Encimi

Splone lastnosti Osnove delovanja, specifinost, encimska aktivnost Encimska kinetika Vesubstratne encimske reakcije Kofaktorji, koencimi in prostetine skupine Mehanizmi encimske katalize Encimska inhibicija Uravnavanje biokemijskih reakcij Klasifikacija encimov Encimi v medicinski diagnostiki

Splone lastnosti
Encimi so visokospecializirani proteini (in RNA) - velika katalitina mo - velika specifinost Encimi biokatalizatorji omogoajo reakcije v blagih razmerah temperatura, pH, tlak) - primer razgradnja saharoze, vaje (1,5 in 2,5 M HCl) Delujejo organizirano katalizirajo reakcijska zaporedja po stopnjah: razgradnja hranilnih molekul in shranjevanje/ transformacija energije biosinteze makromolekul, transmembranski transport, gibanje ... Bolezenske spremembe - spremenjena encimska aktivnost (zniana, zviana) diagnostika, terapija Uporaba encimov: v medicini, v farmacevtski in ivilski industriji, v agronomiji...

Reakcije vseh metabolinih poti katalizirajo encimi

Zgodovina
V 18. stoletju raziskave razgradnje mesa z izloki elodca V 19. stoletju razgradnja sladkorja s slino in rastlinskimi izvleki 1850 Luis Pasteur: kvasovke fermentirajo sladkor alkohol: fermenti v ivih celicah (vitalizem) 1897 Eduard Buchner: izvleki iz kvasovk fermentirajo sladkor aklohol: aktivne molekule - encimi 1926 James Sumner: encim ureaza je protein 1930 J.B.S. Haldane: katalitino mo encimov pogojujejo ibke interakcije med encimom in substratom

Kako encimi delujejo?

nekatalizirana kemijska reakcija

Substrat, vezan na aktivno mesto encima

S P
substrat produkt

encimsko katalizirana kemijska reakcija

E + S ES EP E + P
E encim S substrat, P produkt ES kompleks encim-substrat EP kompleks encim-produkt
POZOR, to nista aktivirana kompleksa!

Encim predstavlja za molekule, ki reagirajo /substrate/, specifino okolje, reakcija potee na aktivnem mestu encima

Reakcijski koordinatni diagram kemijske reakcije

nekatalizirana reakcija

Ravnotena konstanta Kravn (Keq) in sprememba standardne proste energije Go

Encim je katalizator, zato ne spreminja ravnoteja reakcije! Reakcija, ki spontano ne poteka od reaktantov do produktov, tudi v prisotnosti encima ne bo potekala v to smer. V prisotnosti encima ne moremo dobiti ni ve produktov kot jih lahko dobimo brez encima. SPREMENI SE SAMO HITROST!

S P

nekatalizirana reakcija in katalizirana reakcija

S P

E + S ES EP E + P

G0 sprememba standardne proste energije pri prehodu SP G# SP energijska bariera za prehod S # (prehodno stanje) G# PS energijska bariera za prehod P # (prehodno stanje)

nekatalizirana = katalizator ne vpliva na reakcijsko ravnoteje ES, EP intermediata katalizirane reakcije G#cat energijska bariera katalizirane reakcije

G0

G0katalizirana

8,3 J/molK

SP

Go = - RT ln K
298 K

Hitrost (v) reakcije S P doloa hitrostna konstanta k, to pa G

v = k [S] v = k [S1] [S2] k reakcija S P k reakcija S1 + S2 P

Primerjava nekatalizirane in katalizirane reakcije

Nekatalizirana reakcija SP Ravnoteje S Veja aktivacijska energija Manja reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko prehodnega stanja
K= P

Katalizirana z encimom E + S ES EP E + P
K= Ravnoteje S Manja aktivacijska energija Veja reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko drugih reakcijskih intermediatov in prehodnih stanj P

k Boltzmannova konstanta (n.R/NA; n = t. molov, R = plinska konstanta, NA = Avogadrova konstanta) h Planckova konstanta G aktivacijska energija (aktivacijska prosta entalpija) R, T konstanti

Aktivacijska energija G# doloa hitrost reakcije Katalizatorji pospeijo hitrost reakcije (zniajo aktivacijsko energijo), ne spremenijo pa ravnoteja reakcije!

