, st. olenemata sellest kas kolmas tht on U vi C vastab koodon ikka samale aminohappele. Koodoni kolmanda the mitmetheduslikkus ehk koodi kdumine vimaldab sama aminohappelist jrjestust kodeerida erinevate nukleiinhppe jrjestuste abil. Kolmanda koodoni the asendusi, mis ei muuda valgu aminohappelist jrjestust, nimetatakse snonmseteks asendusteks. Viimased on suure thtsusega geenide evolutsioonilise vrdlemise juures, aga samuti genoomi ehitusest tulenevate seadusprasuste puhul. Erinevate koodonite kasutamine on erinevates organismirhmades erinev ja ka erinevatel geenidel erinev, aga seda vaatleme lhemalt eraldi. Geneetilise koodi struktuur vljendub ka tRNA ehituses ja koodon-antikoodon seondumise spetsiifikas. Koodon-antikoodon interaktsioon toimub ribosoomis, kus mRNA koodonile seatakse vastavusse tRNA antikoodon. RNA ehituse geomeetriast tulenevalt on RNA A vormis kaksikheeliksis G-nukleotiidil vimalik paarduda lisaks Cle ka Uga. Selline paardumine saab stabiilselt toimuda teatud konformatsioonilise vabaduse olemasolu korral. G-U paardumiseks vajalik struktuurne vabadus on olemas koodon-antikoodon paardumisel koodoni kolmandas positsioonis (vastab antikoodoni esimesele thele). Koodoni kolmanda positsiooni suuremat vabadust paardumisel nimetatakse wobble reegliks (wobble - ingl. k. vnkuma, vbisema). Vastavalt wobble reeglile vib koodoni kolmandas positsioonis toimuda G-C ja G-U paardumine vrdse eduga st. nii kooodoni kolmandas positsioonis kui antikoodoni esimeses positsioonis olev G vib paarduda C vi Uga. Seega suudab tRNA, mille antikoodoni 1. positsioonis on G dekodeerida (ribosoomide abil transleerida e. llitada koodonile vastav aminohape valguahelasse) koodoneid, mille kaks esimest thte on samad ja kolmandaks on primidiin (C vi U), teine tRNA, mille antikoodoni esimene tht on U suudab dekodeerida koodoneid, mille kolmandas positsioonis on puriin (G vi A). Siit jreldub, et iga tRNA suudab dekodeerida kahte koodonit juhul kui tema antikoodoni esimeses positsioonis on G vi U. Tepoolest, enamusel tRNAdest ongi esimeses positsioonis kas G vi U. Wobble reegel vimaldab organismidel tRNAsid kokku hoida 61 aminohappeid kodeeriva koodoni transleerimiseks kasutab enamus organisme alla 40 erineva tRNA molekuli. Paraku on siin ka erandid - metioniinil (Met), nagu juba eldud, on vaid ks koodon - AUG. Met-tRNA antikoodoni esimeses positsioonis on C nukleotiid, mis paardub ainult Gga ja seega ei ole Met-tRNA vimeline transleerima AUGle lhimat koodonit AUA, mis vastab isoleutsiinile. Teine erand on trptofaani (Trp) tRNA, millel samuti antikoodoni esimeses positsioonis C. Siiski toimub trptofaani llitamine tema koodonile (UGG) lhedase, stop-koodoni (UGA) kohal suurema sagedusega kui teiste stopkoodonite kohale aminohappe llitumine. Sellist nhtust kus koodonit transleeritakse valesti tuntakse valelugemisemise (miscoding, misreading ingl.k.) nime all. Koodon-antikoodon paardumist kirjeldavad koodilugemise reeglid, mis seavad vastavusse tRNA antikoodoneis sageli esinevad modifitseeritud nukleosiidid vastavate koodonitega. Niteks ei paardu tiouridiin millegagi peale adeniini, mitokondrites ja mkoplasmades aga suudab harilik U

antikoodoni esimeses positsioonis dekodeerida kiki nelja koodoniperekonna liiget st. olenemata koodoni kolmandast thest nn. neljane wobble. Koodilugemise reeglid on tpsemalt kirjeldatud peatki lpus antud viites (Osawa, et al., 1992). Sarnased aminohapped paiknevad kooditabelis lhestikku. See thendab, et juhuslikud vead koodi lugemisel (valgusnteesil) ei muuda snteesitava valgu omadusi eriti suures ulatuses kuna aminohape asendub lhedaste omadutega aminohappega. Teiste snadega, geneetiline kood on mra suhtes vhetundlik. Seda fakti, et universaalne geneetiline kood on vigade summutamise suhtes optimaalne, on kasutatud argumendina geneetilise koodi evolutsioneerumise testuseks. Teine seisukoht on, et kood on klmunud nnetus, mis thendab, et kui kood kord tekkis, siis ei saanud ta enam muutuda kuna iga muutus koodis tooks kaasa asenduse kigis kodeeritud valkudes, see aga oleks organismile vljakannatamatu. Alternatiivsete koodide puhul, mida ksitleme allpool, on siiski mitmed asendused UGKst aset leidnud, aga see on vimalik olnud ainult vga vikeste genoomide korral. Tenoliseks tuleb pidada UGK kllalt pikaajalist evolutsiooni. Eri ksimus on aga see, miks mingile kindlale koodonile vastab just see konkreetne aminohape. Niteks, miks koodonid UUU ja UUC kodeerivad fenlalaniini, aga koodoni perekond GGN kodeerivad gltsiini. Kas see viks ka olla vastupidi. Sellele huvitavale ksimusele on ptud vastata stereokeemiliste (aminohappe seondumine oma koodoni vi antikoodoniga) ja funktsionaalsete argumentidega (eri aminohapete peptiidsideme moodustamise reaktsioonivime ja vastava koodon-antikoodon seondumise stabiilsuse vahel on negatiivne korrelatsioon). Veenvat eksperimentaalnset testust pole kummagi argumendi kasuks seni avaldatud. Jrelikult on ksimus UGK tekkimisest ja thendusest lahtine. Nagu eespool juba mrgitud vastab mnele aminohappele 1 koodon, enamusele 2 vi 4, aga mnele koguni 6 koodonit (alternatiivsete koodide puhul kuni 8 koodonit). On selge positiivne seos aminohappe valkudes esinemise sageduse ja nendele kooditabelis vastavate koodonite arvu vahel, mida sagedamini esinev aminohape, seda rohkem vastab talle koodoneid (vt. joon. 9.2). Ka see fakt viitab koodi otstarbekohasusele ja seega evolutsioonilisele optimiseeritusele e. pikale evolutsioonilisele ajaloole. Valguahelat kodeerivad koodonid on jrjestikku. Seetttu on vimalik sama mRNA jrjestust tlkida valguks kolmes erinevas lugemisraamis. Niteks jrjestus: AUGGCUUCGCUCAA, thendab esimeses lugemisraamis (alustades lugemist esimesest koodonist, AUG) Met-Ala-Ser-Leu, teises raamis (nimetatakse ka +1 raamiks) on jrjestus: UGGCUUCGCUCA, mis vastab valgujrjestusele: Cys-Leu-Arg-Ser, kolmandas raamis (ka -1 raam) GGCUUCGCUCAA kodeerib sama RNA jrjestusega aminohappeid: Gly-Phe-Ala-Glu

Neme et need valgu jrjestused on tiesti erinevad, vaid Ala ja Leu esinevad korduvalt ja sedagi erinevais positsioonides. Jrelikult on sama nukleotiidset jrjestust vimalik tlikida valgu jrjestuseks kolmes eri thenduses. Alternatiivsed koodid Universaalsest geneetilisest koodist erinevaid koode esineb paljudes taksonites. Eriti sagedased on alternatiivsed koodid vikese genoomiga organismides. Kige viksemad genoomid on mitokondritel ja seega ei ole llatav, et just mitokondrites on erinevused universaalsest koodist ldiselt levinud. Mitokondrid jagunevad geneetilise koodi poolest kaheks - taimsed mitokondrid, mis kasutavad universaalset koodi ja mitte-taimsed mitokondrid, mille koodid erinevad UGKst. Genoomi suuruse ja koodi stabiilsuse vaheline seos tuleneb koodi klmunud olemusest. Kui geneetilises koodis he koodoni thendus muutub (niteks hakkab ks tRNA ra tundma uut koodonit) siis toob see kaasa mutatsiooni kikides geenides, kus vastav koodon esineb. heaegne muutus paljude valkude primaarstruktuuris on suure tenosusega organismile kahjulik. Seeprast on muutused geneetilises koodis letaalsed. Vga vikeste genoomide puhul vib ks kindel koodon esineda ainult hes vi kahes geenis ja ksikud aminohappe asendused valkudes ei pruugi omada vga suurt mju organismi eluvimele. Sellisel juhul saavad juhuslikud muutused geneetilises koodis evolutsiooniliselt fikseeruda, mille tulemusel tekib alternatiivne geneetiline kood. Siiski on ka vikeste genoomide puhul koodi muutumise kiirus vga aeglane, enamuse koodonite osas on kik erinevad koodid samad. Vaatleme nitena selgroogsete organismide mitokondrite kooditabelit koos vastavate antikoodonitega (A.K.): aminohape A.K. (koodon) Phe (UUU) Phe (UUC) GAA Leu (UUA) UAA Leu (UUG) Leu (CUU) Leu (CUC) Leu (CUA) UAG Leu (CUG) Ile (AUU) Ile (AUC) GAU Met (AUA) UAU aminohape A.K. (koodon) Ser (UCU) Ser (UCC) Ser (UCA) UGA Ser (UCG) Pro (CCU) Pro (CCC) Pro (CCA) UGG Pro (CCG) Thr (ACU) Thr (ACC) Thr (ACA) UGU aminohape A.K. (koodon) Tyr (UAU) Tyr (UAC) GUA Stop (UAA) Stop (UAG) His (CAU) His (CAC) GUG Gln (CAA) UUG Gln (CAG) Asn (AAU) Asn (AAC) GUU Lys (AAA) UUU Aminohape A.K. (koodon) Cys (UGU) Cys (UGC) GCA Trp (UGA) UCA Trp (UGG) Arg (CGU) Arg (CGC) Arg (CGA) UCG Arg (CGG) Ser (AGU) Ser (AGC) GCU Stop (AGA)

Met (AUG) Val (GUU) Val (GUC) Val (GUA) UAC Val (GUG)

Thr (ACG) Ala (GCU) Ala (GCC) Ala (GCA) UGC Ala (GCG)

Lys (AAG) Asp (GAU) Asp (GAC) GUC Glu (GAA) UUC Glu (GAG)

Stop (AGG) Gly (GGU) Gly (GGC) Gly (GGA) UCC Gly (GGG)

Koodonite perekonnad on rasvases kirjas, antikoodon on kirjutatud komplementaarse koodoni taha. Nagu tabelist nha on selgroogsete organismide mitokondriaalne geneetiline kood lihtsam kui universaalne kood. Kik koodonipaarid (3. positsioonis Pu vi Py) kodeerivad samu aminohappeid, erinevalt UGKst vastab AUA koodon metioniinile ja mitte isoleutsiinile, UGK stop koodon UGA vastab siin trptofaanile, lisaks on arginiinil vaid 4 koodonit ja UGK Arg koodonid AGPy vastavad siin stop koodonitele, mida on kokku 4 (UGKs on 3 stop koodonit). Selline koodi organisatsioon vimaldab vertebraatide mitokondritel valku snteesida viksema arvu tRNAdega kui UGKd kasutavates organismides. Vertebraatide mitokondrite kigi koodoniperekondade transleerimisel osaleb ainult ks tRNA, mis moodustab neljase wobble paari kigi nelja koodoniga. Vrib mrkimist, et kigil 4 koodonit kodeerivatel tRNAdel on antikoodoni 1. positsioonis U. Mitokondrite koodide evolutsiooniline suhe on kujutatud joonisel 9.6. Lisaks mitokondritele esineb ksikuid krvalekaldeid UGKst ka teistes oragnismides. Eriti sage asendus on stop koodoni UGA asendumine Trp koodoniga. Neil organismidel on ainult kaks stop koodonit. Mnedel prmseentel Candida perekonnast esineb universaalse koodi leutsiini koodoni, CUG transleerimine seriinina. Seejuures transleerib CUG koodonit seriinitRNA antikoodoniga CAG. Erakordne siinjuures on aga fakt, et see tRNASerCAG llitab peptiidahelasse nii seriini kui leutsiini, viimast kll vikese sagedusega. Seega on Candida prmidel leutsiini koodon CUG mitmethenduslik. Selline olukord vis tekkida evolutsiooni kigus seetttu, et koodonit CUG kasutatakse prmides harva ja selle muutus ei omanud mingil evolutsiooni perioodil letaalset mju. Huvitav fenomen on ka koodonite ning vastavate tRNAde puudumine. Mycoplasma capricolum genoom ei sisalda (niipalju kui teada) CGG koodonit ega ka vastavat tRNAArgCCG geeni. Kui sellese organismi viia CGG koodonit sisaldav geen, siis viimase translatsioon peatub CGG koodoni kohal. Sellist asendumist seletatakse genoomi AT survega (vt. koodonite kasutamisest) koodoni kasutusele, mille tuelemusena arginiini jaoks kasutatakse philiselt AGPu koodoneid. Prmi Torulopsis glabrata mitokondriaalsed geenid ei sislada htegi CGN koodonit, ega ka vastavat tRNA geeni ei ole leitud. Ka siin vib oletada genoomi AT survet, kuna prmi mitokondritel on see krge. Kurioosumina puudub bakteril Micrococcus luteus kuus koodonit (UUA-Leu, CUA-Leu, AUA-Ile, GUA-Val, CAA-Gln ja AGA-Arg). Seega on siin geneetilise koodi evolutsiooniks vaba ruumi. Koodonid, millel puudub thendus on telised nonsens koodonid. Koodonite kasutamisest. Kuna koodoneid on kolm korda rohkem kui kodeeritud aminohappeid, siis on igal organismil vabadus valida milliseid koodoneid kasutada rohkem ja milliseid vhem. Koodonite

