上 海 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 )

Vol. 26 No. 2 Feb. 2006 Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science ) ・155・

【文章编号 】　0258 - 5898 ( 2006 ) 02 - 0155 - 04 ・基础研究 ・

噬菌体展示技术构建重组人 TNF2α单链抗体库
1 2 3 2
柴蔚然 , 　杨 　涛 , 　胡晓年 , 　牛 　勃
( 1上海交通大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 , 上海 　200025; 2山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 ;
3
中国协和医科大学基础研究所 )

【摘 　要 】目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子 - α ( rhTNF2α)的单链抗体库 。方法 利用噬菌体表面展示技

术、
绕过杂交瘤技术 ,提取经免疫 BALB / c 小鼠淋巴细胞总 RNA , 用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白 VH 基因和 VL 基因 , 构建
VH、VL 抗体库 。由 L inker2p rim er m ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体 。再用 RS p rim er
m ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应 , 从而获得全套抗 rhTNF2
α的单链抗体基因 。以 S fiⅠ /N otⅠ, 位点定向插入
pCANTAB 25E噬菌粒载体 ,转化大肠杆菌 TG1 后 ,经 M13KO7 辅助噬菌体拯救 ,构建成全套抗 rhTNF2
α单链抗体表面展示文库 。
结果 成功构建了 rhTNF 2α全套单链抗体噬菌体表面展示文库 。经 M13KO7 超感染后 , 噬斑计数滴度为 2. 1 ×1011 pfu。结论
rhTNF2
α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建 ,为研究 rhTNF2α抗体结合位点 ,了解其结构与功能的关系以及研究用于临
床免疫治疗的新型抗体打下了基础 。
【关键词 】肿瘤坏死因子 - α; 　单链抗体 ; 　噬菌体展示技术
【中图分类号 】 Q78 　　　　【文献标识码 】A

Con struction of Phage D isplay L ibrary of S in gle 2Cha in Fv An tibod ies Aga in st
Recom b inan t Human TNF 2 α

CHA IW e i2ran , YANG Tao , HU X ia o 2n ian , N IU Bo

1 2 3 2

1
( D epa rtm en t of B iochem istry and M olecu la r B iology, B asicM ed ica l College, S hangha i J iaotong U n iversity, S hangha i
2 3
200025, Ch ina; D epa rtm en t of B iochem istry and M olecu la r B iology, S hanx i M ed ica l U n iversity; Institu tion of B asic
M ed ica l S cience, Pek ing U n ion M ed ica l College)

Abstract: 　O b jec tive 　To construct a phage disp lay library of single 2chain antibodies against recombinant human
tumor necrosis factor 2
α ( rhTNF 2α) . 　M e thods 　B y the technique of phage disp lay, the heavy2chain and kappa
light2chain variable region genes ( VH and VL ) were assembled into single 2chain antibodies ( ScFv ) w ith overlap
extension reaction by L inker2p rim er m ix. The ScFv were cloned into pCANTAB 25 E phagem id and introduced into
E. coli TG1. The phagem id 2containing bacterial colonies were infected w ith M 13 KO 7 , then the total surface disp lay
library of anti2rhTNF 2
α was established. 　R esu lts 　The phage antibody library was constructed. The titre of p laque
was 2. 1 ×10 pfu after superinfection w ith M 13 KO 7. 　C onc lus ion 　ScFv fusion p rotein was disp layed on the sur2
11

face of recombinant phage successfully. It is the basis of studying the recep tor binding site of rhTNF 2
α and the rela2
tionship betw een its structure and function as well as the neutralization characteristic of monoclonal antibody.
Key words: 　 tumor necrosis factor 2α; 　 single 2chain antibody; 　phage disp lay technique

　　肿瘤坏死因子 - α ( tumor necrosis factor2α, TNF 2 TNF 2

α介导的 。由于 TNF 2α大量释放而致的炎症 、
α)是机体内主要的炎症因子之一 , 在机体的多种病 损伤 、
感染性休克等 ,往往症状凶险 , 难以治疗 , 典型
[1]
理生理过程中起着非常重要的作用 。许多实验表 的例子是恶病质 、
败血症休克和炎症性肠病
[2]
。而
明 ,内毒素对机体的多种病理和生理作用 ,主要是由 且在艾滋病
[3]
、
移植物抗宿主病
[4]
、
脑型疟疾
[5]
、
类
[6]
【作者简介 】
柴蔚然 ( 1973 - ) ,女 ,河北任丘人 ,博士生 风湿性关节炎 、
再生障碍性贫血 、
骨髓增生异常综
 ・156・ 上海 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) Vol. 26