SP E + S ES EP E + P

SP E + S ES ES1 ES2 EP E + P
- e je reakcija sestavljena iz zaporedja ve reakcij, hitrost celotne reakcije doloa najpoasneja stopnja (najveja aktivacijska energija) rate limiting step - energijske bariere so kljunega pomena za ivljenje e jih ne bi bilo, bi se makromolekule spontano razgrajevale v osnovne gradnike ... - med evolucijo (zelo dolg as!) so se razvili encimi, ki selektivno zniujejo aktivacijsko bariero

Go = Go = - RT ln K

G# < G#

v>v

Zvianje reakcijske hitrosti z encimi katalitina mo encimov

K energijski barieri G# prispeva:

Zmanjanje entropije - manja svoboda gibanja dveh molekul v raztopini Hidratacijski pla vode obdaja biomolekule in jih stabilizira Deformiranje (prelom) substrata v reakciji Potreba po pravilnem prileganju katalitinih funkcionalnih skupin encima s substratom Od kod energija za znianje energijske bariere?

ES - komplementarnost substrata z vezavnim mestom na encimu

Zgodovina: Emil Fischer 1894 E vs. S - klju v kljuavnico Inducirano prilagajanje encima substratu in substrata encimu Encim je komplementaren reakcijskemu prehodnemu stanju Aktivacijska energija se znia zaradi sproene vezavne energije ob nastanku ibkih interakcij med encimom in substratom

Model mehanizma hipotetine reakcije razcepa substrata: A, klju (substrat) v kljuavnico (encim) B, encim je komplementaren reakcijskemu
prehodnemu stanju

A
Prileganje substrata in encima

B
Inducirano prilagajanje encima substratu in substrata encimu

Imaginarni encim, ki katalizira prelom kovinske palice

S S P

Od kod katalitina mo?

nastanek kompleksa ES
Prerazporeditev kovalentnih vezi med encimom in substratom kemijske reakcije med funkcionalnimi skupinami aktivnega mesta encima (-R ak, ioni, koencimi) in substratom Prehodne kovalentne vezi aktivirajo substrat za reakcijo, zniajo aktivacijsko bariero nizkoenergijska pot preko intermediatov ibke interakcije med encimom in substratom (ES) vezavna energija GV (angl. GB) znia aktivacijsko bariero nizkoenergijska pot preko intermediatov ibke interakcije prispevajo h katalizi in k specifinosti; pomen velikosti molekule encima ibke interakcije so maksimalne v reakcijskem prehodnem stanju (aktivno mesta encima komplementarno prehodnemu stanju substrata)

Vezavna energija prispeva h katalizi in k specifinosti

ibke interakcije 4-30 kJ/mol Znianje G# za 60-100 kJ/mol Iste interakcije prispevajo k specifinosti maksimalno t. interakcij med encimon in substratom v prehodnem stanju (intermediatom). Skupine na encimu ustrezajo skupinam na substratu specifinost!

Specifinost zagotavlja ujemanje (komplementarnost) povrin substrata in encima

Peptidaza prime substrat (dipeptid) z najmanj tremi ibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je peptidna vez e natrgana (prehodno stanje!)
ENCIM VODA (S2)

Encimska kinetika
Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti v produkte SP Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v asovni enoti (mol/s) v = -d(S)/dt = d(P)/dt Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za aktivnost: U = 1mol/min ali katal (kat) = 1mol/s Specifina aktivnost encimskega pripravka: hitrost na t. encimskih enot/mg proteina, npr. mol/min/mg

SUBSTRAT (S1)

S1

S2

P1

P2

Koncentracija substrata vpliva na zaetno hitrost encimske reakcije

ODVISNOST ZAETNE HITROSTI (v0) OD KONCENTRACIJE SUBSTRATA [S].