ebavrdset kasutamist eri organismides ja he organismi eri geenides on palju analsitud. On kindlaks tehtud mned ldised reeglid koodonite kasutamise kohta. Kigepealt nn. genoomi efekt: igale genoomile on omane kindel aluspaaride sisaldus, G-C paaride osa kogu DNA aluspaaride hulgast vljendab GC% (G+C/A+C+G+T). See vrtus kigub 0,3 - 0,7. Krge GC sisaldusega organismidel on koodoni kolmandas positsioonis enamasti G vi C nukleotiid. Vastupidine on olukord madala GC sisaldusega genoomides, kus koodoni kolmandas positsioonis on sagedamini A vi T. Genoomi efekti juurde prdume tagasi genoomi peatkis. Teine oluline seaduspra seondub valgusnteesiga ja on energeetiline printsiip. Erinevatel valgugeenidel on erinev koodni kasutus vastavalt valkude ekspressioonitasemele (snteesi kogusele). Ainult suhteliselt vike osa geenidest (alla 10%) avaldub krgel tasemel, nende produkte snteesitakse rakus suures koguses. Need ohtralt avalduvad geenid kasutavad vikest arvu koodoneid. See seaduspra paistab eriti silma nende aminohapete puhul, millele vastab 4 vi 6 koodonit aga on tiesti mrgatav ka 2 koodoniste aminohapete puhul. Ohtralt avalduvatele geenidele vastavad mRNAd, kuigi neid on vhe liike, moodutavad suurema osa mRNA koguhulgast rakus. Seega on raku valgusnteesiaparaat ametis philiselt just krgelt ekspresseeruvate valkude snteesiga. Jrelikult kulub rakus rohkem tRNAsid, mis kodeerivad ohtralt avalduvates mRNAdes sageli esinevaid koodoneid. Sellise koodoni kasutamisega on suurem osa rakus olevatest mRNAdest vimalik transleerida vhese arvu tRNAdega, mida on rakus krgemas kontsentratsioonis. Selline tjaotus tRNAde vahel vimaldab rakkudel snteesida viksemat arvu tRNAsid ja seega energiat ssta. Seda seaduspra vib nimetada ka tRNAde standardiseerimiseks. Jrgmine seaduspra koodonite kasutamisel seondub samuti valgusnteesiga ja seisneb nn. konteksti efektis. Nimelt ei ole koodonite jrgnevus juhuslik, koodoni kolmas tht sltub jrgmisest koodonist. Kuna koodoni esimene ja teine tht mravad aminohappe, siis nende osas on valikuvabadus viksem. Koodonite konteksti efekt on nii tugev, et seda on vimalik edukalt kasutada kodeerivate jrjestuste leidmiseks. Kodeerivate jrjestuste leidmine on sajandilpu molekulaarbioloogias aktuaalne probleem suure hulga DNA jrjestuse andmete akumuleerumise tttu. Sageli ei ole nende jrjestuste kohta kuigi palju teada. Veelgi enam, eukarootsete geenide intron-ekson struktuuri tttu ei ole kuigi ekrge kodeerivaid jrjestusi ra tunda. Seetttu kasutataksegi koodnite kasutamise ja koodonite konteksti andmeid kodeerivate piirkondade indentifitseerimiseks. Koodoni konteksti phjused ei ole paraku veel selged. Eriti tugev on konteksti efekt stop koodonite puhul ja kontekst mjutab oluliselt valgusnteesi terminatsiooni efektiivsust. Tiendav kirjandus geneetilise koodi kohta: Osawa, S., Jukes, T. H., Watanabe, K., Muto, A., (1992) Recent evidence for evolution of the genetic code. Microbiological Reviews 56, (1), p. 229-264 Suzuki, T., Ueda, T., Watanabe, K., (1997) The polysemous codon - a codon with multiple amino acid assignment caused by dual specificity of tRNA identity. EMBO J. 16, (5), p. 1122-1134

IIb tRNA ja valgusnteesi preribosomaalne etapp

Transport-RNA struktuur Transport RNA (tRNA) avastati 50. aastate lpul. Varem oli F. Crick ennustatud adaptormolekuli, mis seaks aminohappe vastavusse nukleotiidse koodoniga. Sellest ajast alates on tRNA olnud ks enam-uuritud biomolekul. tRNA oli esimene RNA, mille primaarstruktuur kindlaks tehti ja samuti esimene RNA molekul, mille ruumilist struktuuri tundma piti. Tnaseks on teada paljude tuhandete tRNA molekulide primaarstruktuur vga pajudes eri liikidest. Kigi tuntud tRNA molekulide ruumiline struktuur on sarnane nii sekudaar- kui tetsiaarstruktuuri tasemel. tRNA molekulide pikkus varieerub tavaliselt 74-92 nukleotiidini, kuigi ksikud erandid on mnevrra lhemad vi pikemad. tRNA nukleotiidid on nummerdatud htse nomenklatuuri alusel, esimene nukleotiid on 5 otsas, antikoodoni moodustavad nukleotiidid 34, 35, 36 ja 3 otsa konserveerunud jrjestus CCA kannab numbreid 74-76 olenemata sellest mitu nukleotiidi konkreetses tRNA molekulis on. Niteks on lisalingus nukleotiidid 47, 47:1, 47:2,. Samas puudub nukleotiid 47 paljudel tRNA molekulidel. Sekundaarstruktuur on tRNA molekulidel samuti konserveerunud, mida iseloomustatakse ristikheina lehe kujuga (vt. joon. 7.3). tRNA sekundaarstruktuuri moodustavad 4 kaksiahelalist osa (lga) ja 4 ksikahelalist piirkonda (3 lingu e. aasa ja 4 paardumata nukleotiidi 3 otsas), mis paiknevad vastavate lgade otstes (vt. joonis 7.4). tRNA molekuli otsad asuvad lhestikku, nende paardumisel tekkiv kaksiahelaline osa e. lg kannab nime aktseptoorne lg (acceptor arm). Viimase pikendus on heahelaline osa 3 otsas, millele liidetakse estersidemega karbonlradikaali kaudu aminohape (joonis 7.3). Aktseptorlg on 7 aluspaari pikk. T-lg (ka T C lg) on saanud oma nime modifitseeritud lmmastikaluste prast, mis asuvad T-aasas. Jrjestus T C on tRNA T-aasas vga laialdaselt konserveerunud. Need alused on ribosltmidiin - T (tRNA snteesi kigus on sellel kohal harilik U nukleotiid, mis muudetakse tmidiiniks juba tRNA koosseisus nn. post-transkriptsiooniline modifikatsioon) ja pseudouridiin - (vt. joon. 9.4) (ka pseudouridiin tekib transkriptsioonijrgse modifitseerimise tulemusena). T-lg on 5 aluspaarine, aga T-aasa pikkus vib varieeruda 7-9 nukleotiidi ulatuses. Antikoodon lg on alati 5 aluspaari pikk ja nagu nimi tleb, sisaldab antikoodon ling kolme nukleotiidist antikoodonit, mis mrab tRNA koodoni spetsiifika. Antikoodon lingus on alati 7 nukleotiidi. Ka antikoodon ling sisaldab modifitseeritud nukleotiide, mida ksitleme lhemalt allpool. D-lg, mis koosneb tavaliselt 4 aluspaarist ja kannab D-lingu, on saanud nime dihdrouridiinjkide (jllegi RNA snteesijrgne modifikatsioon vt. joon. 9.4) alusel. Dlingu pikkus on varieeruv. Lisaks neile sisaldavad paljud tRNA molekulid lisalga ja/vi lisalingu, mille pikkus vib varieeruda laias vahemikus. tRNA ruumiline struktuur tekib heeliksite liitumise (coaxial stacking) teel, kusjuures tekib L the kujuline struktuur, mille hes otsas on antikoodon aas ja teise otsa (3 otsa) kinnitub

aminohape (vt. joonised 7.5 ja 7.6). Omavahel liitunud aktseptoorne ja T-lg moodustavad hise heeliksi. Teine heeliks tekib D-la ja antikoodon la liitumimse tulemusena. Ruumilises struktuuris satuvad D-aas ja T-aas lhestikku ja nad on omavahel lmmastikaluste vaheliste vesiniksidemete abil seotud (tertsiaarsed vesiniksidemed), mis stabiliseerib tRNA molekuli struktuuri. Erinevate tRNA molekulide ruumiline struktuur peab olema sarnane kuna nad kik peavad seonduma ribosoomil samasse piirkonda. Seeprast on aminohappe ja antikoodoni vaheline kaugus oluline parameeter, mis peab kigil tRNAdel olema sama (70 ). tRNA funktsiooni seisukohalt on thtsaim osa antikoodon (nukleotiidid 34-36). Antikoodoni kolm nukleotiidi paarduvad mRNA kolme nukleotiidiga (koodoniga), mis on geneetilise translatsiooni (nukleiinhappe jrjestuse valgu jrjestuseks tlkimise) struktuurseks aluseks. Seeprast on antikoodoni geomeetria oluline koodon-antikoodon interaktsiooni toimumisel. Antikoodon aasas on alati (v.a. raaminihke suppressorid, vt. allpool) 7 nukleotiidi, milles antikoodoni moodustavad 3 keskmist nukleotiidi. Antikoodoni ees paikneb konserveerunud U33 nukleotiid, mille jrel teeb nukleiinhappe ahel jrsu prde (vt. joonis 7.7). Antikoodoni kik kolm nukleotiidi paiknevad RNA ahela hel kljel sarnases konformatsioonis nagu esineb RNA kaheahelalises A vormis. Atikoodon on sobivas struktuuris koodoniga paardumiseks. Antikoodon aasa struktuur on oluline ka lugemisraami hoidmisel, kuna U33 on antikoodoni teljest jrsult ra pratud, siis ei saa see nukleotiid osaleda mRNAga paardumisel pideva heeliksina. Tuleb silmas pidada, et nukleotiid 34, esimene antikoodoni nukleotiid, paardub koodoni viimase, 3. nukleotiidiga ja seeprast on oluline, et koodonantikoodon interaktsioon lppeks just 34. nukleotiidiga ega jtkuks U33ga. Seeprast mrab U33 juures toimuv jrsk pre ra koodon-antikoodon seose pikkuse (3 aluspaari). Antikoodoni jrel paiknevad nn. hpermodifitseeritud nukleotiidid, mis tavaliselt ei ole vimelised aluspaardumises osalema. On teada, et modifitseeritud aluste olemasolu antikoodoni 3 kljel on vajalik translatsiooni tpsuse tagamiseks. Bakteri mutantides, kus mni tRNAd modifitseeriv ensm puudub tehakse valgusnteesil rohkem vigu. tRNA teine oluline piirkond, 3 ots, asub antikoodonist ~70 kaugusel. tRNA kolm viimast nukleotiidi on CCA jrjestus, mis seondub ribosoomis peptiidsideme moodustumist katalsiva tsentriga. Aminoatsl-tRNA sntees tRNA ruumiline struktuur on kigil erinevatel tRNA molekulidel sarnane. See sarnasus on vajalik tRNA funktsiooni titmiseks valgusnteesil. Ribosoomidega seonduvad kik tRNA molekulid samadesse piirkondadesse aga samuti peavad kik aa-tRNA molekulid seonduma elongatsioonifaktor Tga, mis transpordib neid ribosoomidess nagu neme edaspidi. Teisest kljest peavad kik tRNA molekulid olema erinevad, et tagada nende identiteeti st. igal tRNA liigil peavad olema mingid struktuursed determinandid, mille jrgi teda ra tuntakse ja mis mravad aminohappe spetsiifika. Philised ensmid, mis peavad tRNA molekuli identifitseerima on aminoatsl-tRNA sntetaasid e. ligaasid (thistatakse lhenditega ARL vi ARS aga samuti kolmetheline aminohappe lhend-RS, niteks Ala-RS, Phe-RS). Edaspidi kasutan lhiduse huvides nimetust sntetaasid. Viimased on geneetilise koodi realiseerimise seisukohalt sama thtsad kui tRNA. Just sntetaasid seavad vastavusse tRNA molekuli ja vastava aminohappe. Seejuures peab sntetaas heselt ra tundma nii tRNA kui aminohappe ja seejrel nad omavahel estersidemega liitma. Neid tRNA struktuuri elemente, mis mravad ra millise aminohappega tRNA aminoatsleeritakse, nimetatakse tRNA identsuse elementideks. tRNA identsuse elemendid

