肿瘤防治研究 2006 年第 33 卷第 2 期 ・7 7 ・

人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定
王建军 , 刘志苏 , 袁玉峰
Construction and Prel iminary Identif ication of Single2chain Fv Antibody against Human
Hepatocellular Carcinoma
WAN G Jian2jun ,L IU Zhi2su , YUAN Yu2feng
De p art ment of General S ur gery , Zhon g nan Hos pit al , W uhan U ni versit y , W uhan 430071 , Chi na
Corres pon di n g A ut hor : L I U Zhi2su

Abstract :Objective 　To const ruct t he p hage display library of anti2human hepatocellular carcinoma ScFv.
Methods 　The ScFv gene library was co nst ructed by p hage display technology. Binding activity of recom2
binant scFv was detected by EL ISA after panning. Results 　Eight antigen binding clo nes were identified
f rom 30 individual p hagemid clones. Conclusion 　In t he const ruction of engineering antibodies against hu2
man hepatocellular carcinoma , t he st rategy of p hage display technique and of R T2PCR f ro m perip heral
blood lymp hocytes mRNA may p rovide an alternative app roach.
Key words :Phage display ; Single chain antibody ; Hepatocellular carcino ma
摘 　要 : 目的 　构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库 。方法 　利用噬菌体表面呈现技术 ,
构建基因文库 ,经过 panning 筛选富集后 ,用 EL ISA 方法检验抗原结合活性 。结果 　从 30 个噬菌体克
隆中筛选到 8 个具有肝癌细胞株 SMMC7721 结合活性的阳性克隆 。结论 　从外周血淋巴细胞中获取
可变区基因 ,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的 。
关键词 : 噬菌体表面呈现技术 ; 单链抗体 ; 肝癌
中图分类号 : R735 . 7 ; R7323 　　文献标识码 :A 　　文章编号 : 100028578 ( 2006 ) 0220077203

0 　引言 M 13 KO 7 helper p hage 购自 Pro mega 公司 , HRP/

肝癌是我国常见的恶性肿瘤 , 目前治疗措施是 羊抗 M13 噬菌体抗体 、T4 DNA 连接酶 、 限制性内
以肝切除术为主的综合治疗 。但对于肝癌的早期诊 切酶 Sfi Ⅰ、 Not Ⅰ购自 Pharmacia 公司 , TaqDNA 聚
断、 治疗疗效尚不理想 [ 1 ] 。单链抗体 ( ScFv) 是用基 合酶购自 Takara 公司 ,淋巴细胞分离液购自上海生
因工程方法将抗体重链可变区 ( V H ) 和轻链可变区 化试剂厂 。SOBA G 琼脂板 , 2 ×YT2A G , 2 ×YT2
( VL ) 通过一段连接肽 ( Linker ) 连接而成的重组蛋 A K 等试剂均自行配制 。引物为 10 种 V H 和 VL
白 ,是保持了亲本抗体抗原亲和活性和特异性的最 引物混合物 、 与 V H 基因 3′端和 VL 基因 5′ 端序列
小功能性抗体片段 [ 2 ] 。构建抗 HCC 噬菌体抗体库 互补的 linker Primer Mix 、 带有 Sfi Ⅰ酶切位点的
和制备特异性单链抗体具有较大的基础研究价值和 V H 5′ 端引物和带有 Not Ⅰ酶切位点的 VL 3′ 端引
广阔的临床应用前景 [ 3 ] 。本实验就是利用噬菌体表 物 , 引物设计参考文献 [ 5 ] , 引物合成由北京 Sun2
面呈现技术 ,构建了抗人肝癌单链抗体基因噬菌体 biotech 公司完成 。肝癌细胞株 SMMC7721 由武汉
表面呈现文库 ,并从中筛选到有抗原结合活性的抗 大学典藏中心提供 。30 份肝癌患者的外周血标本
体。 采自湖北省肿瘤医院和武汉大学中南医院普外科 。
1 . 2 　方法
1 　材料和方法 1 . 2 . 1 　从肝癌患者外周血中分离淋巴细胞 　无菌
1 . 1 　材料 抽取 30 例肝癌患者外周血各 5 ml , 于每管中加入
Trizol 试剂 、
cDNA 合成试剂盒和凝胶纯化试 3 ml 淋巴细胞分离液 , 采用密度梯度离心法分离淋
p CAN TAB25 E 、
剂盒购自 Gibco 公司 , E. coli T G1 、 巴细胞 。
1 . 2 . 2 　提取总 RNA 及 cDNA 第一链的合成 　用

