1060 第四军医大学学报 ( J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 ( 12 ) 　http: / / journal. fmmu. edu.

cn

・研究原著 ・ 文章编号 : 1000 22790 ( 2006 ) 12 21060 204

Arg9 /人抗 HBsAg 单链抗体 / EGFP 融合蛋白基因的构建 、

表达及活性
分析
1 1 1 1 1 2 2 1, 2
薛 　茜 ,温伟红 ,孟艳玲 ,张 　勇 ,张 　巍 ,王 　涛 ,张 　瑞 ,杨安钢 　
(第四军医大学基础部 : 1
免疫学教研室 , 生物化学与分子生物学教研室 ,陕西 西安 710033)
2

【摘 　要 】目的 : 构建带有转膜结构域 A rg9 编码序列的 R9 /

Con struction, expression and activ ity
ScFv14 / EGFP融合基因 ,将其转化入大肠杆菌中进行表达 ,并
ana lysis of Arg9 / human an ti2HBsAg 分析表达产物与 HB sAg 的结合活 性 . 方法 : 设计引 物 , 将
sin gle cha in an tibody / EGFP fusion gene A rg9 的编码序列引入单链抗体基因的 5 ′
端 , PCR 扩增后获得
W EN W ei2Hong , M EN G Yan 2L ing , 带有 A rg9 编码序列的 ScFv14 基因 ,将 PCR 产物连入 pMD18 2
1 1 1
XU E Q ian , ZHAN G
Yong , ZHAN G W ei , WAN G Tao , ZHAN G R u i , YAN G A n 2
1 1 2 2
T载体 , 进行序列测定 . 将 测序 正确的 ScFv14 基 因和 R9 /
1, 2
Gang ScFv14 基因分别与 EGFP 基因连接后转化入原核表达载体
1 2
Departm ent of Immunology, Departm ent of B iochem istry and pET32a,获得 ScFv14 / EGFP 和 R9 / ScFv14 / EGFP 两种融合基
Molecular B iology, School of Basic M edicine, Fourth M ilitary 因的表达载体 ,转化大肠杆菌 BL21 ( DE3 ) LysS,以 IPTG诱导
M edical University, Xiπan 710033, China 表达 ,对表达产物进行 SDS2PAGE分析 ,并用间接 EL ISA 方法
检测其与 HB sAg的亲和活性 . 结果 : 经酶切鉴定及测序证实
【Abstract】A IM : To construct R9 / ScFv14 / EGFP fusion genes ScFv14 / EGFP融合基因和 R9 / ScFv14 / EGFP 融合基因序列完
and to analyze the binding activity of the fusion p roteins after they 全正确 . SDS2PAGE 分析表明两种融合基因在大肠杆菌 BL21
were exp ressed in E. coli BL21. M ETHOD S: A series of oligo2 中成功获得表达 ,表达量分别占菌体总蛋白的 20% 和 25%.
nucleotide p rim ers were designed and used to amp lify the genes of 间接 EL ISA 检测证实所表达的 ScFv14 / EGFP融合蛋白和 R9 /
ScFv14 and R9 / ScFv14. The PCR p roducts were cloned into ScFv14 / EGFP融合蛋白均具有 HB sAg结合活性 . 结论 : 成功
pMD18 2T vector, followed by DNA sequencing. R9 / ScFv14 gene 构建了带有转膜结构域 A rg9 编码序列的 R9 / ScFv14 / EGFP融
and ScFv14 gene were ligated w ith EGFP gene respectively before 合基因 ,并在大肠杆菌 BL21 中成功表达 , 表达产物 ScFv14 /
they were recombined into the exp ression vector pET32a. After in2 EGFP和 R9 / ScFv14 / EGFP 均具有与抗原 HB sAg特异性结合
duced in E. coli BL21 by IPTG, the exp ressed fusion p roteins 的活性 .
named R9 / ScFv14 / EGFP and ScFv14 / EGFP were detected by
【关键词 】肝炎 ,乙型 ; 肝炎表面抗原 ,乙型 ; ScFv; A rg9
SDS2PAGE and the binding activity of them were analyzed by
【中图号 】R392. 11 　　　【文献标识码 】A
indirect EL ISA. RESUL TS: Restriction endonuclease digestion