on tRNA nukleotiidid kindlates positsioonides. Siin tuleb arvestada, et ht aminohapet kodeerib 1-6 koodonit ja seega tavaliselt mitu erinevat tRNA molekuli (isoaktseptoorset tRNAd), mis erinevad teineteisest antikoodoni jrjestuse poolest. Sntetaase on aga iga aminohappe jaoks ksainus (igas rakus on 20 erinevat sntetaasi, nii nagu kodeeritud aminohappeidki). Seeprast peab ks sntetaas vrdselt hsti ra tundma ja he ning sama spetsiifilise aminohappega aminoatsleerima mitut erineva antikoodoniga tRNA molekuli. Sama aminohappe spetsiifilistel tRNA liikidel (isoaktseptoorsetel tRNAdel) on samased identsuse elemendid. Identsuse elemendid on antikoodonis ainult osaliselt ja sedagi vaid nende nukleotiidide osas, mis on kigil isoaktseptoorsetel tRNAdel samad. Siiski on antikoodoni nukleotiididel tRNA aminohappelise identsuse mramisel suur thtsus. Kik sntetaasid tunnevad ra 4. nukleotiidi 3 otsast st. nukleotiidi 73, mis on isoaktseptooretel tRNAdel identsed ja mida seetttu nimetatakse diskriminaator-aluseks. Suurem osa tRNA identsuse elemente paiknevad kas aktseptoorses las vi antikoodon lingus. Need kaks piirkonda on sntetaasidega tihedas kompleksis, kusjuures lejnud tRNA molekul moodustab sntetaasiga vaid ksikuid kontakte (vt. joonised 9.9-9.11). Sntetaasid jaotuvad jrjestuse homoloogia alusel kahte klassi. Klass 1 sntetaasidel on Nterminaalne kataltiline domn aminohappe ja nukleotiidi sidumiseks. Sama domn sisaldab ka kaheosalist osaliselt konserveerunud jrjestust mis on sarnane kigil klass 1 sntetaasidel. Seda konseveerunud jrjestust kutsutakse ka allkirjajrjestuseks (signature sequence). Nukleotiidi siduva domni tertsiaar-struktuur on sarnane pea kigil nukleotiidi siduvatel valkudel ja see koosneb tavaliselt 4-6 antiparalleelsest -ahelast ja 2-4 -heeliksist, mis on kihiga risti. lejnud osas on klass 1 sntetaaside nii primaar- kui tertsiaarstruktuur varieeruv. Ka klass 2 sntetaasidel on kataltilises domnis homoloogne osa, aga see on varieeruvam kui klass 1 ensmidel. Nukleotiidi siduvate domnide ruumiline struktuur on mlemal klassil sarnane, aga jrjestuse homoloogia nende vahel puudub. Ka tRNAga seondumine toimub kahel klassil erinevalt (vt. joon. 9.10 ja 9.11). Kahe sntetaaside klassi struktuurielementide jaotus ja vrdlus on toodud joonisel 9.8. Kuna kahe sntetaaside klassi vahel homoloogiat ei ole, on nad ilmselt tekkinud sltumatult aga kummalgi klassil vib oletada hist eellasmolekuli. Aminohappe liitmine tRNA molekulile toimub kaheastmelise reaktsioonina (vt. joon. 9.7). Kigepealt seonduvad sntetaasiga aminohape ja ATP molekul, mis ensmi pinnal moodustavad aminoatsl-adenlaadi (aminohappe karbokslrhma hapnik reageerib ATP -fosfaadiga, vt. joon 9.7). Aminoatsl-adenlaadis on aminohape aktiveeritud karbokslrhma kaudu. Teise etapina toimub estersideme sntees aminohappe karbokslrhma ja tRNA 3-terminaalse riboosi 2 vi 3 ssiniku vahel ja vabaneb AMP (joonised 9.7, 7.3). Seega jb aminohape seotuks tRNA 3 terminaalse riboosiga estersideme abil. Aminoatsleerimise reaktsiooni mlemad etapid on prduvad, sntetaas vib aminoatsl-tRNAst ja AMPst profosfaadi manulusel snteesida ATPd, kusjuures vabanevad aminohape ja tRNA. tRNA aminoatsleerimisreaktsiooni vrrand: 1. E + aa + ATP E.ATP.aa E.AMP-aa + PP 2. E.AMP-aa + tRNA E.AMP-aa.tRNA E.aa-tRNA + AMP E+ aa-tRNA, kus E on aminoatsl-tRNA sntetaas, aa on aminohape, AMP-aa on aminoatsl-adenlaat, . thistab mittekovalentset kompleksi ja - thistab kovalentset keemilist sidet.

Aminoatsl-tRNA snteesi tpsus on vga krge, vigade sagedus on 10-5 (ks vale aminohape 100 000 igesti snteesitud aa-tRNA kohta). Kuna paljud aminohapped on omavahel vga sarnased (niteks erinevad Ala ja Glu, ning Ile ja Val ainult he metlrhma poolest), siis on sellise tpsuse tagamine vga huvitav molekulaarse ratundmise ksimus. Teisest kljest peab sntetaas suutma valida paljude tRNA molekulide vahel, mis on omavahel sarnase ruumilise struktuuriga. tRNA valik sntetaasi poolt toimub kahes etapis. Esiteks seondub sntetaas stabiilselt vaid sobiva tRNA molekuliga ja teiseks toimub vaid igele tRNAle aminohappe liitmine kiiresti, st. vale tRNA vib kll seonduda sntetaasiga, aga teda ei aminoatsleetita (vt. joon 9.12). ige tRNA molekul indutseerib sntetaasil konformatsiooni muutuse, mis kiirendab aminoatsleerimise reaktsiooni, samas aga vale tRNA sntetaasi struktuuri muutust esile ei kutsu ja ta juab enne ensmi pinnalt lahkuda kui keemilise sideme sntees aset leiab.. Sellist valiku mehhanismi, mis phineb reaktsioonide kiiruste erinevusel nimetatakse ka kineetiliseks veerulugemiseks (kinetic proofreading). Aminohappe valik toimub neil sntetaasidel, mille substraadil on keemiliselt lhedasi valesid aminohappeid (niteks Ile, millel on lhedased Val ja Leu), samuti mitmeastmelisena. Kui vale aminohape hendatakse tRNAga, siis hdrolsib snteataas tekkinud estersideme, mille tulemusena valesti snteesitud produkt laguneb ja aminohape ning tRNA vabanevad. Seda reaktsiooni viib lbi sntetaasi eriline hdroltiline tsenter, mis on osa esmi aktiivtsentrist. Ka see hdroltiline mehhanism toimub reaktsioonikiiruste erinevuse tttu, ige produkti hdrols on aeglane ja vale produkti hdrols kiire. Sarnased mitmeastmelised valikumehhanismid on omased paljudele ensmidele, mis viivad lbi geneetilise informatsiooni lekannet ja nendega puutume kokku ka edaspidi.

IIc Valgusntees ribosoomides

Ribosoomid ja valgusnteesi reaktsioonid Ribosoomid viivad kikides organismides lbi programmeeritud valgusnteesi kasutades aminoatsl-tRNAd (aa-tRNA) substraadina. Sntees toimub vastavalt mRNA programmile (vt. geneetiline kood ja allpool). Ribosoomid koosnevad alati kahest ebavrdsest osast, suurest ja viksest subhikust. Ribosoomi on thistatud ka snaga pihukeha tema vikeste mtmete tttu. Nimetus ribosoom tuleneb RNA sisaldusest. Ribosoomi mlemad subhikud koosnevad RNAst ja valkudest. Ribosoomides osalevad substraadi sidumisel ja keemiliste reaktsioonide lbiviimisel nii valgud kui RNA. Viimase osa valgu biosnteesil ksitleme veel eraldi peatki lpus. Fakt, et ribosoomides on RNA heks kataltilise funktisooni kandjaks on olnud oluliseks aluseks nn. RNA maailma hpoteesilse. Selle hpoteesi kohaselt tekkis elu kigepealt RNA baasil, mis kandis algselt nii geneetilist informatsiooni kui oli ka keemiliste reaktsioonide lbiviijaks. Bioloogiliste makromolekulide ja nende komplekside suuruse iseloomustamiseks kasutatakse raskusvljas liikumise kiirust. Viimast kirjeldab Svedbergi hik (S). Mida suurem partikkel, seda suurem S vrtus. Raskusvljas liikumise kiirus (S) sltub nii partikli molekulmassist kui tema mtmetest (tihedusest) kusjuures see sltuvus on mittelineaarne. Ribosoomide komponente ja nende suurust esitab jrgmine tabel Ribosoomide komponendid E. colis ja inimeses (vastavate komponentide molekulamssid on sulgudes). Ribosomaalse RNA (rRNA) pikkus nukleotiidides on lisatud. Ribosoomi valkude (r-valkude) puhul on toodud molekulmasside vahemik, inimese ribosoomivalkude molekulmassid on teada ainult osaliselt.

Ribosoom Bakteriaalne ribosoom (2,5x10 D) Inimese ribosoom (4,2x106 D)

6

Subhikud vike 30S suur 50S vike 40S suur 60S

rRNA 16S - 1542 23S - 2904, 5S - 120 18S - 1874 28S - 4718, 5,8S - 160, 5S - 120

r-Valgud 21 (6-61 kD) S-valgud 33 (5-30 kD) L-valgud 33 S-valgud 49 L-valgud

Ribosomaalne RNA (rRNA) moodustab bakteriaalsetes ribosoomides 66% massist ja eukarootsetes ribosoomides 60% massist. Ribosoomid ise moodustavad bakterites 20-40% kuivmassist, eukarootides tunduvalt viksema osa. Ribosoomi struktuuri uurimise alal on viimaste aastate jooksul toimunud lbimurre, on suudetud kristalliseerida ribosoomide subhikud ja lahendada rngenkiirte hajumisel tekkiv difraktsioonipilt, mille tulemusel koos elektronmikroskoopia andmetega on esitatud ribosoomide ruumilise struktuuri mudel. Mudelid on seni veel keskmise lahutusvimega (55,5 , Thermus thermophiluse 50S ja Haloarcula marismortui 30S) aga annavad siiski pildi ribosoomi struktuurse organisatsiooni kohta. rRNA ja valgud on organiseeritud ribosoomi struktuurseteks domnideks, mis moodustavad mRNA, tRNAde ja valguliste translatsioonifaktorite sidumiskohad. rRNA moodustab suurema osa ribosoomist ja seega annab just rRNA struktuurne organisatsioon ribosoomi philise vormi. rRNA sekundaarstruktuuri domnid (vt. joon. 8.3) moodustavad ka ribosoomis eraldi struktuursed ksused. r-Valgud seonduvad rRNA kindlatesse kohtadesse stabiliseerides rRNA ruumilist struktuuri ja hendades erinevaid rRNA domne omavahel nii valk-valk kui valk-RNA interaktsioonide kaudu. E. coli ribosoomis on suurema osa valkude sidumiskohad rRNAl teada. Ribosoomi suuremas subhikus on kanal, mille kaudu ilmselt vljub kasvav peptiidahel. Ribosoomi subhikud on omavahel seotud kahest kohast ja subhikute vahele jb philine aktiivtsenter, mis moodustab tRNAde sidumiskohad. Ribosoomis on kolm tRNA sidumispiirkonda, mida nimetatakse tRNA sidumis-saitideks. Saidid on nimetatud vastavalt tRNA liigile, mis philiselt seondub vastava ribosoomi piirkonnaga kuigi nagu kohe neme, vivad A- ja P-saidid siduda mitut erinevat tRNA liiki. A-saiti seondub aminoatsl-tRNA (millest ka nimi). Samas kohas toimub ka aa-tRNAde valik mRNA koodoni alusel. A-saidis olev aa-tRNA reageerib ribosoomis peptidltRNAga, mille tulemusena moodustub peptiidside. Peale peptiidsideme snteesi asub A saidis vrskeltsnteesitud peptidl-tRNA. A-sait paikneb nii viksemal kui suuremal subhikul. P-saiti seondub peptidl-tRNA. Saidi nimetus tulebki peptidl-tRNA jrgi. Peale peptiidsideme moodustumist, kui kasvav peptiidahel kantakse ribosoomis peptidl-tRNAlt A-saidis asuvale aa-tRNAle jb ribosoomi P-saiti alles deatsleeritud tRNA (lihtsalt tRNA, mille 3 otsas on vaba hdrokslrhm). P-sait paikneb samuti mlemal ribosoomi subhikul.