收稿日期 : 2005204214 ; 修回日期 : 2005206222 Trizol 试剂提取淋巴细胞中的 总 RNA 。以 oligo

基金项目 : 湖北省卫生厅科研基金资助项目 (J X1B020 ) ( d T) 18 为引物 ,用 cDNA 合成试剂盒反转录为 cD2
作者单位 : 430071 武汉大学中南医院普外科
NA 。
通讯作者 : 刘志苏
作者简介 : 王建军 ( 19692) , 男 , 硕士 , 副主任医师 , 主要 1 . 2 . 3 　V H 、
VL 基因的扩增和鉴定 　分别以 10 种
从事肝胆胰疾病的基础和临床研究 V H 和 VL 混合物为引物 ,以 cDNA 第一链为模板 ,
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加入 TaqDNA 聚合酶 , PCR 扩增全套 V H 、 VL 基

因 ,反应体积 50μl , 反应条件为 : 94 ℃, 1 min ; 55 ℃,
2 min ; 72 ℃, 2 min ; 共 30 个循环 。72 ℃延伸 10 min 。
循环结束后 ,以1 . 5 %琼脂糖凝胶回收并纯化 DNA 。
1 . 2 . 4 　ScFv 基因的扩增和鉴定 　以与 V H 基因 3′
端和 VL 基因 5′ 端序列互补的 linker Primer Mix
为引物 ,进行重叠延伸反应 ,将 V H 、 VL 随机拼接为
μ
ScFv 。反 应 体 积 50 l , 反 应 条 件 为 94 ℃, 1 min ;
63 ℃,4 min ; 共 7 个循环 。用 Sfi Ⅰ、
Not Ⅰ限制性内
切酶切割 上 述 ScFv PCR 产 物 , 与 相 应 双 酶 切 的
p CAN TAB25 E 载体片段用 T4 DNA 连接酶连接 。 图 1 　全套 VH、VL 基因的扩增