SP
v = (P)/t
koncentracija substrata se s asom spreminja zaetna hitrost (vo) je hitrost v asu t = 0 in je karakteristina za reakcijo

S4 > S3 > S2 > S1

Vpliv koncentracije substrata zaetno hitrost encimske reakcije

Michaelis-Mentenova kinetika
S P

maksimalna hitrost Vmax

Kljunega pomena za encimsko katalizo je nastanek kompleksa ES L. Michaelis in M. Menten 1912

hitra reverzibilna stopnja

v0 = k2.[ES]
poasna reverzibilna stopnja, razpad ES doloa hitrost celotne reakcije Z veanjem koncentracije S se vse ve encima nahaja v obliki kompleksa ES, encim postaja nasien s substratom, zato saturacijska kinetika! Michaelisova konstanta Km (ES) je konstantna po asu, stacionarno stanje steady state

Spremembe koncentracije [S], [P], [E], [ES] s asom

Saturacijska kinetika (hidroliza ecetilholina)

K=

P S

v0 = k2.[ES]

Odvisnost zaetne hitrosti v0 od koncentracije substrata S (v0=k.[S]n)

Vpliv koncentracije substrata zaetno hitrost encimske reakcije

V0=k[S]1 1. red reakcije V0=k[S]0 0. red reakcije

Opis krivulje podaja Michaelis-Mentenova enaba

Predpostavke pri izpeljavi in namen - V zaetku je koncentracija P zanemarljivo majhna, ni reakcije P S (k-2 = 0) - Razgradnja ES doloa hitrost celotne reakcije v0 = k2[ES] - Teko je izmeriti [ES] (v0 = k2([ES])), zato doloimo Km in Vmax , s katerima okarakteriziramo encimsko aktivnost

v0 = k2.[ES]
hitrost nastanka ES = hitrost razpada ES =
V stacionarnem stanju sta ti dve hitrosti enaki!

Km

Michaelisova konstanta Km

Michaelis-Mentenova enaba

Odvisnost zaetne hitrosti od koncentracije substrata grafina doloitev konstant Km in Vmax

Transformacija Michaelisove enabe v dvojno reciprono enabo (Lineweaver-Burk)

[S] << Km

Izraanje in primerjava katalitine uinkovitosti razlinih encimov

Km kcat kcat/Km

Dvojni reciproni diagram, 1/V0 vs.1/[S], uporaben za doloitev Vmax in Km

Izraanje in primerjava katalitine uinkovitosti razlinih encimov, Km

Vrednosti Km nekaterih encimov in substratov

Vmax , Km eksperimentalno doloimo

e merimo vo !

VELJA: - velika Km - majhna Km

= Kd

majhna afiniteta encima do substrata velika afiniteta encima do substrata

Km - odraa afiniteto encima do substrata

- odraa fizioloke razmere - za mnoge encime valja: Km [S]fiziol.

primer: obutljivost Azijcev na alkohol Japonci in Kitajci doseejo isti uinek alkohola (vazodilatacija, pospeen ritem srca...) e pri niji koncentraciji zauitega alkohola kot Evropejci Reakcije razgradnje alkohola CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + H+ + NADH alkoholna dehidrogenaza CH3CHO + NAD+ CH3COOH + H+ + NADH aldehidna dehidrogenaza Azijci imajo aldehidno dehidrogenazo z vijim Km (aldehid v krvi dolgo kroi po telesu); izoencim! Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), razline pa so molekulske lastnosti encimov: razlina encimska aktivnost (kkat in Km), razlina molekulska masa (Mr). Genski zapis je drugaen, zato druga sekvenca!