and DNA sequencing p roved that the two fusion genes were
0 　引言
correctly constructed. SDS2PAGE analysis showed that they were
successfully exp ressed in E. coli BL21 and the percentages of them
单链抗体 ( ScFv)是抗体重链可变区 (VH )与轻链
were 20% and 25% of total bacteria p roteins respectively. Indi2 可变区 (VL ) 通过一段连接肽 ( linker) 连接而成的一
rect EL ISA confirmed that the exp ressed p roducts had antigen 种小分子抗体 . 其分子质量仅为完整抗体的 1 /6, 不
specific binding activity. CO NCL US IO N: The two fusion genes 仅能较好地保持抗原结合能力 , 并且具有分子质量
were constructed successfully. And the p roducts of them ex2 小、
穿透力强 、
半衰期短 、
免疫原性低 、
制备流程简单
p ressed in E. coli BL21 maintained the binding activity to HB sAg. [1 - 3]
等特 点 , 更 有 利 于 体 内 应 用 . 绿色荧光蛋白
【 Keywords】 hepatitis B; hepatitis B surface antigens; ScFv; ( green fluorescent p rotein, GFP ) 是从水母中分离出
A rg9
来的一种发光蛋白 ,可在 A450 nm ～490 nm的蓝光激发下发
出绿色荧光 ,使用普通荧光显微镜即可进行观察 . 是
收稿日期 : 005 211 207; 　接受日期 : 2005 212 219 近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记性蛋白
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30400379) ; 国家“973 ”
计划资助项
质之一 . EGFP 为一种突变型 GFP, 所产生的荧光比
目 ( 2004CB518805) ; 教育部创新团队资助项目 ( IRT0459)
通讯作者 : 杨安钢 . Tel: (029) 83374528 　Email: agyang@ fmmu. edu. cn
野生型 GFP增强 , 可作为标签用于检测目的蛋白及
作者简介 : 薛 　茜 . 硕士生 (导师杨安钢 ) . Tel: ( 029 ) 83374531 Ext. 指示目的蛋白的定位 . ScFv与效应分子组成的融合
808 　Email: xueqian@ fmmu. edu. cn 蛋白能否高效地内化入细胞对于其生物学功能的发
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挥具有非常关键的作用 . A rg9 是一个九聚精氨酸的
短肽序列 ,是蛋白转膜结构域 ( PTD s) 的一种 ,它能够
将与之融合的蛋白携带入细胞内 . 我们将抗 HB 2
[4]
[5]
sAg的单链抗体 ( ScFv14 ) 基因 与 EGFP 基因融合 ,
并将 A rg9 编码序列融合到 ScFv14 / EGFP 基因的 5 ′
端 ,构建带有转膜结构域 A rg9 的 R9 / ScFv14 / EGFP
融合蛋白基因 ,将它们在大肠杆菌中进行诱导表达 ,
并对表达产物的亲和活性进行了分析 .
1 　材料和方法
1. 1 　材料 　含有编码人抗 HB sAg 单链抗体 ScFv14
基因的载体 pUC19 2ScFv14、 大肠杆菌 E. coli. DH5α株
和原核表达载体 pET32a 第四军医大学生物化学与
( 分析 .
[5]
分子生物学教研室构建 并保存 ) ; EGFP 融合蛋白
表达载体 pEGFP 2N3 ( C lontech 公司 ) ; DNA M arker,
T4 DNA L igase, pMD18 2T vector 和 限 制 性 内 切 酶
B am H Ⅰ, EcoR Ⅰ, N ot Ⅰ ( TaKaRa 公司 ) ; 质粒提取
试剂盒 、
胶回收试剂盒 (上海华舜公司 ) ; W erstern blot
显影液 ( Pierce 公司 ) .
1. 2 　方法
1. 2. 1 　引物的设计与合成 　根据 ScFv14 基因序列 ,
设计引物扩增 ScFv14 基因 ,并设计引物将 A rg9 的编
码序列引入 ScFv14 基因的 5 ′ 端 ,引物序列如下 :
14F 5 ′TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC
3′; 14R9F 5 ′TTTGAATTCATG AGACGCAGGAGACG2
CAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3 ′ ; mAb ( 1 ∶
L3 5 ′TTTGGATCCTCGATTGATTTCCACCTTGGT 3 ′.
其中划线部分为九聚精氨酸的编码序列 .