1 . 2 . 5 　ScFv 基因噬菌体呈现文库的构建 　取连接

产物转化感受态 E. coli T G1 , 于 SOBA G 琼脂板上
过夜 ,筛选出转化菌落 ,用 2 ×YT - A G 稀释培养细
菌悬 液 至 A 600 nm = 0 . 3 , 37 ℃震 荡 培 养 , 加 入
M 13 k07 ,离心后于 2 ×YT - A K 中过夜 , 离心收集
上清 ,即为抗人肝癌单链抗体库 。
1 . 2 . 6 　噬 菌 体 抗 体 库 的 筛 选 　在 上 清 中 加 入
P E G/ NaCl ,取含叠氮钠的封闭液稀释 P E G 沉淀的
重组噬菌体 ,室温下孵育 , 加入 SMMC7721 细胞抗
原包被 的锥 形培 养瓶 中 孵 育 。 PBS 、PBS T 洗 瓶 。
将对数生长期的 E. coli T G1 加入上述免疫吸附后
的培养瓶内孵育 。移至 50 ml 细菌培养管中 , 再加
入 M13 K07 ,37 ℃震荡培养 ,共 4 轮富集筛选 。
1 . 2 . 7 　噬菌体抗体库抗体特异性测定 　将富集的
重组菌涂平皿 ,从中挑选 30 株单克隆菌株 。均加入
辅助噬菌体超感染后 ,置于 2 ×YT2A G 中过夜 。接
种适量 SMMC7721 细胞于 96 孔培养板中 , 待细胞
长满孔底后 , 用 0 . 125 %戊二醛室温固定 10 min , 以
3 %BSA 封闭非特异结合部位 。每孔加上述噬菌体
抗体 50μl ,经0 . 05 % Tween202PBS 洗涤后 , 加辣根
过氧化物酶标记的抗 M13 抗体进行结合反应 ,37 ℃
温育 1 h , PBS 洗板 5 次 ,AB TS 显色 。以 M13 KO 7
为阴性对照 , 测定孔 EL ISA OD 值为阴性孔 2 ～ 3
倍者为阳性 。
2 　结果
2 . 1 　V H 、
VL 的扩增和鉴定 　扩增产物在 1 . 5 %琼
脂糖 凝 胶 中 电 泳 , 扩 增 出 的 V H 基 因 片 段 应 为
340 bp ,VL 基因片段为 325 bp ,实验结果与预期结果
相符 , 见图 1 。
2 . 2 　ScFv 基因的拼接 、
扩增和鉴定 　扩增产物在
1 . 5 %琼脂糖凝胶 中电 泳应 得到 一条约 750 bp 的
ScFv 片段 ,实验结果与预期结果相符 ,见图 2 。
2 . 3 　噬菌体抗体库的筛选 　经对噬菌体抗体库进
行 4 轮“吸附 - 洗脱 - 扩增”的富集筛选 , 测定噬菌
图 2 　ScFv 基因的扩增
体滴度 ,计算每一轮筛选后噬菌体的收获率 ,噬菌体
收获率由第 1 轮的 6 . 6 ×10 - 9 % 增到第 4 轮的 1 . 7
×10 - 6 % ,共增加了 257 倍 。
2 . 4 　Panning 筛选及抗原结合活性鉴定 　从第 4
轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选 30 个克隆 ,用
EL ISA 测定上清液中噬菌体抗体与 SMMC7721 细
胞结合活性 。加入 H2 O2 - AB TS 后 ,阳性克隆孔中
液体变为绿色 ,阴性孔中液体不变色 。显色后 ,阴性
对照孔 A 410 nm 值为0 . 09 ,有 8 株 EL ISA 的 OD 值
较高 ,呈现阳性反应 , 其 A 410 nm 值分布于 0 . 25 ～
0 . 51 之间 ,阳性克隆检出率约为 27 % 。
3 　讨论
部分单克隆抗体 , 如治疗乳腺癌的抗体 Her2
cep tin 已进入临床应用中 , 还有数种抗体也处于临
床前实验阶段 [ 5 ] 。然而 , 由于目前制备的单克隆抗
体绝大多数为鼠源性的 ,对人体有较强的免疫源性 ,
在临床治疗中易引起人抗鼠抗体 ( HAMA ) 反应 ,且
其分子量大 ,血管通透性差 ,注入人体后在肿瘤部位
的积聚量少 , 给临床应用带来了一定的困难 [ 6 ] 。而
用噬菌体抗体展示技术 , 不经免疫途径而直接从外
周血淋巴细胞中获取可变区基因 , 经 R T2PCR 扩增
出整套的 ScFv 基因片段 ,重组于噬菌体中 , 形成含
有全套抗体谱 ( repertoire ) 的噬菌体抗体库 , 再利用
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抗原 - 抗体特异性结合进行筛选 、
富集 ,并扩增所需
克隆 。将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒
颗粒内 ,在大肠杆菌中稳定高效表达 ,所获得的人源
性抗体的免疫源性明显减弱 , 使其临床应用成为可
能[ 7 ] 。
本文从肝癌患者外周血淋巴细胞中抽提 RNA ,