Pomen Km v fiziologiji

Izraanje in primerjava katalitine uinkovitosti razlinih encimov, kkat

Vmax = k2.[E]t Vmax = kkat.[E]t ; v 0 = k kat [ES ]

kkat = k najpoasneje stopnje! (v smeri, ki daje produkt!) kkat - pretvorbeno tevilo: t. molekul substrata,
ki se pretvori v produkt na eni molekuli encima v enoti asa (encim je nasien s substratom)

Kinetina uinkovitost encimov: pretvorbeno tevilo (turnover number), kkat

Najbolji nain za izraanje encimske aktivnosti: kkat/Km

Slabost izraanje encimske uinkovitosti s Km ali kkat: ni upotevana neencimska reakcija, ni informacije za koliko encim pospei reakcijo

Alosterini proteini (encimi)

Alosterini proteini (encimi) sestojijo iz ve podenot (multimerni proteini) in imajo ve vezavnih mest (za substrat in/ali modulator) Alosterini proteini (podenote) zavzamejo razline konformacije Konformacijsko spremembo (prehod v manj ali bolj aktivno obliko) povzroi modulator (ligand, pri encimih tudi S) Modulatorji so ali inhibitorji ali aktivatorji e je normalni ligand obenem modulator homotropina modulacija (O2 na Hb, substrat pri encimu) ; e je modulator druga molekula heterotropina modulacija Mnogi alosterini proteini imajo ve modulatorjev obenem gre za heterotropine in homotropine modulatorje Vezava liganda na multimerni protein (O2 na Hb, S na encimu) je kooperativna vezava vezava enega liganda vpliva na afiniteto drugih vezavnih mest (O2 je ligand in pozitivni homotropini aktivator Hb, S deluje enako pri alosterinem encimu) Za kooperativno vezavo je znailna sigmoidna krivulja Sigmoidna krivulja omogoa obutjiv odgovor na majhne spremembe koncentracije liganda v okolju

Hb
(2D5Z.pdb)

Prehod Hb iz T (deoksi) v R (oksi) konformacijo vezava O2

2 modela za pretvorbo neaktivne v aktivno obliko proteina po kooperativni vezavi liganda; pri encimih je ligand kar S (L = S)

konformacija T

konformacija R

(a) Usklajen model: vse podenote so v isti konformaciji, bodisi bodisi (b) Skupni model: vsaka podenota je lahko ali v eni ali v drugi konformaciji,

ali

Saturacijske krivulje Mb in Hb

Kinetika alosterinih encimov analogija s Hb

sigmoidna krivulja alosterini encim (ve soodvisnih aktivnih mest)
hiperbolina krivuljaMichaelis-Mentenov encim (eno samo aktivno mesto ali ve neodvisnih mest)

homotropina alosterija!

Vezava O2 na Mb in Hb

Vezava O2 na R, T in naravni Hb

v0 = k kat [ES ]

[ES ] = Y [E ]t

Y =

K ' [S ] 1 + K ' [S

]n

Dve vrsti modulatorjev alosterinih encimov

heterotropina alosterija!

Bi(ve)substratne reakcije
(velikanska veina je takih!)

S1 + S2 P1 + P2
Primer: prenos funkcionalne skupine (fosforilne, amino...) z enega substrata na drug substrat

ATP + D-glukoza ADP + D-glukoza-6-fosfat

modulatorji vplivajo na Km modulatorji vplivajo na Vmax

ATP + D-fruktoza ADP + D-fruktoza-6-fosfat ak1 + ketokislina2 ak2 + ketokoslina1

Transaminacija: encim transaminaza Prenos fosforilne skupine z enega na drug substrat S1 + S2 P1 + P2 ATP + D-glukoza ADP + D-glukoza-6-fosfat ATP + D-fruktoza ADP + D-fruktoza-6-fosfat
Glutamat/piruvat transaminaza (GPT) Glutamat/oksaloacetat transaminaza (GOT)

(koencim piridoksalfosfat)