1. 2. 2 　重组质粒的构建与鉴定 　以 pUC19 2ScFv14
为模板 , 分 别 以 14F, L3 和 14R9F, L3 为 引 物 扩 增
ScFv14 基因和 R9 / ScFv14 基因 . 反应条件 : 95 ℃ 35
s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in, 共进行 25 个循环 . 产物进
行 10 g /L 琼脂糖凝胶电泳 , 胶回收试剂盒回收 . 回
收产物分别连入 pMD18 2T 载体 , 转化 E. coli. DH5α
宿主菌 ,挑取单克隆 ,提取质粒进行酶切鉴定 ,阳性克
隆命名为 pMD18 2T2ScFv14 和 pMD18 2T2R9 / ScFv14,
送北京三博远志生物技术公司测序 . 将测序正确的
pMD18 2T2ScFv14 和 pMD18 2T2R9 / ScFv14 用限制性内
切酶 EcoR Ⅰ和 B am H Ⅰ进行酶切 , 得到 ScFv14 和
R9 / ScFv14 基因片段 ,将 pEGFP 2N3 用 B am H Ⅰ和 N ot
Ⅰ酶切 ,得到 EGFP 基因片段 . 分别将 ScFv14 和 R9 /
ScFv14 基因与 EGFP基因在 16 ℃条件下连接 4 h 后 ,
再连入经 EcoR Ⅰ和 N ot Ⅰ酶切的表达载体 pET32a
中 ,转化 E. coli. DH5α后 ,筛选阳性克隆酶切鉴定 . 鉴
定正确的质粒分别命名为 pET32a 2ScFv14 / EGFP 和
1061
pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP.
1. 2. 3 　融合基因的诱导表达及鉴定 　将 pET32a 2
ScFv14 / EGFP和 pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP 质粒分别
转化入 E . coli. BL21,挑取单克隆菌落接种于含有氨
苄青霉素的 LB 培养基中 , 220 r/m in, 37 ℃培养过夜 ,
次日以 1 ∶ 100 转接 ,在 220 r/m in, 37 ℃条件下振荡培
养至 A600 nm = 0. 4 ～ 0. 6, 加 入 IPTG 至 终 浓 度 为 1
mmol/L ,诱导培养 3 h, 取 1 mL 诱导菌液离心 , 收集
菌体 ,进行 SDS2PAGE 分析 . 另取 5 mL 诱导菌液离
心 ,收集菌体 ,以 0. 2 mol/L 的 Tris2HC l ( pH = 8. 0 ) 重
悬 ,超声裂解后 ,离心取上清 ,沉淀用 0. 2 mol/L Tris2
HCl ( pH = 7. 4 ) 重悬 , 取上清和沉淀进行 SDS2PAGE
1. 2. 4 　重组融合蛋白的 W estern blot分析 　将诱导
菌进行 SDS2PAGE 分离蛋白质 ,用半干式电转仪将凝
胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜 (NC )上 ,经 50 g/L
的脱脂奶粉封闭 1 h, 用鼠抗 EGFP mAb ( 1 ∶ 1000 稀
释 ) , 4 ℃孵育过夜 ,用 TBS2T洗膜 6 次 ,每次 5 m in,再
加入辣根过氧化酶 HRP标记的山羊抗小鼠 IgG,室温
孵育 1 h, 用 TB S2T洗膜 6 次 , 每次 5 m in, 按显影液
说明加入显影液 ,用化学发光法进行检测 .
1. 2. 5 　融合蛋白亲和活性的 EL ISA 检测 　用 5 mg/L
HB sAg包被 EL ISA 板 , 每孔 100 μL , 4 ℃过夜 . 加入
不同稀释度的细菌裂解上清 ,每孔 100 μL , 37 ℃孵育
1 h. 设空白和阴性对照 . 洗涤后 , 加入鼠抗 EGFP
1000 稀释 ) , 37 ℃孵育 1 h. 洗涤后再加入辣
根过氧化酶 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG, 37 ℃孵育
1 h. 最 后 各 孔 加 入 新 鲜 配 制 的 AB TS 显 色 液 100
μL , 37 ℃孵育 30 m in,终止反应 . 以酶标仪测定各孔
A410 nm值 .
2 　结果
2. 1 　目的基因扩增和酶切鉴定 　PCR 产物经 10 g/L
琼脂糖凝胶电泳证实分别扩增出大小约为 750 bp 和
780 bp 的条带 (图 1A ) . 测序结果证实扩增的 ScFv14
和 R9 / ScFv14 基因完全正确 . 用 EcoR Ⅰ和 B am H Ⅰ
双酶切鉴定 ,得到大小约为 750 bp 和 780 bp 的条带 ,
与预期长度相符 (图 1B ) .
2. 2 　原核表达载体的酶切鉴定 　重组载体 pET32a 2
ScFv14 / EGFP和 pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP 用限制性
内切 酶 EcoR Ⅰ和 B am H Ⅰ双 酶 切 ScFv14 和 R9 /
ScFv14 基因 ,分别得到大小约为 750 bp 和 780 bp 的
条带 ; 用 EcoR Ⅰ和 N otⅠ双酶切融合蛋白基因 , 分别
得到大小约为 1490 bp 和 1520 bp 的条带 , 与预期长
度相符 (图 2 ) .
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0. 05 ) .