E-sait on deatsleeritud tRNA spetsiifiline. Peale seda kui P-saidis tekkis deatsl- tRNA liiguvad tRNAd koos mRNAga ribosoomis he koodoni vrra edasi ja deatsl-tRNA satub E-saiti. E-sait on saanud oma nime selle jrgi, et selle koha kaudu vljub ribosoomist deatsl-tRNA et minna uuele ringile. E-sait ei ole vimeline siduma ei aa-tRNAd ega peptidl-tRNAd. E-sait asub philiselt ribosoomi suuremal subhikul. Nii A- kui P-saidis toimub tRNA antikoodoni paardumine mRNA koodoniga. Kui tRNA liigub E-saiti siis jb koodon-antikoodon seos ilmselt ajutiselt alles aga katkeb enne tRNA lahkumist ribosoomist. Seeprast tehakse mnede autorite poolt vahet kahe erineva E-saidi oleku vahel. Kui ribosoomi saite vaadata tRNA liigi jrgi, siis aa-tRNA seondub ainult Asaiti, peptidl-tRNA vib asuda nii A- kui P-saidis ja deatsl-tRNA vib asuda nii P- kui Esaidis. tRNA sidumis-saite vaatleme veelkord peale elongatsioonitskli ksitlemist seoses translatsiooni elongatsiooni hbriidsaitide mudeliga. Lisaks tRNA sidumiskohtadele on ribosoomis veel aktiivtsentrid. Ribosoomi dekodeeriv tsenter asub ribosoomi viksemal subhikul. Dekodeerivas tsentris toimub koodonantikoodon ratundmine. Selles protsessis osaleb ribosoom aktiivselt, ribosoomis toimuv koodon-antikoodon interaktsioon on stabiilsem ja tpsem kui vabas lahuses tRNA antikoodoni ja mRNA koodoni paardumine. Dekodeeriva tsentri moodustumisel osalevad nii 16S rRNA kui ribosoomi viksema subhiku valgud. Dekodeeriva tsenri lheduses paikneb ribosoomi viksemal subhikul mRNA sidumispiirkond, mis toimib valgusnteesi initsiatsioonil. See piirkond koosneb eranditult rRNAst ja moodustub 16S rRNA 3 otsas, mis paardub mRNA ribosoomi seondumispiirkonnaga (nn. anti-Shine-Dalgarno jrjestus). Ribosoomi suuremal subhikul asuvad peptiidsideme moodustumist katalsiv tsenter e. peptidltransferaasne tsenter on piirkond kuhu seonduvad aa-tRNA ja peptidl-tRNA 3 otsad koos vastavalt aminohappe- ja kasvava peptiidahelaga, ning viimane oluline koht, valgusnteesi faktoreid siduv tsenter. Neist esimene, aminohappeid omavahel hendav tsenter, koosneb philiselt 23S rRNAst, aga selle tsentri moodustumisel osalevad ka L valgud. Faktoreid sideuva tsenteri thtsaim komponent on aga valguline, mille moodustavad valgud (L7/L12)2 kompleksis L10ga kuigi selle tsentri thtsad osad on ka kaks piirkonda 23S rRNAs. Ribosomaalse valgusnteesi etapid Valgusntees ribosoomidel jagatakse kolmeks etapiks: initsitsioon, elongatsioon ja terminatsioon. Initsiatsioonil toimub ribosoomi subhikute assotseerumine, valku kodeeriva ala alguse leidmine mRNAl, ige lugemisraami fikseerimine ja esimese peptiidsideme sntees. Elongatsiooni kigus toimub valguahela pikenemine kuni stop-koodonini. Terminatsioonil toimub stop-koodoni ratundmine terminatsioonifaktori poolt, snteesitud valgu, mRNA ja tRNA vabanemine ning ribosoomi subhikute eraldumine. Sellega on taastunud ribosoomide algne olek, st. subhikud on eraldi ja ribosoomid on lbinud valgusnteesi ribosoomi tskli (joon. 8.9). Valgusnteesi initsiatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele ka valgulised initsiatsioonifaktorid, initsiaator-tRNA ja GTP. Initsiatsioon toimub prokarootidel ja eukarootidel vrdlemisi suurte erinevustega, seeprast ksitleme siin ainult prokarootset initsiatsiooni ja eukarootide valgusnteesi omapra ksitleme eraldi peatkis. Bakteritel on kaks konserveerunud valgusnteesi initsiatsioonifaktorit, mnedel bakteritel on kolm erinevat initsiatsioonifaktorit. Neist IF-2 on suur valk (molekulmass 110 kD), IF-3 ja

IF-1 on vikesed valgud (9 ja 25 kD vastavalt). IF-2 ja IF-3 esinevad kigil bakteritel. IF-2 seob GTP juuresolekul initsiaator-tRNAd, mis bakterites on fMet-tRNAfMet. Sellise kolmikkompleksina seondub IF-2 ribosoomi viksema subhikuga ja moodustab viimasega stabiilse kompleksi. IF-2 on GTPd siduv valk ja tal on teistele GTPga seonduvatele valkudele omane valgudomn nn. GTP domn. IF-2 omab GTPd hdrolsivat tsentrit, mis aktiveerub intsiatsiooni kigus ja on sltuv ribosoomide suuremast subhikust. IF-3 on ribosoomide dissotsiatsioonifaktor, ta takistab ribosoomide subhikutel assotseerumast, vimaldades niiviisi vabade 30S subhikute olemasolu, mis on vajalikud mRNA ja IF-2.GTP.fMettRNAfMet kompleksi sidumiseks. Initsiaator-tRNA, mis prokarootides on fMet-tRNAfMet, erineb veidi tavalistest tRNAdest. Esimene nukleotiid ei ole initsiaator-tRNAs paardunud. Teistel tRNAdel on esimene nukleotiid paardunud 72. nukleotiidiga. Ka antikoodon la struktuur on veidi erinev (vt. joon. 8.13). Need erinevused on vajalikud, transformlaasile ratundmiseks mis lisab Met-tRNAfMetle formlgrupi ja fMet-tRNAfMet seondumiseks otse ribosoomi P saiti, ilma eelnevalt A saiti lbimata. Bakteriaalne mRNA on reeglina poltsistroonne, st. ks mRNA kodeerib mitut valku (joon 7.15). Valku kodeerivat jrjestust nii mRNAl kui DNAl nimetatakse ka avatud lugemisraamiks, lhend ORF (open reading frame). Avatud lugemisraam on nukleiinhappe jrjestus, mis sisaldab jrjestikuseid aminohappeid kodeerivaid koodoneid ja mis algab initsiaator-koodoniga ning lpeb stop-koodoniga. mRNAd sisaldavad lisaks kodeerivale jrjestusele (ORFle) ka speisserjrjestusi. Enne (5 poolselt) ORFi asub liiderjrjestus ja peale viimast ORFi on treilerjrjestus. Erinevate lugemisraamide vahel asuvad intertsistroonsed speisserid. Initsiatsiooniprotsessi kigus otsib ribosoom les ORFi alguskoha st. initsiaator-koodoni, mis on enamasti AUG. Bakteriaalsetel mRNAdel eelneb initsiaatorkoodonile ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosome binding site). RBS on 4-7 nukleotiidine jrjestus, mis on komplementaarne ribosoomi viksema subhiku RNA (16S rRNA) 3 otsaga. RBS paikenb AUG koodonist 5-7 nukleotiidi eespool (5 suunas). RBS jrjestust kutsutakse ka Shine-Dalgarno jrjestuseks (lhend SD) avastajate jrgi. Prokarootides esinevad ka ilma RBSta mRNAd, mis on aga madala ekspressiooniga, kuna nad ei osale efektiivselt valgusnteesi initsiatsioonil. Bakteriaalne mRNA on vimeline seonduma ribosoomi viksema subhikuga ilma lisafaktorite abita moodustades kaksikahelalise kompleksi mRNA RBS jrjestuse (e. SD jrjestuse) ja 16S rRNA 3 otsa vahel. Kuigi ribosoomi viksem subhik on komplekseerunud IF-3ga, ei oma see faktor olulist mju mRNA seondumisele. mRNA.30S kompleks seondub IF-2.GTP.fMet-tRNAfMet kompleksiga, mille kigus tekib esimene koodon-antikoodon paardumine. Viimane mrabki ra lugemisraami alguse. Initsiaator-tRNA (fMet-tRNAfMet) seondub 30S ribosoomi P saiti (joon. 8.12). Umbes 10% bakteriaalsetest mRNAdest on initsiaator-koodoniks GUG ja vga harva mni teine lhedane koodon. Hoolimata sellest milline koodon on initsiaator-koodoniks seondub sellega ikka sama fMet-tRNAfMet (Initsiatsioon on skemaatiliselt joonisel 8.14). Jrgmine etapp valgusnteesi initsiatsioonil peale 30S.mRNA.IF-2.GTP.fMet-tRNAfMet.IF-3 kompleksi teket on ribosoomi suurema subhiku (50S) seondumine. Viimasega hinemise tulemusena tekib 70S ribosoom ning hdrolsitakse IF-2ga seotud GTP. Peale GTP hdrolsi vabanevad IF-2, IF-3 ja GDP. Jrgmine aa-tRNA seondub ribosoomidega juba kompleksis EF-Tu ja GTPga. Peale esimese peptiidsideme snteesi on valgusnteesi intsiatsioon lppenud ehk sujuvalt elongatsiooniks le linud.

Valgusnteesi elongatsiooni kigus toimub ribosoomis peptiidahela pikendamine vasavalt mRNA programmile kuni ribosoomi dekodeerivasse tsentrisse juab ks kolmest stopkoodonist. Elongatsioon on tskliline protsess, mis toimub bakterites kiirusega kuni 20 amionohapet sekundis. Iga tskli kigus lisatakse kasvavasse peptiidi ks aminohape. Elongatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele, mRNAle ja aa-tRNAle veel elongatsioonifaktorid: EF-Tu, EF-Ts ja EF-G ning kofaktorina GTP. EF-Tu ja EF-Ts moodustavad kompleksi, mis kannab EF-T nime. Lhendite thendused: EF - elongatsiooni faktor; EF-T - T tuleneb snast transfer, vikesed thed u ja s thistavad termilist stabiilsust; u - unstable (ebastabiilne), s - stable (stabiilne). Seega EF-Tu ja EF-Ts on transpordi funktsiooniga elongatsioonifaktorid, millest esimene on ebastabiilse ja teine stabiilse struktuuriga. EF-G nimetus tuleneb tema vimest hdrolsida ribosoomide juuresolekul GTPd. Nagu juba faktorite nimedest nha osalevad EF-Tu ja EF-Ts aa-tRNA transpordil ribosoomi A saiti. Nende osa selles transpordis on aga tiesti erinev. EF-Tu moodustab kompleksi aa-tRNA ja GTPga. Seda kompleksi kutsutakse ka kolmikkompleksiks (ternary complex ingl. k.). EF-Tu.GTP.aa-tRNA kolmik-kompleks seondub ribosoomi A saiti. Juhul, kui aa-tRNA antikoodon on komplementaarne ribosoomi dekodeerivas tsentris eksponeeritud koodoniga, toimub EF-Tul GTP hdrols ja EFTu.GDP ning fosfaatjk lahkuvad ribosoomist. Kui aga tRNA antikoodon ei ole komplementaarne siis kolmikkompleks ribosoomiga ei seondu. EF-Tu seondub GDPga vga stabiilselt, umbes 100x tugevamini kui GTPga. GDP stabiilsem sidumine vrreldes GTP sidumisega on omane paljudele G-nukleotiidi siduvatele valkudele (nn. G-valkudele). Lisaks sidumise stabiilsusele on GDP dissotsiatsioon EF-Tult vga aeglane. Nukleotiidi vahetust EF-Tul katalsib EF-Ts. Saransed nukleotiidi vahetust katalsivad faktorid on paljudel Gvalkudel. Rakkudes on GTP kontsentratsioon harilikult 1000x krgem kui GDP kontsentratsioon, seeparast tekib peale EF-Tsi poolt katalsitud nukleotiidi vahetust EFTu.GTP kompleks, mis on vimeline seonduma jrgmise aa-tRNAga (EF-Tu.GDP kompleks ei seo aa-tRNAd). Teine hasti tuntud G-valk valgusnteesi aparaadis on EF-G, mis katalsib ribosoomidel mRNA.tRNA kompleksi translokatsiooni (vt. allpool). Elongatsioonitskli esimene reaktsioon on EF-Tu sltuv aa-tRNA sidumine ribosoomi A saiti. Siin toimub ka aa-tRNAde valik vastavalt mRNA programmile. aa-tRNA valik ribosoomi Asaidis toimub stohhastiliselt, st. EF-Tu.GTP.aa-tRNA kompleksid seonduvad ribosoomi A saidiga juhuslikult ja ainult nende kompleksidega, millel tekib koodon-antikoodon ratundmine (tRNA antikoodon on komplementaarne mRNA koodoniga) tekib stabiilne seondumine, mis omakorda indutseerib GTP hdrolsi EF-Tul. EF-Tu seondub aa-tRNA aktseptoorse la ja 3otsaga nii, et aminohape on kolmik-kompleksis kaitstud st. ei ole ribosoomile kttesaadav. Seni kuni ribosoomis on EF-Tu ei saa aa-tRNA osaleda peptiidsideme moodustumisel kuna aa-tRNA 3 ots ja aminohape on seotud EF-Tuga. See asjaolu hoiab ra peptiidsideme moodustumise vale aminohappega. Alles peale EF-Tu sltuvat GTP hdrolsi ja EF-Tu.GDP kompleksi lahkumist ribosoomidelt saab toimuda peptiidsideme sntees. EF-Tu lahkub ribosoomist GDP vormis ja enne jrgmise aa-tRNA sidumist peab toimuma nukleotiidi vahetus - GDP asendub GTPga. Seda vahetusrteaktsiooni viib lbi EF-Ts. EF-Tu sltuvad reaktsioonid on kujutatud joonisel 8.20. Jrgmine reaktsioon elongatsioonitsklis on peptiidsideme sntees. Peptiidside moodustub aminoatsl-tRNA -aminogrupi nukleofiilse ataki tulemusena peptidl-tRNA peptidlestersidemesse (vt. joon 8.21). Teiste snadega, aminohape, mis on tRNA 3 otsas, reageerib oma aminorhma kaudu peptid-tRNA karbokslrhmaga ehk veelkord teisiti eldult, peptiidjk kantakse peptidl-tRNAlt le aminoatsl-tRNAle. Kuna peptiidsideme snteesi kigus kantakse peptiidjk le siis nimetatakse seda reaktsiooni ka peptidl-