合征等疾病的发生和发展中也起着重要作用 。应用 点 。限制性核酸内切酶 、DL 2000 DNA M arker ( TaKa2

抗 TNF 2α抗体中和 TNF 2α的生物学活性 , 已成为治
-
Ra ) , SuperScrip tTM ⅡRnase H Reverse Transcrip tase
[7]
疗和改善这类疾病的主要策略之一 。 ( Invitrogen ) , T4 连接酶 ( Promega ) 。
动物血清和动物来源的单克隆抗体在临床应用 动物免疫及脾细胞总 RNA 提取 　rhTNF2α 200 μL
上有明显的局限性 。基因工程抗体技术将抗体基因 ( 50 μg) 与等体积福氏完全佐剂乳化后 , 初次免疫
置于人工操纵范围之内 ,抗体分子的大小 、
亲和力的 6～8周龄的雌性 BALB / c小鼠 。 15 d 后用等量抗原
高低 、
细胞毒性的强弱均可根据所制备的生物制剂 与福氏 不 完 全 佐 剂 乳 化 , 腹 腔 注 射 , 再 过 15 d 以
的需求进行设计和操作 , 这是杂交瘤技术所不能实 rhTNF2
α不加佐剂腹腔注射 。 1 周后取小鼠血清以常
现的 。单链抗体 ( single chain Fv, ScFv) 因其分子量 规酶联免疫吸附法检测抗体滴度 。滴度达 1 ∶
10 000
小、
穿透力强 、
免疫源性低 、
易于大量生产等优点 , 得 后 ,进行第 4 次免疫 , 400 μL /只 ,不加佐剂腹腔注射 。
到了较为广泛的应用 。 1 周后再次免疫 ,剂量同前 ,连续 3 d。取上述免疫效
本研究利用以分子生物学技术为基础的噬菌体表 果最好的一只小鼠断颈处死 , 无菌摘取脾脏 , 按照
面展示技术 , 构建了全套抗重组人肿瘤坏死因子 α TR Izol试剂说明书提取脾细胞总 RNA。
( rhTNF2
α) ScFv噬菌体表面展示文库 。该文库为利 cD NA 的合成和全套 VH、VL 基因的扩增 　于
用亲和富集筛选技术 ,获得具有结合活性的完整重组 一个无菌 Eppendorf 管中加入下列试剂 : O ligo ( dT )
噬菌粒克隆奠定了基础 ,也为基因工程抗体的进一步 12 - 18 ( 500 μg /mL ) 1 μL、
总 RNA 2 μL、10 mmol/L
研究及抗原 - 抗体相互作用机制的阐明打下了基础。 的 dNTP混合液 ( 10 mmol/L 的 dATP、dGTP、dCTP 和
dTTP溶解在中性溶液中 ) 1 μL、
无菌去离子水 8 μL ,
材料与方法 总体积为 12 μL。加热混合物 , 65 ℃ 5 m in, 然后立
即置于冰上 。短暂离心 。加入下列试剂 : 5 ×First2
质粒 　噬菌粒载体 pCANTAB 25 E,其中含有氨苄 Strand 缓 冲 液 4 μL、0. 1 mol/L DTT 2 μL、 RNase2
r
抗性基因 (Amp ) 、p lac 启动子 、
M 13 噬菌体间隔区片 OUT Recombinant R ibonuclease Inhibitor ( 40 U /μL )
TM