-R = -CH3

-R , -CH2-COOH

Primer: Prenos NH2 skupine z enega na drug substrat

Proces: TRANSAMINACIJA Koencim: piridiksal-fosfat Encimi: TRANSAMINAZE

Mehanizem encimsko kataliziranih bisubstratnih reakcij

Encimske reakcije, ki vkljuujejo ternarni kompleks

Encimske reakcije, pri katerih ne nastaja ternarni kompleks (ping-pong mehanizem)

H2N-

+ O=

H2N-

+ O=

Kako ugotoviti mehanizem bisubstratnih reakcij? Kinetina analiza bisubstratnih reakcij

(dvojni reciproni diagram)

Na encimsko aktivnost vplivajo zunanje razmere

Vmax , Km eksperimentalno doloimo Vmax , Km karakteristini za encim Vmax , Km spreminjata se z zunanjimi razmerami: - pH - temperatura - ionska mo

potek reakcije preko ternarnega komleksa

ping-pong mehanizem

Vpliv pH na encimsko aktivnost (v0)

Peptidaza prime substrat (dipeptid) z najmanj tremi ibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je peptidna vez e natrgana (prehodno stanje!)

pepsin

glukoza-6-fosfataza

kumulativni vpliv

Vpliv pH na encime je navadno kompleksen primer kimotripsin

Vpliv pH in temperature na encimsko aktivnost (V)

vpliv na kkat

vpliv na afiniteto E do S (KM)

10

POSPEITEV REAKCIJE LE ZARADI PRIBLIANJA IN ORIENTACIJE

Mehanizmi encimske katalize

Kompleks ES stabilizirajo ibke interakcije Sledi razcep ES in nastanek vezi po razlinih mehanizmih, ki vkljuujejo prehodni nastanek kovalentnih vezi - priblianje in orientacija (praktino vedno!) - splona in specifina kislinsko-bazna kataliza - kovalentna kataliza - kataliza s kovinskimi ioni

Mehanizem encimskih reakcij:

Specifina/splona kislinsko-bazna kataliza
primer: razcep amida

Kislinsko-bazna kataliza:
Specifina - proton donor in proton akceptor je molekula H2O Splona - proton donor in proton akceptor je druga molekula (ibke organske kisline in ibke baze) Veina encimskih reakcij poteka po mehanizmu splone kislinsko-bazne katalize Aktivna mesta encimov vsebujejo aminokislinske ostanke, ki so ibke kisline in ibke baze Poveanje hitrosti reakcije za 100 100.000 krat

ne en cim re sk ak a cij a

encim

Specifina!!!

Splona!!!

Encim: -OH, B in AH !

Aminokislinski ostanki, ki lahko sodelujejo v sploni kislinsko-bazni katalizi

pK vrednosti ak, ki sodelujejo v sploni kislinsko bazni katalizi (pozor: vrednost pKR se lahko zelo
spremeni, ko je AK vpeta v polipeptidno verigo ZARADI BLIINE DRUGIH SKUPIN INDUKTIVNI EFEKT) aminokislina pK1 pK2 pKR

His Glu Lys Cys Tyr

1,82 2,19 2,18 1,96 2,20

9,17 9,67 8,95 10,28 9,11

6,00 4,25 10,53 8,18 10,07

11

Kovalentna kataliza
Med encimom in substratom nastane prehodna kovalentna vez Primer: hidroliza vezi med A in B

Primer kovalentne in kislinsko-bazne katalize: razcep peptidne vezi

1. stopnja: kovalentna kataliza 2. stopnja: kislinsko-bazna kataliza

Katalizator: encim z nukleofilno skupino X: se prehodno kovalentno vee na substrat

H2O H+

Reakcija je hitreja, e ta pot poteka preko nije energijske bariere kot nekatalizirana reakcija R2NH2 R1COOH

katalitina kaskada pri tripsinu (analogno je pri kimotripsinu)

-OH skupina Ser postane veliko reaktivneja zaradi bliine in orientacije His in Asp (induktivni efekt!)