transferaasseks reaktsiooniks. Keemilises mttes on peptiidsideme sntees kige thtsam ribosoomi poolt katalsitav reaktsioon, kuna kik teised reaktsioonid on mittekovalentsete komplekside moodustamised, mis seejrel jlle lagunevad. Selle reaktsiooni produktid on he aminohappe vrra pikem peptidl-tRNA ja vaba tRNA (deatsl-tRNA). Peptiidsideme snteesi katals on ribosoomi suurema subhiku integraalne funktsioon, mis ei vaja ribosoomivliseid lisafaktoreid. Ribosoomide peptiidsideme moodustumist katalsiv tsenter nn. peptidltransferaasne tsenter, koosneb nii rRNAst (23S rRNA) kui ribosoomi suurema subhiku valkudest. Peptidltransferaasses tsentris on kaks tRNA 3 otsa sidumiskohta, ks aa-tRNA ja teine peptidl-tRNA CCA jrjestuse jaoks. Peptdl-tRNA 3 otsa CCA jrjestus on vhemalt osaliselt paardunud 23S rRNAga. On kindlaks tehtud Watson-Crick tpi aluspaar tRNA nukleotiidi C73 ja 23S rRNA nukleotiidi G2252 vahel. Peale peptiidsideme moodutumist vi ka selle reaktsiooni kigus paiknevad tRNAde 3 otsad ribosoomis mber. Vrskelt snteesitud peptidl-tRNA 3 ots asetub endise peptidl-tRNA kohale ja viimane omakorda (mis on ndseks oma peptiidjgi kaotanud ja on muutunud deatsl-tRNAks) liigub deatsl-tRNA spetsiifilisse E saiti. Peptidl-tRNA paiknemise kohta ribosoomis nitab selle vime reageerida puromtsiiniga. Puromtsiin on antibiootikum, Tyr-tRNA 3 otsa analoog (joon. 8.22), seega aminoatsl-tRNA 3 otsa analoog, mis vib peptiidsideme snteesil viimast asendada. Kasvav peptiidahel vidakse puromtsiinile le kanda ja sel juhul muidugi katkeb mRNA suunatud peptiidahela pikenemine kuna puromtsiin koos peptiidahelaga lahkuvad ribosoomilt. Puromtsiiniga reageerib ainult P saidis asuv peptdl-tRNA. Vahetult peale uue peptiidsideme moodustamist, kui peptidl-tRNA on A saidis, ei ole ta vimeline puromtsiiniga reageerima. A ja P saidid ongi ajalooliselt mratud peptidl-tRNA vime jrgi osaleda reaktsioonis puromtsiiniga. Jrgmine reaktsioon ribosoomi elongatsioonitsklis on translokatsioon, mille kigus mRNA kompleks, mis koosneb mRNAst koos kahe tRNAga nihkub ribosoomis he koodoni vrra edasi. Peale translokatsiooni asetub pepitl-tRNA tervenisti ribosoomi P saiti ja deatsltRNA asetub ribosoomi E saiti. Seda mberpaiknemise reaktsiooni katalsib elongatsioonifaktor G (EF-G) koos GTPga. Peale translokatsiooni vi ka selle kigus toimub EF-Gl GTP hdrols ja EF-G koos GDPga lahkub ribosoomist (joonised 8.23 ja 8.24). EFG seostub G nukleotiididega nrgalt ja ei vaja nukleotiidi vahetuseks lisafaktorit nagu seda vajab EF-Tu. Ribosoomi translokatsioon on huvitav ja kompleksne protsess, milles on veel palju ebaselget ja mille kohta on mitmeid vasturkivaid mudeleid muuhulgas on ebaselge GTP osa translokatsioonis. ks huvitav fakt ribosoomi elongatsioonifaktoritega seotud reaktsioonides on EF-Tu ja EF-G seondumine ribosoomi sama piirkonnaga (faktorite sidumistsentriga). EF-G ruumiline struktuur on saranane EF-Tu.GTP.aa-tRNA kompleksi struktuuriga kusjuures ks EF-G struktuurne domn sarnaneb tRNA antikoodon ling-lg omaga st. valguline EF-G osa meenutab RNA struktuuri. Sellist struktuurset sarnasust eri molekulide vahel nimetatakse molekulaarseks mimikriks. Translokatsiooni kigus asendab EF-G.GTP ribosoomi A saidis EF-Tu.GTP.aa-tRNA kompleksi, mis on tenoliselt heks translokatsiooni molekulaarseks aluseks. Ka teised GTPd hdrolsivad translatsioonifaktorid (IF-2, RF-3) sisaldavad elongatsioonifaktoritega sarnast domni, mis tenolisekt seondub ribosoomis sama piirkonnaga kui EF-Tu ja EF-G. Ribosoomi faktorite sidumistsenter koosneb nii valkudest (suurema subhiku valgud L7/12) kui kahest eri piirkonnast 23S rRNAs. Ribosoomi elongatsioonitskli mudelid

Peptiidahela terminatsioonil osalevad terminatsioonifaktorid RF-1, RF-2, RF-3 ja RRF. Nimed tulenevad snadest release (vabanema ingl. k.) ja factor, RRF tuleneb ribosome release factorist. Terminatsioonifaktorid RF-1 ja RF-2 tunnevad kumbki ra kaks terminaator-koodonit. RF-1 seondub spetsiifiliselt UAA ja UAG stop-koodoniga (kooditabelis asuvad need koodonid krvuti vertikaalselt). RF-2 tunneb ra stop-koodoneid UAA ja UGA (kooditabelis horisontaalsed naabrid). Seega tunnevad mlemad terminatsioonifaktorid ra stop-koodoni UAA ja lejnud stop-koodonite jaoks on kummalegi oma faktor. Seeprast pole llatav, et UAA on kige tugevam ja kige sagedamini esinev stop-koodon bakterites. RF-1 ja RF-2 kituvad ribosoomis nagu tRNA molekulid seondudes ribosoomil samasse piirkonda (A saiti) interakteerudes nii 30S kui 50S subhikutega. Seega on ka siin tegemist molekulaarse mimikri nhtusega. Terminatsioonifaktorid RF-1 ja RF-2 vajavad seondumiseks ribosoomi A saidis eksopneeritud vastavat stop-koodonit ja P saidis polpeptidl-tRNAd. Kui ribosoomis on lhike peptidl-tRNA, siis ei ole terminatsioonifaktorite seondumine ribosoomidega stabiilne ja jrelikult on terminatsiooni toimumine vhese efektiivsusega. RF-3 seondub ribosoomiga siis kui ribosoomis on juba RF-1 vi RF-2. RF-3 stimuleerib RF-1 ja RF-2 suunatud reaktsiooni, peptidl-tRNA hdrolsi, mille tulemusena vabaneb ribosoomist polpeptiidahel. mRNA vabanemiseks on vajalik RRF. Stop koodonid ei ole ribosoomis vrdsed valgusnteesi lpetamise suunamisel. Kuigi stopkoodonitele ei vasta otseselt kski tRNA, tuleb siiski arvestada, et terminatsioonifaktorite kontsentratsioon rakus on suhteliselt madal ja et stop-koodonile lhedast koodonit transleerivad tRNAd vivad osaleda stop-koodoni transleerimisel (vt. ka suppressor tRNA). UGA koodonile on lhedane UGG koodon, mis vastab trptofaanile. Trptofaani llitatakse vikese sagedusega UGA stop-koodoni kohale. Selline vigane translatsioon viib normaalsest pikemate valkude snteesile. Stop-koodonite transleerimist nimetatakse ka lelugemiseks (readthrough ingl. k.). lelugemine on rakkude eluks vajalik protsess. Mnede valkude pikemad vormid omavad kindlat regulatoorset thtsust. UAA on kige tugevam stop-koodon ja selle koodoni kohale aminohapet ei llitata. Seeprast on stopkoodoni valik valgu snteesil oluline parameeter. Selenotssteiini (Sec) kodeerib UGA stop-koodon. Selenotssteiin esineb vaid vhestes valkudes (E. colis kahes valgus ja needki on vajalikud ainult anaeroobsetes tingimustes). Selenotssteiini llitumist valkudesse mravad kolme geeni produktid. Neist esimene kodeerib tRNAd, mis aminoatsleeritakse seriiniga. Teine geen kodeerib Sec sntetaasi, ensmi mis muudab tRNAga seotud seriini selenotssteiiniks. Kolmas geen aga on spetsiifiline EF-Tu, mis seondub ainult Sec-tRNASerga. Sec snteesi mravad geenid indutseeritakse ainult anaeroobsetes tingimustes, tavalistes, aeroobsetes tingimustes kasvavates bakterites need geenid ei avaldu. Sec llitumiseks valgu kindlasse kohta ei piisa siiski neist kolme geeni produktidest. mRNAs on Seci kodeeriva UGA jrel eriline juuksenel struktuur, mis tekitab ribosoomi peatumise. UGA koodoni kohal toimub konkureerimine Sec-tRNA ja RF-2 vahel. Tenoliselt toimub Sec llitumine ainult osadel valkudel ja teistel toimub sel kohal terminatsioon. Eriline, Sec-spetsiifiline EF-Tu ei lase selenotssteiini llitada stop-koodonina funktsioneerivate UGA koodonite kohale. Suppressor tRNA ja translatsiooni tpsus. Valgu geenides toimuvad mutatsioonid vivad tekitada lugemisraamis stop koodoneid, mis viivad valgu lhenemisele ja valgu funktsiooni kadumisele. Sellistest kahjulikest mutatsioonidest saavad organismid le suppressor tRNAde abil. Suppressor tRNAd vivad transleerida nii stop koodoneid (neid kutsutakse nonsens suppressoriteks) kui aminohappeid