经 R T2PCR ,并采用噬菌体抗体库技术 ,构建了抗人
肝癌全套单链抗体基因文库 ,从 30 个克隆中筛选出
8 个具有抗原结合性的抗体片段 。属全人源性抗
体 ,避免了鼠源性抗体所需的人源化等下游工程 。
在具体的筛选过程中 , 通常采用纯化抗原包被培养
板或在肿瘤细胞表面筛选初级抗体库 。本研究中采
用 SMMC7721 细胞抗原包板 ,对抗体库进行亲和筛
选 。经过几轮吸附 —洗脱 —扩增的 Panning 过程 ,
富集到含特异性抗体片段的噬菌体 , 筛选到目的克
隆 。不仅可省去了纯化抗原的繁琐操作 , 而且有利
于保持靶抗原的天然构象 。我们认为 , 这样所获得
的抗体能确保与天然状态下的膜表面抗原结合 , 确
保了抗体今后的应用潜力 [ 8 ] 。此外 , 抗原竞争洗脱
法还避免了常用的酸洗脱法对噬菌体活性的影响 ,
有利于下一轮扩增 。用噬菌体抗体展示技术筛选到
的抗体其亲合力与抗体库容量成正相关 , 载体的转
化效率是制约抗体库容量的主要因素[ 9 ] , 为此我们
使用转化率高的电穿孔法进行转化 , 并增加转化次
数以累积库容 。
目前 , 我们已利用噬菌体表面呈现技术构建人
・7 9 ・
源肝癌单链抗体基因库 , 初步鉴定显示抗体针对肝
癌细胞株的亲和活性 ,为提高 ScFv 的稳定性 , 评价
其免疫原性等进一研究打下基础 。
参考文献 :
[ 1 ] 　吴孟超 . 原发性肝癌外科综合治疗的现状和展望 [J ] . 中华外
科杂志 , 2004 , 42 ( 1 ) : 13215 .
[ 2 ] 　Siegel 1 RW , Allen1 B , Pavlik P , et al . Mass spect ral analysis
of a p rotein co mplex using single2chain antibodies selected on a
peptide target : applications to f unctional genomics[J ] . Mol Bi2
ol , 2000 , 302 ( 2 ) : 2852293 .
[ 3 ] 　Chan KT , Cheng SCS , Xie H , et al . A humanized monoclonal
antibody const ructed f rom int ronless expression vectors target s
human hepatocellular carcinoma cell s [ J ] . Biochem Biop hys
Res Co mmun , 2001 , 284 ( 1 ) : 1572167 .
[ 4 ] 　梁国栋 . 最新分子生物学实验技术 [ M ] . 第 1 版 . 北京 : 科学出
版社 , 2001 . 84287 .
[ 5 ] 　Azemar M , Djahansouzi S , J ager E , et al . Regression of cuta2
neous t umor lesions in patient s int rat umorally injected wit h a
reco mbinant single2chain antibody2toxin targeted to ErbB2 /
H ER2 [J ] . Breast Cancer Res Treat ,2003 , 82 ( 3 ) : 1552164 .
[ 6 ] 　Scott AM , Welt S. Antibody2based immunological t herapies
[J ] . Curr Opin Immunol , 1997 , 9 ( 5 ) : 7172722 .
[ 7 ] 　Azzazy HM E , Highsmit h WE. Phage display technology : cli2
nical applications and recent innovations [ J ] . Clin Biochem ,
2002 , 35 ( 6 ) : 4252445 .
[ 8 ] 　朱建高 ,李官成 ,李跃辉 ,等 . 全人源化抗结肠癌单链抗体基因
的克隆和表达 [J ] . 生物工程学报 , 2001 ,17 ( 5 ) : 5262530 .
[ 9 ] 　Hong S H , Lee MS , Par k S , et al . A p hagemid system enab2
ling easy estimation of t he combinatorial antibody library size
[J ] . Immunol Lett , 2004 ,91 ( 223 ) : 2472253 .
[ 编辑 : 贺 　文 ]