Kataliza s kovinskimi ioni

Kovinski ioni so ali trdno vezani na encim ali prihajajo iz okolja Ionske in/ali koordinativne vezi med ionom in substratom orientirajo substrat v poloaj za reakcijo in stabilizirajo prehodno stanje Lahko pride do izmenjave elektronov med kovinskim ionom in substratom (oksidoredukcijska reakcija) Priblino ena tretjina encimov potrebuje kovinski ion za svojo aktivnost Primer: metaloproteinaze

Encimi, kofaktorji, koencimi, prostetine skupine

Encimi (biokatalizatorji) Mr od 12 000 do 106 Za aktivnost encima pomembna 3D struktura (primarna, sekundarna, terciarna, kvartarna) encimi - proteini (sestavljeni samo iz polipeptidne verige) katalitska funkcija - proteini + kofaktorji (ioni) katalitska funkcija - proteini + koencimi (kompleksne organske molekule) katalitska funkcija koencim ni stalno vezan na proteinski del prostetina skupina = koencim, trdno vezan na proteinski del molekule
HOLOENCIM = APOENCIM + PROSTETINA SKUPINA encim proteinski del neproteinski del molekule

Anorganski elementi (ioni) kofaktorji encimov

12

KOENCIMI IN PROSTETINE SKUPINE

PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM ALI PROSTETINA SKUPINA

Modulatorji encimske aktivnosti

Aktivatorji encimska aktivnost Inhibitorji ecimska aktivnost - reverzibilna inhibicija - kompetitivna - akompetitivna - meana (npr. nekompetitivna) - ireverzibilna inhibicija

tiamin (vitamin B1) riboflavin (vitamin B2) nikotinska kislina (niacin) pantotenska kislina in druge molekule piridoksin (vitamin B6) vitamin B12 biotin folna kislina

aldehidna skupina elektroni in protoni hidridni ion (H-)

tiamin pirofosfat FMN, FAD NAD

acilne skupine

koencim A

amino skupine H-atomi in alkilne skupine CO2 (-COOH) skupine z enim C-atomom

piridoksal fosfat (ciano)kobalamin biocitin tetrahidrofolna kislina

lipojska kislina

elektroni in acilne skupine

lipojska kislina

Kompetitivna inhibicija

Reverzibilna inhibicija

Encimska inhibicija - uporaba

Inhibitorji encimov najpomembneje farmacevtske uinkovine (npr. aspirin inhibira sintezo prostaglandinov) Uporaba inhibitorjev pri tudiju mehanizma encimskih reakcij Uporaba inhibitorjev pri tudiju metabolinih poti A B? C D
Inhibitor encima E2, kopienje vmesnega produkta B, Sklepamo lahko, da poteka zaporedje reakcij preko B in E2
E1 E2 E3

Akompetitivna inhibicija

Meana inhibicija

Kompetitivna inhibicija

Kompetitivna inhibicija
brez inhibitorja z inhibitorjem Vmax se ne spremeni

Km se povea (zmanja se afiniteta za S)

S in I sta si podobna in se veeta na isto mesto, a nikoli soasno!

13

Kompetitivna inhibicija (spremenjena Km)

dvojni reciproni diagram

Akompetitivna inhibicija (spremenjena Km in Vmax)

dvojni reciproni diagram

-1/Km

Meana inhibicija (spremenjena Km in Vmax)

dvojni reciproni diagram

Poseben primer meane kompeticije: nekompetitivna inhibicija (spremenjena Vmax, Km pa ne!)

dvojni reciproni diagram

Ki = Ki X X =

Ki = Ki

DIAGNOSTINI DIAGRAMI ZA RAZLINE VRSTE INHIBICIJE

Kompetitivna inhibicija Nekompetitivna inhibicija

Ireverzibilna inhibicija inhibitor se ireverzibilno

vee v aktivnem mestu encima
Primer: reakcija kimotripsina ali acetilholin-esteraze (v aktivnem mestu je Ser) z diizopropilfluorofosfatom (DIFP)

Akompetitivna inhibicija

Meana inhibicija

serin, Ser

ENCIM JE TRAJNO OKVARJEN!