kodeerivaid koodoneid teise aminohappena (misens suppressorid) ja muuta valgusnteesi lugemisraami (raaminihke suppressorid). Suppressor tRNAd on vimelised ra tundma stop koodoneid ja suunama stop koodonist sltuvalt peptiidahelasse aminohappe llitumist. Eriti sagedased on suppressor tRNAd miko-organismides. Mutatsioonid tRNA antikoodonis vivad viia stop koodonile komplementaarse antikoodoni tekkele ja nii saabki alguse suppressor tRNA. Mned nited suppressor tRNAdest on jrgnevas tabelis: Suppressor tRNAd. Koodonid on 5 3 suunas, antikoodonid on vastupidises suunas, st. 3 5. Muteerunud nukleotiidid antikoodonis on nidatud rasvases kirjas. tRNA geeni aminohape algne suppressor lookus koodon/anitk. antik. / koodon supD (su1) Ser UCG CGA CUA UAG supE (su2) Gln CAG CUG CUA UAG supF (su3) Tyr UAC GUA CUA UAG UAU supC (su4) Tyr UAC GUA UUA UAA UAU UAG supG (su5) Lys AAA UUU UUA UAA AAG UAG supU (su7) Trp UGG CCA UCA UGA UGG Tabelist on nha, et kik suppressor tRNAd on tekkinud he punktmutatsiooni tagajrjel. supC ja supG transleerivad heaegselt kahte stop koodonit UAA ja UAG. supU suudab transleerida nii stop koodonit (UGA) kui normaalset trptofaani koodonit (UGG). Suppressor tRNA geenid tekivad piisavalt krge sagedusega et tagada bakterite kasv ka nonsens mutatsiooni korral eluthtsas geenis. Neid on vimalik selekteerida kasutades bakterite nonsense mutatsiooniga geeni, mis on mikroobide kasvuks vajalik. Sellist selektsiooniskeemi kutsutakse vahel viga parandab vea printsiibiks. Suppressor tRNAde puhul tekib ksimus kuidas on bakteritel, mis sisaldavad stop koodonit transleerivat tRNAd, vimalik veel valgusnteesi terminatsioon, mis nuab stop koodoni ratundmist terminatsioonifaktori poolt. Vastuse sellele ksimusele annab valgusnteesi kineetiline mudel. Ensmaatiliste protsesside tpsuse mramisega kineetiliste parameetrite erinevuse alusel puutusime juba kokku aminoatslt-RNA snteesi juures. Valgusntees on dnaamiline protsess, mille kiiruse mravad substraatide kontsentratsioon ja ensm substraat komplekside moodustumise kiirus ja taskaal. Eriti oluline on dnaamiline aspekt aatRNAde valiku juures. Ribosomaalse valgusnteesi vigade sageduseks on mdetud 10-4 st.

ks viga 10 000 igesti transleeritud koodoni kohta. Valgusnteesi tpsuse mrab philiselt ribosoomi A saidis toimuv aa-tRNA selektsioon vastavalt eksponeeritud mRNA koodonile. See valik toimub kaheastmelisena: esmane valik toimub kolmikkomplekside (EF-Tu.GTP.aatRNA) seondumise tasemel, ja teine valikuetapp toimub peale EF-Tu suunatud GTP hdrolsi aga enne peptiidsideme moodustumist. Nagu juba eespool kirjeldatud toimub komikkomplekside valik stohhastiliselt st. iga aa-tRNA prkub juhuslikult ribosoomi A saidiga. Kolmikkompleksid, mille aa-tRNA antikoodon paardub vhemalt kahe koodoni jrjestikuse nukleotiidiga, indutseerivad ribosoomiga seondumisel EF-Tul GTP hdrolsi. Peale GTP hdrolsi dissotseeruvad ribosoomilt EF-Tu.GDP kompleks. Selles etapis vib toimuda ka aa-tRNA dissotsiatsioon juhul kui koodon-antikoodon kompleks ei ole kgi kolme nukleotiidipaari ulatuses paardunud. aa-tRNA dissotsiatsioon ribosoomilt peale EF-Tu suunatud GTP hdrolsi ongi tRNA selektsiooni teine etapp nn. kineetiline veerulugemine. Piltlikult vljendudes mdetakse teises selektsiooni etapis koodonantikoodn seondumise stabiilsust aja skaalal kui antikoodon seondub koodoniga stabiilselt siis psib kompleks piisavalt kaua ja ribosoom katalsib peptiidsideme moodustumist, mis muudab reaktsiooni prdumatuks. Kui aga koodon-antikoodon seondumine ei ole piisavalt stabiilne siis ei jua peptiidside moodustuda ja aa-tRNA lahkub ribosoomist. On leitud ribosoomi mutante (mutatsioonid ribosoomi valgus S12 vi rRNAs) mille puhul selektsioon on nii tugev, et ka ige aa-tRNA peab lbima rohkem kui he valikutskli enne kui aminohape llitub kasvavasse peptiidahelasse. Need mutatsioonid viivad nn. litpsele valgusnteesile ja neis bakteritvedes toimub nonsens suppressioon vga vikese efektiivsusega. Ribosoomidel toimuvat kaheastmelist aa-tRNA valikut iseloomustab jrgmine skeem:
12

EF-Tu.GTP.aa-tRNA + RSA EF-Tu.GTP.aa-tRNA.RSA

3

aa-tRNA.RSA + EF-Tu.GDP+ Pi pep-tRNA.RSE

4

aa-tRNA + RSA , kus RSA on vaba A saidiga ribosoom, RSE on ribosoom peale peptiidsideme moodustumist, Pi on anorgaaniline fosfaat, mis tekib GTP hdrolsil. Numbritega on thistatud reaktsioonid: 1. on aa-tRNA valiku esmane etapp. See reaktsioon on prduv, stabiilne kompleks ribosoomi ja kolmikkompleksi vahel tekib ainult siis kui vhemalt kaks jrjestikust antikoodoni nukleotiidi paarduvad mRNA koodoniga. 2. reaktsioon on GTP hdrols EF-Tul, mida indutseerib koodon antikoodon paardumine. 3. reaktsioon on peptiidsideme sntees, mille tulemusel tekib ha aminohappe vrra pikem peptidl-tRNA. See reaktsioon viib peptiidahela pikenemisele. 4. reaktsioon on mitteproduktiivne dissotsiatsioon peale GTP hdrplsi. Seda protsessi nimetatakse ka proofreadinguks e. veeruparanduseks. 2., 3. ja 4. rekatsioon on prdumatud. Suppressor tRNAd on tavalistega vrreldes vhemvimekad, nad ei llita mitte iga valikutskli kigus aminohapet peptiidi. Suppressor tRNAde poolt moodustuvad kolmikkompleksid seonduvad ribosoomidega vhempsivalt ja neil on suurem tenosus

dissotseeruda peale EF-Tu suunatud GTP hdrolsi. Seeprast suunavad suppressor tRNAd stop koodoni tranlseerimist ainult vikese efektiivsusega, enamikel juhtudel toimub stop koodoni kohal siiski terminatsioon. Suppressor tRNA ja terminatsioonifaktorite vahelises konkureerimises on terminatsioonifaktoritel peaaegu alati lekaal. Suppressor tRNA juuresolekul toimub vastav stop koodoni transleerimine sense koodonina alla 50%, mis on siiski piisav muteerunud valgugeeni translatsiooniks ja samas viib suppressor tRNA ka normaalsete valkude pikenemisele, aga seda siiski alla 50% juhtudest. Nii saab rakk vajaliku valgu ja ka peptiidahela terminatsioon saab toimuda piisava sagedusega. Siin tuleb arvestada, et enamikul valgugeenidel on stop koodonid vikese vahega korratud, kui ei toimu terminatsioon esimesel stop koodonil, siis jrgmisel toimub see juba suure tenosusega, eriti kui on tegemist erinevate stop koodonitega. Lisaks on normaalsed stop-koodonid sobivas jrjestuse kontekstis, mis suurendab terminatsiooni tenosust ja vhendab suppressiooni efektiivust. Raaminihke ja misense suppressorid on veelgi viksema vimekusega kui nonsense suppressorid. See on ka mistetav, arvestades milliseid tagajrgi nad vivad kaasa tuua llitades aminohappeid metsiktbi valkudesse. Valgusnteesi tpsusega on seotud ka valgusnteesi protsesiivsus, mis nitab kui suur osa alustatud valkudest lpuni snteesitakse. Valgusnteesi protsesiivsus on hmmastavalt krge arvestades kui palju erinevaid phjusi vivad viia protsesiivsuse vhenemisele. Prokarootides sltub valgusnteesi protsesiivsus ka RNA snteesi protsesiivsusest, mis on tingitud translatsiooni ja transkriptsiooni seotusest (polaarne effekt vt. transkriptsiooni regulatsioon). Philine phjus, mis vhendab valgusnteesi protsesiivsust on pep-tRNA lahkumine (dissotsiatsioon) transleerivatelt ribosoomidelt. Raku elutegevuseks on vga oluline, et alustatud valgud ka lpuni snteesitakse, poolikud valgud vivad phjustada mitmete protsesside hirimist rakus. Kui valgusntees lpeb enneaegselt mRNA katkemise tttu, siis on selliste poolikute valkude lagundamiseks eraldi ssteem. Mittetielikele valkudele lisatakse C-otsa eriline aminohapete jrjestus, mis on valgu lagundamise (degratatsiooni) signaaliks ja sellist jrjestust (jrjestuse mrge, sequence tag) kandev peptiid lhutakse proteaaside poolt aminohapeteks. Kui ribosoomi A saiti satub katkenud mRNA st. ei ole normaalset kolmenukleotiidist koodonit, siis seondub ribosoomiga eriline RNA, 10Sa RNA. Viimane molekul tidab heaegselt nii tRNA kui mRNA funktsioone ja seda nimetatakse seeprast tmRNAks. tmRNA sarananeb osaga tRNAst, nimelt selle aktseptoorse ja T-laga, mis moodustavad nii tmRNAs kui harilikes tRNAdes liitunud heeliksi (vt. tRNA struktuur). tmRNA sisaldab aminohappe alaniiniga liitumiseks vajalikke nukleotiide (RNA determinante) ja on seega substraadiks alanl-tRNA sntetaasile. Lisaks tRNAga sarnanevale osale sisaldab tmRNA ka mRNA jrjestust ja leminekujrjestusi. Kui tmRNA on aminoatsleeritud alaniiniga siis moodustab ta kompleksi EF-Tu ja GTPga ning selline kolmikkompleks, mis sarnaneb aa-tRNA poolt moodustatava kompleksiga, seondub ribosoomi A saiti juhul kui seal ei ole korrektset tripletset koodonit. Peale Ala-tmRNA seondumist ribosoomiga toimub EF-Tul GTP hdrols ja EF-Tu.GDP vabaneb ning kasvav peptiidahel kantakse le alaniniinele. Peale EF-G ja GTP suunatud translokatsiooni satub peptidl-tmRNA ribosoomi P saiti ja katkenud mRNA ning detatsl-tRNA lahkuvad ribosoomist. Nd satub ribosoomi dekodeerivasse tsentrisse tmRNA osa, mis asendab mRNAd ja kodeerib spetsiifilist jrjestust suunates valgu lagundamise teele. Seega tidab tmRNA kigepealt tRNA, seejrel nii tRNA kui mRNA ja lpuks ainult mRNA funktsiooni. tmRNA lugemisraam (kodeeriv jrjestus) lpeb stopkoodoniga, mis suunab valguahela lpetamisele. Peale tmRNA poolt mrgitud valgu vabanemist ribosoomidelt see lagundatakse. Nii ei saa osaliselt snteesitud valgud eksitada raku normaalset elutegevust.