A 　1: DL2000 marker; 2: ScFv14 基因 PCR 产物 ; 3: R9 / ScFv14 基因

PCR 产物 . B 　1: pMD18 2T2ScFv14; 2: DL2000 Marker; 3: pMD18 2T2
A 　1: Marker; 2, 4: 未诱导的 pET32a和 pET32a2R9 / ScFv14 / EGFP 的
R9 / ScFv14.
全菌蛋白质 ; 3, 5: IPTG 诱导的 pET32a 和 pET32a2R9 / ScFv14 / EGFP
图 1 　R9 / ScFv14 和 ScFv14 基因 PCR 结果 (A )及 PCR 扩增产
的全菌蛋白 质 . B 　 1: marker; 2, 4: 未 诱 导的 pET32a 和 pET32a2
物酶切鉴定结果 (B )
ScFv14 / EGFP 的全菌蛋白质 ; 3, 5: IPTG 诱导的 pET32a 和 pET32a2
ScFv14 / EGFP 的全菌蛋白质 .
图 3 　 pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP 和 pET32a 2ScFv14 / EGFP 表
达的 SDS2PAGE分析

A 　1: DL2000 marker; 2: EcoR Ⅰ和 B am H Ⅰ双酶切 pET32a2ScFv14 /

EGFP 的产物 ( ScFv14 ) ; 3: EcoR Ⅰ和 N ot Ⅰ双酶切 pET32a2ScFv14 /
EGFP 的 产物 ( ScFv14 / EGFP) . B 　1: DL2000 marker; 4: EcoR Ⅰ和
B am H Ⅰ双酶切 pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP 的 产 物 ( R9 / ScFv14 ) ; 5:
EcoR Ⅰ和 N otⅠ双酶切 pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP 的产物 ( R9 / ScFv14 /
EGFP) . 1: Marker; 2, 4: IPTG 诱 导 的 pET32a2R9 / ScFv14 / EGFP 和 pET32a2