14

Spojine, kot so nekateri pesticidi ... se ireverzibilno veejo na encim acetilholin-esterazo (AChE), ki hidrolizira nevrotransmitor acetilholin
pesticid

Inhibitorji so lahko strupi kako postopati ob zastrupitvah?

Pri reverzibilnih inhibitorjih uvesti substrat v visoki koncentraciji Pri ireverzibilnih inhibitorjih uvesti sredstvo, ki vee inhibitor z vejo afiniteto kot encim

ivni bojni strup

acetiholin + voda ocetna kislina + holin, encim = AChE (serinska hidrolaza)

Uravnavanje encimske aktivnosti

Glede na potrebe celice se encimska aktivnost povea ali zmanja uravnavanje encimske aktivnosti Uravnavanje poteka na ve ravneh in na ve nainov: - uravnavanje koncentracije encimov - aktivacija encimov s proteolitinim razcepom (prebava, strjevanje krvi, delovanje hormonov...) - kovalentna modifikacija encima spremenjena encimska aktivnost - alosterina modulacija encimske aktivnosti - sinteza specifinih proteinskih encimskih inhibitorjev

Koncentracija encima vpliva na hitrost reakcije

v0 [E ]
v0

Ei koncentracija encima

[E]

Glede na potrebe celice se sintetizira ve encima ve substrata se pretvori v produkt v doloenem asu - vija encimska aktivnost Konstitutivni in inducibilni encimi!

Aktiviranje encima s proteolitinim razcepom:

z neaktivnega encima (zimogen/proencim/-ogen) se odcepi doloen peptidni del aktivni encim

Kovalentna modifikacija encima spremenjena encimska aktivnost

Primer: fosforilacija encima na ostankih serina (Ser)

Primer: aktiviranje prebavnih proteolitinih encimov tripsina in kimotripsina

15

Vrste kovalentne modifikacije encimov

fosforilacija ADP-ribozilacija

Primer uravnavanja encimske aktivnosti s fosforilacijo encima: razgradnja glikogena encim

glikogenska fosforilaza

adenilacija

uridilacija metilacija

Aktivnost glikogenske fosforilaze je uravnavana s fosforiliranjem/defosforiliranjem encima

Aktivacija glikogenske fosforilaze s fosforiliranjem

Uravnavanje razgradnje glikogena (kadar potrebujemo glukozo)

fosforilaze-kinazo aktivira zunanji signal (cAMP)

Alosterina modulacija encimske aktivnosti

Alosterini encimi ve podenot (katalitska, regulatorna) Aktivnost uravnavajo alosterini modulatorji (majhne molekule) Modulatorji se veejo (ibke interakcije) na regulatorno podenoto sprememba konformacije regulatorne podenote spremamba konformacije katalitske podenote sprememba na aktivnem mestu spremenjena encimska aktivnost Modulatorji so aktivatorji ali inhibitorji Modulatorji: substrat (homotropina modulacija) ali druge molekule (heterotropina modulacija)

Regulatorni encim shematski prikaz aktivacije encima z vezavo aktivatorja M na regulatorno podenoto
katalitska podenota regulatorna podenota

16

Shema pozitivne alosterine modulacije encimske aktivnosti: substrat A aktivira encim, ki

pretvarja BC ali EF Sinteza Ile iz Thr poteka v 5 stopnjah, ki jih katalizira 5 encimov (E1-E5)

INHIBICIJA S POVRATNO ZVEZO (FEED-BACK INHIBITION)

e br

zm

u od

zm

ja or lat jem t or ula od

L-izolevcin (Ile) je negativni alosterini modulator E1 ( treonin-dehidrataze, TDH). Ki za vezavo Ile na alosterino (modulatorsko) mesto TDH doloa koncentracijo Ile.