Eukarootse translatsiooni eripra Eukarootsetes (pristuumsetes) rakkudes toimub valgusntees philiselt sama skeemi kohaselt nagu prokarootideski. Nagu eespool kirjeldatud on eukarootide ribosoomid suuremad ja sisaldavad suhteliselt rohkem valku. tRNA molekulid on eukarootides sama suured kui bakteris. Nagu prokarootides on ka eukarootides initsiatoorne tRNA eriline metionl-tRNA, mida aga ei formleerita. Thistus: Met-tRNAiMet. mRNA ehitus eukarootides on vrreldes prokarootsete mRNA-dega oluliselt erinev: 1. Eukarootne mRNA on reeglina (>90%) monotsistroonne ja kodeerib seega ainult hte valku. Prokarootne mRNA on reeglina poltsistroonne st. kodeerib mitut erinevat valgu molekuli (hes mRNA molekulis on mitu ORFi ehk avatud lugemisraami). 2. Transkriptsiooni kigus lisatakse eukarootse mRNA 5 otsa m7G cap struktuur (m7GpppNpNpN). m7G cap on mRNA-ga hendatud 5-5 sidemega, seega on eukarootsel mRNAl kaks 3 otsa, algne 5 ots on aga cap struktuuriga peidetud. Prokaroodis sellist struktuuri ei esine. 3. Eukarootse mRNA 3 otsas on kuni 200 nukleotiidi pikkune pol(A) jrjestus, mis lisatakse mRNA 3-mittetransleeritavas osas paiknevale pol(A) signaaljrjestusele (AAUAAA). 4. Eukarootse mRNA initsiaator-AUG on raamistatud spetsiifilise kontekst-jrjestusega A/GNNAUGG, mida nimetatakse avastaja jrgi Kozaki konsensuseks ja mis soodustab oluliselt translatsiooni initsatsiooni. Bakteris tidab sarnast rolli Shine-Dalgarno jrjestus. Eukarootides snteesitakse mRNA tuumas, translatsioon toimub aga tstoplasmas, seega on transkriptsioon ja translatsioon ruumiliselt lahutatud. Eukarootne mRNA lbib reeglina enne tstoplasmasse judmist protsessingu, mille kigus primaarsest transkriptist eraldatakse intronid ja lisatakse 5 otsa cap struktuur ning 3 otsa lisatakse poly(A) jrjestus. Peale protsessingut transporditakse kps mRNA lbi tuumapooride tstoplasmasse. Nii cap kui pol(A) on lisaks mRNA stabiilsusele ja transpordile vajalikud ka mRNA seondumiseks eukarootsete intisiatsioonifaktoritega ja soodustavad vga tugevalt translatsiooni initsatsiooni. Initsiaatorkoodon, AUG asub sageli 5 otsa lheduses (40-100 nt. capist). Paljudel eukarootsetel mRNAdel on initsiaator-koodon siiski cap-st vga kaugel, see vahe vib olla kuni tuhandeid nukleotiide. Initsiaator-AUG on raamistatud spetsiifilise kontekstjrjestusega A/GNNAUGG, mida nimetatakse avastaja jrgi Kozaki konsensuseks. Translatsiooni initsatsiooni efektiivsus on maksimaalne kui AUG-st 3 positsioonis on A vi G ja +4 positsioonis on G (vt eelpool allajoonitud thti). Ainult ~ 35% eukarootsetel mRNAdel on 3 ja +4 positsioonid mlemad optimaalsed. Seega vib arvata, et 65% mRNA-dest on oma jrjestusest tulenevalt initsatsiooni tasemel allareguleeritud. Eukarootse mRNA kodeeriv osa erineb prokarootsest selle poolest, et sisaldab tpiliselt vaid ht tsistronit e. ORFi. Erineva struktuuri tttu ei ole mRNA eukarootide ja prokarootide vahel vahetatav, st. prokarootne mRNA ei tta eukarootses valgusnteesis ja vastupidi, eukarootne mRNA ei ole substraadiks prokarootsetele ribosoomidele. Kui translatsiooni elongatsioonitskkel ja terminatsioon on pro- ja eukarootides phimtteliselt sarnane, siis translatsiooni initsatsioon on kllalt erinev. Arvatavasti peegeldab eukarootse translatsiooni initsatsiooni keerukus eukarootse organismi suuremat

vajadust geeniekspressiooni kontrollitavuse le ka translatsiooni tasemel. Kui nii prokaroodis kui eukaroodis on 2 valgulist elongatsioonifaktorit, siis eukaroodil on bakteri 3 initsatsioonifaktori vastu vlja panna vhemalt 12 erinevat valku vi mitmest valgust koosnevat kompleksi. Erinevaid translatsiooni kontrolli mehhanisme on eukarootides nii palju, et neid ldkursuses puudutada ei jua. Erinevate mRNA-de translatsiooni kontrollitakse initsiatsioonifaktorite (eIF-de), mRNA struktuuride, mRNA-ga seonduvate valkude, mRNA pol-adenleerimise, mRNA rakulise lokalisatsiooni jm kaudu. Prokarootides toimub enamasti sisemine initsiatsioon st. mRNA sisaldab mitut tsistronit ja valgusntees toimub kigil initsaatorkoodoni ja Shine-Dalgarno jrjestusega varustatud lugemisraamidel. Eukarootidel on valdav (>95% mRNA-dest) initsiatsioon mRNA 5 otsale kige lhemal asuvalt initsiaator-koodonilt. AUG koodonite vi tugevate (> -50 kJ/Mol) RNA sekundaarstruktuuride tekitamine 5cap-i ja valku kodeeriva lugemisraami vahele inhibeerib sellelt translatsiooni vi kaotab selle sootuks. Siit tuleneb klassikaline skaneeriv translatsiooni intsatsiooni mudel, mille kohaselt ribosoom seostub mRNA-le 5cap-st sltuvalt ning koos initsiaator-tRNA'ga skaneerib mRNA-d 5 3 suunas kuni esimese iges kontekstis initsaatorkoodonini kus toimub valgusnteesi initsatsioon. Initsiatsioonikompleksi moodustumine toimub jrgmiste etappide kaudu: 1. eIF1A ja eIF3 seonduvad ribosoomi 40S alahikuga, tekib 43S kompleks. eIF3 takistab 60S alahiku seondumist 40S-ga. 2. 43S kompleks seob Met-tRNAiMet-eIF2-GTP kompleksi. 3. eIF4E, eIF4G ja eIF4A (neid kolme valku koos kutsutakse eIF4F-ks) seonduvad mRNA 5otsaga. eIF4E on mRNA cap-i siduv valk, eIF4A on RNA helikaas, mis harutab lahti RNA sekundaarstruktuuri. eIF4G on selles cap-i siduvas kompleksis adaptorvalk. eIF4G seob teisi initsiatsioonifaktoreid (eIF3, eIF4E, eIF4A ja Pab1p valku), moodustades koos 43S ribosoomi kompleksiga uue, 48S kompleksi. Pab1p on valk, mis seondub mRNA 3 pol(A) struktuuriga. Seega tuuakse translatsiooni initsioonil mRNA mlemad otsad lhestikku. 3. 48S kompleks skaneerib 5 3 suunas kuni esimese sobivas kontekstis initsaatorkoodonini. Skaneerimiseks on snergistlikult vajalikud eIF1 ja eIF1A valgud. 4. Nd seondub 60S alahik kompleksis eIF5-ga. eIF5 katalsib GTP hdrolsi eIF2-l. 5. Ribosoomi alahikute antiassotsatsioonifaktorid (eIF-3, eIF5) ja eIF2-GDP vabanevad, valgusnteesi elongatsioon vib nd alata. Eukarootsed translatsioonifaktorid Initsiatsioonifaktorid: eIF1 (15 kDa) koos eIF1A-ga (16 kDa) on vajalik 43S-i skaneerimiseks mRNA-l.

eIF2 (koosneb 3 valgust: - 35 kDa, - 38 kDa ja -52 kDa). alahiku fosforleerimine inhibeerib translatsiooni initsatsiooni peatades eIF2-GTP kompleksi tekke. See fosforleerimine kutsutakse esile niteks viirusinfektsiooni korral, et pidurdada viiruse elutsklit rakus. ja alahik osalevad Met-tRNAi ja GTP sidumisel. Seega on eIF2 bakteri IF2 analoog. eIF2B (5 alahikut). Katalsib G nukleotiidi vahetust eIF2-l. eIF3 (8-10 alahikut, 650 kDa). Seob ribosoomi 40S alahikut, ei lase sel seonduda 60S-ga. Seob ka eIF4G-d. eIF4A (25 kDa). RNA helikaas, nrgendab mRNA sekundaarstruktuuri ATP hdrolsist sltuvalt. eIF4B (80 kDa). Stimuleerib eIF4A helikaasset aktiivsust, seostub mRNA-ga. eIF4E (24 kDa). Seob mRNA 5cap struktuuri. eIF4E on translatsiooni initsatsioonil limiteeriv faktor. le selle valgu toimub translatsiooni aktiveerimine vastusena insuliinile vi kasvufaktoritele, viirusinfektsioonil aga vib le eIF4E toimuda ka cap-sltuva valgusnteesi inhibitsioon. eIF4G (220 kDa). Molekulaarne adaptor, seob eIF4E, eIF4A, eIF3, Pab1p. eIF5 (125 kDa). Ribosoomist sltuv GTPaas, soodustab ribosoomi alahikute hinemist. eIF6 (25 kDa) Seob 60S alahikut, philine antiassotsiatsioonifaktor. Elongatsioonifaktorid eEF1 (3 alahikut: 51 kDa, 48 kDa ja 35 kDa). Seob GTP-sltuvalt aa-tRNA-d, omab ka GDP-GTP vahetusaktiivsust. Seega EF-Tu ja EF-Ts analoog. eEF2 (95 kDa). Bakteri EF-G analoog, translokatsiooni faktor. eEF3 (125 kDa). Ainult prmis, katalsib tRNA dissotsatsiooni ribosoomi E-saidist. On ribosoomist sltuv GTPaas ja ATPaas. Eukarootides on leitud ks universaalne terminatsioonifaktor: eRF (54 kDa dimeer). Phjustab terminatsioonikoodonist sltuvat valgusnteesi terminatsiooni. Kuna eukarootide valgusnteesi terminatsiooni on seni suhteliselt uuritud, siis on tenoline, et on veel avastamata terminatsioonifaktoreid (niteks prokarootse RRF'i analoog). On leitud eukarootseid mRNA-sid kus 5cap-i ja valku kodeeriva lugemisraami vahel on tuhandeid nukleotiide. Need mRNA-d sisaldavad oma 5-mittekodeerivas osas tugevaid RNA sekundaarstruktuure ja sageli ka kmneid AUG koodoneid. Selliste mRNA-de translatsiooni initsatsioon ei saa toimuda skaneerimise teel. On teada, et nende mRNA-de sekundaarstruktuurid juhivad kuidagi 40S alahiku ige initsaatorkoodoni lhedale. Sisemist translatsiooni initsiatsiooni suunav struktuuri mRNA's kannab nime IRES (internal ribosome

entry site). Sellist cap-st sltumatut translatsiooni kasutavad mitmed rakulised mRNA-d (TBP, FGF2, IGF2, antennapedia, ultrabithorax, eIF4G, BiP jt) ja paljud viiruste mRNA-d. Sisemist initsatsiooni kasutavad rakulised mRNA-d kodeerivad enamasti proto-onkogeene vi arengugeene, mille ekspressiooni on oluline tpselt reguleerida. Paljud viirused kasutavad cap-st sltumatut translatsiooni initsatsiooni, et selektiivselt inhibeerida peremeesraku cap-st sltuvat translatsiooni ja suunata peremehe valgusnteesi aparaat eelistatult viiruse valke tootma. Osad viirused (hepatiit C) suudavad oma sisemist initsatsiooni kasutaval mRNA-l initsaatorkoodonit ra tunda kasutades vaid ribosoomi 40S alahikut, Met-tRNAiMet, eIF2 ja GTP-d. See komplekt faktoreid vastab aga tpselt prokarootseks initsatsiooniks vajaliku faktorite komplektiga. Seega tundub, et eukarootse translatsiooni suurem keerukus on ehitatud konserveerunud prokarootset pritolu initsatsioonimehhanismile. Seega ei ole eukaroot oma translatsiooni mehhanismi mitte uuesti les ehitanud vaid lihtsalt prokarootset translatsiooni tiendanud, et tagada protsessi paremat kontrollitavust. Valkude kotranslatsiooniline transport eukarootides. Valgusnteesi inhibeerivad antibiootikumid ja ribosomaalse RNA funktsioonid. Antibiootikumid on madalmolekulaarsed ained, mis pidurdavad mikroobide elutegevust ja paljud neist on sedamda kasutusel ravimitena. Varem tuntud antibiootikumid olid prit mikro- vi ka hulkraksetest organismidest (looduslikud antibootikumid). On huvitav, et ka inimese organism toodab mitmeid antimikroobseid aineid, nn. defensiine, mis on oma keemiliselt loomuselt lhikesed peptiidid ja nad on geneetiliselt kodeeritud st. igale defensiinile vastab oma geen. Tnapeval on kasutusel suur hulk snteetilisi antibiootikume, mis on kas looduslike ravimite derivaadid vi tiesti uued keemilised hendid. Enamasti on antibiootikumid madalmolekulaarsed ained. Antibiootikumidel on vga palju paralleelnimesid, iga ravimifirma kasutab sama toimeaine thistamiseks eri nime. Mikrobioloogias on siiski kasutusel iga aine jaoks ks nimi. Suur osa antimikroobsetest ainetest, mida kasutatakse inimese ja loomade ravimisel, toimivad valgusnteesi aparaadile. Siinkohal ksitleme mningaid neist, mis toimivad kas otse ribosoomile vi on seotud elongatsioonifaktorfite poolt suunatud protsesside inhibeerimisega. Antibiootikumidel on spetsiifilise seondumise piirkond mne ribosoomi aktiivtsentri lheduses ja nad inhibeerivad reeglina philiselt ht ribosoomi osareaktsiooni. Lisaks valgusnteesi inhibitsioonile ja seelbi ravimi omadustele on antibiootikumid olnud vga kasulikud ka valgusnteesi uurimisel. Parim nide on siinkohal puromtsiin. Puromtsiinist oli juba eespool juttu seoses ribosoomi tRNA sidumiskohtade ja peptiidsideme moodustumisega. Siin on kohane mrkida, et antibiootikumid on olnud olulisteks abimeeteks valgusnteesi molekulaarsete mehhanismide vljaselgitamisel ja neid kasutatakse valgusnteesi uurimisel ka praegu. Alljrgnevalt vaatleme antibiootikume, valgusnteesi inhibiitoreid, vastavalt nende poolt mjutatavatele protsessidele. tRNA sidumist ja koodoni ratundmist (koodon-antikoodon interaktsiooni) mjutavad rohud: Aminoglkosiidid (streptomtsiin, neomtsiin, kanamtsiin, gentamtsiin, kasugamtsiin), inhibeerivad aa-tRNA seondumist ribosoomi A saiti ja koodon-antikoodon ratundmist. Streptomtsiin (Strp) on tuntud omaduse poolest indutseerida koodilugemise vigu st. valede aminohapete llitumist valkudesse. Kui normaalselt teevad bakteri ribosoomid he vea 10 000 igesti llitatud aminohappe kohta, siis streptomtsiini juuresolekul vib vigade sagedus