图 2 　原 核 表 达 载 体 pET32a 2ScFv14 / EGFP 和 pET32a 2R9 / ScFv14 / EGFP 的全菌上清 ; 3, 5: IPTG诱导的 pET32a2R9 / ScFv14 / EG2
FP和 pET32a2ScFv14 / EGFP 的包涵体中的蛋白质 .
ScFv14 / EGFP酶切鉴定
图 4 　融合蛋白表达的分析

2. 3 　重组融合蛋白表达的鉴定和分析 　 SDS2PAGE
分析显示 , 与未诱导菌相比 , 两种诱导菌在 M r 约为
73 ku 处均有一特异性蛋白条带 , 同预期的大小相
符 . 经凝胶成像系统扫描显示 , 它们的表达量分别约
占菌体总蛋白的 20%和 25% (图 3 ) . 取 IPTG 诱导
后的菌液进行超声裂解 ,分别取其裂解上清和沉淀进
1: R9 / ScFv14 / EGFP; 2: ScFv14 / EGFP.
行 SDS2PAGE 分析 ,电泳结果显示两种目的蛋白均主
图 5 　融合蛋白表达的 W estern blot 分析
要存在于诱导菌的裂解上清中 (图 4 ) .
2. 4 　重组融合蛋白的 W estern blot分析 　在 M r 约
为 73 ku 处 有 一 特 异 性 蛋 白 条 带 (图 5 ) , 与 SDS2
PAGE 分析结果相符 ,说明该诱导蛋白为目的蛋白 .
2. 5 　融 合 蛋 白 亲 和 活 性 的 EL ISA 检 测 　间 接
EL ISA 检测结果显示表达的两种 ScFv14 / EGFP 融合
蛋白均能与 HB sAg抗原特异性结合 (图 6 ) , 二者相
比 , R9 / ScFv14 / EGFP 与 HB sAg 的 亲 和 力 稍 大 于
图 6 　两种免疫融合蛋白与 HB sAg 结合力的间接 EL ISA 检测
ScFv14 / EGFP与 HB sAg, 但不具有统计学意义 ( P >
第四军医大学学报 ( J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 ( 12 ) 　http: / / journal. fmmu. edu. cn 1063

3 　讨论
天然 Fv 片段中 VH 和 VL 为非共价性结合 , 是抗 【参考文献 】
[ 1 ] Kasuya K, Boyer JL, Tan Y, et al. Passive immunotherapy for an2
体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段 . 将 VH
thrax toxin mediated by an adenovirus exp ressing an anti2p rotective
和 VL 用一个小肽 ( linker)连接起来 ,即单链抗体 . 单
antigen single2chain antibody [ J ]. Mol Ther, 2005, 11 ( 2 ) :
链抗体易与效应分子相连 , 与其他蛋白融合 , 可得到 237 - 244.
具有多种生物学功能的融合蛋白 . 近年来 , 以单链抗 [ 2 ] Neve RM , N ielsen UB , Kirpotin DB , et al. B iological effects of an2
体为导向物的免疫融合蛋白在抗肿瘤 、 抗病毒等的治 ti2ErbB2 single chain antibodies selected for internalizing function