(Ile)

Ki =

[TDH ].[ Ile] Ki [TDH ] ; = [TDH Ile] [ Ile] [TDH Ile]

URAVNAVANJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI S SINTEZO SPECIFINIH INHIBITORJEV Posebno znailno za proteinaze, ki morajo biti strogo uravnavane, drugae razpad celic. Znanih je vrsta naravnih inhibitorjev proteinaz, ki so proteini in se zelo trdno in specifino veejo na izbrani encim prepreijo njegovo delovanje. Eden prvih takih inhibitorjev je bil odkrit v Ljubljani na IJS (Stefin). Inhibicija je uravnavana na genski ravni z regulacijo sinteze inhibitorjev v celici. PRIMER: 1-antitripsin v pljuih. Tobani dim oksidira kljuni Met v tem proteinu, ki zato ne deluje - ne inhibira tripsina. Prevelika aktivnost tripsina v pljuih uniuje pljuno tkivo. Posledica: kronini bronhitis in emfizem pri kadilcih.

ENCIMI V KLININI PRAKSI encimi kot diagnostini indikatorji

- zmanjana aktivnost holinesteraz pri zastrupitvi z organofosfati (pesticidi, bojni strupi...) - ala-transaminaza in asp-transaminaza razpad jeter (ciroza, rak...) - alkalna fosfataza v krvi kostne in jetrne bolezni (razlika v denaturaciji!) - kisla fosfataza v krvi rak prostate - specifini srni encimi (LDH, CPK, AST) infarkt - lipaza in amilaza - pankreatitis

encimi kot razgrajevalci krvnih strdkov in antitumorski dejavniki

- streptokinaza, aktivator plazminogena razgradnja strdkov v krvi - asparaginaza razgrajuje Asp, ki ga nujno rabi levkemino tkivo za rast

dodajanje encimov (posebno prebavnih) zaradi pomanjkanja ali genske napake

asovna odvisnost aktivnosti kreatin-fosfokinaze (CPK), aspartat-transaminaze (AST) in laktat-dehidrogenaze (LDH) v krvi pacienta po srnem napadu. S takimi diagrami lahko pri pacientu potrdijo ali ovrejo sum na srni infarkt.

Nomenklatura encimov
Konnica aza k substratu ali k reakcijski aktivnosti, npr. ureaza, DNA-polimeraza ... Opis iroke funkcije telesne tekoine, ki vsebuje doloen encim, npr. pepsin (iz grine prebava), lizocim (liza razgradnja bakterijske celine stene) ... Zmenjava: en encim ve imen ali ve encimov isto ime Sistematska klasifikacija encimov v 6 razredov glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo; razredi razdeljeni na podrazrede ... Vsak encim tono definiran s 4 tevilkami, npr. EC 2.7.1.1 (EC, Enzyme Commission number)

17

Mednarodna klasifikacija encimov (6 razredov)

1 - oksidoreduktaze 2 - transferaze 3 - hidrolaze 4 - liaze 5 - izomeraze 6 - ligaze Prenos elektronov (tudi kot hidridni ion H- in H atom) Prenos skupin Hidrolitine reakcije (prenos funkcionalnih skupin na H2O) Adicija na dvojno vez/nastanek dvojne vezi Prenos skupin znotraj molekule druga izomerna oblika Nastanek kovalentnih vezi C-C, C-S, C-O in C-N (kondenzacijske reakcije ob porabi energije ATP)

Primer klasifikacije encima, ki katalizira reakcijo:

ATP + D-glukoza ADP + D-glukoza-6 fosfat

EC 2.7.1.1.
1. t. - 2. razred transferaze 2. t. - 7. podrazred, kjer so encimi fosfotransferaze 3. t. - 1. fosfotransferaze, ki imajo OH kot akceptor fosforilne skupine 4. t. - 1. akceptor fosforilne skupine je glukoza Trivialno ime heksokinaza e vedno najve uporabljamo. Sistematino ime je: ATP:D-heksoza-6-fosfotransferaza

18