kasvada 50 korda. Valest snteesitud valgud ei suuda rakus tita vajalikke funktsioone ja kutsuvad esile proteaaside aktiviseerimise. Selle tulemusena peatub valgusntees ja raku kasv ning lpuks jrgneb raku surm. Peale valelugemise vigade indutseerib streptomtsiin ja ka teised aminoglkosiidid translatsiooni raaminihke teket, mis on raku elu seisukohalt veelgi kahjulikuma efektiga kui valelugemine. Enamus amiglkosiidseid antibiootikume toimivad ainult prokarootidele. Selline spetsiifika tuleneb eelkige prokarootsete ja eukarootsete ribosoomide ehituse erinevustest. Aminoglkosiidid on tugeva positiivse laenguga ained ja seonduvad ribosoomides philiselt 16S rRNAga. Seondumine ribosoomidega on vga spetsiifiline ja sageli ka vga stabiilne (streptomtsiin seondub ribosoomidega pea kovalentsele sidemele omase stabiilsusega). Prokarootsetes ribosoomides takistavad aminoglkosiidid koodoni seondumist antikoodoniga vi phjustavad selle protsessi selektiivsuse vhenemist. Eukarootsed ribosoomid aga ei seo enamusi aminglkosiidseid antibiootikume. Kll aga seovad aminoglkosiide mitokondrite ribosoomid. Aminoglkosiidide seondumine philiselt rRNAga on olnud oluliseks argumendiks, millel phineb veendumus, et ribosoomide kataltilised tsentrid on ehitatud peamiselt RNAst. Bakterite resistentsuse aminoglkosiidsete ravimite suhtes tagavad mutatsioonid nii 16S rRNAs kui ribosoomi valkudes. Streptomtsiini resistentsust phjustavad mutatsioonid vhemalt neljas erinevas 16S rRNA piirkonnas (primaarstruktuuril). Ribosoomi ruumilises struktuuris paiknevad kik need piirkonnad siiski lhestikku. 16S rRNA mutandid, mis tagavad streptomtsiini resistentsuse, nrgendavad oluliselt selle ravimi seondumist ribosoomidele. Ribosoomi valgu S12 mutatsioonid vivad samuti tagada streptomtsiini resistentsuse. Streptomtsiini resistentsed ribosoomid (S12 mutandid) transleerivad mRNAd suurema tpsusega kui metsiktbi ribosoomid. Seejuures ei mjuta nad vga oluliselt streptomtsiini seondumist ribosoomidega. Viimase seondumisel vheneb kll translatsiooni tpsus aga jb siiski raku taluvuse piiridesse. Mikroobigeneetika seisukohalt on oluline, et S12 mutatsioonid mjutavad nonsens suppressiooni aktiivsust. Suppressor tRNAd, nagu juba eespool eldud, ei konkureeri tavaliste elongaator tRNAdega vrdselt. Tavalisest tpsemate ribosoomide aa-tRNA selektsioon on vimendunud ja seeprast ei suuda suppressor tRNAd oma funktsiooni tita. See asjaolu nitab veelkord, et ribosoomidel on koodon-antikoodon ratundmises aktiivne osa. Mutatsioonid ribosoomi viksema subhiku valkudes S4 ja S5 pravad S12 sltuvad streptomtsiini resistentsused ribosoomid taas ravimitundlikeks. Nimetatud valkude mutatsioonid ei mjuta aga streptomtsiini seondumist ribosoomidega vaid suurendavad ribosoomi poolt tehtavate translatsiooni vigade sagedust. Neid mutatsioone nimetatakse ribosoomi vimekuse mutatsioonideks (ribosome ambiguiti mutations - ram). Tetratskliin inhibeerib samuti aa-tRNA seondumist ribosoomi A-saiti. Tetratskliin seondub nii pro- kui eukarootsete ribosoomidega. eukaroodid ei ole aga tetratskliini suhtes enamasti tundlikud, kuna rohi ei pse eukarootide rakkudesse. Vga huvitav on tetratskliini resistentsuse mehhanism. Bakterites on leitud valk (TetO), mis tagab tetratskliini resistentsuse. TetO valk eemaldab ribosoomidega seondunud tetratskliini. See reaktsioon on sltuv GTP hdrolsist. TetO valk ise aga on homoloogne elongatsioonifaktor Gga (EF-G). Piltlikult vljendudes pumpab TetO valk ribosoomidest GTP hdrolsi abil seondunud tetratskliini vlja.

Peptiidsideme snteesi ja peptiidahela pikenemist inhibeerivad antibiootikumid (koloroamfenikool, sparsomtsiin, ertromtsiin, linkomtsiin, klindamtsiin ja nukleotiidsed antibiootikumid). Peptiidsideme snteesi inhibeerivad vga pljud antibiootikumid, millest siin ksitleme vaid mnda. Kloroamfenikool ja sparsomtsiin on kige tpilisemad ensmi inhibiitorid, nad seonduvad ribosoomi peptidl-transferaasse tsentri aktseptor saiti (ribosoomi A saidi osa, kuhu seondub tRNA 3 ots -CCA-aa), takistades aminoatsl-tRNA (aktseptorsubstraadi) seondumist ribosoomi aktiivtsentrisse. Kloroamfenikool ja sparsomtsiin takistavad peptiidsideme moodustumist konkurentse inhibitsiooni kaudu. Ribosoomide resistentsuse kloroamfenikooli ja sparsomtsiini suhtes tagavad mutatsioonid 23S rRNA's (domnis V, nn. peptidltransferaasses regioonis). Kuna resistentsuse nende peptiidsideme snteesi inhibeerivate antibootikumide suthes annavad mutatsioonid 23S rRNAs, siis on tenoline, et ribosoomi peptiidsideme snteesi eest vastutav piirkond peptidltransferaasne tsenter koosneb kas tervenisti vi osaliselt 23S rRNAst. rRNA keskset osa peptiidsideme snteesil ja substraatide (aa-tRNA, pep-tRNA) sidumisel toetavad ka teised biokeemilised andmed. Mutatsioonanalsiga on tuvastatud, et pep-tRNA nukleotiid C74 paardub peptiidsideme moodustumise protsessis 23S rRNA numleotiidiga G2252 (moodustub Watson-Crick aluspaar). Ka fotoafiinsusmrkega substaatide ristsidumise, keemislise modifikatsiooni eest kaitsmise ja modifitseeritud substraatide selekteerimisega saadud tulemused viitavad 23S rRNA kindlate piirkondade, mis kik asuvad domnis V, lhedusele vi otsesele osalusele ribosoomi peptidltransferaasele tsentrile. Ertromtsiin kuulub makroliidsete antibiootikumide rhma. Makroliidid (lisaks ertromtsiinile kuuluvad siia rhma veel paljud, niteks karbomtsiin, spiramtsiin, leukomtsiin, nidamtsiin, oleandomtsiin) inhibeerivad peptiidahela pikenemist. Ertromtsiin blokeerib peptiidahela kasvu ribosoomis ainult snteesi algusfaasis ja ei mjuta ei translatsiooni initsiatsiooni ega peptiidi snteesi kui ahel on pikem kui 6-7 aminohapet. Seeprast arvatakse, et makroliidid takistavad kasvava peptiid ja ribosoomi vahelist interaktsiooni, tenoliselt peptiidi sisenemist ribosoomi suuremat subhikut lbivasse tunnelisse. Ertromtsiini resistentsuse tagavad mutatsioonid ribosoomi valgus L4, L22 ja 23S rRNAs. Seega vib arvata, et ertsomtsiin seondub ribosoomis nii suurema subhiku valkudega kui 23S rRNAga. Makroliidide sidumispiirkond ribosoomis kattub osaliselt kloroamfenikooli sidumiskohaga. Makroliidide ja kloroamfenikooli seondumine ribosoomidele on teineteist vlistav. Ertromtsiini, nagu paljude teiste antibiootikumide resistentsus bakterites, saavutatakse ka teiste mehhanismide abil peale mutatsioonide ribosoomi komponentides, niteks permeaablust (ravimi transport bakterisse) mjutavad mutatsioonid. Linkomtsiin ja klindamtsiin (linkoosamiidid) inhibeerivad samuti peptiidsideme snteesi ribosoomidel. Nad blokeerivad aminoatsl-tRNA 3-otsa (aktseptorsubstraadi) fikseerimist ribosoomi peptidltransferaases tsentris ja on selle omaduse poolest sarnased kloroamfenikooliga. Viimasega aga samuti makroliididega on neil osaliselt kattuv sidumispiirkond ribosoomidel. Mned 23S rRNA mutatsioonidest, mis tagavad makroliidide resistentsuse annavad ka linkoosamiidide resistentsuse. Peptiidsideme snteesi ribosoomidel inhibeerivad ka nukleotiidsed antibiootikumid: amitsetiin, bamitsetiin, plikatsetiin, blastitsidiin S, gougerotiin.

Lisaks nimetatuile veel terve rida antibiiotikume takistavad peptiidsideme snteesi ribosoomidel, millest mned nited: glutaarimiidid (tskloheksimiid, streptividoon), streptogramiinid (vernamtsiin, virginiamtsiin), krptopleuriin, krototsiin. Ribosomaalset translokatsiooni inhibeerivad tiostreptoon, viomtsiin ja spektinomtsiin. Neist esimene, tiostreptoon, seondub ribosoomi suurema subhikuga. Tiostreptooni seondumiskoha moodutavad ribosoomi valk L11 ja 23S rRNA. Tiostreptoon ja viomtsiin blokeerivad ribosoomi struktuurse muutuse, mis on vajalik translokatsiooni (mRNA ja 2 tRNA moklekuli kompleksi liikumine ribosoomis he koodoni vrra) toimumiseks. Tiostreptoon, aga mitte viomtsiin blokeerib ka elongatsioonifaktor G seondumise ribosoomidega, mis vimendab translokatsiooni inhibeerimist veelgi. Tiostreptooni resistentsuse tagavad 23S rRNA modifitseerimine vi muteerimine ja valgu L11 puudumine ribosoomidest. Viomtsiini resistentsuse tagavad mutatsioonid nii 23S kui 16S rRNAs ja seega on phjust arvata, et see ravim seondub mlema ribosoomi subhikuga. Kuna viomtsiin on 8 aminohappe jgist koosnev peptiid, siis peab tema seondumiskoht olema ribosoomi kahe subhiku vahel sest oma vikeste mtmete tttu ei saaks ta muidu mlema subhikuga seonduda. Spektinomtsiin, mis takistab EF-G seondumist ribosoomidega, blokeerib samuti translokatsiooni takistades EF-G suunatud reaktsiooni. Spektinomtsiini resistentsuse annavad ribosoomidele mutatsioonid ribosoomi viksema subhiku valgus S5 ja 16S rRNAs. Spektinomtsiin seondub ainult ribosoomi viksema subhikuga. On huvitav mrkida, et EF-G seondub philiselt ribosoomi suurema subhikuga. Sektinomtsiini efekt translokatsioonile toimub ilmselt kahe subhiku omavahelise orientatsiooni muutmise kaudu. Elongatsioonifaktoritega seonduvad antibiootikumid on kirromtsiin ja fusiidhape. Kirromtsiin seondub EF-Tuga aga ei takista EF-Tu komplekseerumist GTP ja aa-tRNAga. Kui selline nelik-kompleks seondub ribosoomi A saiti toimub kll EF-Tu suunatud GTP hdrols aga ei toimu EF-Tu ja GDP dissotsiatsiooni ribosoomidelt ja peptiidsideme snteesi ning valgusnteesi elongatsioon peatub. Mutatsioonid EF-Tus annavad resistentsuse kirromtsiini suhtes. Fusiidhappel on sarnane efekt, aga ta seondub EF-Gga ja stabiliseerib EF-G .GDP kompleksi ribosoomiga takistades niiviisi jrgmise elongatsioonitskli toimumist.