疗和诊断方面展现了广阔的前景 ,引起了人们的广泛 [ J ]. B iochem B iophys Res Commun, 2001, 280 ( 1) : 274 - 279.
[ 3 ] Rosana B , M ichelM , JulesMattes. Intracellular accumulation of the
关注 . 由单链抗体与毒素 、
酶、细胞因子等的基因相连
anti2CD20 antibody 1F5 in B 2lymphoma cells [ J ]. Clin Cancer
的免疫融合蛋白 ,可以结合到特定的靶部位 , 高效的 Res, 2002, 8 ( 8) : 2701 - 2713.
[6 - 7]
发挥生物学功能 . [ 4 ] Hea D , Yangb H, L ina Q , et al. A rg9 2pep tide facilitates the inter2
蛋白转膜结构域 ( PTD s)是一类能够介导与之融 nalization of an anti2CEA immunotoxin and potentiates its specific cy2

合的蛋白内化入细胞的短肽 . 它们作为内化的工具被 totoxicity to target cells [ J ]. Int J B iochem Cell B iol, 2005,
37 ( 1) : 192 - 205.
广泛应用 ,它不仅可以使多肽 、 多聚核苷酸 、
极小微粒
[8] [ 5 ] W en WH, Zhao J, Yu CJ, et al. Construction of single2chain Fv
进入细胞 , 甚至可以在体内介导蛋白质的内化 . Gene of Anti2HB sAg and its exp ression in COS27 cells [ J ] . Chin J
[9]
Futaki等 发现多种富含精氨酸的肽都具有转膜作 Cell Mol Immunol, 2003, 19 ( 2) : 163 - 167.
用 . 在比较了不同长度的多聚精氨酸对内化效率的影 [ 6 ] Schnell R, V itetta E, Schindler J, et al. Treatm ent of refractory

响之后 ,他们发现八聚精氨酸 ( A rg8 ) 的内化效果最 Hodgkin’s lymphoma patients with an anti2CD25 ricin A 2chain immu2
[ 10 ] notoxin [ J ]. Leukem ia, 2000, 14 ( 13) : 129 - 135.
好 . W ender 等 发现 A rg9 具有更高效的内化作
[ 7 ] Doronina SO , Toki BE, Torgov MY, et al. Development of potent
用 . 我们采用转膜结构域 A rg9 来增强融合蛋白的转
monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy [ J ].
膜功能 ,以期使产物具有更高的内化效率 . Nat B iotechnol, 2003, 21 ( 7) : 778 - 784.
我 们 构 建 了 带 有 转 膜 结 构 域 A rg9 的 R9 / [ 8 ] Mai JC, Shen H, W atkins SC, et al. Efficiency of p rotein transduc2
ScFv14 / EGFP融合基因表达载体 ,并将该表达载体在 tion is cell type2dependent and is enhanced by dextran sulfate [ J ].

E . coli. BL21 中进行诱导表达 , SDS2PAGE 分析表明 J B iol Chem , 2002, 277 ( 33) : 30208 - 30218.
[ 9 ] Futaki S, Suzuki T, Ohashi W , et al. A rginine2rich pep tides An
融合蛋白在大肠杆菌中成功表达 ,并且主要在大肠杆
abundant source of membrane2permeable pep tides having potential as
菌的上清中表达 ,这就避免了变性复性的复杂过程 , carriers for intracellular p rotein delivery [ J ]. J B iol Chem , 2001,
直接就可以获得具有生物学功能的活性蛋白 . 间接 276 ( 8) : 5836 - 5840.
EL ISA 检测也证实融合有 A rg9 的 ScFv14 / EGFP融合 [ 10 ] W ender PA , M itchell DJ, Pattabiraman K, et al. The design, syn2

蛋白与不带有 A rg9 的 ScFv14 / EGFP融合蛋白对 HB 2 thesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular
up take: Pep toid molecular transporters [ J ]. Proc Natl Acad Sci
sAg具有相近的亲和活性 . 这为进一步研究 A rg9 对
USA , 2000, 97 ( 24) : 13003 - 13008.
免疫融合蛋白内化的促进作用以及为乙型病毒性肝 编辑 　王 　睿
炎的靶向治疗研究提供了实验基础 .