段 ,还含有用于克隆 ScFv基因的 S fiⅠ、N otⅠ克隆位 1 μL , 轻 柔 混 匀 , 42 ℃孵 育 2 m in。加 入 Super2

点和 E 2tag 序列及琥珀终止码 TAG。M 13 KO 7 辅助 Scrip tTM Ⅱ1 μL ( 200 U ) , 用移液器轻柔上下混匀 。
噬菌体 ,带有突变型基因 Ⅱ、
质粒复制起点和卡那霉 42 ℃ 50 m in, 70 ℃ 15 m in, 终止反应 。以逆转录合
素抗性基因 ( Kan ) , 在其辅助下可使 pCANTAB 25 E
t
成的 cDNA 第一条链为模板 , 按以下体系进行 VH、
产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒 。两者均为 VL 基因的扩增。全套 VH 基因的扩增 : cDNA 5 μL ,
Amersham 公司产品 。 Heavy p rim er 12 μL , Heavy p rim er 22 μL , 10 mmol/L
菌株和试剂 　菌株 TG1 (Amersham ) , rhTNF 2α (海 dNTP混合液 (每种核苷酸均为 2. 5 mmol/L ) 8 μL ,
军总 医 院 ) 。Mouse ScFv Module /Recombinant Phage M gC l2 8 μL , 10 ×
聚合酶链反应 ( PCR )缓冲液 10 μL ,
Antibody System ( Amersham ) , 其 中 Heavy p rim er 1、 无菌双蒸水 59 μL , 95 ℃ 5 m in。加入 Ex Taq DNA 聚
Heavy p rim er 2 分别为 VH 基因 5 ’
端和 3 ’
端引物 ,用 合酶 1 μL。全套 VL 基因的扩增 : 除用 L ight p rim er
来扩增鼠免疫球蛋白 VH 基因 ; L ight p rim er m ix为 10 m ix代替上述引物外 ,其他成分均相同 。 PCR 反应参
种 VL 基因 5 ’
端和 3 ’
端引物的混合物 , 用来扩增鼠 数为 : 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 30 个循
免疫球蛋白 VL 基因 ; L inker2p rim er m ix为含有两条 环 , 72 ℃ 10 m in, 1. 5 % 琼脂糖凝胶电泳 , 用 M icro2
互补、
各有 93 个碱基序列、
带有 L inker序列 ( GGGGS) 3 Sp in Columns回收目的基因片段 。
的 VH 基因 3 ’
端和 VL 基因 5 ’
端引物的混合物 , 该 全套 VH、VL 基因的随机拼接 　此步骤的关键
引物两端的各 24 个碱基分别与 VH 和 VL 基因的 3 ’ 是 VH、
VL 基因等体积加入 。 VH、VL 基因片段经定
端和 5 ’
端相互补 ,从而可将 VH 和 VL 基因片段拼接 量后 ,与 L inker p rim er m ix以相同或近等摩尔浓度混
成 ScFv基因 ; RS p rim er m ix为带有 S fiⅠ位点的重链 合 ,按下列体系进行连接反应 : VH、VL 基因纯化产物
基因 5 ’
端引物和带有 N otⅠ位点的轻链 3 ’
端引物的 2 μL ( 50 ng ) , L inker p rim er m ix 4 μL , 10 mmol/L
混合物 ,用来扩增 ScFv 基因片段 , 同时引入克隆位 dNTP混合液 (每种核苷酸均为 2. 5 mmol/L ) 5 μL ,
No. 2 柴蔚然 ,等 : 噬菌体展示技术构建重组人 TNF2α单链抗体库 ・157・

M gCl2 5 μL , 10 ×PCR 缓冲液 5 μL , Ex Taq DNA 聚 增出的 VH 和 VL 基因片段约为 340 bp 和 325 bp ,

合酶 1 μL , 无菌双蒸水 26 μL。 PCR 反应参数为 : VH 略大于 VL (图 1 ) ,与预期的片段大小相符 。
94 ℃ 1 m in, 63 ℃ 4 m in, 7 个循环 ,从而将全套 VH、
VL 基因随机拼接成 ScFv。
全套 ScFv 基因的第二次 PCR 扩增 　试剂包
括 Ex Taq DNA聚合酶 1 μL , 10 ×PCR 缓冲液 5 μL ,
10 mmol/L dNTP混合液 (每种核苷酸为 2. 5 mmol/L )
2 μL , RS p rim er m ix 4 μL ,无菌双蒸水 38 μL。将其加
入到 7 个循环后的 PCR 管内 ,继续扩增。 PCR 反应参
数为 : 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 30 个循环 图 1 　VH 和 VL PCR产物在 1. 5%琼脂糖凝胶上的电泳图
后 , 72 ℃ 10 m in。 F ig 1 　PCR products of VH and VL genes ana lyzed by electrophore2

全套 ScFv 基因的克隆 　将第二次 PCR 扩增产 sis on 1. 5% agarose gel

物加 到 含 有 Sephacryl S2400 HR 树 脂 的 M icroSp in

Columns中进行回收 。回收产物经 S fi Ⅰ、N ot Ⅰ双酶
切后 ,再用同样的方法进行回收 。经定量分析后 , 将
其与 pCANTAB 25 E 载体在 T4 连接酶作用下进行连
接 ,同 时 做 载 体 自 连 和 阳 性 插 入 。氯 化 钙 法 制 备
E. coli TG1感 受 态 细 胞 , 取 2 μL 连 接 产 物 加 入 到
100 μL感受态菌液中进行转化 。取转化产物 200 μL
涂于 SOB 2AG琼脂板上 , 37 ℃过夜培养 。
噬菌体表面展示文库的构建及初步鉴定 　将过夜
培养的 SOB 2AG琼脂板上长出的单菌落全部刮下来 ,
提取质粒进行酶切鉴定后 ,取部分菌液加入 2 ×YTAG
(含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 2 %葡萄糖 ) 20 mL ,
30 ℃培养 2～2. 5 h,至 D600 = 0. 5 ,使细胞处于对数生
长期 ,得以表达 F 性鞭毛 。加入 2 ×10 M 13 KO 7 ,
10
1 , 2 : VL gene fragment; 3 , 4 : VH gene fragment; 5 : DL 2000 marker
( 100 , 250 , 500 , 750 , 1 000 and 2 000 )
全套 ScFv 基因的拼接和 PCR 扩增 　将纯化回
收后的 VH、
VL 基因片段 , 经过定量后与等摩尔浓度
的 L inker2p rim er 混合 。随机连接成 VH 2L inker2VL。
以此为模板 ,再以带有 S fiⅠ位点的 VH 基因的 5 ’
端
引物和带有 N otⅠ位点的 VL 基因的 3 ’
端引物 ,进行
第二次 PCR 扩增 , 从而获得全套 ScFv基因 , 并引入
了 S fiⅠ、N otⅠ位点 , 用于在 pCANTAB 25 E 中进行克
隆 。电泳结果显示 ,扩增产物约为 750 bp (图 2 ) 。

37 ℃ 60 m in。 4 000 ×g 离心 10 m in, 重悬沉淀于

2 ×YTAK (含 100 μg /mL 氨苄青霉素和 50 μg /mL 卡
那霉素 ) 200 mL,置于 500 mL 三角瓶中 , 30 ℃过夜振
荡培养。加入 1 / 5 体积量 20 % PEG8000、2. 5 mol/L 图 2 　ScFv PCR产物在 1. 5%琼脂糖凝胶上的电泳图

NaCl, 4 ℃ 30 m in, 9 000 ×g 20 m in,最后用 2 mL PBS F ig 2 　 ScFv PCR products ana lyzed by electrophoresis on 1. 5%
agarose gel
重悬沉淀 , 建立单链噬菌体抗体库。将所得文库做
- 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12
1: DL2000 marker( 100 , 250 , 500 , 750 , 1 000 and 2 000) ; 2: DNA of ScFv
10 、10 、10 、10 、10 、10 梯度稀释 ,进行噬菌
斑培养实验 ,观察噬菌斑生长情况以估算 ScFv基因噬 全套 ScFv 基因文库的构建和鉴定 　纯化后的
菌体表面展示文库的滴度。 ScFv基因克隆入 pCANTAB 25 E 载体 (图 3 ) 中 。以全
部连接产物转化 E. coli TG1 ,在载体自连对照和无连
结 　　果 接产物转化菌的平皿上 ,均无单菌落生成 ,而在阳性
插入对照和连接产物转化菌平皿上 , 均见大量单个
全套 VH、VL 基因片段的扩增和鉴定 　以逆转 菌落形成 。刮下平皿上所有单菌落 , 以 S fi Ⅰ、N ot Ⅰ
录合成的 cDNA 为模板 ,利用鼠抗体可变区基因骨架 双酶切鉴定 ,切出了约 750 bp 的条带 (图 4 ) ,与预测
区的特异性简并引物 ,经 PCR 扩增 ,得到了全套抗体 结果一致 , 表明克隆基本成功 。文库经过 M 13 KO 7
11
VH和 VL基 因 。
经 1. 5 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 , 扩 超感染后 ,经噬斑计数 ,滴度为 2. 1 ×10 pfu。
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或组合抗体库 , 从中筛选得到的抗体称为噬菌体抗
体 。这一技术将表型 (与抗原特异结合 ) 和基因型
(含有片段抗体基因 ) 联系起来 , 使识别抗原的能力
与进行再扩增的能力结合在一起 , 可以模拟生物体
内 B 细胞的识别与扩增统一的特性 , 因而是一种极
[8 - 9]
为高效的表达 、筛选抗体的体系 。噬菌体抗体库
技术的出现及噬菌体抗体的研制成功已成为生命科
学研究的突破性进展之一 , 对生物技术的发展有巨
大推动作用 。
TNF 2
α是重要的炎症介质 , 大量医学实验证明
TNF 2
α水平的升高与许多病理过程有关 。由于 TNF 2
α的过量表达所导致的疾病 ,在临床上危害极大 。具
有中和活性的抗体由于其高效性 、 准确性 、
特异性等
图 3 　pCANTAB 25E载体示意图
F ig 3 　D ia gram of pCANTAB 25E vector 优点 ,成为目前的研究热点 。我们利用噬菌体表面
展示技术 , 从 rhTNF 2α免疫的小鼠脾脏 mRNA 中获
得了小鼠单链可变区抗体的重组噬菌体抗体库 。本
文库的构建对进一步筛选具有中和活性的抗人 TNF 2
α ScFv奠定了基础 。为了开展进一步实验和临床应
用 ,所得噬菌体 ScFv需经基因序列分析 、 动物实验以
及制备分泌型抗人 TNF 2α的 ScFv, 这些工作正在进
行中 。

图 4 　ScFv 重组噬菌粒克隆的酶切鉴定 【参考文献 】

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获得特异性抗体 。所构建的抗体库称为全套抗体库 【收稿日期 】2005 - 01 - 21 【本文编辑 】
吴 　洋